NGHIÊN cứu BIỂU HIỆN dấu ấn MIỄN DỊCH TRONG lơ xê MI cấp DÒNG LYMPHO ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP đếm tế bào DÒNG CHẢY tại VIỆN HUYẾT học TRUYỀN máu

B GIO
DC DC
V O
TRNG
TO TO
IHC
HCYY H
H NI
NI B
B Y
Y T
T
B GIO
V
TRNG
O
I

B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

HONG CH CNG

NGHIÊN CứU biểu hiện DấU ấN MIễN DịCH
TRONG LƠ XÊ MI Cấp DòNG LYMPHO ở TRẻ EM
BằNG PHƯƠNG PHáP ĐếM Tế BàO DòNG CHảY
TạI VIệN HUYếT HọC- TRUYềN MáU TRUNG ƯƠNG

CNG LUN VN THC S Y HC

H NI- 2014


B GIO
DC DC
V O
TRNG
TO TO
IHC
HCYY H
H NI
NI B
B Y
Y T
T
B GIO
V
TRNG
O
I

B GIO DC V O TO
B Y T
TRNG I HC Y H NI

HONG CH CNG

NGHIÊN CứU biểu hiện DấU ấN MIễN DịCH

TRONG LƠ XÊ MI Cấp DòNG LYMPHO ở TRẻ EM
BằNG PHƯƠNG PHáP ĐếM Tế BàO DòNG CHảY
TạI VIệN HUYếT HọC- TRUYềN MáU TRUNG ƯƠNG
Chuyờn ngnh: Huyt hc- Truyn mỏu
Mó s:
CNG LUN VN THC S Y HC

Ngi hng dn khoa hc:
PGS.TS. Bch Khỏnh Hũa

H NI- 2014
MC LC


PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ


6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
TẠO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơxêmi (LXM) cấp là nhóm bệnh thường gặp nhất trong các bệnh cơ
quan tạo máu. Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi, biểu hiện bệnh đa dạng.Tại
Việt Nam, tác giả Đỗ Trung Phấn và Trần Thị Minh Hương (2002) nghiên
cứu tình hình bệnh máu tại viện Huyết học- Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai
thấy bệnh LXM cấp gặp với tỷ lệ cao nhất (chiếm 38,5%) trong số các bệnh
máu gặp tại Bệnh viện Bạch Mai. [1]
Ở trẻ em, Lơxêmi cấp cũng là loại ung thư khá phổ biến, chiếm khoảng
31% tổng số các ca ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi trong những năm từ
1990-1995 ở Mỹ, trong đó Lơxêmi cấp dòng lympho chiếm đến 3/4. Ước
tính mỗi năm ở Mỹ có khoảng 3250 trường hợp trẻ em được chẩn đoán
Lơxêmi cấp, trong đó khoảng 2400 trường hợp là Lơxêmi cấp dòng
lympho. Tỷ lệ mới mắc của LXM cấp dòng lympho ở trẻ em tại Mỹ là 3.74.9/100000 người mỗi năm. [2] [3]
Từ nhiều năm nay, với sự phát triển của phương pháp hình thái học,
phương pháp hóa học tế bào, việc chẩn đoán LXM cấp dòng lympho đã có
nhiều thuận lợi. Tuy nhiên vẫn còn có một số khó khăn nhất định do phụ
thuộc nhiều yếu tố chủ quan trong phân tích kết quả, một số sai sót có thể gặp
trong quá trình thực hiện kỹ thuật,… làm ảnh hưởng đến công tác chẩn đoán
thể bệnh, qua đó ảnh hưởng đến việc điều trị và tiên lượng.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của phương pháp
Đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) trên thế giới cũng như ở Việt Nam,
việc chẩn đoán LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng lympho ở trẻ em nói
riêng đã có những bước tiến rõ rệt. Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, độ


7

nhạy, độ đặc hiệu cao hơn, giúp chẩn đoán thể bệnh chính xác hơn, từ đó giúp
ích cho việc điều trị và tiên lượng bệnh.

Đã có một số nghiên cứu xếp loại MDH trong LXM cấp sử dụng
phương pháp Đếm tế bào dòng chảy tại Việt Nam, tuy nhiên chưa có nhiều
nghiên cứu tiến hành trên đối tượng trẻ em. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch trong LXM cấp dòng lympho ở
trẻ em bằng phương pháp Đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) tại
Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương” với mục tiêu:
1.

Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn miễn dịch để xếp loại Lơ xê mi cấp
dòng lympho ở trẻ em tại Viện Huyết học- Truyền máu Trung Ương.

2.

Bước đầu tìm hiểu mối liên quan giữa một số dấu ấn miễn dịch với
đáp ứng điều trị sau đợt điều trị cảm ứng với phác đồ FRALLE 2000.


