Nghiên cứu tạo màng và xử lý màng BC có kích thước và tính chất phù hợ với việc hấp thu thuốc phục vụ việc sử dụng trên da

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
-----------------------------------

ĐOÀN THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THU
VÀ GIẢI PHÓNG THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG
BACTERIAL CELLULOSE ĐỂ PHỤC VỤ
VIỆC SỬ DỤNG QUA DA
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: TS.
Nguyễn Xuân Thành, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm luận văn vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo của Trung tâm Hỗ
trợ NCKH&CGCN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán bộ nhân viên
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 - những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt 2 năm học tại đây.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng, người
thân, bạn bè, những người luôn bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi những
lúc gặp nhiều khó khăn nhất.

Hà Nội, tháng 11 năm 2016
Học viên

Đoàn Thị Yến


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là
kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng
với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu của một
số tác giả, tôi xin phép các tác giả này để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 11 năm 2016
Học viên

Đoàn Thị Yến


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 3

4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 3
5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 4
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn....................................................................... 4
7. Đóng góp mới của luận văn .......................................................................... 4
NỘI DUNG ....................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Tổng quan về BC ....................................................................................... 5
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra BC .......................................................................... 5
1.1.2. Đặc điểm cấu trúc của BC ...................................................................... 6
1.1.3. Tính chất lí hóa của BC........................................................................... 7
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC................................. 9
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải
phóng thuốc qua da ......................................................................................... 11
1.2.1. Trên thế giới .......................................................................................... 11
1.2.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 14
1.3. Tổng quan về neomycin ........................................................................... 15
1.3.1. Công thức .............................................................................................. 15
1.3.2. Tính chất lí hóa...................................................................................... 16
1.3.3. Dược lí và dược động học ..................................................................... 16
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ................................................................... 17
1.4. Tình hình nghiên cứu về neomycin.......................................................... 17
1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 17


1.4.2. Tại Việt Nam .......................................................................................... 18
1.5. Sinh lý hấp thu các chất qua da ................................................................ 18
1.5.1.Cấu trúc và chức năng sinh lý của da .................................................... 18
1.5.2. Cơ chế hấp thu các chất qua da ............................................................ 25
CHƯƠNG 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 25
2.2.1. Chuẩn bị màng BC ................................................................................ 25
2.2.1.1. Lên men thu màng BC thô .................................................................. 25
2.2.1.2. Tạo màng BC tinh chế ........................................................................ 26
2.2.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết màng BC tinh chế........................................... 27
2.2.1.4. Xác định các tiêu chuẩn của màng BC tinh chế sử dụng chế tạo
màng hấp thu thuốc ......................................................................................... 28
2.2.2. Chế tạo màng BC hấp thu neomycin ..................................................... 30
2.2.2.1. Chuẩn bị bộ đệm ................................................................................ 30
2.2.2.2. Xây dựng đường chuẩn neomycin ...................................................... 30
2.2.2.3. Chuẩn bị môi trường cho BC hấp thu thuốc ...................................... 31
2.2.2.4. Xác định lượng neomycin hấp thu vào màng BC .............................. 31
2.2.3. Xác định tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin thông qua hệ thống được
thiết kế ............................................................................................................. 32
2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê .................................................................. 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 36
3.1. Thu màng BC và tinh chế màng............................................................... 36
3.1.1. Thu màng BC từ các môi trường lên men ............................................. 36
3.1.2. Tinh chế màng BC ................................................................................. 37
3.2. Kiểm tra một số tiêu chuẩn của màng BC tinh chế.................................. 38
3.2.1. Kết quả thử độ tinh khiết của màng BC tinh chế .................................. 38


3.2.2. Kết quả đo pH của màng BC tinh chế................................................... 39
3.2.3. Kết quả khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng BC ....................... 40
3.3. Phương trình đường chuẩn neomycin trong dung dịch đệm PBS .......... 43
3.4. Tỉ lệ neomycin hấp thu vào màng BC...................................................... 44
3.5. Tỉ lệ neomycin giải phóng từ các hệ thống màng BC mang thuốc đã thiết
kế ..................................................................................................................... 48
3.6. Đánh giá động học giải phóng neomycin từ màng BC mang thuốc ........ 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 57
1. Kết luận ....................................................................................................... 57
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A - BC

