Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vả

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-------------------

NGUYỄN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN
TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Hà Nội, 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và
kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình
nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn,
tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn
thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận
tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những
người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi
học tập và hoàn thành luận văn của mình.
Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012
Học viên

Nguyễn Thị Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1.

Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis ......................................................... 3

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ..................................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt........................................................................... 6
1.1.3. Đặc điểm sinh hoá....................................................................................... 8
1.1.4. Đặc điểm phân loại ..................................................................................... 8
1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ........................ 9
1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis ............................................... 11
1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể ..................................................... 13
1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng ................................. 14
1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam ................................................... 15
1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc .......... 16
1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai ............. 18
1.2.

Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy ..................................................... 19

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy .............................................................................. 19
1.2.2. Côn trùng thử nghiệm ............................................................................... 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24
2.1.

Vật liệu ..................................................................................................... 24

2.1.1. Sinh phẩm .................................................................................................. 24
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 24

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh ................................ 26
2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt ........................................................................ 27
2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm .................................................. 27
2.2.4 Tách chiết DNA plasmid ............................................................................ 28
2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR ...................................... 29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 30
2.2.7 Xác định trình tự nucleotide...................................................................... 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33
3.1

Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C

có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ ................................................... 33
3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu ..................... 33
3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh.................................................................. 35
3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu ............. 36
Nồng độ bào tử .................................................................................................... 36
Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ .................................. 37
3.2

Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C ........................................... 39

3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR............................. 39
3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 40
3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C ........................................................... 44
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

STT

Viết tắt

Viết đầy đủ

1

Amp

Ampicillin

2

Bp

Base pair

3

Bt

Bacillus thuringiensis

4

Bta

Bacillus thuringiensis subspecies aizawai

5

dH2O

Nước khử ion

6

DNA

Deoxyribonucleotide acid

7

E. coli

Escherichia coli

8

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

9

OD

Optical density

10

PCR

Polymerase chain reaction

11

SDS

Sodium dodecyl sulphate

12

Sol

Solution

13

TE

Tris EDTA

14

X-gal

5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt………………………………………… .............. 10
Bảng 3.1. Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bt…......................................... 34
Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm . 37
Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm. ................... 38

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis ……………………..…. ................... 7
Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis ....................................... .................... 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac ................14

Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis …… ………….. .................. 15
Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….……... ........... 21
Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại …………… ……………………………... ............... 21
Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng …………… ………...……………. ........... 23
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC...........33
Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần . ............................ 34
Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển
vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………….... ................... 36
Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu............................. 37
Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu………………... .......... 38
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu………… .................... 39
Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua
đêm………………………………………………………………………………. ....... 41
Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… ........... 42
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên
agarose 1%.......................................................................................................... .......... 43
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều
kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng
bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên
180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt
hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà.

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa
học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Trung bình
mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn
lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm,
gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường. Thay
vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử
dụng. Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn
90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với
con người, động vật và môi trường [24].
Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) được nghiên cứu
nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis. Bacillus thurigiensis
subsp. aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng
bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh
(Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn
trùng bộ 2 cánh (Diptera). Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong
quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh.
Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng
cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy
vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh
protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.1.

Mục tiêu

- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) có hoạt
tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.
- Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc
có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.
1.2.

Nội dung

- Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái
Nguyên.
- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương
pháp huyết thanh học.
- Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được.
- Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn
trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR.
- Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy.
- Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình
tự gene trên Gene Bank.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1.

Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis
 Trên thế giới
B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học
Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu,
đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi
Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8].
Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây
bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã
đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8].
Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục
thân ở Châu Âu.
Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa
mì tại Pháp.
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể
có bản chất là protein [8].
Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với
khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus đã
chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33].
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại
mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết
thanh.
Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra
chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not

read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....