8

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Khái quát về các dấu ấn trong quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào máu.
1.1.1. Các dấu ấn biệt hóa tế bào máu.
Trong quá trình sinh sản, biệt hóa tế bào máu, tế bào lần lượt trải qua
các thay đổi về cấu trúc của nhân, nguyên sinh chất và đặc biệt là có sự hình
thành những dấu ấn mang tính chất đặc trưng cho từng dòng, thậm chí cho từng
loại tế bào và các dấu ấn này tương ứng với từng giai đoạn biệt hóa. Việc xác
định các dấu ấn biệt hóa này đã cho phép nhận dạng chính xác các tế bào máu.
Dấu ấn màng đầu tiên đặc trưng cho tế bào gốc tạo máu là CD34. Sau
đó cùng với quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào gốc thành các tế bào gốc

định hướng dòng tủy hay định hướng dòng lympho, mật độ các dấu ấn CD34
trên màng tế bào gốc giảm dần và dần dần xuất hiện thêm các dấu ấn khác đặc
trưng và đánh dấu quá trình biệt hóa.
Năm 1981, một hội nghị quốc tế về kháng nguyên màng bạch cầu đã
thống nhất đặt tên các dấu ấn màng là CD (Cluster of Differentiation - cụm
biệt hóa). Cho đến nay người ta đã phát hiện ra khoảng trên 350 CD [4]. Các
CD này không chỉ xuất hiện trên màng tế bào mà một số CD còn xuất hiện
trong bào tương và nhân tế bào.


9

Sơ đồ 1.1. Xếp loại tế bào máu bằng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với
kháng nguyên biệt hóa (Hoffbrand 1995) [5]


10

1.1.2. Sự trưởng thành và các dấu ấn biệt hóa của tế bào dòng lympho.
Tế bào mẹ (CFU-L) của lympho chung được phát triển từ tế bào gốc
sinh máu. Từ đây, chúng phân chia (theo chức năng) thành 3 nhóm chính là
lympho T (85%), lympho B (10%) và NK- Natural Killer cell (5-10%). [6]
Dòng lympho B: trưởng thành từ tế bào mẹ của lympho chung (CFUL), trải qua giai đoạn biệt hóa khác nhau ở tủy xương, song song với việc xuất
hiện, thay đổi mức độ biểu hiện hoặc mất đi các CD để trở thành tế bào
trưởng thành ở máu ngoại vi, với sự có mặt của các tế bào đệm trong tủy
xương tiết các cytokine cần thiết cho quá trình biệt hóa này. [7]

Hình 1.1. Các dấu ấn miễn dịch tế bào lympho B theo tuổi biệt hóa
Dòng lympho T: quá trình biệt hóa và trưởng thành xảy ra ở tủy xương
và tuyến ức, trải qua nhiều giai đoạn với sự hình thành và biến mất của các

CD đặc trưng, với sự hỗ trợ của các tế bào biểu mô, tế bào đuôi gai và các đại
thực bào tại tuyến ức. [7]


11

Hình 1.2. Các dấu ấn miễn dịch tế bào lympho T theo tuổi biệt hóa
1.2. Tóm tắt về LXM cấp và LXM cấp dòng lympho ở trẻ em và các
phương pháp chẩn đoán.
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu.
LXM cấp là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy
trong tủy xương và máu ngoại vi của những tế bào non ác tính. Những tế bào
này dần sẽ thay thế và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các tế
bào bình thường trong tủy xương.
Bệnh LXM cấp được Velpeau ghi nhận lần đầu từ năm 1827. Đến năm
1845, Bennett đã đặt tên cho bệnh LXM cấp là leucocythemia (tăng bạch
cầu). Sau đó, Virchow gọi bệnh này là bệnh máu trắng (white blood), rồi
chính ông đặt tên cho bệnh cái tên mà cho đến bây giờ vẫn đang được sử
dụng, đó là leukemia (tiếng Hy Lạp có nghĩa là máu trắng). Năm 1887, phải
nhờ có phát minh nhuộm tiêu bản của Ehrlich thì mới có thể phân biệt được


12

những dạng khác nhau của dòng bạch cầu. Tới năm 1900 thì các cụm từ dòng
tủy và dòng lympho đã bắt đầu được sử dụng để xếp loại LXM cấp [6]. Ngày
nay, cùng với những tiến bộ trong các phương pháp chẩn đoán, đặc biệt là các
tiến bộ trong phương pháp miễn dịch học (MDH) và di truyền phân tử
(DTPT), việc chẩn đoán LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng lympho ở trẻ
em nói riêng cũng được cải tiến rõ rệt. Các thể LXM ở trẻ em được thống kê

