Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
---------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM
THUỐC TIÊM
LIPOSOME DOXORUBICIN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
----------------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM
THUỐC TIÊM
LIPOSOME DOXORUBICIN
Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
Mã số

: 62 72 04 02
LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ
2.PGS.TS.Nguyễn Minh Chính
HÀ NỘI - NĂM 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả

Khánh Thị Nhi


LỜI CÁM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ tận tình của các Thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp và những
người thân trong gia đình.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới:

PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ
PGS. TS. Nguyễn Minh Chính
Những người Thầy đã tận tình trang bị cho tôi kiến thức quý báu trong chuyên
môn, nghề nghiệp cũng như trong nghiên cứu khoa học. Các Thầy đã luôn bên tôi,
động viên tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn chân thành tới: Ban Giám

đốc, phòng Sau đại học, các Thầy Cô Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Bộ
môn Sinh Lý Bệnh, Bộ môn Dược Lý - Học viện Quân Y đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trinh học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Bào chế Trường đại
học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện vệ sinh dịch tễ Trung
ương đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin được gửi lời cám ơn chân thành tới Trung tâm Y Tế Hoài Đức Hà Nội,
sở Y tế Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án.
Ngày

tháng

năm 2017

Khánh Thị Nhi


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Ký hiệu viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1..........................................................................................................3
TỔNG QUAN..................................................................................................3
1.1. Đại cương về doxorubicin.......................................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hóa lý...............................................................................................................3

1.1.2. Độ ổn định.......................................................................................................................4
1.1.3. Cơ chế tác dụng...............................................................................................................6
1.1.4. Các dạng bào chế của doxorubicin...................................................................................6
1.1.5. Dược động học................................................................................................................8
1.1.6. Chỉ định............................................................................................................................9
1.1.7. Độc tính.........................................................................................................................10
1.1.8. Liều lượng......................................................................................................................11
1.2. Đại cương về liposome doxorubcin......................................................................................12
1.2.1. Khái niệm.......................................................................................................................12
1.2.2. Phân loại liposome.........................................................................................................13
1.2.3. Ưu, nhược điểm của liposome.......................................................................................15
1.2.4. Nguyên liệu bào chế liposome.......................................................................................16
1.2.5. Phương pháp bào chế liposome....................................................................................18


1.2.6. Đánh giá liposome.........................................................................................................21
1.3. Các nghiên cứu về liposome doxorubicin..............................................................................25
1.3.1. Nghiên cứu bào chế.......................................................................................................25
1.3.2. Đánh giá tác dụng invivo................................................................................................33

Chương 2........................................................................................................38
NGUYÊN VẬT LIỆU,THIẾT BỊ,ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU...............................................................................................38
2.1. Nguyên vật liệu.....................................................................................................................38
2.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.............................................................................................39
2.3. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................................................40
2.4. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................................40
2.4.1. Phương pháp bào chế....................................................................................................40
2.4.2. Phương pháp đánh giá các đặc tính liposome doxorubicin............................................45
2.4.3. Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin...........................51

2.4.4. Phương pháp đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin trên khối u động vật.........51
2.5. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................................................55
2.6. Điều kiện thí nghiệm.............................................................................................................55
2.7. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................................................55

Chương 3........................................................................................................56
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................56
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin..................................................................56
3.1.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS.................................................................56
3.1.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.........................................................................59
3.2. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin.............................................................63
3.2.1. Bố trí thí nghiệm............................................................................................................63
3.3. Xây dựng qui trình bào chế liposome doxorubicin................................................................74
3.3.1. Bào chế liposome chưa mang dược chất.......................................................................74
3.4. Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin............................................................................90
3.5. Đề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin...............93


3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn.........................................................................................................94
3.5.2. Đánh giá độ ổn định.......................................................................................................95
3.6. Đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u động vật thực nghiệm
...................................................................................................................................................100
3.6.1. Đánh giá trên chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180.................................100
3.6.2. Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bào ung thư tiền liệt
tuyến.....................................................................................................................................106

Chương 4......................................................................................................109
BÀN LUẬN.................................................................................................109
4.1. Phương pháp bào chế liposome.........................................................................................109
4.1.1. Bào chế liposome chưa mang dược chất.....................................................................109

