Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
---------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN
KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊMLIPOSOME
DOXORUBICIN

Chuyên ngành
CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
Mã số : 62 72 04 02
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- NĂM 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ
2. PGS.TS. Nguyễn Minh Chính

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải
Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội
Phản biện 2: PGS.TS. Trần Hữu Dũng
Trường Đại học Y Dược Huế
Phản biện 3: GS.TS. Võ Xuân Minh

Trường Đại học Dược Hà Nội
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án
cấp trường họp tại Học viện Quân y
vào hồi:

giờ 00 ngày

tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc Gia
2. Thư viện Học viện Quân y


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
ADN
ARN
BP
DC
DĐVN
DOPE
DDAB
DOX
DPPC
DPPE
DPPS
DSPA
DSPC
DSPE

DSPE–
PEG
DSPG
EPC
EPG
FDA
HEPES
HPC
HPI
HPLC
KHV
KTTP
LUV
MLV
MVV
PC

Từ/cụm từ đầy đủ
Acid deoxiribinucleic
Acid ribonucleic
Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoeia)
Dược chất
Dược điển Việt Nam
Dioleoylphosphatidyl ethanolamin
Dimethyldioctadecylammonium bromid
Doxorubicin hydroclorid
Dipalmitoylphosphatidylcholin
1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin
1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid

Distearoyl phosphatidylcholin
Distearoyl phosphatidylethanolamin
Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol
Distearoyl phosphatidyl glycerol
Egg-derived phosphatidylcholin
Egg-derived phosphatidylglycerol
Cục Quản Lý Thực Phẩm và Dược Phẩm Hoa Kỳ (Food and
Drug Administration)
N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid
Phosphatidylcholin hydrogen hóa
Phosphatidylinositolhydrogen hóa
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography)
Kính hiển vi
Kích thước tiểu phân
Liposome đơn lớp lớn (Large unilamellar vesicle)
Liposome nhiều lớp đồng trục (Multilamellar vesicle)
Liposome kép (liposome trong liposome) (Multivesicular
vesicle)
Phosphatidyl cholin


PDI
PEG
SPC
SUV
TCCS
Tf
Tm
USP

UTTLT

Chỉ số đa phân tán (polydispersity index)
Polyethylenglycol
Phosphatidyl cholin dầu đậu tương(Soy phospatidyl cholin )
Liposome đơn lớp nhỏ (Small unilamellar vesicle)
Tiêu chuẩn cơ sở
Nhiệt chảy hoàn toàn
Nhiệt chảy lỏng (melting temperature)
Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia)
Ung thư tiền liệt tuyến


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị bệnh ung thư là sự
lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại các khối u
và giảm độc tính ở các tế bào lành. Một trong những hệ đưa thuốc tại
đích đang được chú trọng phát triển trong bào chế hiện đại là dạng
thuốc liposome. Ngoài các đặc điểm của dạng thuốc hướng đích,
liposome có ưu điểm lớn là tính tương hợp sinh học cao do có cấu tạo
là các phospholipid. Trên thế giới đã có một vài hãng sản xuất
nanoliposome doxorubicin và được ứng dụng trong lâm sàng như các
biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox… với nhiều cải tiến về mặt bào
chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính.
Tuy nhiên ở Việt Nam, nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa
có chế phẩm nào được đưa vào nhằm phát triển một thế hệ thuốc mới
cho ngành Dược Việt Nam. Hiện nay, dạng bào chế liposome đang
được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy
nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết.

Với lý do trên, đề tài luận án:
“Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực
nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến hành với 2 mục
tiêu:
1. Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô
phòng thí nghiệm và xây dựng TCCS, đánh giá độ ổn định chế phẩm.
2. Đánh giá được tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên
khối u chuột thực nghiệm.
*Những đóng góp mới của luận án:
1. Đã xây dựng được công thức bào chế liposome doxorubicin
với các tá dược: Phosphatydin cholin, cholesterol. Liposome bào chế