rõ ràng hơn với tỷ lệ LXM cấp dòng lympho chiếm đến 80%, tiếp theo là
LXM cấp dòng tủy, chiếm khoảng 15%, còn lại 3-5% là LXM kinh dòng BC
hạt [8]. Nhiều nghiên cứu trên các cộng đồng người khác nhau cũng đã chỉ ra
LXM cấp dòng lympho ở trẻ em chiếm tỷ lệ cao nhất trong các LXM [9]. Ở
Mỹ, nghiên cứu về LXM cấp dòng lympho cũng chỉ ra rằng đây là loại LXM
cấp hay gặp nhất ở trẻ em, với tần suất mắc bệnh cao nhất ở độ tuổi từ 2-5
tuổi. Trong đó, LXM cấp dòng lympho B chiếm hơn 80% số trường hơp,
LXM cấp dòng lympho T chiếm khoảng 10-15% số trường hợp. [2] [10]
1.2.2. Các phương pháp chẩn đoán, xếp loại LXM cấp dòng lympho ở trẻ em.
1.2.2.1. Phương pháp hình thái học (HTH).
Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và tiêu bản
dịch hút tủy xương, dựa vào đặc điểm hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bào
blast, ngoài ra ta có thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào ác
tính.
1.2.2.2. Phương pháp hóa học tế bào (HHTB).
Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặc
trưng cho từng dòng tế bào đã được áp dụng hình thành các kỹ thuật nhuộm
hóa học tế bào, các kỹ thuật phổ biến hiện nay đang sử dụng cho xếp loại
LXM cấp như: Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen (SB: Sudan Black),


13

Periodic Acid Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chế
bằng NaF, Esterase đặc hiệu.
Kỹ thuật nhuộm MPO dựa trên nguyên lý là các tế bào có chứa men
myeloperoxydase (MPO) như bạch cầu hạt, bạch cầu mono có tác dụng oxy hóa
các cơ chất như gốc phenol, một số acid amin và acid thơm. Phản ứng này sẽ
diễn ra nhanh hơn nếu có thêm hydrogen peroxydase (H 2O2) trong phản ứng.
Các tế bào dòng lympho không chứa men này nên phản ứng sẽ âm tính.

Kỹ thuật nhuộm Sudan đen đã được nghiên cứu và phân tích mức độ
dương tính ở các dòng tế bào máu khác nhau và thống nhất nhận định dòng
bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức độ
khác nhau còn dòng lympho thường âm tính. Trên cùng một tế bào thì mức độ
dương tính của SB thường mạnh hơn MPO.
Kỹ thuật Esterase không đặc hiệu giới hạn ở những men thủy phân các
ester đơn giản của các alcol có nhóm N- tự do và các acid hữu cơ. Sau này
người ta dùng muối NaF để ức chế phản ứng này ở dòng mono giúp phân biệt
dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono.
Kỹ thuật nhuộm PAS sử dụng periodic (HIO4.2H2O) dùng để phát hiện
blast dòng lympho trong xếp loại LXM cấp nhưng chỉ khoảng 50% LXM cấp
dòng lympho cho phản ứng dương tính.
Dựa trên đặc điểm hình thái học và HHTB của tế bào LXM, xếp loại
FAB 1986 (French American British 1986) đã và đang được sử dụng trong
xếp loại LXM từ nhiều năm nay.


14

Bảng 1.1. Xếp loại LXM cấp dòng lympho theo FAB 1986
Hình thái TB
Kích thước

L1

Nhỏ chiếm đa số Lớn, không đều

Chất nhiễm sắc Đồng nhất, mịn
Hình dạng nhân
Hạt nhân



L2
Không đồng nhất

L3
TB lớn, không đều
Mịn và đồng nhất

Đều đặn, đôi khi Không đều, thường Đều đặn hình bầu dục
có rãnh, khía

có rãnh, khía

hoặc tròn

Không thấy hoặc Một hay nhiều hạt Một hay nhiều hạt
nhỏ

nhân to

nhân hình túi

Tỷ lệ nhân/NSC Thấp

Khá cao, thay đổi

Cao

Độ kiềm NSC

Thay đổi

Vừa hoặc đậm

Rất đậm

Không bào

Thường không có Thường không có

Hốc to và nhiều

Hóa học tế bào: Âm tính với MPO, SB, esterase không đặc hiệu.
Khoảng 50% các trường hợp dương tính với PAS.
1.2.2.3. Phương pháp di truyền tế bào- di truyền phân tử.
Nghiên cứu bệnh sinh LXM cấp nhận thấy có liên quan đến tổn thương
di truyền trong các tế bào gốc tạo máu làm tăng sinh và tích tụ các tế bào non
gây lấn át các dòng tế bào tạo máu bình thường gây bệnh cảnh lâm sàng
LXM, biểu hiện tổn thương di truyền trong LXM cấp rất đa dạng bao gồm cả
những bất thường về số lượng đến những bất thường về cấu trúc phân tử.
Việc phát hiện các bất thường di truyền có ý nghĩa quan trọng trong chẩn
đoán, tiên lượng cũng như theo dõi điều trị.

