Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PHENOL

Header Page 1 of 145.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN THỊ THÚY HẰNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
PHENOL

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. NGUYỄN HỮU HIỆP

NĂM 2013

Footer Page 1 of 145.


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 2 of 145.

TÓM TẮT
Trong số những hợp chất thơm, phenol được biết đến như một thành
phần phổ biến trong đất và chất thải bị ô nhiễm từ nhiều ngành công nghiệp:

nhà máy lọc dầu, dược phẩm, dầu khí, dệt may,…Độc tính của phenol gây
ảnh hưởng tiêu cực đến con người, môi trường, động thực vật và sinh vật
thủy sinh. Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng phân hủy
phenol tạo cơ sở hình thành giải pháp làm sạch môi trường theo hướng sinh
học. Nghiên cứu được thực hiện từ 12/2013- 08/2013. Trong nghiên cứu này,
các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MSB (Minerral salts basal)
với phenol là nguồn carbon duy nhất. Kết quả 37 dòng vi khuẩn có khả năng
phân hủy đã phân lập từ các địa điểm Trà Vinh, Vĩnh Long, Cần Thơ và Sóc
Trăng. Trong số đó, 35 dòng có dạng hình que, 2 dòng có dạng hình cầu;
34/37 dòng có khả năng di động, 3/37 dòng không di động; 29/37 dòng Gram
âm, 8/37 dòng Gram dương. Ba dòng vi khuẩn P3, P10, P36 có khả năng
phân hủy phenol tốt nhất. Sau 7 ngày trong môi trường có 0,5 g/L phenol,
dòng vi khuẩn P3, P10 và P36 theo thứ tự có thể phân hủy 39,8%, 95,2% và
83,2% và phenol. Kết quả giải trình tự gene 16S rRNA xác định dòng P3 là
Paenibacillus sp., dòng P10 và P36 là Rhodococcus sp.
Từ khóa: Paenibacillus sp., phân hủy sinh học, Rhodococcus sp., 16S
rRNA, vi khuẩn phân hủy phenol.

Footer Page 2 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 3 of 145.

ABSTRACT

Among aromatic compounds, phenol is known as a common constituent
of soil and wastes contaminated from many industries including oil refineries,
pharmaceutical, petroleum, textiles and coal refining etc. The toxicity of
phenol causes negative effects to human, environment, fauna and aquatic
organisms. Isolation, selection and identification bacterial strains capable of
degrading phenol to form the basis of an environmental cleaning solution by
biological methods. The study was carried out from 12/2013 to 08/2013. In
this study, the bacterial strains were isolated in MSB medium (Minerral basal
salts) with phenol as sole source of carbon. Thirty-seven bacterial strains
capaple of degrading phenol were isolated from soil and waste water in Tra
Vinh, Vinh Long, Can Tho and Soc Trang provinces. Among them, 35 strains
were rod shape, 2 trains were globular shape; 34/37 strains were motile, 3/37
strains were not motile; 29/37 trains were gram negative, 8/37 trains were
gram positive. P3, P10 and P36 could degrade phenol the best. After seven
days in the medium containing 0,5 g/L of phenol, P3, P10 and P36 could
degrade phenol at 39,8%, 95,2% and 83,2%, respectively. The results of 16S
rRNA sequence analysis showed that P3 strain was Peanibacillus sp. and P10,
P36 were Rhodococcus sp.
Key words: Biodegradation, Paenibacillus sp., phenol-degrading
bacteria, Rhodococcus sp., 16s rRNA.

Footer Page 3 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 4 of 145.

MỤC LỤC

Trang
Tóm tắt........................................................................................................... iii
Abstract .......................................................................................................... iv
Chương 1: Giới thiệu .....................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài............................................................................................2
Chương 2: Lược khảo tài liệu ........................................................................3
2.1 Cấu tạo và tính chất của phenol ..................................................................3
2.2 Nguồn gốc phát sinh chất thải chứa phenol .................................................3
2.2.1 Nguồn tự nhiên ........................................................................................3
2.2.2 Nguồn nhân tạo .......................................................................................4
2.3 Tác động của phenol đến sức khỏe con người, động vật và hệ sinh thái ......5
2.3.1 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người.........................................................5
2.3.2 Ảnh hưởng đến động vật..........................................................................5
2.3.3 Ảnh hưởng đến hệ sinh thái .....................................................................6
2.4 Sự phân hủy sinh học của phenol bởi vi khuẩn ...........................................7
2.4.1 Vi khuẩn phân hủy phenol .......................................................................7
2.4.2 Cơ chế phân hủy phenol bởi vi khuẩn ......................................................8
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy phenol ............................ 11

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu................................. 13
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................ 13
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................... 1313
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................... 1313
3.1.3 Hóa chất ................................................................................................ 14
3.1.4 Vật liệu .................................................................................................. 16
3.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
3.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm .............................................................................. 16
Footer Page 4 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 5 of 145.