4.1.2. Giảm và đồng nhất kích thước liposome.....................................................................110
4.1.3. Đưa dược chất vào liposome.......................................................................................113
4.2. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin...........................................................117
4.2.1. Tỷ lệ các lipid................................................................................................................117
4.2.2. Tỷ lệ lipid/ doxorubicin.................................................................................................118
4.3. Phương pháp đánh giá liposome........................................................................................121
4.3.1. Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất.........................................................121
4.3.2. Phương pháp đánh giá phân bố kích thước tiểu phân.................................................122
4.3.3. Phương pháp đánh giá hình thái cấu trúc....................................................................122
4.3.4. Đánh giá giải phóng dược chất từ liposome................................................................123
4.3.5. Độ ổn định liposome....................................................................................................124
4.3.6. Về đánh giá tác dụng trên khối u.................................................................................125
KẾT LUẬN...................................................................................................................................129
ĐỀ XUẤT.....................................................................................................................................130

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN...................................................................131
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................132


PHỤ LỤC.....................................................................................................151
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
1

Viết tắt
ADN

Từ/cụm từ đầy đủ
Acid Deoxyribonucleic

2

ARN

Acid ribonucleic

3

BP

Bristish Pharmacopoeia ( Dược điển Anh)

4

CHF

Congestive heart failure (Suy tim sung huyết )

5

CHL

Cholesterol


TT

6

Viết tắt
CS

Từ/cụm từ đầy đủ
Cộng sự

7

DC

Dược chất

8

ĐCSH

Đối chứng sinh học

9

ĐCUT

Đối chứng ung thư

10

DĐVN

Dược điển Việt Nam

11

DOPE

Dioleoylphosphatidyl ethanolamin

12

DDAB

Dimethyldioctadecylammonium bromid

13

DOX

Doxorubicin hydroclorid

14

DPPC

Dipalmitoylphosphatidylcholin

15

DPPE

1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin

16

DPPS

1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin

17

DSPA

1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid

18

DSPC

Distearoyl phosphatidylcholin

19

DSPE

Distearoyl phosphatidylethanolamin

20

DSPE–PEG

Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol

21

DSPG

Distearoyl Phosphatidyl glycerol

22

EPC

Egg-derived phosphatidylcholin

23

EPG

Egg-derived phosphatidylglycerol

24

EurPh

European Pharmacopoeia ( Dược điển Châu Âu)

25

FDA

Food and Drug Administration ( Cục Quản Lý Thực
Phẩm và Dược Phẩm Hoa Kỳ)

26

HEPES

N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid

27

HER2 /neu

Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
(Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì)

28

HPC

Hydrogenated phosphatidylcholin

29

HPI

Hydrogenated phosphatidylinositol


TT

30

Viết tắt
HPLC

Từ/cụm từ đầy đủ
High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng
hiệu năng cao)

31

KHV

Kính hiển vi

32

KTTP

Kích thước tiểu phân

33

LUV

Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn)

34

LVEF

Left ventricular ejection fraction (Thể tích tống máu
thất trái)

35

MLV

Multilamellar vesicle (Liposome nhiều lớp đồng trục )

36

MVV

Multivesicular (Liposome kép )

37

NĐ

Nồng độ

38

NST

Nhiễm sắc thể

39

PC

Phosphatidyl cholin

40

PDI

polydispersity index (Chỉ số đa phân tán)

41

PEG

Polyethylenglycol

42

PI

Phosphatidyl inositol

43

PTFE

Polytetrafluoroethylene Teflon

44

RSD

Relative Standard deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối)

45

SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn )

46

SPC

Soy phospatidyl cholin (Phosphatidyl cholin dầu đậu
tương )

47

SUV

Small unilamellar vesicle (Liposome đơn lớp nhỏ)

48

TB

Trung bình

49

TBUT

Tế bào ung thư

50

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

51

TEM

Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử
truyền qua)


TT
52

Viết tắt
TKHH

Từ/cụm từ đầy đủ
Tinh khiết hóa học

53

Tf

Nhiệt chảy hoàn toàn

54

Tm

melting temperature (Nhiệt chảy lỏng)