Bảng 1.2. Ý nghĩa tiên lượng của các bất thường di truyển hay gặp trong
LXM cấp dòng lympho trẻ em [11]
Bất thường nhiễm sắc thế

Sống 5 năm không bệnh

15

Đa bội thể
> 50 NST
47-50 NST
Tam bội thể, 66-73 NST
Tứ bội thể, 82-94 NST
Lưỡng bội thể bình thường, 46 NST
Thiểu bội thể, < 46 NST
Giả lưỡng bội (pseudodiploid)
t(1;19)
t(4;11)
t(9;22)

80% (65-90%)
90% (50-98%)
Không rõ, có thể tốt
Không rõ, có thể dưới 60%
80% (65-90%)
71% (55-85%)
73% (55-85%)
53%
45%
14%

1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch học (MDH).
Từ đầu những năm 1970, một số nhà nghiên cứu đã bắt đầu áp dụng
phương pháp MDH trong xếp loại LXM cấp. Từ đó đến nay đã có rất nhiều

tiến bộ, từ việc xếp loại miễn dịch trên kính hiển vi (KHV) huỳnh quang, đến
nay đã xếp loại miễn dịch (XLMD) bằng kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy
(Flow Cytometry) một cách thường xuyên ở nhiều trung tâm trên thế giới.
 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, gián tiếp.

Dựa trên nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể (KNKT) để phát hiện các KN biệt hóa tế bào khi cho chúng kết hợp đặc hiệu với
KT đơn dòng có gắn huỳnh quang và phát quang khi đọc kết quả trên KHV
huỳnh quang. Kỹ thuật này đã mang lại giá trị bổ sung cho phương pháp
HTH-HHTB (hình thái học-hóa học tế bào). Tuy nhiên còn có một số hạn chế
đó là: Kết quả phụ thuộc vào người làm, người đọc, chưa tách biệt được tuyệt
đối quần thể tế bào non ác tính (Blast) cần nghiên cứu, chỉ phân tích được
từng dấu ấn riêng biệt do đó độ chính xác chưa cao.
 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch.

Hóa mô miễn dịch là một phương pháp được áp dụng từ khá lâu trong
việc chẩn đoán, xếp loại bệnh lý LXM cấp cũng như các bệnh lý ác tính khác


16

của hệ tạo máu. Phương pháp này dựa trên cơ sở các kháng thể đơn dòng gắn
chất nhuộm màu liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bề mặt tế bào,
sau đó quan sát trên kính hiển vi để xác định nguồn gốc, đặc tính tế bào.
Phương pháp này có một số nhược điểm là phân tích được số lượng ít các dấu
ấn tế bào, độ nhạy thấp hơn do phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật nhuộm, phụ
thuộc chủ quan người phân tích kết quả…
 Phương pháp đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry).

Đếm tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) là kỹ thuật đo và phân tích
đồng thời nhiều thông số, đặc điểm của một phần tử (tế bào) cần nghiên cứu

bao gồm: Kích thước, tính chất hạt trong nguyên sinh chất (NSC), độ phức
tạp của bào tương và nhân, mức độ gắn huỳnh quang (mức độ kết hợp kháng
thể với kháng nguyên cần nghiên cứu).
Kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy được thực hiện trên tế bào trong huyền
dịch (máu, tủy xương, dịch cơ thể hoặc huyền dịch tế bào tổ chức), các tế bào
này được ủ với các KT gắn huỳnh quang, KT này đặc hiệu với các protein KN
tương ứng trên bề mặt tế bào hoặc trong bào tương và nhân tế bào. Dùng một
panel KT có số lượng KT phù hợp tùy thuộc vào yêu cầu lâm sàng cụ thể ở
mỗi bệnh nhân để xác định kiểu hình miễn dịch.

1.3.Tóm tắt về phương pháp Đếm tế bào dòng chảy
Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody): là các kháng thể đặc hiệu
cho một đáp ứng kháng nguyên. Các kỹ thuật sinh học cho phép xác định các
tế bào mang các dấu ấn đặc trưng có mặt trên bề mặt hoặc trong nhân tế bào
bạch cầu người. Các tế bào này được dùng để gây miễn dịch cho động vật thu
được các tế bào lympho B mẫn cảm của cá thể động vật đó. Lai tế bào
lympho B đã được mẫn cảm này với một tế bào u plasmo thu được một tế