Agitade – Bacterial cellulose

BC

Bacterial celullose

CNM

Cao nấm men

cs

Cộng sự

ĐHSP

Đại học Sư phạm

Đk

Đường kính

KTNN

Kỹ thuật nông nghiệp

PBS

Phosphate buffered saline

NCKH&CGCN

Nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ

Nxb

Nhà xuất bản

mht

Khối lượng thuốc hấp thu

MT1

Môi trường 1

MT2

Môi trường 2

MT3

Môi trường 3

S – BC

Static – Bacterial celllulose


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần của các môi trường lên men thu màng BC ................. 26
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS ...................................................................... 30
Bảng 2.3. Môi trường thử nghiệm cho màng BC hấp thu thuốc..................... 31
Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tươi. ............................................................. 37
Bảng 3.2. Kết quả đo pH ở các lô màng thí nghiệm ....................................... 40
Bảng 3.3. Tốc độ mất nước của màng BC …………………………………..38
Bảng 3.4. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vào màng BC dày 0,5cm ................ 44
Bảng 3.5. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vào màng BC dày 0,3cm ................ 44
Bảng 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ
môi trường cao nấm men (màng CNM) .......................................................... 49
Bảng 3.7. Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ
môi trường nước dừa (màng dừa) .................................................................. 50
Bảng 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ
môi trường nước gạo (màng gạo).................................................................... 51
Bảng 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc từ dung dịch neomycin đối chứng nồng
độ 2mg/ml ....................................................................................................... 51
Bảng 3.10. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng CNM
(trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ..................................... 54
Bảng 3.11. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng dừa (trong

môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ............................................... 50
Bảng 3.12. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng gạo (trong
môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ................................................50


DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Cellulose vi khuẩn ............................................................................ 6
Hình 1.2. Cellulose thực vật ............................................................................. 6
Hình 1.3. Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) ................................................... 7
Hình 1.4. Thí nghiệm cấy BC dưới da động vật thí nghiệm. ............................ 8
Hình 1.5. Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng ....................... 12
Hình 1.6. Màng BC – lidocaine hydrochloride ứng dụng trên da .................. 13
Hình 1.7. Sử dụng màng BC hấp thu thuốc điều trị nhiễm khuẩn .................. 13
Hình 1.8. Công thức cấu tạo của neomycin .................................................... 15
Hình 1.9. Cấu trúc siêu hiển vi của da ……….…………………………….. 20
Hình 1.10. Cấu tạo của biểu bì da người …………………………………... 20
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng BC ........................................................... 27
Hình 2.2. Mô hình thí nghiệm khuếch tán thuốc qua da Franz....................... 33
Hình 3.1. Nuôi cấy màng BC tại phòng thí nghiệm Trung tâm Hỗ trợ
NCKH&CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2 ........................................................ 36
Hình 3.2. Môi trường dinh dưỡng lên men thu màng ..................................... 36
Hình 3.3. Màng BC tạo ra từ vi khuẩn A. xylinum.......................................... 38
Hình 3.4. Kết quả tìm sự hiện diện của glucose trong dịch chiết màng
BC.................................................................................................................... 39
Hình 3.5. Kết quả tìm sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng BC .... 39
Hình 3.6. Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 1 .................. 40
Hình 3.7. Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 2. ................. 41
Hình 3.8. Khả năng cản khuẩn của vải gạc vô trùng ...................................... 42
Hình 3.9. Phương trình đường chuẩn của neomycin trong môi trường
đệm .................................................................................................................. 44

Hình 3.10. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày
0,5cm ............................................................................................................... 46
Hình 3.11. Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày 0,3
cm .................................................................................................................... 47


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Trong những năm gần đây, khoa học đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử
dụng các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng
tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong
những vật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Vật
liệu này vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [32]. Trong
đó, Bacterial Cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của
các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là một loại vật liệu
mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm,...
Theo một số kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt
tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác.
BC có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC
còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích
thước. BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn,
giải phóng nước kéo dài. Đồng thời BC còn có tính xốp, độ ẩm cao, có lực
bền cơ học cao. Vì vậy, BC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ
thống giải phóng thuốc qua da, qua đường miệng và mô – kĩ thuật, và một số
ứng dụng y sinh học khác [6], [9], [14], [19], [20], [22], [24],…
Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngoài những đặc
điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các vi sinh vật khác,

ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của tia cực
tím. Đồng thời BC cũng là vật liệu không gây kích ứng da (do có bản chất là
saccharide) [24].
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm
vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả


2

rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường. Việc sử
dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine
[53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [45],
benzalconium chloride [19] và sulfadiazine bạc [37] cho kết quả tích cực. Các
kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có
độ bền và trương nở tương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di
chuyển của tế bào da người [14], [18], [19].
Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC hấp thu thuốc là khả năng
chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, không dị ứng với da và khả năng hấp
thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết
các chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau. Do đó,
một hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí
một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí
[11], [53].
Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thân, được
y học khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thường được dùng
rộng rãi toàn thân như penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin,... do
có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng
thuốc. Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm
chứa các loại kháng sinh bôi trên da.
Neomycin là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều trị vết thương do

tụ cầu và liên cầu gây ra. Tuy nhiên, neomycin cũng như một số chế phẩm
kháng sinh khác được khuyến cáo tránh sử dụng toàn thân do có khả năng gây
mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Để giảm thiểu
phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng
sinh trên dạng bôi trên da. Tuy nhiên, những phát hiện gần đây cho thấy rằng
neomycin ở dạng chế phẩm dung dịch có bán trên thị trường thì khả năng hấp


3

thu vào da quá nhanh (trong vòng 4 giờ đầu có thể hấp thụ 85,01% ở vùng da
tổn thương) dễ gây độc trên tai, suy giảm thần kinh và thận, có thể gây mẫn
cảm khi điều trị lâu dài [17]. Điều này không thích hợp với việc điều trị một
số bệnh viêm da mủ trên da cần điều trị kéo dài. Bên cạnh đó, chế phẩm dạng
dung dịch thường nhanh khô và không có khả năng cản vi khuẩn bên ngoài
xâm nhập. Vì vậy, giải pháp cần đặt ra cho vấn đề này là dùng một loại vật
liệu có khả năng giải phóng kéo dài thuốc, có khả năng giữ ẩm vết thương và
cản khuẩn,...
Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của neomycin trong
điều trị kháng khuẩn trên da, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển
vọng. Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thu
và giải phóng thuốc neomycin của màng bacterial cellulose để phục vụ
việc sử dụng qua da”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng
thuốc định hướng sử dụng qua da.
- Thiết kế, chế tạo màng BC hấp thu thuốc neomycin nhiều nhất. Đánh
giá khả năng giải phóng neomycin kéo dài từ hệ thống màng BC mang thuốc.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo màng và xử lí màng BC có kích thước và tính chất phù

hợp với việc hấp thu thuốc phục vụ việc sử dụng trên da.
- Đánh giá khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng
BC in vitro.
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ sự lên men của vi khuẩn A.
xylinum; thuốc neomycin tinh khiết 98% và một số chất khác.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc


4

neomycin của màng BC định hướng sử dụng qua da.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Lên men thu màng BC từ một số môi trường.
- Tinh chế màng BC thô.
- Đánh giá độ tinh khiết của màng BC.
- Chế tạo màng BC hấp thu thuốc, xác định lượng thuốc hấp thu vào màng.
- Xác định lượng thuốc giải phóng từ màng BC mang thuốc.
- Xử lí thống kê.
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học:
Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng
thuốc định hướng sử dụng trên da. Từ kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở
để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về khả năng hấp thu cũng như kiểm soát
thuốc của màng BC trên nhiều loại thuốc khác nhau nhằm tăng hiệu quả điều
trị của các loại thuốc đó.
Ý nghĩa thực tiễn:
Việc sử dụng màng BC làm vật liệu để hấp thu và giải phóng thuốc kéo
dài này có thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc và khắc phục được nhược
điểm của thuốc ở dạng thông thường.

7. Đóng góp mới của luận văn
Đây là đề tài đầu tiên tại Việt Nam sử dụng màng BC làm hệ thống hấp
thu và giải phóng thuốc neomycin trong điều trị nhiễm khuẩn trên da.
Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể định hướng tạo hệ thống giải phóng
thuốc kéo dài từ đó có thể áp dụng trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên da.


5

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về BC
Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần
chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của
vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn (becterial cellulose – BC) là sản phẩm trao đổi
chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ [55].
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra BC
BC là một polysaccharide được tổng hợp bởi các loài vi khuẩn khác nhau,
chẳng hạn như Aerobacter, Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium,
Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium và Sarcina [39]. Cho đến
nay, A. xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng sinh màng BC
hiệu quả nhất trong tự nhiên. A. xylinum là loài vi khuẩn Gram âm sống hiếu
khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất của
nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử
glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là
rất lớn [3], [6], [8], [10], [27].
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc
không và không sinh bào tử (hình 1.1). Chúng là vi khuẩn Gram âm nhưng
trọng lượng của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi
trường nuôi cấy. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế

chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí
và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [11]. Trên môi
trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A. xylinum có dạng nhỏ,
nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà
phê sữa, khô dần [11]. Trên môi trường lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện
một lớp màng đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và
ngày càng dày.


6

1.1.2. Đặc điểm cấu trúc của BC
Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β – 1,4 – glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản
của BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc
đại thể [14], [18].
Theo Brown (1999) [21], BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ cellulose, đường
kính 1,5nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều
bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm. Hình
1.2 cho thấy rõ cấu trúc này.

Hình 1.1. Cellulose vi khuẩn

Hình 1.2. Cellulose thực vật

(× 20 000 lần) [18]

(×200 lần) [18]

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi

cấy theo phương pháp tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề
mặt nuôi cấy tĩnh, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy.
Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng. BC
được tạo ra từ môi trường nuôi cấy tĩnh gọi là Static – Bacterial cellulose (S –
BC) còn BC tạo ra trong môi trường nuôi cấy động là Agitade – Bacterial
cellulose (A – BC). Cấu trúc siêu hiển vi của BC được mô tả trong hình 1.3.


7

(a)

(b)

Hình 1.3. Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) [36]
BC được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy tĩnh (S – B) có các bó xellulose
chuỗi xếp song song quanh trục. Các sợi cellulose liên tục được tạo ra từ
những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi
sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose
từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song, sợi S – BC kéo dài và
chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau không có tổ chức, có vai trò
chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum.
Khi nuôi cấy động, một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng
huyền phù phân tán trong đó chuỗi β – 1,4 glucan xếp một cách ngẫu nhiên.
BC được tạo ra bằng phương pháp động (A – BC) dưới dạng các hạt nhỏ, các
sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy,
hoặc các hạt bông hình sao phân tán trong môi trường, tuy nhiên bề mặt cắt
ngang của sợi A – BC nhỏ hơn sợi S – BC. Có các nghiên cứu cho rằng, sự
khác nhau giữa hai loại này ở mức độ kết tinh của nó và kích cỡ kết tinh của
A – BC nhỏ hơn S – BC.

1.1.3. Tính chất lí hóa của BC
Khả năng tương thích sinh học cao
Cấu trúc sợi nano trong BC mang một số đặc điểm tương đồng với các
thành phần ngoại bào, đặc biệt với collagen. Các sợi collagen và BC có kích
thước tương tự nhau khoảng 100nm [20]. Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra BC


8

như một vật liệu collagen [31]. Trong y sinh ứng dụng, BC đang được tìm
hiểu về vai trò sử dụng như collagen. Tuy nhiên, BC có thể có lợi thế so với
collagen ở đặc điểm không gây dị ứng với hệ miễn dịch. Vì collagen có bản
chất protein nên dễ bị nhận biết với hệ thống miễn dịch và dễ bị kích hoạt
phản ứng miễn dịch, trong khi đó BC có lợi thế riêng biệt như một
polysaccharide là ít miễn dịch kích thích.
Khả năng tương thích sinh học của BC đã được nghiên cứu và chứng
minh thành công trong các nghiên cứu trước đây [39]. Khả năng tương thích
sinh học của BC được nghiên cứu cho đến nay vẫn cho kết quả tương tự.
Helenius và cộng sự (cs) (2006) [28] trong một nghiên cứu in vivo cấy
cellulose vi khuẩn dưới da ở chuột. Kết quả cho thấy sau 12 tuần, phát hiện
bằng kính hiển vi cho thấy không có viên nang hoặc các tế bào xơ cho thấy cơ
thể không phản ứng với BC (Hình 1.4). Hơn nữa, quanh vết cấy không có
hiện tượng bị đỏ, sưng, hoặc tiết dịch.

a. Một tuần sau khi cấy, BC cho thấy không có dấu hiệu phản ứng tại vị trí cấy.
b. Độ phóng đại cấu trúc xốp của BC cho thấy xâm nhập của nguyên bào sợi thành các
mạng lưới BC sau 12 tuần cấy. Đầu mũi tên là dấu hiệu của collagen được tổng hợp bởi
các nguyên bào sợi.

Hình 1.4. Thí nghiệm cấy BC dưới da động vật thí nghiệm [28]

Độ bền cơ học lớn: BC có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng
nhẹ, độ bền đáng kể [10].


9

Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [49], [55].
Khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm: BC có cấu trúc dạng xốp nên có
khả năng giữ nước đáng kể. Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể
hút khoảng 200 lần trọng lượng của nó. Bên cạnh đó BC còn có khả năng giải
phóng nước kéo dài. Đây cũng là đặc tính của BC mà các nhà khoa học nghiên
cứu ứng dụng BC trong lĩnh vực giải phóng thuốc [10], [14], [19], [55].
Tính chất của BC có thể thay đổi ở mỗi quá trình tổng hợp trong những
môi trường khác nhau [38]. Các nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay là
một nỗ lực để tìm kiếm các ứng dụng sáng tạo BC làm vật liệu hấp thu và giải
phóng thuốc điều trị nhiễm khuẩn trên da.
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC
Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả
các phân tử enzim, axit nucleic, và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy,
các nguồn hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh
vật. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất BC được thể hiện ở
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC
Nguồn cacbon

Năng suất

Nguồn cacbon

Năng suất tổng

monosaccharide

tổng hợp BC

disaccharide

hợp BC

D – Glucose

100

Lactose

16

D – Fructose

92

Maltose

7

D – Galactose

15

Surcrose

33

D – Xylose

11

Cellobiose

D – Arabinose

14

D – Sorbose

11

7 – 11


10

Nguồn nitơ: ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên liệu
cho cơ thể sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân
tử aminoaxit, nucleotit, các bazơ dị vòng [46]. Nguồn nitơ dễ hấp thu nhất với
vi sinh vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa
trong các thức ăn hữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn
nitơ hữu cơ là pepton, cao nấm men [46].

Nguồn dinh dưỡng khoáng: Photpho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất
trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật. Photpho có mặt trong
hầu hết các thành phần của tế bào. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho,
người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng photpho vô cơ như K2HPO4,
KH2PO4, KNO3,... Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng ảnh hưởng
đến quá trình tạo màng BC như Mg, Fe, S, Na, Ca, Mn, Cl,... Một trong số
nguyên liệu chủ yếu ngày nay được sử dụng để tạo màng BC là nước dừa già,
nước vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đường,... nên khi nuôi cấy không cần phải bổ
sung nguyên tố vi lượng nữa [46].
Các chất kích thích sinh trưởng: các vitamin như pyridoxin, axit
nicotinic, biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng
hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [46].
Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy vi
khuẩn thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần
hóa học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein
trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín. Đường ở đây có thể là glucose,
fructose, sucrose hay sirbitol. Ngoài ra, nước dừa còn nhiều khoáng chất,
vitamin, axit amin,... phù hợp cho quá trình hình thành màng BC [10]. Nước
gạo cũng là một trong những thành phần thích hợp để tạo màng BC vì trong


11

nước gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi
lượng như Fe, Zn,... và axit amin.
Ngoài ra các điều kiện nuôi cấy như độ pH, nhiệt độ, độ thông khí, thời
gian nuôi cấy,... cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC.
Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do
đó môi trường nuôi cấy thu màng BC cần được bổ sung thêm axit acetic nhằm
axit hóa môi trường, đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự

phát triển của vi sinh vật có hại [6], [46].
Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC là từ khoảng
250C đến 300C. Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm. Nếu nhiệt
độ quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của
tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [3], [6], [8], [10].
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên
quyết, quyết định đến năng suất tạo màng BC là độ thông khí.
Tùy vào thời gian nuôi cấy để người ta thu được màng với độ dày mong
muốn. Thường 24 giờ sau khi nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề mặt, phía
dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48 giờ sẽ hình thành lớp màng
mỏng và ngày càng dày lên.
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và
giải phóng thuốc qua da
1.2.1. Trên thế giới
BC là vật liệu hấp dẫn cho các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng BC làm vật liệu hấp thu và giải
phóng thuốc qua da.
Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thu và giải phóng thuốc
của màng BC định hướng sử dụng qua da với một số loại thuốc đã cho thấy


12

có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược điểm của thuốc ở dạng
thông thường.
Một trong những ứng dụng y sinh học nổi tiếng nhất của BC là như một
màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng. Các nghiên cứu của
một số tác giả như Fontana và cs (1990) [26]; Czaja và cs (2006) [24], Czaja
và cs (2007) [25] đã chỉ ra BC có khả năng băng kín vết thương, duy trì dịch
tiết, làm giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỉ lệ nhiễm

trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm tra. Bên cạnh đó, với vết
thương mất da, nhiễm trùng trên da, BC đáp ứng được nhu cầu giữ ẩm cho da,
tránh da bị khô (hình 1.7).

Hình 1.5. Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng [25]
Để tăng khả năng giữ ẩm cho da của BC, một số tác giả nghiên cứu về
lidocaine [53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin
[45], benzalconium chloride [19] và sulfadiazine bạc [37] cho thấy việc bổ sung
glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho
bề mặt da. Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro cho thẩm
thấu qua da và so sánh với cách thức thông thường. Kết quả cho thấy
lidocaine hydrochloride (là chất tan trong nước tương tự như neomycin) giải
phóng từ BC qua màng da nhân tạo chậm hơn ibuprofen (một chất ưu lipit).
Kết quả này cho thấy màng BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức
tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỉ lệ giải


13

phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế
cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn [54].
Bên cạnh đó, Luan J. và cs (2012) [37] đã nghiên cứu màng BC cho băng vết
thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều
trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng
BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine đắp lên vết thương, hoạt động kháng khuẩn
đối với P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi
hay dung dịch thông thường.

Hình 1.6. Màng BC- lidocaine hydrochloride ứng dụng trên da [42]

Hình 1.7. Sử dụng màng BC nạp thuốc điều trị nhiễm khuẩn [33]
Nghiên cứu của Bhavana V. và cs (2016) [19] cho thấy màng khô BC
thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng
khuẩn) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được
tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống
lại hoạt động của S. aureus và B. subtilis. Pinto R.J.B. và cs (2009) [44] đã
tiến hành tẩm sợi BC với các hạt nano bạc đã sản xuất thành công lên đến


14

99,99% hoạt tính kháng khuẩn chống lại E. coli và S. aureus. Đồng thời trong
các thí nghiệm trên vết thương hở bị nhiễm khuẩn, BC cũng có vai trò như
màng cản khuẩn, giảm sự xâm nhập của vi khuẩn mới, giúp vết thương nhanh
hồi phục [19]. Các S – enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao
huyết áp, có được giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate,
và đã thử nghiệm in vivo cho kết quả tốt [15], [22]. Một miếng dán có thể
giải phóng thuốc enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một
bể chứa gel và polyme in dấu phân tử (MIP) màng. Nghiên cứu về gel miếng
dán gồm của chitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8 giờ, Cmax của S –
propranolol đã đạt được (8,0 ± 1,0 microgam/ml) từ bể chứa 1,5mg
propranolol racemic [39]. Almeida I.F. và cs (2014) [14] cũng đã nghiên cứu
tiềm năng hấp thu và giải phóng thuốc của màng BC qua da thông qua việc
tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không được chiếu xạ.
BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hưởng
của BC chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC không chỉ có
khả năng hấp thu mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua
màng.
Các nghiên cứu thành công của các tác giả nêu trên cho thấy màng BC
có tiềm năng lớn trong việc làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da

hiệu quả.
1.2.2. Tại Việt Nam
Tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [6], [11]
đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng BC từ A. xylinum đạt hiệu quả
cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo
trong ứng dụng màng BC điều trị bỏng da với 2 loại màng BC gồm cho thêm
hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng
của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng màng thông thường.


15

Tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs (2012) [8], [9] đã nghiên cứu và chế
tạo thành công chế phẩm màng BC trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid
0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc
kích ứng da, không gây rối loạn toàn thân.
Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh
BC có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thu và giải phóng một số loại thuốc
qua da. Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển
ứng dụng màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc neomycin mục
đích giải phóng kéo dài thuốc sử dụng trên da.
1.3. Tổng quan về neomycin
Neomycin là loại kháng sinh nhóm aminoglycosid được phát hiện vào
năm 1949 từ phòng thí nghiệm của Waksman. Neomycin được sản xuất từ
môi trường nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [49].
1.3.1. Công thức
Tên thông thường: Neomycin
Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6 –
[(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –
[(2R,3R,4R,5S,6S) – 3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2

– yl] oxy – 3 – hydroxy – 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –
hydroxycyclohexyl] oxyoxane – 3,4 – diol [17].
Công thức phân tử: C23H46N6O13. Khối lượng phân tử: 614,65g/mol.

Hình 1.8. Công thức cấu tạo của neomycin [17]


16

1.3.2. Tính chất lí hóa
Ở dạng tinh khiết, neomycin có màu trắng hoặc trắng ngà, dễ tan trong
nước, rất khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [1], [39]. Quang
phổ hấp thu của neomycin ở bước sóng 277nm. Định tính neomycin trong các
chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt,...) sử dụng
phương pháp quang phổ hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [17].
1.3.3. Dược lí và dược động học
Neomycin có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram
dương gây nên các nhiễm khuẩn ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với
neomycin như: S. aureus, E. coli, H. influenzae,...
Cơ chế hoạt động của neomycin là ức chế sự tổng hợp protein của vi
khuẩn: bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm
đọc sai thông tin của ARN, làm hình thành các protein không có hoạt tính, ngoài
ra còn làm tách các protein ở trạng thái polyme thành monome. Kết quả là vi
khuẩn dễ bị chết do thiếu protein chức năng.
Cơ chế này gồm 4 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thuốc gắn vào protein là thụ thể chuyên biệt ở trên tiểu
đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn.
Giai đoạn 2: Thuốc phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên của quá
trình thành lập chuỗi peptit (mARN + formylmethiomine + tARN).
Giai đoạn 3: Thông tin mARN bị đọc sai ở vùng nhận diện của

ribosome, kết quả là một axit amin không phù hợp được đưa vào chuỗi
peptide, tạo một protein không có chức năng.
Giai đoạn 4: Sự gắn của thuốc làm vỡ các polysome thành các
monosome không có khả năng tổng hợp protein, các tác động này xảy ra ít
nhiều có tính đồng thời và kết quả là tế bào vi khuẩn bị chết [16].