3.2.2 Phân lập vi khuẩn từ đất và nước thải nhiễm phenol .............................. 16
3.2.3 Khảo sát một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................. 16
3.2.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng phân hủy
phenol ..................................................................................................... 19
3.2.5 Kiểm tra khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn đã tuyển
chọn. ....................................................................................................... 20
3.2.6 Khảo sát sự sinh trưởng của vi khuẩn đã tuyển chọn ở các nồng độ
phenol khác nhau .................................................................................... 21

3.2.7 Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy phenol ............................... 22
3.2.8 Nhận diện vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử ................................ 23
Chương 4: Kết quả thảo luận ...................................................................... 25
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ đất và nước thải nhiễm phenol .................... 25
4.2 Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập được .............................. 26
4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy phenol ....... 30
4.4 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn tuyển
chọn .................................................................................................... 3030
4.4.1 Khảo sát khả năng tạo enzyme protease ................................................. 30
4.4.2 Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase ..................................................... 31
4.4.3 Khảo sát khả năng tạo enzyme amylase ................................................. 33
4.4.4 Khảo sát khả năng tạo enzyme cellulase ................................................ 33
4.5 Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn tuyển chọn ở các
nồng độ phenol khác nhau ....................................................................... 34
4.6 Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy phenol của vi khuẩn ............. 38
4.7 Nhận diện vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử ................................... 40
Chương 5: Kết luận và đề xuất .................................................................... 44
5.1 Kết luận .................................................................................................... 44
5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 44
Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 45
Phụ lục .......................................................................................................... 54

Footer Page 5 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH

Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 6 of 145.

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Giá trị LD50 đối với một số loài động vật ở cạn ................................. 6

Bảng 2.2: Giá trị LD50 đối với một số loài động vật thủy sinh ...........................6
Bảng 2.3: Vi khuẩn phân hủy phenol ................................................................7
Bảng 3.1: Nồng độ phenol ở các nghiệm thức trong thí nghiệm...................... 21
Bảng 4.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập...................................... 25
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập sau 72
giờ........................................................................................................... 27
Bảng 4.3: Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập ............................. 29
Bảng 4.4: Kích thước vùng sáng do vi khuẩn tạo ra khi tổng hợp protease ..... 31
Bảng 4.5: Mật số dòng vi khuẩn P3 ở các nồng độ phenol khác nhau ............. 35
Bảng 4.6: Mật số dòng vi khuẩn P10 ở các nồng độ phenol khác nhau ........... 36
Bảng 4.7: Mật số dòng vi khuẩn P36 ở các nồng độ phenol khác nhau ........... 37

Footer Page 6 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

viii

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH

Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 7 of 145.

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Công thức cấu tạo của phenol ...........................................................3
Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa phenol theo con đường hiếu khí ...........................9
Hình 2.3: Sơ đồ chuyển hóa phenol theo con đường kỵ khí ............................ 10
Hình 3.1: Các bước thực hiện quy trình nhuộm Gram .................................... 19
Hình 3.2: Đường chuẩn phenol ....................................................................... 23
Hình 3.3: Nhiệt độ và thời gian của phản ứng PCR ........................................ 24
Hình 4.1: Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phát triển sau 72 giờ trên môi
trường MSB agar .................................................................................... 26
Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram của một số dòng vi khuẩn phân lập được ...... 28
Hình 4.3: Sự sinh trưởng của các dòng vi khuẩn ở nồng độ 0,5 g/L phenol .... 30
Hình 4.4: Vòng sáng của vi khuẩn có khả năng tạo enzyme protease sau 3
ngày ........................................................................................................ 31
Hình 4.5: Khả năng tổng hợp lipase của các dòng vi khuẩn ............................ 32
Hình 4.6: Lipid bị thủy phân bởi các dòng vi khuẩn ....................................... 32
Hình 4.7: Hoạt tính enzyme amylase của các dòng vi khuẩn sau 3 ngày ủ ...... 33
Hình 4.8: Hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn sau 3 ngày ủ ..... 33
Hình 4.9: Sự tăng trưởng của dòng P3 trên môi trường MSB ở các nồng độ
phenol khác nhau .................................................................................... 35
Hình 4.10: Sự tăng trưởng của dòng P10 trên môi trường MSB ở các nồng
độ phenol khác nhau ............................................................................... 36
Hình 4.11: Sự tăng trưởng của dòng P36 trên môi trường MSB ở các nồng
độ phenol khác nhau ............................................................................... 37

Hình 4.12: Đường chuẩn phenol ..................................................................... 38
Hình 4.13: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P3 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 39
Hình 4.14: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P10 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 39
Hình 4.15: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P36 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 40
Footer Page 7 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ix

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 8 of 145.