17

bào lai có khả năng sinh một lương không giới hạn kháng thể đơn dòng chống
lại dấu ấn đặc trưng của tế bào bạch cầu người ban đầu. Kháng thể đơn dòng
là công cụ quan trọng để xếp loại miễn dịch LXM cấp cũng như thực hiện
nghiên cứu về nhiều biểu hiện protein tế bào khác nhau, mở ra một kỷ nguyên
mới cho nền y học.
Cấu tạo của hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy: bao gồm có 3 hệ
thống chính.
1. Hệ thống thủy lực: Có chức năng tạo thành dòng chảy từng tế bào
riêng rẽ qua chùm tia laser để phân tích các thông số trên mỗi tế bào;

2. Hệ thống quang học bao gồm: Nguồn phát laser và bộ phận lọc
quang học để chuyển các tín hiệu ánh sáng tới bộ phận nhận cảm thích hợp và
bộ phận nhận cảm đặc biệt;
3. Hệ thống máy tính điện tử: Có chức năng chuyển các tín hiệu ánh
sáng thu được thành tín hiệu điện, các tín hiệu này sẽ được hệ thống máy tính
thu thập và phân tích bởi các phần mềm;

Sơ đồ 1.2. Cấu tạo cơ bản hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy


18

Nguyên lý của phương pháp
Hoạt động của thiết bị dựa trên nguyên lý thủy động lực học (hydrodynamic), tạo ra một dòng chảy tế bào liên tục qua một khe đếm. Dòng chảy
này được duy trì đảm bào tại một thời điểm chỉ có một tế bào riêng lẻ đi qua
khe đếm, tại khe đếm này có chùm sáng laser đi qua. Các tế bào tác động đến
việc tán xạ của chùm sáng, đồng thời các chất huỳnh quang gắn với kháng thể
bị chùm sáng kích thích, phát ra ánh sáng huỳnh quang. Thu nhận và phân
tích các thông tin của chùm sáng này cho phép phân tích thông tin về tế bào,
bao gồm kích thước, độ phức tạp nhân và nguyên sinh chất, sự có mặt hay
không các dấu ấn trên bề mặt tế bào, trong bào tương, nhân tế bào… Chùm
sáng thu được sau khi tia laser đến bị tác động bào gồm ánh sáng tán xạ và
ánh sáng bức xạ có được do sự phát xạ của chất huỳnh quang. Ánh sáng tán
xạ cùng chiều với tia tới gọi là tán xạ thẳng (FS: Forward Scatter), còn ánh
sáng tán xạ với góc lớn hơn được gọi là tán xạ bên (SS: Side Scatter). Mức độ
tán xạ phụ thuộc vào các đặc tính của tế bào đó, như kích thước, mức độ hạt,
độ phức tạp của nhân,… Tán xạ thẳng cho biết kích thước tế bào; tán xạ bên
cho biết mức độ phức tạp của nhân và nguyên sinh chất, mức độ hạt. Do có sự
khác biệt về các thông số này, biểu đồ 2 thông số FS và SS cho phép ta phân
biệt 3 quần thể tế bào lớn là mono, lympho, bạch cầu hạt. Tuy nhiên, do

không có sự khác biệt rõ rệt giữa các tế bào non ác tính với các tế bào tiền
thân của các quần thể trên nên trên biểu đồ FS và SS, người ta không nhận
biết được rõ quần thể tế bào non ác tính. Bằng việc sử dụng CD45 (hay LCA)
là kháng nguyên phổ biến dòng bạch cầu, kết hợp với thông tin có được của
chùm ánh sáng tán xạ bên (SS), Borowitz và cộng sự đã phân tách được quần
thể tế bào non ác tính với các quần thể tế bào bình thường [12]. Cơ sở của
phương pháp sử dụng CD45 và SS này là các tế bào non ác tính bắt nguồn từ
hệ tạo máu và các tế bào tiền thân dòng tủy trong tủy xương có biểu hiện


19

CD45 ở mức thấp và trung bình, trong khi tế bào mono và lympho có mức
biểu hiện cao hơn, đồng thời chúng có SS thấp hơn so với các tế bào dòng
bạch cầu hạt [13].

Hình 1.3. Phân bố các quần thể tế bào trên Đếm tế bào dòng chảy [14]
Tế bào có dấu ấn cần khảo sát được ủ với kháng thể đơn dòng tương
ứng gắn với chất huỳnh quang. Phức hợp tế bào (KN)- kháng thể này đi qua
hệ thống máy Đếm tế bào dòng chảy. Chất huỳnh quang gắn kháng thể đơn
dòng dưới tác động của chùm laser tới bị kích thích và phát ra ánh sáng, có
bước sóng đặc trưng theo loại chất huỳnh quang. Ánh sáng này được thu nhận
bởi các đầu thu đặc biệt thích hợp với từng bước sóng, qua đó cho phép đánh
giá có sự hiện diện hay không, cũng như mật độ hiện diện của dấu ẫn miễn
dịch (kháng nguyên) cần khảo sát trên bề mặt tế bào, trong bào tương hay
trong nhân tế bào.
Ứng dụng của phương pháp trong xếp loại LXM cấp
 Xếp loại miễn dịch bằng phương pháp Đếm tế bào dòng chảy có vai trò rất

quan trọng giúp xác định dòng tế bào và mức độ biệt hóa. Việc lấy bệnh phẩm

sử dụng cho phương pháp này cũng dễ dàng hơn, do có thể thực hiện với bệnh


20

phẩm máu ngoai vi (trong trường hợp bệnh nhân không thực hiện được xét
nghiệm huyết tủy đồ)
 Xác định quần thể tế bào blast bằng cửa sổ CD45 và SSC: Quần thể blast có

SSC thấp (thấp hơn quần thể lymphocytes bình thường) và có CD45 dương
tính mức độ nhẹ cho tới âm tính. Đó là đặc điểm khác biệt với quần thể blast
dòng hạt.Sử dụng phần mềm phân tích kết quả trên chương trình phân tích
LXM cấp cho máy Cytomic Navios của hãng Beckman Coulter (Mỹ).

Bạch cầu hạt

Dương tính nhẹ CD45
Cửa

sổblas

t

CD45
Sơ đồ 1.3. Các vùng cửa sổ blast trên cửa sổ kết hợp CD45 và SSC bằng kỹ
thuật đếm tế bào dòng chảy
 Phân tích dấu ấn biệt hóa tế bào máu trong quần thể tế bào blast

+ Tiêu chuẩn chẩn đoán dương tính của các CD trên Đếm tế bào dòng
chảy:(Theo European Group for the Immunogical characterization of

leukemias: EGIL)


21

Dương tính khi: Có ≥ 20% tế bào trong quần thể tế bào blast dương tính
với dấu ấn biệt hóa tương ứng và ≥ 10% đối với kháng nguyên nhân TdT.
 Dựa vào đặc điểm xuất hiện các dấu ấn miễn dịch theo dòng để xác định các

dưới nhóm.
1.4. Tóm tắt về điều trị LXM cấp dòng lympho ở trẻ em
1.4.1. Mục tiêu điều trị
Mục tiêu điều trị của điều trị LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng
lympho ở trẻ em là làm lui bệnh tới khỏi bệnh, gồm:
- Làm lui các biểu hiện lâm sàng và huyết học;
- Duy trì tình trạng lui bệnh bằng hóa trị liệu hệ thống và điều trị dự
phòng thâm nhiễm thần kinh trung ương;
- Điều trị các biến chứng của bệnh và do điều trị.
1.4.2. Các phương pháp điều trị.
1.4.2.1. Điều trị hóa chất
Điều trị hóa chất là phương pháp điều trị tiên phong (front-line) và chủ
yếu trong LXM cấp ở trẻ em. Có nhiều phác đồ điều trị, song tất cả các phác
đồ đều bao gồm 4 giai đoạn với các mục đích khác nhau: điều trị cảm ứng kéo
dài 4-5 tuần để đạt lui bệnh, điều trị củng cố để tăng cường lui bệnh hoặc
giảm bệnh tồn dư tối thiểu, điều trị dự phòng bệnh lý LXM ở hệ thống thần
kinh trung ương, và điều trị duy trì để kéo dài tình trạng lui bệnh, giảm tái
phát. [15] [16]. Điều trị cảm ứng với 3 hay 4 thuốc (như Vincristin,
Prednisolon, L-asparaginase, Methotrexat tiêm tủy sống) đã đạt được tỷ lệ lui
bệnh 95%. [15]
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của các công ty và nhà phân phối

dược phẩm, sự lựa chọn thuốc cho điều trị theo đúng và đủ các phác đồ chuẩn
đã trở nên dễ dàng hơn. Đã có nhiều phác đồ được áp dụng trong điều trị
LXM cấp dòng lympho ở Việt Nam như phác đồ CCG1991 cho nhóm nguy