55

USP

United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ )

56

µ

Cường độ ion

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Một số phương pháp định lượng doxorubicin

4

1.2

Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường

7

1.3

Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp

14

1.4

Mốt số đặc tính của phospholipid dùng bào chế liposome

17


Bảng

Tên bảng

Trang

1.5

Tổng hợp một số nghiên cứu về liposome tuần hoàn lâu trong
máu và hướng đích

29

2.1

Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu

38

3.1

Mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng
482 nm có và không có tá dược

58

3.2

Mối tương quan giữa mật độ quang ở các bước sóng và các
pH khác nhau với nồng độ doxorubicin

59

3.3

Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng

đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

60

3.4

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

61

3.5

Độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng HPLC

62

3.6

Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

62

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng

63

3.8

Các công thức bào chế liposome doxorubicin

65

3.9

Hàm lượng và hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome

66

3.10

Tỷ lệ giải phóng dược chất từ các mẫu liposome DOX (pH
7,4)

67

3.11

Tỷ lệ giải phóng dược chất của các mẫu liposome DOX (pH
5,5)

68

3.12

Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu

69

3.13

Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu sau 4 tuần
bảo quản

72

3.14

Hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 4 tuần và mới bào


Bảng

Tên bảng

Trang

chế

73

3.15

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần
bảo quản tại pH 7.4

74

3.16

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần
bảo quản tại pH 5,5

75

3.17

Phân bố kích thước hệ liposome ở các điều kiện siêu âm khác
nhau

78

3.18

Phân bố kích thước hệ liposome khi siêu âm thể tích nhỏ ( 10
ml)

79

3.19

Các qui trính nén /đẩy qua màng

82

3.20

Sự phân bố KTTP phụ thuộc vào qui trình nén/đẩyqua màng

83

3.21

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ ở 50⁰C

85

3.22

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ trong 30 phút

87

3.23

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp thẩm
tích 3 lần đệm HEPES

88

3.24

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo số lần đổi đệm tiếp
tuyến

89

3.25

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp đổi
đệm bằng lọc tiếp tuyến

90

3.26

KTTP liposome trước và sau khi gắn doxorubicin

91

3.27

Thời gian hòa tan DOX và hiệu xuất liposome hóa khi sử
dụng dược chất đông khô

94

3.28

So sánh các chỉ tiêu chất lượng giữa liposome dox bào chế
với chế phẩm Lipodox

96


Bảng

Tên bảng

Trang

3.29

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm
liposome doxorubicin ở điều kiện dài hạn

99

3.30

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm
liposome doxorubicin ở điều kiện phòng thí nghiệm

101

3.31

Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày

103

3.32

Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

104

3.33

Khối lượng u dưới da của chuột sau 30 ngày

105

3.34

Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

106

3.35

Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày

107

3.36

Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày

108

3.37

Kích thước khối u UTTTL người ở các nhóm

110

4.1

Các hệ đệm được sử dụng để bào chế hỗn dịch liposome
DOX

123

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid

5

1.2

Cấu tạo vỏ liposome

13

1.3

Các loại liposome

14

Hình

Tên hình

Trang

2.1

Cơ chế đổi đệm của hệ lọc tiếp tuyến

43

2.2

Cơ chế đổi đệm của phương pháp thẩm tích

43

2.3

Mô tả quá trình thẩm tích để tách doxorubicin tự do trong
mẫu liposome

49

3.1

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang ở các
bước sóng và các pH khác nhau với nồng độ doxorubicin

59

3.2

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

61

3.3

Đồ thị biểu diễn các chỉ số PDI và Z-average hệ liposome của
các mẫu

70

3.4

Hình ảnh chụp TEM của liposome doxorubicin bào chế theo
công thức A3.2

71

3.5

Đồ thị so sánh các chỉ số PDI và Z-average của các mẫu
liposome sau 4 tuần và mới bào chế

73

3.6

Hình ảnh chụp bề mặt soi âm bản của mẫu liposome sau siêu
âm

81

3.7

Hình ảnh chụp cắt ngang của mẫu liposome sau siêu âm

82

3.8

Hình ảnh chụp TEM của liposome khi sử dụng các phương
pháp giảm KTTP khác nhau

84

3.9

Sơ đồ bào chế lọ chứa bột doxorubicin đông khô

93

3.10 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của qui trình bào chế thuốc tiêm
liposome doxorubicin

95

3.11 Tỷ lệ chuột mang khối u dưới da sống sót sau 30 ngày

103

3.12 Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

104

3.13

105

Khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày


Hình

Tên hình

Trang

3.14 Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

106

3.15 Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày

107

3.16 Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày

108

3.17 Diễn biến kích thước khối u trên chuột

110

3.18 Trọng lượng chuột ở các nhóm điều trị

111

4.1

Cơ chế tăng thấm thuốc từ tuần hoàn vào vùng u

114

4.2

Cơ chế đưa doxorubicin hydroclorid vào trong liposome bằng

117

pH-gradient


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ những năm 50 của thế kỷ XX, doxorubicin (DOX) đã được phát hiện,
phân lập từ chủng vi khuẩn Streptomyces peucetius var. caesius và được ứng
dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư. Hiện nay, doxorubicin có thể
được bán tổng hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên,
cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóa
khác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độc
tính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và
có thể dẫn đến tử vong. Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị
bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại
các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành.
Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển
trong bào chế hiện đại là dạng thuốc liposome. Đây là dạng thuốc có nhiều ưu
điểm trong quá trình vận chuyển, phân bố, kiểm soát giải phóng và tăng sinh
khả dụng của dạng thuốc. Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điều
trị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc và
hạn chế thuốc đến các mô lành. Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trên
thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng
dụng trong lâm sàng như các biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox,…[41] với
nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính.
Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa
có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Hiện nay, dạng bào chế liposome
đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy
nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế
hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam.


2

Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác
dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến

hành với 2 mục tiêu:
1. Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô
phòng thí nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá được độ ổn định
của chế phẩm.
2. Đánh giá được tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên
khối u chuột thực nghiệm.
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu
sau:
1. Nghiên cứu xây dựng công thức và qui trình bào chế liposome
doxorubicin bằng phương pháp hydrat hóa film.
2. Đánh giá được các đặc tính của liposome doxorubicin để tiêu chuẩn
hóa liposome doxorubicin và thuốc tiêm liposome doxorubicin.
3. Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml.
4. So sánh hiệu quả kháng u của thuốc tiêm doxorubicin bào chế được
và thuốc đối chiếu trên động vật thực nghiệm.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về doxorubicin
Công thức cấu tạo:
- Công thức phân tử:
C27H29NO11.HClKhối lượng phân tử:
579,99

Tên khoa học: (8S,10S)-10-{(3-Amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexo
pyranosyl)

oxy}-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)

-1-methoxy-5,12-naphthacen-dion[133].
1.1.1. Đặc điểm hóa lý
Tính chất: Ở điều kiện thường doxorubicin hydroclorid tồn tại dưới
dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Điểm nóng
chảy 230oC. Dung dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5. Hằng số phân ly pKa 1 = 7,34
(phenol); pKa2 = 8,46 (amin); pKa3 = 9,46 (ester). Tan trong nước (50 mg/ml
ở 25oC), methanol, acetonitril, tetrahydrofuran. Không tan trong cloroform,
aceton, ethyl ether, benzene, ether dầu hỏa [133]. Trong methanol hấp thụ ở
bước sóng 233, 252, 288, 479, 496, 529 nm. Dung dịch nước có màu vàng
cam với pH acid, màu đỏ da cam tại môi trường trung tính, và màu tím màu
xanh ở pH > 9. Với các đặc tính trên, có thể áp dụng định lượng doxorubicin
bằng phương pháp quang phổ UV-vis hoặc HPLC với detector tử ngoại hoặc
huỳnh quang [131] (bảng 1.1).


4

Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng doxorubicin
Phương pháp

Áp dụng

Tài liệu

định lượng
tham khảo
Đo quang ở bước sóng Đánh giá giải phóng dược chất từ [15],[79],[133].
234, 282, 285.

HPLC, detector tử

các hệ mang thuốc.
Định lượng dược chất trong một số [14],[22], [131]

ngoại

dạng bào chế: thuốc tiêm dung dịch,

bột đông khô, liposome.
HPLC, detector huỳnh Định lượng dược chất tại khối u, tại [16],[144]
quang

các tổ chức.

1.1.2. Độ ổn định
Ảnh hưởng của pH:
Doxorubicin có khả năng biến đổi thành các dẫn chất: doxorubicinon; 9carboxydoxorubicin; 7,8 ,10,9 ,dehydrodoxorubicinon; 7,8- dehydro-desacetyl
- daunorubicinon do các tác nhân: acid mạnh, ion kim loại, kiềm.
Ở pH 9,0 và 10,0 DOX bị phân hủy nhanh chóng. Sự phân hủy có thể
quan sát trực tiếp bằng mắt thường thông qua sự thay đổi màu sắc dung dịch
từ màu đỏ đến màu xanh-tím và cuối cùng là phân hủy hoàn toàn [34] .Công
thức của doxorubicin có nhóm NH 2 có khả năng bị proton hóa và 2 nhóm OH
có khả năng tách proton. Do đó trong dung dịch, doxorubicin có thể tồn tại ở
các dạng: phân tử trung hòa, ion lưỡng cực, anion và cation.
So sánh với các glycoside khác, ví dụ ginsenosid, trong công thức thiếu
một nhóm chức amin so với doxorubicin, cho thấy rằng doxorubicin ổn định
hơn trong dung dịch acid. Dược chất tương đối ổn định trong môi trường pH
< 4. Doxorubicin hydrochlorid bền trong dung dịch có pH gần 4,0. Trong
môi trường acid với pH trên 4, DOX có thể bị phân hủy như sau:[133]

5

Hình 1.1. Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid
*Nguồn: Theo Dominique M.M. (1986)[34]

Các chế phẩm dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền trên thị
trường đều có pH 3,0-4,0; sử dụng acid hydrocloric để điều chỉnh pH.
Ảnh hưởng của nồng độ ion:
Sự ảnh hưởng của nồng độ ion tới tốc độ phân hủy DOX đã được
nghiên cứu. Dung dịch dược chất được điều chỉnh ở pH không đổi (1,25) và
thay đổi nồng độ ion bằng cách thêm natri clorid. Độ ổn định của dược chất tỷ
lệ căn bậc hai của cường độ ion (µ) trong khảng 0,14 <(µ) 1/2<0,75. Tại (µ)1/2>
0,75 tốc độ phản ứng phân hủy dược chất tăng cùng với tỷ lệ trao đổi ion
doxorubicin và proton H+[21],[23].
Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Doxorubicin không bền dưới tác động của nhiệt độ. Chế phẩm thông
thường được bảo quản tại nhiệt độ 4ºC. Các nghiên cứu đánh giá sự ổn định
của DOX trong huyết tương cũng cho thấy tại nhiệt độ 39ºC, DOX nhanh
chóng bị phân hủy thành các hợp chất không phân cực (DOX-ONE và DOXOL); quá trình diễn ra chậm hơn tại nhiệt độ 23ºC và tương đối ổn định tại
4ºC [34].
Bảo quản:
Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp. Dược chất
doxorubicin hydroclorid thường bảo quản dưới 25oC, tránh ánh sáng. Các chế


6

phẩm như dung dịch, hỗn dịch liposome được bảo quản tránh ánh sáng, để ở

nhiệt độ khoảng từ 2- 8oC, bột đông khô pha dung dịch tiêm bảo quản không
quá 30oC, tránh ánh sáng [3], [133].
1.1.3. Cơ chế tác dụng
Cơ chế tác dụng chính xác của doxorubicin còn chưa được biết rõ hoàn
toàn, tuy nhiên người ta cho rằng nó có khả năng chen vào giữa các cặp ADN,
do đó làm ngăn cản quá trình tổng hợp ADN và loại ARN phụ thuộc ADN
làm rối loạn và phá vỡ cấu trúc. Viêc chen vào giữa chuỗi có thể làm đứt
mạch đơn hoặc mạch đôi cũng như làm thay đổi chromatid chị em. Sự chia
cắt của ADN bằng thuốc qua tác dụng của topoisomerase II hoặc bởi sự phát
sinh ion xúc tác của các gốc tự do, cả hydrogen peroxyd và hydroxyl, là
những tác nhân phá hủy tế bào. Doxorubicin cũng gây ra sự tạo phức
topoisomerase- ADN cùng hóa trị do đó ngăn cản phần hàn kín mạch của
phản ứng cắt hở- hàn kín mạch trong quá trình sao chép ADN. Mặc dù tác
dụng của nó qua chu trình tế bào, nhưng độc tính cao nhất xảy ra trong pha
tổng hợp ADN (pha S). Với nồng độ dược chất thấp, các tế bào qua được pha
S nhưng sẽ chết ở pha G2[17], [44], [45], [62], [112].
1.1.4. Các dạng bào chế của doxorubicin
Về mặt bào chế, có thể chia thành 2 dạng thuốc chứa doxorubicin để pha
dung dịch tiêm truyền trên thị trường. Một là dạng chứa doxorubicin
hydroclorid tự do, hai là hỗn dịch liposome. Với dạng chứa dược chất tự do,
phổ biến là dạng dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền, thường với
hàm lượng 2 mg/ml, đóng lọ với thể tích khác nhau. Một số nhà sản xuất lại
bào chế bột đông khô để pha dung dịch tiêm truyền nhằm tăng tuổi thọ cho
chế phẩm.
Các dạng bào chế chứa doxorubicin được tóm tắt ở bảng 1.2 [3],[17],
[118], [72].


7

Bảng 1.2. Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường
Phân loại

Dạng bào chế
Dung dịch đậm
đặc để pha
truyền tĩnh
mạch

Dạng bào
chế chứa
DOX tự
do

Hàm lượng
10mg/5ml
Adorucin
50mg/25ml
10mg/5ml
Adriamycin
50mg/25ml
Adriblastina 10mg, 50mg

Nước sản xuất
Korea United
Pharma (Hàn Quốc)

Adrim
50mg/25ml
Doxorubicin 10mg/5ml,

Ebewe
50mg/25ml

Dabur (Ấn Độ)
Ebewe Pharma
(Áo)
Pharmachemie
(Hà Lan)
David Bull Lab
Mayne Pharm (Úc)
Laboratorios IMA
(Achentina)
Bioprofarma
(Achentina)
Intas (Ấn Độ)

Doxorubicin 10mg, 50mg
Bột đông khô
pha dịch
truyền tĩnh
mạch

Lọ bột đông
khô pha hỗn
dịch tiêm
liposome qui
ước
Liposome

Biệt dược

Doxorubicin 10mg/5ml
DBL
50mg/25ml
Doxorubicin
10mg, 50mg
Servycal
Doxtie

10mg, 50 mg

Zodox

10mg, 50mg

Myocet

Caelyx
Hỗn dịch tiêm
chứa
PEGylated
liposome
doxorubicin
Hỗn dịch
liposome nhạy
cảm với nhiệt

Doxil
Lipodox

ThermoDox

50mg

20mg/10ml
50mg/30ml
20mg/10ml
50mg/30ml
20mg/10ml
30mg/15ml

Pfizer (Úc)
Pharmacia (Italia)

Cephalon (Anh, Tây
Ban Nha);
Sopherion (Mỹ)
Schering Plough
(Mỹ)
Sequus pharm.(Mỹ)
Biopharm
(Đài Loan)
Celsion
Corporation,
Lawrenceville, NJ