2
được bằng phương pháp hydrat hóa film có kích thước dưới 150 nm;
hiệu suất mang thuốc trên 85%.
2. Đã xây dựng được qui trình bào chế thuốc tiêm liposome
doxorubicin 2mg/ml ở qui mô phòng thí nghiệm. Thuốc tiêm đạt tiêu
chuẩn chung của thuốc tiêm tĩnh mạch và tiêu chuẩn của hệ nano
mang thuốc.
3. Đã xây dựng được phương pháp đánh giá về hóa lý và tác dụng
in vivo trên động vật thực nghiệm của hệ nano liposome mang thuốc.
Phương pháp có thể áp dụng để xây dựng công thức và đánh giá các
hệ liposome mang thuốc khác.
*Nội dung và cấu trúc mới của luận án:
Luận án bao gồm 133 trang. Đặt vấn đề: 2 trang; chương 1 (tổng
quan): 35 trang; chương 2 (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng và phương
pháp nghiên cứu): 19 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu): 55 trang;
chương 4 (bàn luận): 20 trang; kết luận và đề xuất: 2 trang.
* Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 153 tài liệu: 13 tài liệu

tiếng Việt và 140 tài liệu tiếng Anh.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề:
Về dược chất: Các tính chất hóa lý và độ ổn định của doxorubicin;
tác dụng dược lý, dược động học và các dạng bào chế đã lưu hành
trên thị trường của doxorubicin.
Liposome: khái niệm; phân loại liposome theo cấu trúc; sự phát
triển của công nghệ liposome nhằm tăng cường khả năng hướng đích
và kiểm soát giải phóng dược chất; thành phần cấu tạo của liposome;
phương pháp bào chế liposome; phương pháp đánh giá liposome.
Mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro và invivo: tổng


3
quan được các mô hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về loại
tế bào ung thư và động vật thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm, cách
xử lý số liệu và biện giải kết quả.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI
TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. Nguyên vật liệu
- Nguyên liệu: Doxorubicin hydroclorid (DOX) đạt tiêu chuẩn
Dược điển Mỹ USP 28. Phosphatydin cholin đậu tương (SPC) và
cholesterol (CHL) đạt tiêu chuẩn pha tiêm. Nguyên liệu, hóa chất
khác đạt tiêu chuẩn dược điển hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo
mục đích sử dụng).
- Thuốc đối chiếu: Dung dịch tiêm doxorubicin “Ebewe” của nhà
sản xuất Ebewe, Áo; hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin- Lipodox
của hãng TTYBiopharm, Đài Loan.
- Động vật thí nghiệm:

• Chuột nhắt trắng dòng Swiss, BAL C57/6, giống đực, khỏe
mạnh, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng trung bình 20,0 ± 1,0 g
do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
• Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mouse): chuột nhắt đực
BALB/c, không có tế bào lympho T (nude mice, Foxn1 nu), nhập khẩu
từ Công ty Charlie-River, Hoa Kỳ.
- Tế bào ung thư:
• Dòng tế bào ung thư Sarcoma TG180, do phòng thí nghiệm thực
nghiệm trên chuột bạch của Bộ môn mô phôi – tế bào, khoa Sinh học,
đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.
• Tế bào ung thư tiền liệt tuyến (UTTTL) người dòng PC-3 (CRL1435), của ATCC, Hoa Kỳ.


4
1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Các trang thiết bị đã sử dụng đạt yêu cầu cho nghiên cứu bào chế,
kiểm nghiệm và đánh giá sinh khả dụng.
Các thiết bị đặc thù cho bào chế liposome: máy cất quay chân
không, máy siêu âm, thiết bị ép qua màng (extruder), thiết bị lọc tiếp
tuyến, hệ thống thẩm tích, tủ an toàn sinh học cấp III.
Các thiết bị cho phân tích đánh giá: thiết bị đo kích thước tiểu
phân, kính hiển vi điện tử truyền qua, máy đo quang phổ UV-vis, hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao... và một số thiết bị dụng cụ thông
thường khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế
2.3.1.1. Bào chế liposome doxorubicin
*Phương pháp bào chế liposome chưa mang dược chất:
- Hòa tan phospholipid, cholesterol trong cloroform rồi bốc hơi
dung môi trên thiết bị cất quay ở 40 oC trong 12h để tạo lớp film

mỏng trên thành bình cầu. Hydrat hóa lớp film bằng dung dịch đệm
citrat ở 50oC với ở tốc độ 80 vòng/phút trong 2h để tạo hỗn dịch
liposome.
- Giảm kích thước liposome tạo ra bằng siêu âm hoặc bằng thiết
bị nén nhiều lần qua màng polycarbonat có kích thước giảm dần từ
1000 nm đến 100nm.
*Đưa DOX vào liposome:
- Tạo chênh lệch pH hai bên màng liposome bằng cách điểu chỉnh
pH tới 7,4 bằng NaOH hoặc bằng cách đổi môi trường đệm citrat
thành đệm HEPES pH 7,4. Quá trình đổi đệm được tiến hành trên
thiết bị lọc tiếp tuyến hoặc thiết bị thẩm tích.


5
- Đưa DOX vào liposome: Sử dụng bể điều nhiệt nâng nhiệt độ
hỗn dịch liposome đã tạo chênh lệch pH lên 60 oC, hòa tan DOX vào
cho đạt nồng độ yêu cầu. Ủ trong thời gian nhất định để dược chất
khuếch tán vào bên trong liposome. Sau đó để mẫu trở về nhiệt độ
phòng và bảo quản ở nhiệt độ2-8oC.
2.3.1.2. Phương pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin
Thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml được bào chế tương tự
như trên nhưng có kết hợp với biện pháp tiệt khuẩn phù hợp ở mỗi
công đoạn và pha chế trong điều kiện vô khuẩn.
2.3.2. Phương pháp đánh giá các đặc tính liposome doxorubicin
2.3.2.1. Đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân (KTTP) và phân
bố KTTP
Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan.
Cấu trúc: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ
thuật nhuộm soi âm bản và cắt siêu mỏng.
Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân: sử dụng

phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá
kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90.
Sử dụng các thông số đường kính trung bình (dnm) và hệ số đa phân
tán (PDI) để đánh giá.
2.3.2.3. Phương pháp định lượng doxorubicin
* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS
Nguyên tắc: Phá vỡ cấu trúc liposome bằng dung dịch Triton X100
10% rồi pha loãng tới nồng độ 10 µg/ml và đo quang phổ tử ngoại ở
bước sóng 482 nm. Với dược chất tự do đo ở bước sóng 234 nm.
* Phương pháp HPLC


6
Điều kiện: Cột C18, tốc độc dòng 1,3ml/ph, detector UV 254nm;
pha động: Hỗn hợp dung môi acetonitril : methanol : nước : acid
phosphoric theo tỉ lệ 450: 150 : 400 : 2. Hòa tan 1g natri lauryl sulfat
trong 1 lít hỗn hợp trên rồi dùng dung dịch NaOH 2M điều chỉnh về
pH 3,6±0,1. Căn cứ diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử tính toán
ra nồng độ doxorubicin trong chế phẩm.
*Định lượng dược chất tự do:
Sử dụng phương pháp thẩm tích (Molecular weight cut offMWCO = 12 – 14 kD) để tách riêng dược chất tự do ra khỏi
liposome. Định lượng doxorubicin trong môi trường ngoài túi thẩm
tích bằng phương pháp đo quang phổ hoặc HPLC như trên.
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa
Hiệu suất liposome hóa là phần trăm dược chất gắn vào bên trong
liposome. Tách doxorubicin tự do bằng túi thẩm tích, sau đó định
lượng doxorubicin trong liposome còn lại trong túi, so sánh với lượng
doxorubicin ban đầu (toàn phần) để tính hiệu suất liposome hóa.
2.3.2.6. Phương pháp đánh giá độ ổn định của liposome
Bảo quản liposome ở nhiệt độ 2-8oC. Đánh giá các chỉ tiêu: hình

thái, cấu trúc tiểu phân, kích thước và phân bố kích thước tiểu phân,
hàm lượng doxorubicin.
2.3.3. Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome
doxorubicin
Với thuốc tiêm liposome doxorubicin, vẫn đánh giá toàn bộ các
chỉ tiêu giống như của liposome doxorubicin nhưng đánh giá thêm
các chỉ tiêu sau:
pH, độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn:Theo DĐVN IV


7
Độ ổn định của chế phẩm trong thời gian bảo quản: Đánh giá sự
thay đổi các chỉ tiêu của thuốc tiêm ở điều kiện bảo quản ở nhiệt độ
2-8oC và điều kiện phòng thí nghiệm sau 24 tháng.
2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome
doxorubicin trên khối u động vật
So sánh giữa các nhóm dùng thuốc: Nhóm chứng (dung dịch
NaCl 0,9 %); nhómnghiên cứu (hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin
nghiên cứu); nhóm đối chiếu: hỗn dịch liposome(Lipodox) và thuốc
tiêm dung dịch doxorubicin tự do (EBEWE).
2.3.4.1. Trên chuột nhắt trắng
Tế bào: Sử dụng tế bào Sarcoma TG180. Số lượng tiêm là 5×105 tế
bào cho từng chuột để gây khối u cơ và u dưới da.
Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian sống trung bình; thời gian sống thêm;
kích thước khối u.
2.3.4.2. Trên chuột thiếu hụt miễn dịch
Tế bào: Tế bào UTTTL người dòng PC-3 được tiêm lên chuột với
số lượng 107 tế bào / chuột.
Chỉ tiêu đánh giá: Kích thước khối u, trọng lượng chuột, thời gian
sống.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin
3.1.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS
Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS được sử dụng để
định lượng doxorubicin trong quá trình nghiên cứu xây dựng công
thức. Thẩm định một số chỉ tiêu như ảnh hưởng của tá dược, độ tuyến
tính, độ lặp lại.
- Qua đánh giá ảnh hưởng của tá dược, chọn bước sóng 482 nm để


8
định lượng dược chất toàn phần trong liposome và bước sóng 234 nm
để định lượng dược chất tự do.
-Tính tuyến tính: Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính
của nồng độ doxorubicin và mật độ quang ở các điều kiện khảo sát ở
2 bước sóng : 234nm ở pH 5,5 và 7,4 bước sóng 482 nm ở pH 5,5
và các pH khác nhau trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2 μg/ml đến
12 μg/ml (mức tin cậy 0,01). Như vậy có thể áp dụng phương pháp
đo quang ở các khoảng nồng độ khảo sát cho mục đích nghiên cứu.
- Độ lặp lại: Độ lệch chuẩn tương đối ở các điều kiện định lượng
khác nhau đều có RSD < 2%, như vậy có thể thấy rằng phương pháp
cho độ lặp lại tốt.
3.1.2. Phương pháp HPLC
Phương pháp HPLC áp dụng để định lượng DC toàn phần và hiệu
suất liposome hóa trong xây dựng tiêu chuẩn và theo dõi độ ổn định.
Qua tham khảo USP thay đổi một số điều kiện sắc ký để phù hợp với
định lượng liposome. Thẩm định phương pháp với các tiêu chí: độ
tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, tính thích hợp hệ thống.
- Tiến hành xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ từ 10

μg/ml- 100 μg/ml với 7 mẫu chuẩn doxorubicin pha trong pha động,
mỗi mẫu phân tích 6 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả cho thấy có
sự tương quan tuyến tính của nồng độ doxorubicin và diện tích pic (y
= 35,665x + 8,9508;R² = 0,99875).
- Độ lặp lại: Pha độc lập 6 mẫu doxorubicin chuẩn với nồng độ
chính xác 25,5μg/ml, tiến hành chạy sắc ký. Kết quả khảo sát cho
thấy độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối nhỏ (RSD=1,004%<
2%), chứng tỏ phương pháp đủ độ chính xác để định lượng.
- Tính thích hợp của hệ thống:Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần


9
cùng một dung dịch chuẩn DOX có nồng độ 40 µg/ml. Kết quả khảo
sát cho thấy giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%, hệ số bất đối 0,6 < AF <
1,5; số đĩa lý thuyết lớn hơn 2000. Chứng tỏ hệ thống HPLC sử dụng
là phù hợp cho phép phân tích định lượng doxorubicin toàn phần.
- Độ đúng: Được khảo sát bằng phương pháp thêm chuẩn.Tiến
hành thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được dung dịch mẫu tự tạo có
nồng độ 30, 40, 60 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 mẫu riêng
biệt. Tiến hành chạy sắc ký định lượng lại lượng chuẩn trong các mẫu
trên, từ đó tính toán được % thu hồi. Kết quả khảo sát cho thấy lượng
chất chuẩn thu hồi lại được nằm trong khoảng 98,35% đến 100,75%,
RSD < 2%. Chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
Kết luận: Phương pháp định lượng DOX bằng HPLC có tính thích
hợp, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng cao.
3.2. Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế liposome
doxorubicin
Tiến hành bào chế các mẫu liposome doxorubicin theo mô tả ở
phương pháp nghiên cứu với thành phần công thức như sau:
Bảng 3.8: Các công thức bào chế liposome doxorubicin

Công
thức
1.1
1.2
3.1
3.2
5.1
5.2

SPC
mg
196
196
274
274
352
352

mmol
0,253
0,253
0,354
0,354
0,454
0,454

CHL
mg
99
99

60
60
21
21

mmol
0,256
0,256
0,155
0,155
0,054
0,054

SPC : CHL
mol:mol
49,7 : 50,3
49,7 : 50,3
69,5 : 30,5
69,5 : 30,5
89,3 : 10,7
89,3 : 10,7

DOX
mg
25
50
25
50
25
50

mmol
0,043
0,086
0,043
0,086
0,043
0,086

Tổng Lipid :
DOX
mol:mol
11,8 : 1
5,9 : 1
11,8 : 1
5,9 : 1
11,8 : 1
5,9 : 1

Khảo sát các công thức với 2 cách tạo chênh lệch pH: điều chỉnh
pH bằng dung dịch NaOH và đổi đệm Hespes. Kết quả thực nghiệm


10
cho thấy:Tạo chệnh lệch pH bằng phương pháp đổi đệm cho hiệu
suất liposome hóa dược chất cao hơn so với phương pháp điều chỉnh
pH bằng NaOH. Tỉ lệ mol lipid : DOX không ảnh hưởng tới hiệu suất
liposome hóa dược chất. Tỉ lệ mol SPC:DOX là 70:30 cho liposome
DOX có hiệu suất liposome hóa dược chất cao nhất (trên 60%).
Liposome tạo ra vẫn có kích thước lớn (> 300 nm) và không

đồng nhất (PDI > 0,4). Kết quả chụp hiển vi điện tử cho thấy
liposome có cấu trúc đa lớp và đa khoang. Sau 1 tháng bảo quản, các
liposome tạo ra đều có sự suy giảm rõ rệt về khả năng mang thuốc
(EE chỉ còn dưới 50%), có hiện tượng sa lắng, tách lớp và kích thước
tiểu phân cũng tăng lên tới hàng ngàn nm. Như vậy, cần phải nghiên
cứu làm giảm KTTP cho liposome để tăng độ ổn định cũng như tăng
khả năng hướng đích.
Với các kết quả thu được, công thức 3.2 được sử dụng cho
nghiên cứu tiếp theo nhằm xây quy trình bào chế liposome tốt hơn.
3.3. Kết quả xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin
3.3.1.Nghiên cứu tìm biện pháp giảm kích thước liposome
Nhằm tạo ra liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất, nghiên
cứu làm giảm KTTP bằng siêu âm và nén qua màng:
Phương pháp siêu âm: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu thiết bị
siêu âm, thời gian siêu âm đến kích thước tiểu phân. Kết quả thực
nghiệm cho thấy: Thiết bị siêu âm đũa (Labsonic) cho khả năng giảm
KTTP tốt hơn so với bể siêu âm (Wiseclean).Thời gian siêu âm tăng
sẽ làm KTTP giảm dần, hệ trở lên đồng nhất hơn. Tuy nhiên nếu thời
gian siêu âm quá dài thì hệ lại trở lên kém đồng nhất.
Với phương pháp siêu âm, lựa chọn thiết bị siêu âm đũa với tần số
30kHz, thời gian siêu âm 10 phút, thể tích siêu âm 10ml. Liposome


11
bảo chế theo phương pháp này cho kích thước khoảng 80 nm, PDI
đạt dưới 0,3.
Phương pháp nén qua màng: ép/ đùn 10 lần qua màng 400 nm rồi
nén tiếp 20 lần qua màng 100 nm đạt kích thước khoảng 150 nm, PDI
rất thấp (0,06) chứng tỏ hệ đồng nhất.
So sánh hình ảnh chụp TEM của liposome được giảm kích thước

bằng phương pháp siêu âm và nén/đẩy qua màng:

Siêu âm
Nén qua màng
Hình 3.8: Ảnh chụp TEM của liposome khi sử dụng các phương
pháp giảm kích thước tiểu phân khác nhau
Qua hình ảnh chụp TEM kết hợp với đo phân bố kích thước tiểu
phân nhận thấy liposome tạo ra bởi phương pháp nén qua màng phân
bố kích thước đồng đều hơn (PDI thấp) nhưng có KTTP trung bình
lớn hơn so với phương pháp siêu âm. Trong điều kiện nghiên cứu,
chọn phương pháp siêu âm dễ dàng nâng qui mô bào chế hơn.
3.3.2 Quá trình đưa dược chất vào liposome
- Đổi đệm: Hai phương pháp đổi đệm là thẩm tích và lọc tiếp
tuyến được sử dụng để đổi môi trường bên ngoài liposome từ đệm
citrat pH4 thành đệm HEPES pH 7,4. Liposome sau khi đổi đệm


12
được hòa tan DOX và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Kết quả
thực nghiệm cho thấy: Phương pháp lọc tiếp tuyến có nhiều ưu điểm
hơn thẩm tích, thời gian tiến hành ngắn, tốn ít đệm trao đổi, hiệu suất
liposome hóa cao hơn.
Đưa dược chất vào liposome: Thời gian ủ và nhiệt độ ủ có ảnh
hưởng tới hiệu suất liposome hóa. Điều kiện liposome hóa thích hợp
là ủ ở 50oC trong 30 phút.Sau khi ủ, DOX mới chỉ vào trong
liposome đươc khoảng 40 -60%. Sau đó dược chất tiếp tục được
khuếch tán vào trong liposome trong quá trình bảo quản, đạt hiệu suất
là trên 80% sau 1 tuần.
Từ các kết quả thu được, đề xuất thay đổi một số thông số và
điều kiện bào chế hỗn dịch liposome doxorubicin như sau:

- Siêu âm: Hỗn dịch liposome được chia thành các thể tích nhỏ
(10ml) và được siêu âm trong thời gian 10 phút bằng thiết bị
Labsonic.
- Sử dụng phương pháp đổi đệm HEPES pH 7,4 bằng lọc tiếp
tuyến để tạo chênh lệch pH qua màng.
- DOX được phối hợp vào liposome tại nhiệt độ 50⁰C sau đó được
bảo quản lạnh trong 1 tuần để đạt hiệu suất liposome hóa cao.
3.4. Kết quả bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin
Việc áp dụng kết quả nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin
thu được vào bào chế thuốc tiêm chủ yếu là tìm biện pháp đảm bảo
độ vô khuẩn cho thuốc tiêm và kiểm soát được các thông số trong
quá trình bào chế. Ngoài các biện pháp tiệt khuẩn không thường về
môi trường bào chế, dụng cụ, thiết bị, các dung dịch đệm... còn cần
phải giải quyết các vấn đề đặc biệt sau:


13
- Liposome sau khi gắn DOX không thể tiệt khuẩn bằng phương
pháp lọc hoặc hấp tiệt khuẩn. Do đó cần phải sử dụng nguyên liệu vô
khuẩn.
- DOX hydroclorid có tốc độ hòa tan kém, dễ bị vón cục khi tiếp
xúc với nước bởi hiện tượng dime hóa. Quá trình hòa tan DOX thực
tế phải rắc từ từ dược chất vào hỗn dịch liposome cho đến khi tan hết
để tránh bị vón cục, thời gian hòa tan DOX kéo dài và có nguy cơ
ảnh hưởng đến độ bền của dược chất bởi nhiệt độ. Để giải quyết khó
khăn này, dược chất được đông khô trước nhằm mục đích tăng tốc độ
hòa tan và kiểm soát độ vô khuẩn cho DOX. Công thức đông khô
không sử dụng tá dược tạo khung, vì vậy qua khảo sát, lựa chọn các
thông số của thiết bị theo qui trình như sơ đồ ở hình 3.9.

14
Hình 3.9. Sơ đồ bào chế lọ vô khuẩnchứa doxorubicin đông khô
Với các kết quả đã thu được, nghiên cứu đã đưa ra qui trình bào
chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml với qui mô 50 lọ /mẻ
được trình bày ở hình 3.10.


15
Hình 3.10. Sơ đồ tóm tắt qui trình bào chế thuốc tiêm liposome
DOX 2mg/ml
Chế phẩm sau bào chế có hiệu suất liposome hóa 86,93± 0,4%,
kích thước liposome 86,57 ± 1,03 d.nm, PDI= 0,274 ±0,03.
Đánh giá thời gian hòa tan ban đầu và hiệu suất liposome hóa sau
1 tuần bảo quản 2-8 oC, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.27. Thời gian hòa tan DOX và hiệu suất liposome hóa khi
sử dụng dược chất đông khô
Thời gian hòa tan DOX (phút)
Hiệu suất liposome hóa (%)

DOX thô

DOX đông khô

10 ± 2

2 ± 0,5

76,58 ± 0,68

86,65 ± 0,27

3.5.Kết quảđề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của
thuốc tiêm liposome doxorubicin
3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn
Dựa trên các kết quả nghiên cứu và khảo sát trên, đề xuất tiêu
chuẩn liposome và cho thuốc tiêm liposome doxorubicin như sau:
3.5.1.1. Tiêu chuẩn liposome chưa mang dược chất
Tính chất: Hỗn dịch liposome không màu, hơi đục mờ, đóng trong
lọ thủy tinh có nắp hàn kín.pH: 6,5 – 7,5.Kích thước tiểu phân: Các
tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 120 nm, PDI ≤ 0,30.
3.5.1.2. Tiêu chuẩn liposome doxorubicin
Tính chất:Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, hơi đục mờ, đóng
trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín. pH: 6,0 – 8,0. Định tính: Phải thể
hiện phép thử định tính của doxorubicin hydroclorid. KTTP: Các tiểu
phân có đường kính trung bình từ 60- 150 nm, PDI ≤ 0,30. Định
lượng: Dược chất liposome hóa: không dưới 80%; Dược chất toàn


16
phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0- 115,0% lượng doxorubicin
hydroclorid so với lượng ghi trên nhãn.
3.5.1.3. Tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml
Tính chất: Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, hơi đục mờ, đóng
trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín.Thể tích: 10ml + 10 %.pH: 6,0 –
8,0.Định tính: Phải thể hiện phép thử định tính của doxorubicin
hydroclorid.Kích thước tiểu phân: Các tiểu phân có đường kính trung
bình từ 60- 150 nm; PDI ≤ 0,30.Định lượng:Dược chất liposome hóa:
không dưới 80%; dược chất toàn phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0115,0% lượng doxorubicin hydroclorid so với lượng ghi trên
nhãn.Độ vô khuẩn: phải vô khuẩn. Nội độc tố vi khuẩn: không được

nhiều hơn 2,2 EU/mg hoạt chất.
Tiêu chuẩn được thẩm định tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
Ương.
3.5.2. Đánh giá độ ổn định
Trong thời gian theo dõi, các mẫu liposome bảo quản ở điều kiện
khác nhau có sự biến đổi khác nhau. Ở nhiệt độ 2-8 oC và nhiệt độ
phòng, hàm lượng dược chất toàn phần trong mẫu hầu như ít thay đổi
do dược chất ổn định ở nhiệt độ thấp và được bao phủ phần lớn trong
lớp vỏ phospholipid với pH thấp. Ở điều kiện 2-8 oC, sự biến đổi kích
thước tiểu phân này không nhiều, nhưng ở điều kiện nhiệt độ phòng,
có hiện tượng kết tụ làm tăng kích thước liposome, đồng thời lượng
dược chất bị rò rỉ khỏi liposome khá lớn. Vì vậy đối với các chế
phẩm này cần phải khống chế điều kiện bảo quản nghiêm ngặt,
không thể dùng biện pháp lão hóa cấp tốc để dự đoán tuổi thọ của
thuốc được. Với các kết quả thu được, sơ bộ kết luận thuốc có tuổi
thọ 24 tháng.


17
3.6. Kết quả đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome
doxorubicin trên khối u động vật thực nghiệm:
Thuốc tiêm liposome doxorubicin (ký hiệu Li-do) được đánh giá
trên khối u chuột, so sánh với thuốc đối chiếu Lipodox và dung dịch
tiêm DOX tự do.
3.6.1. Đánh giá trên chuột nhắt mang ung thư Sacoma TG 180
- Với u dưới da: So với nhóm chứng không dùng thuốc, cả 3
nhóm điều trị đều có tác dụng nâng cao tỉ lệ sống sót của chuột mang
u. Số chuột sống sót sau 30 ngày của nhóm nhận thuốc nghiên cứu
tăng gần 2 lần, tương đương với kết quả thu được ở những chuột
nhận Lipodox đối chiếu và cao hơn có ý nghĩa so với nhóm dùng

DOX tự do. Các nhóm chuột được điều trị đều có thời gian sống cao
hơn so với nhóm chứng (p<0,05). Thời gian sống trung bình của
chuột ở các nhóm điều trị là không khác nhau (p>0,05). Trên mô hình
gây u dưới da, tác dụng của Li-Do nghiên cứu tuy kém hơn Lipodox
một chút, song so với nhóm chứng, tác dụng này cũng rất rõ rệt
(p<0,05). Trong cùng điều kiện thử nghiệm ở mô hình gây u dưới da,
thuốc tiêm dung dịch DOX tỏ ra có tác dụng yếu, khác biệt so với
nhóm chứng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Hình 3.13, 3.14).


18

Hình 3.13. Khối lượng khối u

Hình 3.14. Thể tích khối u

dưới da của chuột sau 30 ngày

dưới da của chuột sau 30 ngày

- Trên khối u cơ (Hình 3.15, 3.16): Về chỉ tiêu khối lượng khối u
cơ, 2 nhóm được nhận Li-Do nghiên cứu và Lipodox có sự khác biệt
rõ ràng so với nhóm chứng (p<0,01). Khối lượng khối u của cả 2
nhóm đều chỉ bằng 25% so với nhóm không dùng thuốc. Trong 2
nhóm này, Lipodox làm giảm khối lượng u tốt hơn Li-Do nghiên cứu
nhưng sự khác biệt giữa chúng không đáng kể. Thể tích khối u chỉ
còn khoảng 40% so với nhóm chứng. Lipodox có hiệu lực mạnh hơn
Li-Do nghiên cứu về chỉ tiêu này song khác biệt không có ý nghĩa
thống kê (p<0,05).Dạng bào chế liposome có tác dụng vượt trội so
với dạng quy ước về chỉ tiêu làm giảm thể tích khối u.

19

Hình 3.15. Khối lượng khối u cơ

Hình 3.16.Thể tích khối u

trung bình của chuột sau 30 ngày

cơ của chuột sau 30 ngày

3.6.2. Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch
mang tế bào ung thư tiền liệt tuyến
3.6.2.1.Ảnh hưởng của liposome DOX trên kích thước khối u
Chuột suy giảm miễn dịch được nuôi trong điều kiện phòng sạch.
Sau khi ghép tế bào ung thư thành công, đo kích thước khối u. Sau
điều trị 3 tuần.
Kết quả kích thước khối u được trình bày ở bảng 3.37 và hình
3.17:
Bảng 3.37. Kích thước khối u ung thư tuyến tiền liệt ngườiở các
nhóm
Thời gian
điều trị
(tuần)
0
1
2

Nhóm

chứng
TB
SD
32,26 12,6
116,2
62
73,
142,3
7

Kích thước khối u (mm3)
Nhóm Li-Do
Nhóm
Lipodox
TB
SD
TB
SD
28,9
12,28
29,3
8,36
59,06 22,16 40,75 21,11
60,63

23,8

40,44

17,57

p (one way
ANOVA)
>0.05
>0.05
<0.05


20
3
152,3

76,
3

82,39

11,0

42,2

18,66

<0.05

3.6.2.1. Ảnh hưởng của liposome DOX trên kích thước khối u
Sau 2 tuần điều trị, có sự khác biệt đáng kể về kích thước khối u
giữa nhóm chứng, Li-do và Lipodox. Sự khác biệt này càng rõ ràng ở
tuần thứ 3 sau điều trị, nhóm chứng có kích thước khối u lớn hơn có
ý nghĩa thống kê so với 2 nhóm còn lại.

Hình 3.17. Diễn biến kích thước khối u trên chuột

3.6.2.2. Ảnh hưởng của liposome DOX trên trọng lượng chuột:
dddSự khác biệt về trọng lượng chuột của các nhóm tại cùng một thời
điểm không có ý nghĩa thống kê (hình 3.18).


21
Hình 3.18. Trọng lượng chuột ở các nhóm điều trị

Chương 4: BÀN LUẬN
4.1.Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin
Phương pháp tráng film được lựa chọn để bào chế liposome do
đơn giản, dễ tiến hành và dễ điều chỉnh được tỉ lệ pha phân tán. Quá
trình hydrat hóa cần được tiến hành ở xung quanh nhiệt độ chuyển
pha của phospholipid để đảm bảo tạo ra được cấu trúc màng kép.
Về công thức bào chế, thành phần chính của liposome là
phosphatidyl choline đậu tương và cholesterol. Cholesterol có vai trò
làm chắc vỏ liposome tuy nhiên nếu dùng nhiều quá sẽ làm giảm tính
linh động của lớp màng kép và do đó ảnh hưởng tới độ ổn định và
hiệu suất liposome hóa. Qua khảo sát, tỉ lệ 70:30 đã được lựa chọn là
phù hợp. Theo tài liệu tham khảo, tỉ lệ dược chất/lipid có ảnh hưởng
lớn tới hiệu suất liposome hóa, tỉ lệ 6:1 được lựa chọn để đảm bảo đạt
được nồng độ 2 mg/ml cho chế phẩm. Dung môi hòa tan lipid dùng là
cloroform, qua thực nghiệm tỷ lệ 10-20 mg lipid/ml dung môi có thể
tạo được film.
Để đảm bảo khả năng hướng đích, khả năng tiệt khuẩn bằng
phương pháp lọc cho chế phẩm, liposome cần phải có kích thước nhỏ
dưới 200 nm; 2 phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân: Siêu âm

và ép/đùn qua màng được khảo sát với các thông số kỹ thuật sao cho
đạt được kích thước tiểu phân như mong muốn và đồng đều (chỉ số
PDI thấp).
Quá trình tạo chênh lệch pH là quá trình quan trọng trong bào chế
liposome doxorubicin bởi nó là động lực cho quá trình liposome hóa
dược chất. Cả thẩm tích và lọc tiếp tuyến đều có hiệu quả trong việc
tạo ra chênh lệch pH hai bên màng liposome. Tuy nhiên phương pháp