22

cơ thường, phác đồ MSKCC- New York 2 cho nhóm nguy cơ cao, phác đồ
MSKKC cho nhóm tái phát tủy xương, phác đồ FRALLE2000... [15]. Trong
đó, phác đồ FRALLE2000 đã được áp dụng rộng rãi ở các cơ sở điều trị huyết
học nhi khoa trên cả nước nói chung và tại khoa Nhi Viện Huyết học- Truyền
máu Trung Ương nói riêng từ năm 2010 tới nay.
1.4.2.2. Ghép tế bào gốc tạo máu
Trong khoảng hơn 40 năm qua trên thế giới, chất lượng điều trị LXM
cấp dòng lympho đã đạt được nhiều thành công và có tính cải thiện một cách
ổn định. Hầu hết bệnh nhi ngày nay được điều trị thành công, đạt được tình
trạng lui bệnh mà không cần sử dụng đến phương pháp ghép tế bào gốc tạo
máu [17]. Ghép tế bào gốc tạo máu được đặt ra với nhóm bệnh nhân nguy cơ
cao, không đạt được tình trạng lui bệnh hoặc tái phát, đặc biệt tái phát sớm
sau khi hoàn thành hóa trị liệu [16]. Ghép tế bào gốc tạo máu ở những bệnh
nhi này gíúp kéo dài thời gian sống thêm 5 năm không bệnh (EFS) và thời
gian sống thêm chung (OS). Trong khoảng thời gian từ năm 1995 đến năm
2000, dưới sự phối hợp của Nhóm nghiên cứu Quốc tế Berlin- FrankfurtMunster (I-BFM) với Nhóm nghiên cứu nhi khoa của Hiệp hội Ghép Châu Âu
(EBMT), một nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên đã được thực hiện trên 357
bệnh nhi, với mục đích so sánh kết quả điều trị của phương pháp ghép tế bào
gốc sử dụng nguồn người cho cùng huyết thống cho bệnh nhi nhóm nguy cơ
cao sau đợt lui bệnh hoàn toàn đầu tiên (CR1) với phương pháp hóa trị liệu
đơn thuần. Kết quả cho thấy, thời gian sống thêm 5 năm không bệnh ở nhóm
ghép tế bào gốc được cải thiện đáng kể (56,7%) so với nhóm hóa trị liệu đơn
thuần (40,6%) (P= 0,02) [18]. Trong một nghiên cứu tương tự của các tác giả

Italia mới được công bố gần đây, phân tích kết quả điều trị trên 211 bệnh nhi
thuộc nhóm nguy cơ cao được ghép tế bào gốc đồng loại ở lần lui bệnh hoàn
toàn đầu tiên từ năm 1990 đến năm 2005, cũng cho thấy xác suất sống thêm


23

toàn bộ 10 năm và sống thêm 10 năm không bệnh lần lượt là 63,4% và 61%.
Cũng trong nghiên cứu này, tỷ lệ tử vong và tỷ lệ tái phát tích lũy 10 năm liên
quan đến ghép cũng rất thấp, tương ứng là 15% và 24% [19].
1.4.2.3. Điều trị nhắm đích
Điều trị hóa chất có nhược điểm chung, đó là cùng một lúc làm tổn
thương cả tế bào ác tính và tế bào lành, dẫn đến một số hạn chế trong hiệu quả
điều trị và khả năng phục hồi sau điều trị. Từ nhiều năm nay, các nhà khoa
học đã tiến hành nhiều nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tác
dụng chọn lọc trên tế bào ác tính, hoặc trên một số phân tử đặc hiệu có tính
quyết định trong cơ chế bệnh sinh của bệnh, gọi là điều trị nhắm đích
(targeted therapies). Một bước tiến quan trọng trong điều trị LXM cấp dòng
lympho là hiệu quả của điều trị nhắm đích, tấn công vào các bản dịch mã đặc
hiệu, như phân tử protein lai BCR-ABL bởi các chất ức chế tyrosine kinase
(TKIs), hoặc các kháng nguyên bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu. Các tế
bào blast trong LXM cấp dòng lympho biểu hiện nhiều kháng nguyên đặc
hiệu khác nhau như CD19, CD20, CD22, CD33 và CD52; đây chính là các
đích nhắm của các kháng thể đơn dòng. Cho đến nay, kháng thể đơn dòng
kháng CD20 (rituximab) là có nhiều dữ kiện sử dụng lâm sàng nhất, được sử
dụng phối hợp trong các phác đồ đa hóa trị liệu điều trị LXM cấp dòng B
trưởng thành/ U lympho Burkitt. Một kháng nguyên khác là CD19, với tần
xuất biểu hiện cao trong LXM cấp dòng lympho B, cũng đã có kháng thể đặc
hiệu, đó là blinatumomab, tấn công trực tiếp CD19 và CD3. Ngoài ra, cũng đã
có những nghiên cứu nhỏ hơn, hoặc các báo cáo ca bệnh được ghi nhận về

kháng

thể

đơn

dòng

kháng

CD52

(alemtuzumab),

kháng

CD22

(epretuzumab), và kháng CD33 (gemtuzumab)... [20]. Việc áp dụng phương
pháp điều trị nhắm đích này càng cho thấy vai trò quan trọng của xếp loại


24

miễn dịch trong việc xác định chính xác các dấu ấn đặc hiệu để có quyết định
chính xác trong việc sử dụng thuốc đúng là hợp lý.
1.5. Tình hình nghiên cứu xếp loại và đặc điểm, mối liên quan giữa các
dấu ấn miễn dịch với đáp ứng điều trị trong LXM cấp ở trẻ em trên thế
giới và Việt Nam
1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Đầu những năm 1970, Greaves, Borella đã sử dụng những kháng thể
đặc hiệu để xếp loại ALL. Đến năm 1986, phương pháp MDH đã được ứng
dụng tại nhiều trung tâm huyết học lớn và mang lại những kết quả tốt, bổ sung
những hạn chế của xếp loại FAB (xếp loại dựa trên hình thái và hóa học tế
bào). PB Neame và cộng sự đã nghiên cứu LXM cấp bằng phương pháp miễn
dịch trên 138 BN LXM cấp thấy xếp loại miễn dịch đóng vai trò quan trọng ở
22% trường hợp không phân biệt được AML hay ALL bằng HHTB, 13% thể
LXM cấp hỗn hợp và ông đưa ra khuyến cáo phương pháp tốt nhất xếp loại
LXM cấp phải kết hợp giữa HTH, HHTB và MDH. [21] Ngày nay kỹ thuật
này đã trở thành thường quy để chẩn đoán xếp loại bệnh lý ác tính cơ quan tạo
máu ở nhiều trung tâm huyết học trên thế giới và đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu về XLMD ở bệnh nhân LXM cấp nói chung và LXM cấp dòng
lympho ở trẻ em nói riêng bằng kỹ thuật Đếm tế bào dòng chảy.Wan S., Gong
W. và cs (2002) nghiên cứu trên 86 trường hợp LXM cấp dòng lympho cho
kết quả 95.3% số trường hợp là LXM cấp dòng lympho B, trong đó LXM cấp
dòng B chung và tiền B lần lượt chiếm 76.8% và 6.1%. CD34(+) gặp trong
57.0% số trường hợp và số trường hợp có biểu hiện kháng nguyên dòng tủy
chiếm 34.9%. Trong các trường hợp LXM cấp dòng tiền B, các trường hợp có
CD33(+) gặp phổ biến hơn so với CD13(+), song sự khác biệt này không xuất
hiện ở các dưới nhóm khác của LXM cấp dòng lympho. [22] Năm 2003, tác
giả Shen HQ, Tang YM và cs công bố trên tạp chí Nhi khoa Trung Quốc,


25

nghiên cứu xếp loại miễn dịch trên 222 bệnh nhi LXM cấp sử dụng phương
pháp Đếm tế bào dòng chảy đa màu, có 124 bệnh nhi LXM cấp dòng lympho,
trong đó 75.8% là LXM cấp dòng lympho B và 24.2% là LXM cấp dòng
lympho T. CD13 là kháng nguyên dòng tủy hay biểu hiện bất thường nhất
trong nhóm này (18.5%), tiếp đến là CD15 (11.3%), CD11b (6.5%) và CD33

(4.3%). [23] Nghiên cứu tương tự của nhóm nghiên cứu gồm các tác giả
Khurram M.M, Nadeem A (Pakistan) và cs năm 2010 trên 100 bệnh nhân
LXM cấp cho kết quả LXM cấp dòng lympho chiếm 73%, dòng tủy chiếm
27%, trong đó có 26% các trường hợp có biểu hiện các kháng nguyên bất
thường. [24] Một nghiên cứu khác ở Nhật do Iwwamoto S, Deguchi, Ohta H
và cs tiến hành trên 1174 bệnh nhi được chẩn đoán mới LXM cấp dòng
lympho, kết quả cho thấy LXM cấp dòng lympho B chiếm 87%, dòng lympho
T chiếm 13%. Trong nhóm LXM cấp dòng lympho B, dưới nhóm LXM cấp
dòng B sớm chiếm tỷ lệ cao nhất (81%). Hơn 90% các trường hợp này có
biểu hiện CD19, CD79a, CD22, CD10 và TdT. CD34 biểu hiện ở 3/4 các
trường hợp. Với nhóm LXM cấp dòng lympho T, CyCD3 và CD7 có biểu
hiện dương tính ở tất cả các trường hợp. Hơn 80% các trường hợp có CD2,
CD5 và TdT dương tính. Trong 2 nhóm LXM cấp dòng lympho B và LXM
cấp dòng lympho T, CD13 và CD33 biểu hiện dương tính bất thường gặp ở
nhóm LXM cấp dòng lympho B nhiều hơn. [25]
Liên quan giữa các dấu ấn miễn dịch với vấn đề điều trị và tiên
lượng trong LXM cấp dòng lympho ở trẻ em
Trong nhiều năm trở lại đây, đã có hàng loạt các nghiên cứu khác nhau
trên thế giới đã đưa ra những lập luận về mối tương quan giữa sự biểu hiện
của các dấu ấn miễn dịch khảo sát được trên Đếm tế bào dòng chảy với vấn
đề điều trị và tiên lượng cho bệnh nhân LXM cấp nói chung và LXM cấp
dòng lympho ở trẻ em nói riêng. Nghiên cứu trên 335 bệnh nhi mới mắc LXM