8

1.1.5. Dược động học

Doxorubicin hydroclorid không ổn định trong dạ dày và các nghiên cứu
trên động vật cho thấy thuốc hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa. Ngoài ra,
thuốc rất khó được phân bố tới các mô qua đường uống, do đó thuốc được bào
chế dạng tiêm truyền tĩnh mạch. Doxorubicin được chuyển hóa bởi enzym
aldoketoreductases-NADPH thành chất chuyển hóa ưa nước doxorubicinol
13-hydroxyl có tác dụng chống ung thư và là chất chuyển hóa chính. Những
reductases có mặt trong hầu hết các tế bào, đặc biệt là trong hồng cầu, gan và
thận. Chất chuyển hóa khác không có tác dụng điều trị bao gồm các aglycon ít
tan trong nước, như doxorubicinon (adriamycinon) và 7-deoxy-doxorubicinon
(17-deoxy-adriamycinon). Các enzyme reductase chuyển doxorubicin thành
7-deoxyaglycon làm tăng tác dụng gây độc tế bào của thuốc vì nó tạo ra các
gốc hydroxyl gây tổn thương tế bào [133].
Do sự khác biệt về mặt bào chế, các chế phẩm chứa doxorubicin khác
nhau khi sử dụng cho các thông số dược động học khác nhau [141].
Với dung dịch truyền tĩnh mạch, đồ thị nồng độ trong huyết tương không
xuất hiện ở 3 pha tương ứng với thời gian bán thải là 12 phút; 3,3 giờ và 33
giờ. Thời gian bán thải tương đối dài của doxorubicin phản ánh việc phân bố
vào các mô của dược chất. Chỉ khoảng 33-50% dạng chuyển hóa tìm thấy
trong nước tiểu, mật và phân sau 5 ngày truyền tĩnh mạch. Phần còn lại của
dược chất và các sản phẩm chuyển hóa vẫn còn nằm lại trong các mô tại các
tổ chức của cơ thể. Với bệnh nhân ung thư, doxorubicin làm giảm
adriamycinol, một chất có độc tính. Quá trình này được xúc tác bởi enzym
aldoketoreductases-NADPH, được tìm thấy trong tất cả các mô và đóng vai
trò quan trọng để xác định dược động học của doxorubicin [28]. Thể tích phân
bố lớn (700 - 1100 L/m2), liên kết doxorubicin và chất chuyển hóa
doxorubicinol với protein huyết tương là 74-76% và không phụ thuộc vào
nồng độ của doxorubicin (> 2 µM).


9

Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin
dạng tự do. Sự phân bố của dạng liposome bị giới hạn bởi lòng mạch, liên kết
protein không đáng kể, thời gian phân bố dược chất tới các mô là 5 phút cho
thấy sự hấp thu nhanh chóng của doxorubicin. Trong khi thời gian bán thải
của thuốc gắn với liposome thường là dài (ví dụ Doxil có t 1/2= 20–48 giờ).
Khác với dạng dung dịch, liposome chuyển hóa theo hai giai đoạn: giai đoạn
đầu tương đối ngắn (5 giờ) và giai đoạn thứ hai kéo dài (55 h)[134].
Gabizon và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu với chế phẩm Caelyx
cho thấy thời gian bán thải khoảng 50-55 giờ với liều lượng từ 10-20 mg/m2
trong điều trị các bệnh nhân sarcoma Kaposi liên quan đến AIDS, 60-80 giờ
với mức liều 35-70 mg/m2 ở bệnh nhân mang khối u rắn; 36 giờ với liều 4070mg/m2 trên các bệnh nhân khoa nhi.
Độ thanh thải huyết thanh của Doxil 0,041 L/h/m2 với liều 20 mg/m2.
Do thanh thải chậm, nên sinh khả dụng của Doxil gấp 2-3 lần so với
doxorubicin tự do [105].
Các chế phẩm liposome gắn PEG và không gắn PEG cũng có sự khác
biệt. Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong
vòng tuần hoàn kéo dài hơn. Dạng liposome doxorubicin không PEG hóa
cũng cho thấy nồng độ đỉnh trong huyết tương của tổng lượng doxorubicin sử
dụng cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng tự do [134].
1.1.6. Chỉ định
Doxorubicin có khả năng tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư và thường
được sử dụng cùng các hóa trị liệu khác để điều trị: u lympho dạng Hodgkin
và không Hodgkin, sarcoma xương và mô mềm, bạch cầu cấp, u nguyên bào
thần kinh, ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung
thư buồng trứng [3],[46].
Với dạng bào chế bột pha tiêm, dung dịch tiêm doxorubicin hydroclorid
các chỉ định được đưa ra thường là điều trị trong một số khối u rắn và khối u