Hình 4.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn trên gel
agarose 1% .............................................................................................. 40
Hình 4.17: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P3................................. 41
Hình 4.18: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P10 ............................... 42
Hình 4.19: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P36 ............................... 43

Footer Page 8 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

x

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013

Trường ĐHCT

Header Page 9 of 145.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ATSDT

Agency for Toxic Substances and Disease
Registry

CFU

Conoly forming unit

CMC

Carboxymethylcellulose

cm

Centimeter

CV

Coefficient of Variantion

ĐKTƯ

Đa khoa Trung ương

EPA

Enviromental Protection Agency

g

Gam

KCN

Khu công nghiệp

kg

Kilogram

L

Litre

LB

Luria Bertani

LD50

Lethal dose 50

mg

Miligam

ml

Milililer

MSB

Minerral salts basal

MSM

Minimal salt medium

ng

Nanogram

NT

Nghiệm thức

P

Phenol

PBHC

Phân bón hóa chất

PCR

Polymerase chain reaction

ppm

Parts per million

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

VK

Vi khuẩn

WHO

World Health Organization

Footer Page 9 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

xi

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 – 2013

Trường ĐHCT

Header Page 10 of 145.

CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Trong bối cảnh phát triển nhanh chóng của xã hội ngày nay, nhu cầu về
nguyên vật liệu của con người ngày càng tăng, kéo theo sự mở rộng của các
ngành công nghiệp là một điều tất yếu. Song, chất thải tại nhiều cơ sở sản xuất
của các khu công nghiệp không được xử lý triệt để hay chưa được xử lý vẫn
hàng ngày thải ra môi trường. Theo thống kê Tổ chức Y tế thế giới (WHO)
công bố, mỗi năm Việt Nam có hơn 20.000 người tử vong do sử dụng nguồn
nước bị ô nhiễm. Theo thống kê của Bộ Y tế Việt Nam, hơn 80% các bệnh
truyền nhiễm ở nước ta liên quan đến nguồn nước. Do đó, ô nhiễm môi trường

là một trong những mối đe dọa chính, là thử thách mà nhân loại phải đối mặt
hiện nay.
Nguồn: />=4&lang=vi

Tác nhân gây ô nhiễm môi trường phổ biến bao gồm các hợp chất hữu
cơ: các chất dệt nhuộm, chất tẩy rửa, hóa chất, thuốc sát trùng, thuốc trừ sâu,
thuốc diệt cỏ, các hợp chất béo, aromatic,…(Bahnemann, 2004; Vidal, 1998);
hợp chất vô cơ như kim loại nặng, thủy ngân, bạc, niken, chì, các loại khí độc
hại,…và các sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus (Vinu and Madras,
2010). Trong đó, các chất gây ô nhiễm mạnh, độc tính cao phần lớn đều có
chứa nhân vòng thơm. Một trong những sản phẩm trung gian của sự chuyển
hóa các chất nhân vòng thơm này thường là phenol. Từ đó cho thấy sự hiện
diện của phenol trong môi trường là một con số không nhỏ.
Phenol là một chất hữu cơ khó phân hủy, gây hại đến sức khỏe con
người, động vật và ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái. Theo tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 5945-2005, tiêu chuẩn thải cho phép của phenol là rất nhỏ, chỉ từ
0,5 – 1 mg/L. Trong khi đó, hàm lượng phenol trong nước thải của nhiều khu
công nghiệp, khu chế xuất lại vượt mức cho phép. Theo Annadurai et al.
(2000) nồng độ phenol trong nước thải ở mức 10 - 300 mg/L. Do đó, việc xử
lý chất gây ô nhiễm môi trường như phenol là thật sự cần thiết.
Trong khoảng hơn một thập kỷ qua, một số phương pháp xử lý phenol đã
được tiến hành nghiên cứu, chẳng hạn như phân hủy nhiệt, oxy hóa học, oxy
hóa quang điện, oxy hóa quang hóa. Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp. Qua thử nghiệm thực tế, xử
lý bằng phương pháp sinh học đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó

Footer Page 10 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH


Luận văn Thạc sĩ khóa 18 – 2013

Trường ĐHCT

Header Page 11 of 145.

là giá thành thấp, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an
toàn rất cao và thân thiện với môi trường.
Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn trên, các dòng vi khuẩn có khả
năng phân hủy phenol được sự quan tâm của các nhà khoa học hiện nay. Vì
vậy, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng phân hủy
phenol” được nghiên cứu.
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng phân hủy
phenol tạo cơ sở hình thành giải pháp làm sạch phenol trong môi trường theo
hướng sinh học.

Footer Page 11 of 145.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH