Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn listeria, salmonella spp , staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía bắc

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẶNG THỊ MAI LAN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ
ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN
Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM
TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

Chuyên ngành: Ký sinh trùng và VSV học thú y
Mã số: 62.64.01.04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Thái Nguyên, năm 2017


Công trình được hoàn thành tại:
...............................................................................................................

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Bình
2. PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh
Phản biện 1:……………………………………………
…………………………………………….
Phản biện 2:……………………………………………
…………………………………………….
Phản biện 3.....................................................................
.....................................................................
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận cấp Đại học

Thái Nguyên họp tại:
…………………………………………………………………….
………………………………………………………………………
Vào hồi

giờ

ngày

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia;
- Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên;
- Thư viện Trường Đại học Nông Lâm.

tháng

năm


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Đặng Thị Mai Lan, Đỗ Hồng Anh, Nguyễn Thị Huê, Trần
Phi Vương (2014), “Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus
aureus trong thịt lợn ở thành phố Thái Nguyên”, Tạp chí Nông
nghiệp & Phát triển nông thôn, Chuyên đề Nông lâm nghiệp trung
du, miền núi phía Bắc, tháng 6/2014, tr. 104 - 110.
2. Nguyễn Thị Hoài Thu, Phạm Thùy Linh, Bùi Văn Ngọc, Đặng
Thị Mai Lan, Nghiêm Ngọc Minh (2015), “Biểu hiện và tinh sạch
vùng quyết định kháng nguyên Staphylococcus enterotoxin B (SEB)

được mã hóa bởi đoạn gen seb phân lập từ chủng tụ cầu vàng tại Việt
Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 13 (2), tr. 295 - 301.
3. Đặng Xuân Bình, Đặng Thị Mai Lan, Nguyễn Thị Thu
Huyền (2015), “Indentification and Characterrization of
Staphylococcus aureus Bacteria In Fresh Pork At Public Markets In
The North of Vietnam”, Research Journal of Animal and Veterinary
Sciences, 8(2) Special 2015, pp. 24 - 32.

4. Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định
tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh vật hóa học của một số vi khuẩn
gây ngộ độc thực phẩm trên thịt lợn tươi bán tại chợ trên địa
bàn các tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật
Thú y, Tập XXIII, số 6, tr. 53 - 63.
5. Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định
khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella
spp., Staphylococcus aureus phân lập được trên thịt lợn tươi
bán tại chợ một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa
học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 7, tr. 46 - 53.


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy ra
thường xuyên và với số lượng vụ NĐTP rất lớn làm ảnh hưởng
không nhỏ đến sức khoẻ con người và kinh tế của người dân.
Nguyên nhân là do thức ăn không đảm bảo vệ sinh, nhiều tạp chất,
chất hoá học… đặc biệt do thức ăn nhiễm một số loại vi khuẩn như:
E. coli, Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus

aureus và Listeria monocytogenes…
Xuất phát từ thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi
khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm
trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc”.
* Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S.
aureus… nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ ở các tỉnh khu vực phía Bắc.
- Nghiên cứu và xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột
của chủng vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus phân lập được.
* Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp tư liệu khoa học về loài Salmonella spp. và trình tự
gene độc tố enterotoxin type B của S. aureus phục vụ nghiên cứu tiếp
theo nhằm phòng, chống hiệu quả NĐTP.
- Là cơ sở khoa học từ đó đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm
thịt lợn do Salmonella spp. và S. aureus gây ra.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Bổ sung tư liệu về tình hình nhiễm khuẩn nói chung, ô nhiễm
Listeria, Salmonella spp. và S. aureus nói riêng trên thịt lợn.


2

- Bổ sung tư liệu về độc lực và khả năng sản sinh độc tố
enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp., S. aureus và giải trình tự
gene sản sinh độc tố của chúng.
* Điểm mới của đề tài
- Xác định được khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi
khuẩn Salmonella spp., S. aureus ô nhiễm trên thịt lợn.
- Đã nhân dòng và xác định trình tự của gene seb dạng tự nhiên

kích thước 534 bp và gene sản sinh độc tố enterotoxin của
Salmonella spp.. Đồng thời, đã nhân, biểu hiện và tinh sạch thành
công protein tổ hợp seb 534 ở dạng tự nhiên.
* Bố cục của luận án
Luận án gồm 154 trang được chia thành các 3 chương, phần mở
đầu: 3 trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 49 trang; chương 2: Vật
liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 trang; chương 3: Kết
quả nghiên cứu và thảo luận 57 trang; Kết luận và đề nghị 2 trang;
Danh mục các công trình có liên quan đến luận án 01 trang; Tài liệu
tham khảo 16 trang; Hình ảnh của luận án 4 trang, Phụ lục 3 trang.
Luận án có 29 bảng, 22 hình, 152 tài liệu tham khảo (65 tài liệu tiếng
Việt, 79 tài liệu tiếng nước ngoài, 08 tài liệu Internet) và 12 ảnh màu
được cấu trúc từ ảnh điện di.
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bộ Y tế (2008) đã tổng hợp số liệu thống kê của Cục an toàn Vệ
sinh thực phẩm trong vòng 8 năm (2000 - 2007) cho thấy: Nước ta,
xảy ra 1.616 vụ NĐTP làm 41.898 người mắc, 436 người tử vong thì
có 178 vụ làm 4.036 người mắc và 7 tử vong người do sử dụng thức
ăn đường phố. Trong các nguyên nhân gây NĐTP thì nguyên nhân
do vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao nhất (43,20 %).
Đặng Xuân Bình và Dương Thùy Dung (2010) cho biết: Trong
tổng số 136 mẫu thịt lợn tươi được thu thập tại các chợ khu vực


3

Trung tâm thành phố Thái Nguyên từ 5/2009 - 4/2010 có chỉ tiêu
tổng số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt chiếm 50 - 56 %; E. coli chiếm
37,9 - 48,7 %; Salmonella spp. chiếm 10 - 19,5 %; Bacillus cereus
chiếm 27,5 - 31,7 %; S. aureus chiếm 31,0 - 38,8 %; C. perfringens

chiếm 10 - 14 %.
Lê Huy Chính (2003) cho biết: vi khuẩn Listeria ít kháng thuốc
kháng sinh, có thể điều trị bệnh do Listeria bằng penicillin hoặc
erythromycin cho kết quả tốt. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn đã
kháng lại tetracycline như: Listeria là 48,3 %; Salmonella spp. là
63,6 %; Yersinia spp. là 51,3 % (Jamali H. và cs., 2014).
Trần Thị Xuân Mai và cs. (2011) đã thực hiện kỹ thuật PCR đa
mồi để phát hiện Salmonella enteritica trong thực phẩm. Kết quả
nghiên cứu cho thấy cặp mồi invA đặc hiệu cho Salmonella spp. và
cặp mồi spvC đặc hiệu cho S. enteritica (gồm S. typhimurium và
S. enteritidis) đã được phát triển thành công.
Theo Walter Chaim và David A. Eschenbach (2014) thì các yếu
tố độc lực của Listeria monocytogenes bao gồm: listeriolysin O
(LLO), protein ACTA, phospholipases, metalloprotease, protein P60,
protease CLP và ATPases.
Steven R. G. và cs. (2005) đã thành công trong việc giải trình tự
bộ gene dài 2809422 bp của chủng Staphylococcus aureus COL. Kết
quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số:
CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gene plasmid.
Nghiêm Ngọc Minh và cs. (2011) đã lựa chọn ngẫu nhiên dòng
khuẩn lạc số 1 để tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp seb ở nồng độ
IPTG 0,1 mM; nhiệt độ 30oC và thời gian cảm ứng là 5 giờ. Kết quả
cho thấy protein seb đã được biểu hiện có khối lượng khoảng 28 kDa
đúng theo lý thuyết tính toán.


4

Hao D. và cs. (2015) cũng đã phát hiện các gene mã hóa độc tố tụ
cầu vàng, trong đó gene chiếm ưu thế là sec (38,5 %); tiếp theo là seg

(19,7 %); sej (16,2 %); see (12,8 %); sea (11,1 %) và seb (10,3 %).
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Thịt lợn tươi sống bán tại chợ của Thái Nguyên, Hà Tây - Hà
Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc
- Vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
2.1.2.1. Địa điểm triển khai
- Chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - Hà
Nội, Vĩnh Phúc
2.1.2.2. Địa điểm xét nghiệm mẫu
- Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên
- Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch, có khối lượng 18 - 20g/con.
- Thỏ, có khối lượng 2 - 2,5kg/con
2.2.2. Các loại môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu
- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và
giám định vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus: Nutrient


5

Broth, Selenite Broth, XLD, TSI, BHI, Chapman, Fraser, Palcam,…
và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo

Sambrook và Russell (2001) hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Máy móc, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất khác: do Bộ môn Vi
sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và Công nghệ
sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen
- Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh học của vi khuẩn
Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thịt lợn tươi bán tại chợ
Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc
- Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên
thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc
- Xác định các đặc tính sinh hóa, độc lực, tính mẫn cảm với
kháng sinh của các chủng vi khuẩn đã phân lập được.
- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn đã phân lập được
trên chuột thí nghiệm.
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn đã phân lập
được đối với một số loại kháng sinh.
2.3.2. Xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được
bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính
2.3.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi
khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch
tán trong da thỏ”.
2.3.4. Xác định gene sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn
Salmonella spp. và S. aureus phân lập được
- Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi
khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng phương pháp PCR


6

- Đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả
bằng phần mềm chuyên dụng
- Biểu hiện và tinh sạch gene seb của vi khuẩn S. aureus phân lập
được
- Đề xuất biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp
nghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa
theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO).
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu thịt lợn tươi được lấy theo TCVN 4833 - 1 : 2002, TCVN
4833 - 2 : 2002, ISO 3100 - 1 : 1991.
2.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria,
Salmonella spp. và S. aureus nhiễm trên thịt lợn tươi
Xác định chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt lợn tươi theo
TCVN 7046 : 2002, vi khuẩn Salmonella spp. theo TCVN 5153 :
1990, vi khuẩn Staphylococcus aureus theo TCVN 5156 : 1990; vi
khuẩn Listeria theo TCVN 7700 - 1 : 2007.
2.4.3. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn
Nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái và khả năng bắt
màu của vi khuẩn, quan sát hình thái, và tính chất bắt màu của vi
khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100).
2.4.4. Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Listeria,
Salmonella spp. và S. aureus đã phân lập được
Tiến hành giám định đặc tính vi sinh vật hóa học: kiểm tra hình
thái, kích thước, tính chất bắt màu Gram, khả năng di động, phản ứng


7

sinh Indole 45oC (+), H2S; urease, catalaza, coagulase, phản ứng lên
men đường…
2.4.5. Phương pháp xác định độc lực của các
chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S.
aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm
Tiến hành thử độc lực cho chuột thí nghiệm theo quy trình thường
quy sử dụng trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa
học Sự sống - Đại học Thái Nguyên.
2.4.6. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng
sinh của chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus
phân lập được
Để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh, sử dụng phương pháp
của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi
khuẩn với kháng sinh dựa vào bảng đánh giá của NCCLS - 2000 Mỹ.
2.4.7. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella
spp. phân lập được
Tiến hành định type theo bảng định type huyết thanh học của vi
khuẩn Salmonella spp. theo sơ đồ của Kauffman - White (1972).
2.4.8. Phương pháp xác định khả năng sản sinh
độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella
spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuyếch
tán trong da thỏ”
Tiêm độc tố vào dưới da thỏ thí nghiệm, khoảng 2h sau tiêm
dung dịch Evan Blue vào tĩnh mạch tai, liều 40 mg/kg thể trọng.
Nuôi tiếp 2 giờ rồi giết thỏ, lột da và đọc kết quả phản ứng trên da.
2.4.9. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi
khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng phương pháp PCR


8

Để thu nhận ADN tinh sạch, dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến
tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN polymerase
chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn
phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động.
Phân tử ADN quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất
là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN
này để tiến hành xác định trình tự trên máy tự động.
2.4.10. Phương pháp đọc trình tự ADN trên máy
đọc tự động và phân tích kết quả bằng phần
mềm chuyên dụng đối với vi khuẩn S. aureus
Trình tự nucleotide của gene được xác định bằng phương pháp
xác định trình tự gene tự động trên máy ABI PRISMR 3100 Avant
Genetic Analyzer theo phương pháp của Sanger và được xử lý bằng
phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Data Collection v 1.0, sau đó
được so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã được công bố trong
ngân hàng gene thế giới.
2.4.11. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch
gene seb 534 của vi khuẩn S. aureus
Đoạn gene wtSEB được khuếch đại từ khuôn là ADN tổng số
của S. aureus bằng phương pháp PCR. Sau khi kiểm tra bằng cắt với
enzyme hạn chế và PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu,
những dòng chứa plasmid pET21a(+) mang đúng gene wtSEB sẽ
được sử dụng cho biểu hiện gene và khảo sát một số yếu tố ảnh
hưởng như: nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm
ứng để tìm ra các điều kiện tối ưu nhất cho việc sinh tổng hợp
protein ngoại lai wtSEB. Protein tái tổ hợp wtSEB được tinh sạch
bằng cột sắc ký ái lực Ni2+ của Invitrogen.

9

2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy trong
phòng thí nghiệm, phương pháp thống kê sinh học Minitab, SAS
3.1, Nguyễn Văn Thiện (2002) và trên phần mềm Microsoft office
excel 2007.
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình tiêu thụ và tỷ lệ nhiễm khuẩn trên
thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc
3.1.1. Khảo sát tình hình giết mổ lợn trên địa bàn
một số tỉnh phía Bắc
Bảng 3.1. Tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn bán tại chợ
Trung tâm ở Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh
Phúc
Thời

Số

Địa điểm gian hoạt lượng
động
quầy
(chợ)
(giờ)
Thái Nguyên 4 - 20

bán thịt

Tỷ lệ quầy

Số lượng

Khối lượng

được kiểm lợn giết thịt thịt tiêu thụ
tra vệ sinh
thú y
(%)

trung bình trung bình
(con/ngày) (tấn/ngày)

X

±

mX

X

±

mX

29

100

54,56 ± 2,12 2,39 ± 0,58

Bắc Giang

4 - 20

27

100

55,05 ± 1,86 2,81 ± 0,19

Hà Tây

5 - 19

14

100

17,36 ± 1,25 0,75 ± 0,11

Vĩnh Phúc

5 - 19

18

100

22,42 ± 1,51 0,96 ± 0,16

Kết quả từ bảng 3.1, cho thấy: Các chợ bán thịt bắt đầu hoạt
động trong khoảng thời gian từ 4 hoặc 5 giờ đến 19 hoặc 20 giờ. Đây
là thời điểm thuận lợi để người tiêu dùng đến chợ trao đổi/mua bán
thực phẩm nói chung và thịt lợn nói riêng. Số lượng các quầy hàng


10

bán thịt lợn tươi cũng có sự thay đổi do quy mô và vị trí địa lý - tự
nhiên xã hội của từng chợ. Mặt khác có sự tương quan giữa số lượng
con lợn được giết thịt mỗi ngày với khối lượng thịt tiêu thụ do mật
độ dân cư ở mỗi địa điểm lấy mẫu có sự khác nhau.
3.1.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S.
aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái
Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc
Bảng 3.2. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp.
và S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của
tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc
Listeria

Salmonella
spp.

S. aureus

Địa điểm

Số
mẫu
xét

nghiệ
m

Thái Nguyên

105

9

8,57

12

11,43

79

75,24

Bắc Giang

89

16

17,98

11

12,36

74

83,15

Hà Tây

88

12

13,64

9

10,23

67

76,1
4

Vĩnh Phúc

76

10

13,16

9

11,84

55

72,37

Tính chung

358

47

13,13

41

11,45

275

76,82

Số
Số
mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ
dươn (%) dương (%)
g tính
tính

Số
mẫu Tỷ lệ
dươn (%)
g tính

Kết quả bảng 3.2 cho thấy: các mẫu thịt lợn được bày bán có tỷ
lệ nhiễm Listeria chiếm 13,13 %. Salmonella spp. chiếm 11,45 % và
S. aureus chiếm 76,82 %.
3.2. Tỷ lệ nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn
bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà


11

Tây, Vĩnh Phúc
Các chủng vi khuẩn phân lập được tại 4 chợ Trung tâm của Thái
Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc được xác định tỷ lệ nhiễm
và ký hiệu lần lượt với Listeria từ L1 - L47 (13,13 %), Salmonella
spp. từ Sal1 - Sal41 (11,45 %) và S. aureus từ S1 - S275 (76,82 %).
3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella
spp., S. aureus nhiễm trên thịt lợn bán tại các chợ
3.3.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes
nhiễm trên thịt lợn
Tỷ lệ mẫu thịt lấy tại các chợ nhiễm L. monocytogenes chiếm từ
8,57 % đến 17,98 %. Có từ 4,76 % đến 12,36 % mẫu không đạt
TCVN. Mức nhiễm cao nhất từ 1,36 x 10 5 CFU/g - 4,91 x 105 CFU/g;
mức thấp nhất từ 2,73 x 104 CFU/g - 7,27 x 104 CFU/g.
3.3.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp.
nhiễm trên thịt lợn

Trong tổng số 358 mẫu thịt kiểm tra có 41 mẫu nhiễm
Salmonella spp. chiếm 11,45 %. Trong đó, tại Thái Nguyên: mẫu thịt
nhiễm Salmonella spp. không đạt TCVN chiếm 11,43 %; tại Vĩnh
Phúc là 11,84 %; Bắc Giang là 12,36% và Hà Tây là 10,23 %.
3.3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm
trên thịt lợn
Các mẫu thịt có tỷ lệ nhiễm S. aureus chiếm từ 72,37 % đến
83,15 %. Có từ 34,21 % đến 47,19 % mẫu thịt bị nhiễm S. aureus
không đạt TCVN. Mức nhiễm cao nhất từ 3,76 x 106 CFU/g - 5,31 x
106 CFU/g; mức thấp nhất từ 1,05 x 106 CFU/g - 1,18 x 106 CFU/g.
3.4. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp.,
S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu sau bán hàng


12

3.4.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes trên thịt lợn
theo thời gian lấy mẫu
Tỷ lệ mẫu thịt lợn nhiễm L. monocytogenes vào các thời điểm lấy
mẫu trong ngày có sự khác nhau khá rõ rệt, tỷ lệ thịt lợn nhiễm L.
monocytogenes cao nhất vào 4 - 5 giờ chiều (7,54 %), sau đó là thời
điểm 10 - 11 giờ trưa (4,19 %) và thấp nhất là 6 - 7 giờ sáng (1,40 %).
3.4.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt
lợn theo thời gian lấy mẫu
Các mẫu thịt được lấy vào buổi sáng sớm (6 - 7 giờ sáng) tại
các chợ phát hiện có 4/358 mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella spp.
chiếm tỷ lệ 1,12 %. Thời điểm 10 - 11 giờ trưa tỷ lệ mẫu thịt nhiễm
Salmonella spp. tăng lên là 3,63 %. Đến cuối buổi chiều, (khoảng 4
- 5 giờ chiều) tỷ lệ nhiễm lên tới 6,70 %.
3.4.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo

thời gian lấy mẫu
Sau bán hàng từ 1 - 2 giờ (6 - 7 giờ sáng) các mẫu thịt thu thập từ
các chợ phát hiện có 18/358 mẫu nhiễm vi khuẩn S. aureus chiếm tỷ
lệ 5,03 %. Khoảng 10 - 11 giờ trưa tỷ lệ mẫu thịt nhiễm S. aureus
tăng lên là 28,49 %. Đến cuối buổi chiều (khoảng 4 - 5 giờ) tỷ lệ
nhiễm lên tới 43,30 %.
3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes,
Salmonella spp., S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo mùa
3.5.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L.
monocytogenes, trên thịt lợn theo mùa
Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes vào mùa Hè có
18/101 mẫu kiểm tra chiếm 17,82 % là cao nhất với cường độ nhiễm
trung bình ở các mẫu không đạt TCVN là 1,80 x 10 5 CFU/g; sau đó
đến mùa Xuân là 12/80 mẫu kiểm tra chiếm 15,00 % với cường độ
nhiễm trung bình ở các mẫu không đạt TCVN là 1,07 x 10 5 CFU/g.


13

Mùa Thu và mùa Đông có tỷ lệ thịt lợn nhiễm L. monocytogenes
thấp hơn mùa Hè và mùa Xuân, tỷ lệ dao động từ 9,09 % đến 10,26
% với cường độ nhiễm trung bình ở các mẫu không đạt TCVN là
1,07 x 105 CFU/g.
3.5.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trên
thịt lợn theo mùa
Đã phát hiện có 19/101 mẫu thịt nhiễm vi khuẩn Salmonella spp.
vào mùa Hè chiếm 18,81 %; 8/99 mẫu nhiễm vào mùa Xuân chiếm
10,00 %. Và đây cũng là hai mùa có tỷ lệ thịt nhiễm vi khuẩn
Salmonella spp. cao hơn so với mùa Đông (7,69 %) và mùa Thu
(8,08 %). Tất cả các mẫu dương tính với Salmonella spp. này đều

không đạt TCVN.
3.5.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S.
aureus trên thịt lợn theo mùa
Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn S. aureus vào mùa Hè là 96/101 mẫu
kiểm tra chiếm 95,05 % cao nhất, mùa Xuân là 65/80 mẫu kiểm tra
chiếm 81,25 %. Mùa Thu và mùa Đông có tỷ lệ thịt lợn nhiễm S.
aureus thấp hơn mùa Hè và mùa Xuân, tỷ lệ dao động từ 53,85 % đến
72,73 %. Số mẫu không đạt TCVN mùa Hè là 65,63 %; mùa Xuân là
55,38 %; mùa Thu là 44,44 % và mùa Đông là 40,48 %.
3.6. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn
L. monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được
3.6.1. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi
khuẩn L. monocytogenes phân lập được
Các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được bắt màu
Gram (+) và có tính di động, dương tính với phản ứng rhamnose,
xylose và catalase (100 %); âm tính với phản ứng oxidase và không
có khả năng lên men mannitol. 89,36 % số chủng L. monocytogenes
dương tính gây dung huyết (β - hemolysis).


14

3.6.2. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi
khuẩn Salmonella spp. phân lập được
Các chủng vi khuẩn Salmonella spp. đều là vi khuẩn Gram (-),
có khả năng lên men glucose, manitol, phản ứng catalase và sản sinh
H2S (100 %). Các chủng vi khuẩn này đều không dung huyết, không
lên men lactose. Có 34/41 chủng có khả năng di động (82,93 %), còn
7/41 chủng không có khả năng di động (17,07 %) chứng tỏ là
Salmonella pollorum hoặc Salmonella gallinarum.

3.6.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi
khuẩn S. aureus phân lập được
Các chủng S. aureus phân lập được có đặc tính sinh học điển hình
của giống như mô tả trong các tài liệu kinh điển; bắt màu tím của
thuốc nhuộm Gram (+), có phản ứng lên men catalase dương tính, lên
men sucrose dương tính, phản ứng sản sinh coagulase làm đông tụ
huyết tương, hoàn nguyên nitrate thành nitrit (100 %); không lên men
gatactose và không có khả năng di động. Phần lớn các chủng S.
aureus này có khả năng dung huyết (255/275 chủng) chiếm 92,73 %.
3.7. Thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes,
Salmonella spp. và S. aureus phân lập được trên chuột thí
nghiệm
3.7.1. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn L.
monocytogenes phân lập được trên chuột thí nghiệm
Có tới 100 % số chuột được tiêm canh khuẩn L. monocytogenes
qua phúc xoang đều chết trong khoảng thời gian từ 8 - 72 giờ. Từ 8 24 giờ có 12/47 chủng và 25 - 72 giờ có 16/47 chủng gây chết 100 %
chuột thí nghiệm. Tổng các chủng L. monocytogenes đem thử độc
lực gây chết 89,36 % chuột thí nghiệm. Chuột chết được mổ khám để
kiểm tra bệnh tích đồng thời tiến hành phân lập lại vi khuẩn từ máu
tim đều cho kết quả dương tính 100 %.


15

3.7.2. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp.
phân lập được trên chuột thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập đã xác định được
độc lực qua khả năng gây chết chuột thí nghiệm. Có 26 chủng gây chết
cả 100 % chuột thí nghiệm. Trong đó, có 15 chủng gây chết 100 %
chuột gây nhiễm trong vòng 8 - 24 giờ, Các chủng còn lại gây chết

chuột từ 25 - 72 giờ. Có tới 92,68 % chuột thí nghiệm đem thử độc lực
với các chủng Salmonella spp. phân lập được đã chết. Điều này chứng
tỏ, độc lực của các chủng Salmonella spp. phân lập được là rất mạnh.
3.7.3. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn S. aureus phân
lập được trên chuột thí nghiệm
Sau 48 giờ tiêm canh khuẩn, các chủng vi khuẩn S. aureus đã
gây chết tới 100 % chuột thí nghiệm thể hiện độc lực mạnh. Trong
khoảng từ 8 - 24 giờ đã có 53 chủng gây chết 100 % chuột, đến 48
giờ có tổng 117 chủng gây chết 100% chuột thí nghiệm. Đây là cơ sở
để xác định độc tố đường ruột của S. aureus bằng phương pháp giải
trình tự gene mã hoá cho protein độc tố đường ruột nhóm B (seb) của
các chủng S. aureus có độc lực mạnh trên chuột thí nghiệm.
3.8. Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng L.
monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được
3.8.1. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các
chủng L. monocytogenes phân lập được
Các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được có 47/47
chủng rất mẫn cảm với amoxicilline, erythrommycin, SMX/TMP
(100 %); 61,70 % số chủng mẫn cảm trung bình với streptomycin;
53,19 % mẫn cảm với norfloxacin và 38,30 % - 53,19 % chủng
kháng lại streptomycin, clindamycin và oxacill.


16

3.8.2. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các
chủng Salmonella spp. phân lập được
Các chủng Salmonella spp. mà chúng tôi phân lập và thử
nghiệm rất mẫn cảm với cephalexin, SMX/TMP, norfloxacin,
enrofloxacin tỷ lệ từ 56,10 % - 73,17 %. Các loại khác như:

erythromycin, spectinomycin, lincomycin thì mẫn cảm trung bình
với Salmonella spp. tỷ lệ từ 51,22 % - 58,54 %. Có một số chủng
Salmonella spp. kháng với clindamycin, erythromycin, lincomycin
(41,46 % - 56,10 %) và kháng rất cao với oxacill (68,29 %).
3.8.3. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng
sinh của các chủng S. aureus phân lập được
S. aureus rất mẫn cảm với SMX/TMP, doxycycline, cephalexin,
clindamycin và norfloxacin tỷ lệ từ 50,18 % - 87,64 %. Mẫn cảm
trung bình với spectinomycin, penicillin, neomicin (52,36 % - 74,55
%). Tuy nhiên, S. aureus lại kháng khá mạnh với oxacill (51,64 %).
3.9. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi
khuẩn Salmonella và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán
trong da thỏ”
Bảng 3.24. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn
Salmonella spp. bằng “Phản ứng khuếch tán trong da
thỏ”
Đợt thử
Đợt 1
Đợt 2
Đợt 3
Tính chung

Số
chủng
thử
8
10
8
26

Số chủng
Tỷ lệ
sản sinh
(%)
độc tố
3 37,50
6 60,00
4 50,00
13 50,00

Số chủng
Tỷ lệ
không sản
(%)
sinh độc tố
5
62,50
4
40,00
4
50,00
13 50,00

Đã tiến hành thực hiện “phản ứng khuếch tán trong da thỏ” và


17

phát hiện 50,00 % chủng vi khuẩn Salmonella spp. sản sinh độc tố và
50,00 % chủng không sản sinh độc tố. Sau đó, sử dụng các chủng sản

sinh độc tố này để xác định serovar và tách chiết AND.
Bảng 3.25. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn S.
aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”
Đợt thử
Đợt 1
Đợt 2
Đợt 3
Tính chung

Số
chủng
thử
33
46
38
117

Số chủng
Tỷ lệ
sản sinh
(%)
độc tố
14 42,42
23 50,00
17 44,74
54 46,15

Số chủng
Tỷ lệ
không sản

(%)
sinh độc tố
19 57,58
23 50,00
21 55,26
63 53,85

Tương tự như đối với vi khuẩn Salmonella spp., chúng tôi cũng
đã phát hiện 46,15 % chủng vi khuẩn S. aureus sản sinh độc tố và
53,85 % chủng không sản sinh độc tố.
3.10. Kết quả xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân
lập được bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến
kính theo sơ đồ của Kauffmann - White
Bảng 3.26. Kết quả xác định serovar của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp. phân lập được bằng type kháng thể
chuẩn
STT Ký hiệu mẫu

O

H1

H2

Serovar

1

Sal 1

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

2

Sal 2

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

3

Sal 3

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

4

Sal 4

A3, 10, 15

Cr

Z6

Weltevreden

5

Sal 5

A4

Ai

1, 2

Typhimurium


18

6

Sal 12

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

7

Sal 17

O3, 10

e, h

1, 6

Anatum

8

Sa 24

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

9

Sal 28

O3, 10

e, h

1, 6

Anatum

10

Sal 35

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

11

Sal 36

A4

Ai

1, 2

Typhimurium

12

Sal 38

O3, 10

e, h

1, 6

Anatum

13

Sal 40

A3, 10, 15

Cr

Z6

Weltevreden

Kết quả thu được từ bảng 3.26 cho thấy: Có 13 chủng Salmonella
spp. đều cho phản ứng dương tính, định loại được 3 serovar khác nhau
trong đó, có 8 mẫu là chủng Salmonella typhimurium (61,53 %); 3
mẫu là chủng Salmonella anatum (23,08 %) và 2 mẫu là chủng
Salmonella weltevreden (15,38 %).
3.11. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của
chủng Salmonella spp. và S. aureus phân lập được
3.11.1. Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn
Salmonella spp.
13 chủng vi khuẩn được điện di, có 6 chủng cho thấy ADN mang
gene mã hóa sản sinh độc tố ruột đều rõ nét, không có vạch phụ kèm
theo. 6 chủng nói trên, chạy PCR cho kết quả đều đặc hiệu và không
có vạch phụ kèm theo, kích thước khoảng 259 bp đúng theo tính toán
lý thuyết. Các sản phẩm PCR này đã được làm sạch và xác định trình
tự, kết qủa cho thấy phù hợp với các gene sinh độc tố đường ruột của
Salmonella spp. đã được công bố trên ngân hàng gene Quốc tế.


19

3.11.2. Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin nhóm B của
vi khuẩn S. aureus
Đoạn gen (seb) mã hoá cho độc tố đường ruột của 3 chủng vi
khuẩn được khuếch đại bằng phương pháp PCR. Các sản phẩm sau
đó được kiểm tra điện di trên gel agarose cho thấy các băng đều đặc

hiệu, rõ và không có vạch phụ đi kèm, có kích thước khoảng 534 bp,
đúng theo lý thuyết.
* Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR cho thấy đoạn ADN có kích
thước khoảng 534 bp đúng theo lý thuyết khi thiết kế này đã đáp ứng
được cho phản ứng gắn gene seb vào vector tách dòng pTZ57R/T.
* Phân lập gene wtSEB vào vector đọc trình tự và
vector biểu hiện
Kết quả giải trình tự gene seb trong vector tách dòng pJET1.2
cho thấy, gene seb chứa khoảng 534 nucleotide và tương đồng 100 %
so với gene seb mã số AB716349.1, DQ997828.1, AM158256.1,
AY196689.1 trên ngân hàng gene Quốc tế; tương đồng 99 % so với
gene seb mã số AB860415.1, CP007499.1 và nhiều mã số khác trên
ngân hàng gene Quốc tế.
* Kết quả xác định trình tự gene seb trong vector pJET1.2
Tiến hành giải trình tự gene seb trong vector pJET1.2. Đoạn
gene seb của chủng S. aureus nghiên cứu đã được xác định trình tự
nucleotide trên máy đọc tự động ABI PRISMR 3100 Avant Genetic
Analyzer. Sau khi có trình tự, đã tiến hành so sánh mức độ tương
đồng của gene seb ở chủng S. aureus nghiên cứu với những kết quả
đã công bố trên ngân hàng gene thế giới (NCBI).
Kết quả đọc trình tự được trình bày ở hình 3.7 như sau:


20

ccagatgagt tgcacaaagc gagtaaattc actggtttga tggaaaatat gaaagttttg
1
tatgatgata

atcatgtatc

agcaataaac gttaaatcta

tagatcaatt tctatacttt

gacttaatat

attctattaa

ggacactaag ttagggaatt atgataatgt tcgagtcgaa

tttaaaaaca

aagatttagc

tgataaatac aaagataaat acgtagatgt gtttggagct

aattattact

atcaatgtta

tttttctaaa

61
12
1
18
1
24

aaaacgaatg atattaattc

acatcaaact

1
30

gacaaacgaa aaacttgtat

gtatggtggt gtaactgagc ataatggaaa ccaattagat

aaatatagaa gtattactgt

tcgggtattt

1
36

gaagatggta aaaatttatt

atcttttgac

1
42

gtacaaacta ataagaaaaa agtgactgct caagaattag attacctaac tcgtcactat

1
48

ttggtgaaaa ataaaaaact ctatgaattt

aacaactcgc cttatgaaac ggga

1
Hình 3.7: Trình tự gene seb 534 của chủng S. aureus

Bảng 3.29: Độ tương đồng của gene seb ở chủng S. aureus nghiên
cứu với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gene thế
giới (NCBI)
TT Tên trình tự gene tương đồng với gene seb

Mã số trên

Tỉ lệ


21

NCBI

tương
đồng

1

S. aureus DNA, pathogenicity island, strain:
IVM10

AB716349.1

100 %

2

S. aureus strain F136 enterotoxin B precursor
(seb) gene, partial cds

DQ997828.1

100 %

3

S. aureus partial seb gene for staphylococcal
enterotoxin B precursor (SEB)

AM158256.1

100 %

4

S. aureus strain 339E enterotoxin seb variant
gene, partial cds

AY196689.1

100 %

S. aureus DNA, pathogenicity island
5 SaPITokyo12413, complete sequence, strain:
Tokyo12413

AB860415.1

99 %

CP007499.1

99 %

6

S.aureus strain 2395 USA500, complete
genome

Từ bảng 3.29, kết quả thu được cho thấy: Mức độ tương đồng của
gene seb nhân từ chủng S. aureus có mức tương đồng cao từ 99 % 100 % so với một số chủng đã được công bố trên ngân hàng gene thế
giới (NCBI).
* Thiết kế vector biểu hiện
Dòng tế bào tái tổ hợp mang gene seb tổng hợp một protein
ngoại lai có khối lượng đúng theo tính toán lý thuyết. Chúng tôi tiến
hành biểu hiện wtSEB ở các điều kiện khác nhau về nhiệt độ, nồng
độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu để cải thiện được tính tan
của wtSEB và thu được lượng protein wtSEB tốt nhất.