Xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng human papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở việt nam bằng kỹ thuật realtime PCR
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.17 MB, 89 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------
Nguyễn Thanh Tâm
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG
HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG
THƢ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME PCR
LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------
Nguyễn Thanh Tâm
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG
HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG
THƢ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME PCR
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VÂN TRANG
TS. LÊ HỒNG ĐIỆP
Hà Nội - 2016
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vân Trang,
người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Lê Hồng Điệp cùng các thầy giáo,
cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn
Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy
và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời
gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại
Phòng Miễn dịch Vắc xin -Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp
đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệđộng
viên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Học viên
Nguyễn Thanh Tâm
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ADN/ ARN (Deoxi)ribonucleic acid
Vật chất di truyền
Primer
Mồi
-
HPV
Human Papillomavirus
Papillomavirus gây bệnh trên người
Hr-HPV
High risk HPV
Nhóm HPV nguy cơ cao
Lr-HPV
Low risk HPV
Nhóm HPV nguy cơ thấp
LRC
Long Control Region
Vùng kiểm soát dài của gen
PCR
Polymerase Chain Reaction
Probe
-
Đầu dò gắn huỳnh quang
Reverse
-
Primer ngược
ORF
Open Reading Frame
Khung đọc mở của gen
ORI
Origin
Vị trí khở đầu tái bản
OD
Optical density
Mật độ quang của mẫu ADN
URR
Upstream Regulatory Region
Vùng điều hòa của gen
UTCTC
-
Ung thư cổ tử cung
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………………………… ...
DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………………………………
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus...........................................................................3
1.1.1 Đặc điểm hình thái của HPV ........................................................................................3
1.1.2 Đặc điểm sinh học phân tử............................................................................................3
1.1.3 Phân loại HPV ..............................................................................................................8
1.2 HPV và ung thƣ cổ tử cung.........................................................................................12
1.2.1 Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới ..................................................12
1.2.2 Đường lây truyền của HPV.........................................................................................14
1.2.3 Các bệnh lý thường gặp do HPV, cách phòng nhiễm và điều trị................................14
1.2.4 Chu kỳ nhân lên và cơ chế gây bệnh của HPV...........................................................15
1.2.5 Các phương pháp phát hiện HPV ..............................................................................18
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP ................................................................26
2.1 Vật liệu ..........................................................................................................................26
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................26
2.1.2 Sinh phẩm và vật tư tiêu hao ......................................................................................26
2.1.3 Máy móc và thiết bị ....................................................................................................27
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................27
2.2.1 Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 ............27
2.2.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện
các chủng HPV 16, 18 và 33/52 ..........................................................................................29
2.2.3 Thẩm định phương pháp phát hiện chủng HPV16, 18, và 33/52................................32
2.3 Nội dung thực hiện.......................................................................................................34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN .......................................................................35 3.1 Xây dựng kỹ thuật Realtime
PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 .......35
3.1.1 Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe........................................................35
3.1.2 Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe ..........................................................40
3.2. Tạo chứng dƣơng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát
hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52.................................................................................42
3.2.1 Khuếch đại trình tự đích .............................................................................................42
3.2.2 Nhân dòng gen tạo chứng dương................................................................................43
3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR ...........................................48
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52.......................50
3.3.1 Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và
33/52 ....................................................................................................................................51
3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số tái lâp và hệ số lặp lại) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các
chủng HPV16, 18 và 33/52 ..........................................................................................52
3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại của phương pháp ..................................................................52
3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập của phương pháp ..................................................................56
3.3.3 Xác định độ đặc hiệucủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và
33/52 ....................................................................................................................................60
3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
.............................................................................................................................................61
KẾT LUẬN..........................................................................................................................67
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................68
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các type HPV và các bệnh có liên quan............................................................11
Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm HPV trên một số tỉnh thành phố tại Việt Nam...............................13
Bảng 1.3. Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV…………………………………...22 Bảng
2.1. Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe...........................29 Bảng
2.2. Thành phần kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe………………….29 Bảng 2.3.
Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích.................................................30 Bảng 2.4.
Chu kì nhiệt của phản ứng khuếch đại trình tự đích..........................................30 Bảng 3.1.
Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16….34 Bảng 3.2. Kết
quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18….36 Bảng 3.3. Kết quả
kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52.37 Bảng 3.4. Kết quả
kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC…………………..38 Bảng 3.5. Kết quả kỹ
thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, HPV18 và
HPV33/52……………………………………………………………………………...39 Bảng
3.6. Kết quả phản ứng Realtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dương….47 Bảng
3.7.Kết quả thí nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp…………………50 Bảng
3.8.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số lặp lại của phương pháp…………………..52 Bảng 3.9.
Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại…….53 Bảng
3.10.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập của phương pháp…………………55 Bảng
3.11. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập….57 Bảng
3.12. Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp…………………58
Bảng 3.13.Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy của phươngpháp……………………..61
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hạt vi rút của HPV ……………………………………………………………...3 Hình
1.2. Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16 ……………………………….4
Hình 1.3. Cây phả hệ của 118 genotype của Papilomavirus dựa trên trình tự gen vùng L1
ORF ......................................................................................................................................9
Hình 1.4. Tỷ lệ nhiễm HPV ở nữ giới trên thế giới .......................................................... .12
Hình 1.5. Chu kỳ nhân lên của HPV …………………………………………………….16 Hình
1.6. Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV ............................................................21 Hình
3.1. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR đơn cặp
primer và probe phát hiện HPV16 ……………………………………………………….35
Hình 3.2. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer
và probe phát hiện HPV18 ………………………………………………………………36
Hình 3.3. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer
và probe phát hiện HPV33/52 …………………………………………………………...37
Hình 3.4. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer
và probe IC ………………………………………………………………………………39
Hình 3.5. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và
probe phát hiện HPV16, 18 và 33/52 …………………………………………………40 Hình 3.6.
Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV16E6-E7, HPV18L1 …………41 Hình 3.7.
Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV52L1 ………………………....42 Hình 3.8.
Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV16E6-E7 ...........................................43 Hình 3.9. Kết
quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7 ..............................44 Hình 3.10. Kiểm
tra kết quả nhân dòng trình tự HPV18L1 ..............................................44 Hình 3.11. Kết quả
tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 ..................................45 Hình 3.12. Kiểm tra
kết quả nhân dòng trình tự HPV52L1 ..............................................46 Hình 3.13. Kết quả tinh
sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 ..................................46 Hình 3.14. Kết quả kỹ thuật
realtime đa cặp primer và probe với chúng dương ………..48
Hình 3.15. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định độ chính xác
…………………………………………………………………………………………….51 Hình
3.16. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số lặp lại
…………………………………………………………………………………………….52 Hình
3.17. Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại …………………..53 Hình
3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 1
……………………………………………………………………………………..56 Hình
3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 2
……………………………………………………………………………………..56 Hình
3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 3
……………………………………………………………………………………..56 Hình 3.21.
Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập …………………..57
Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu
…………………………………………………………………………………………….59 Hình
3.23. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ nhạy …..62
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
MỞ ĐẦU
Human papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm
trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử
cung (UTCTC), loại ung thư xếp thứ tư trong các loại ung thư mà nữ giới thường mắc
phải và xếp thứ hai với nữ giới độ tuổi 15-44[41].
HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò
quan trọng trong các nguyên nhân dẫn đến ung thư hậu môn, âm đạo, dương vật, ung
thư phổi và một số ung thư vùng hầu họng. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của
nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh
dục-hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinhv.v…[32]
Hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử
vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở
những nước đang phát triển[21]. Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân
UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới - đặc biệt ở khu vực Nam
Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục[21, 34].Cùng với
sự lây nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn
cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới.
Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2012, UTCTC
hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao ở nữ giới, xếp thứ 2 trong số các loại ung thư
mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với hơn 5000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 8.1/100.000
phụ nữ) và tử vong hơn 2000 trường hợp mỗi năm[40]. Điều đặc biệt quan tâm là phần
lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá
trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài. Quá trình tiến
triển từ mức dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai
đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 25 năm[22].Đây chính là cơ hội cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy
cơ mắc ung thư cổ tử cung nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền
ung thư và ung thư giai đoạn sớm.Hiện nay ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh
học (Pap smear) đã được đưa vào thành thường quy trong chương trình sàng lọc
UTCTC, các xét nghiệm HPV cũng đã phổ biến tuy nhiên chi phí còn cao đối với các
kit chẩn đoán đã thương mại
hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với các xét nghiệm trong nước[8].
Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc xác định genotype HPV, cũng như
1
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài "Xây dựng phƣơng pháp phát hiện một số
chủng Human Papillomavirus có nguy cơ cao gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt
Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR" được thực hiện với mục tiêu sau:
1.
Xây dựng phương pháp phát hiện chủng HPV 16, 18 và 33/52 bằng
kỹ thuật multiplex Realtime PCR.
2.
Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV 16, 18, 33/52 bằng
kỹ thuật multiplex realtime PCR trên mẫu dịch quét cổ tử cung.
Đề tài nàyđược chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ
sinh Dịch tễ Trung ương.
2
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
CHƢƠNG1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus
Papillomaviruslàcác thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy
trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con người. Các loài vật chủ khác nhau
sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho
người gọi là Human papillomavirus(HPV).
1.1.1Đặc điểm hình thái của HPV
HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ.Hạt virus có đường kính 5255nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein
cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được
sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu).
Hình 1.1.Hạt vi rút của HPV[14]
Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có
kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein
capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14].
1.1.2Đặc điểm sinh học phân tử
1.1.2.1 Cấu trúc hệ gen
HPV là virus có vật liệu di truyền là ADN, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn
tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-ADN).ADN của virus liên kết với histone tạo
thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm trong lớp vỏ
capsid protein.
3
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
Hình 1.2.Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16[14]
Cấu trúc hệ gen của nhóm Pappillomavirus nói chung tương tự nhau ở các
loài vật chủ, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên
một chuỗi ADN, điều này có nghĩa là quá trình phiên mã chỉ xảy ra trên một mạch duy
nhất. Hệ gen của HPV có 8 khung đọc mở ORF, có thể chia thành 3 vùng
chức năng[26]:
1. Vùng mã hóa sớm (Early region) gồm 6 gen mã hóa, ký hiệu là E1, E2,
E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF tương ứng. Sản phẩm của vùng
gen này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên ADN của virus,
gây hiện tượng tăng sinh tế bào và gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất
tử.
2. Vùng mã hóa muộn (Late region) gồm 2 gen mã hóa protein cấu trúc lớp
vỏ capsid L1 và L2.
3. Vùng kiểm soát dài LRC (Long Control Region) hay còn gọi là vùng điều
hòa URR (Upstream Regulatory Region) chứa ADN không mã hóa, có chức
năng điều hòa quá trình sao chép ADN và quá trình phiên mã. Đây là vùng
biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của bộ gen, tương đương 800
đến 1000bp tùy từng genotype khác nhau. Trình tự vùng này
gồm:
- Trình tự tăng cường là nơi gắn của các yếu tố phiên mã như AP-1,
NF1, TEF1, TEF2, YY1.
- Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu phiên mã
tổng hợp RNA (P97 ở HPV16 và P105 ở HPV18).
- Điểm khởi đầu sao chép ORI và một số chuỗi gen câm (Silencing
gene).
4
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
1.2.2.2Chức năng và sản phẩm của các gen HPV
Chức năng gen E1
HPV là virus sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép ADN.
Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) mã hóa protein
chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép ADN và plasmid. Protein E1 gắn
vào vị trí khởi đầu của quá trình tái bản (ORI), thực hiện quá trình tháo xoắn ADN
(Helicase) và giúp chuổi gen của virus duỗi ra trong quá trình sao chép. Hoạt động tháo
xoắn ADN của E1 không cần ATP.
Khi xâm nhập vào trong tế bào, E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều
chỉnh quá trình sao chép của virus. Protein E2 còn có khả năng gắn với chuỗi ADN đặc
hiệu (ở vị trí E2-E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên cả hai chức năng của protein E2 đều do
gen E1 điều chỉnh.
Chức năng gen E2
Ngoài chức năng trong sao chép ADN của virus, protein mã hoá bởi gen E2
còn đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng như trong quá trình điều hòa
giải mã và duy trì ADN virus ở ngoài NST. Chức năng điều hòa giải mã của E2 được thực
hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gen của virus có ái lực với E2
và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của E2 trong quá trình giải mã
Trong hệ gen của nhóm HPV nguy cơ cao (HR-HPV), gen E2 mã hoá cho
protein có khả năng ức chế quá trình sao chéo bằng các yếu tố thúc đẩy biểu hiện các
gen ở vùng mã hóa sớm của virus, do đó khi nhóm HR-HPV cài gen vào trong NST vật
chủ sẽ làm tăng khả năng biểu hiện của gen gây ung thư E6, E7.
Chức năng của protein E1^E4 (quá trình splicing giữa gen E1 và
E4)
Giống như các protein khác của HPV, protein điều hòa E1^E4 là sản phẩm
được tạo ra từ mRNA kết nối chuỗi mã hóa 5 axit amin đầu tiên của E1 và ORF của E4
khi mở vòngdịch chuyển gen E1 và E4. Protein này có chức năng giúp cho quá trình
trưởng thành và phóng thích vi rút ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.
ProteinE1^E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của vi rút gồm:
(1) Dạng gen chứa nhiều leucine ở đầu tận cùng N liên quan đến keratin và cần thiết cho
nhân lên của ADN; (2) Vùng chứa nhiều proline ở đoạn trung tâm, chứa vị trí threonine
cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M và giải
5
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
mã của phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tương; (3) Đầu tận cùng C chứa domain đơn
dạng kiểu niêm mạc và điều hòa khả năng gen E1^E4 tạo ra sự polimerize, gắn với
DEAD-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợi keratin[23].
Chức năng của protein mã hoá bởi gen E5
Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nước,
kích thước nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nội chất của tế bào, cần thiết cho quá
trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ. Protein E5 là yếu tố tác động ngay
trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm vào trong tế bào, tạo ra phức hợp với các
thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưởng và biệt hóa tế bào đồng
thời giúp cho virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ
Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngặn chặn sự chết theo chu
trình (apotosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính virus gây ra. Khả năng của E5
gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu tố phát
triển và ức chế ATPase không bào.
Chức năng gen E6
Gen E6 mã hóa cho protein E6, gồm khoảng 150 acid amin hình thành cấu
trúc Cys-X-X-Cys gắn với Zn điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở ORF đầu tiên
trong chuỗi gen HPV và là một trong những protein gây ung thư chính của HPV.
Ba chức năng chính của protein E6 cũng là ba chức năng rất nguy hiểm đối
với tế bào vật chủ[12]:
(1)
Protein E6 của nhóm Hr-HPV liên kết hoặc không liên kết với protein
E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và sự phân chia này là liên tục, gây ra
bất tử tế bào. Protein E6 có khả năng gây tăng sản bằng cách ức chế chu kỳ nghỉ của vòng
tế bào do sự phá hủy ADN và gây thúc đẩy bệnh lý của tế bào. Khả năng gây ung thư của
E6 được điều hòa bởi hoạt động tương tác protein với protein. Một số tương tác protein
được mã hóa trên chuỗi E6 gồm: p53, protein liên quan đến E6 (E6AP), protein gắn với
E6 (E6BP), c-myc, p300/CBP, paxillin, protein PDZ, yếu tố điều hòa interferon 3 và
đồng phân của Bcl-2 (Bak).
(2)
Tương tác với p53 thông qua sự liên kết giữa E6 và E6AP bằng liên
kết ligand, tạo ra thoái triển của p53 (yếu tố giải mã và ức chế ung thư, có vai trò điều
hòa chính hoạt động ức chế tổng hợp ADN thông qua chu kỳ nghỉ của tế bào).
Bình thường, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự sai hỏng trong quá
trình nhân lên của ADN, gen ức chế ung thư p53 được hoạt hóa,dẫn đến dừng chu
6
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
kỳ tế bào và gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) thông qua hoạt động giải
mã của gen
Hơn nữa, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển
của protein PDZ, một protein được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết
cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào.
(3)
Liên kết với gen Rastrong quá trình bất tử tế bào và kích thích sự phát
triển của NIH3T3, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus.
Chức năng của gen E7[12, 29]
Protein E7 được mã hóa từ gen E7 gồm 98 acid amin, tuy kích thước nhỏ
hơn protein E6 nhưng lại giữ vai trò không kém phần quan trọng trong cơ chế gây ung
thư ở tế bào chủ.
Hoạt động chức năng của E7 trong cơ chế gây ung thư do (1) protein E7 có
vùng bảo tồn đầu tận cùng N và có domain gắn Kẽm ở đầu C giúp liênkết chặt chẽ hơn
với E6, hỗ trợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào; (2)E7 chứa mô típ gắn protein
pocket (LXCXE) giúp E7 gắn kết với các gen ứcchế khối u (như pRb) hoặc gắn với hai
protein pocket khác là p107 và p130 làmgiải phóng một số lượng lớn
yếu tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trìnhphiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào.
Protein E7 của HPV nhóm "nguy cơ cao" cũng như của nhóm "nguy cơ
thấp" đều có khả năng gắn kết với protein pocket. Tuy nhiên, sự ưu tiên gắnkết của
protein E7 với protein pocket khác nhau giữa hai nhóm HPV. Ái lựcliên kết này ở
những type "nguy cơ cao" cao gấp 10 lần so với ở những type "nguy cơ thấp".
Thông thường, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ của tế bào. Ở giai đoạn
phosphorin hóa, pRb ngắn với yếu tố sao chép E2F/DP (phức hợp hoạt hóa sao chép điều
khiển sự bộc lộ các gen ở giai đoạn S) gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợp sao chép.
Sang giai đoạn G1 muộn, pRb được phosphorine hóa bởi phức hợp cyclin/cdk, giải
phóng phức hợp E2E/DP do đó các gen thúc đẩy giai đoạn S được hoạt hóa và giải mã.
Trong trường hợp nhiễm HPV, sự bộc lộ gen E7 không cần quá trình
phosphorine hóa pRb để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F/DP. Sự kết hợp của E7 với
pRb đã được khử phosphorin dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP từ pRb và hoạt hóa
tiếp theo của phức hợp E2F. Do đó, sự bất hoạt E7 của pRb tạo điều kiện cho HPV có
khả năng vượt quả sự ức chế pRb trong chu kỳ tế bào.
7
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
Chức năng của gen L1 và L2
L1 và L2 là hai vùng gen cấu trúc còn gọi là vùng gen mã hóa muộn cho
protein vỏ capsid chính và phụ.Hình ảnh virus trên kính hiển vi điện tử cho thấy vỏ
capsid của HPV chứa 72 capsomere có cấu trúc vòng bảy cạnh trên hàng rào dạng lưới
icosahedral T=7 với kích thước đường kính khoảng 55nm. Gen L1 là vùng bảo tồn nhất
của vi rút và được dùng để phát hiện cũng như trong phân loại Papillomavirus.
Thành phần của vỏ capsid vi rút gồm protein capsid chính L1 và capsid phụ
L2. Chỉ cần biểu hiện gen L1,đểhình thành các hạt giả vi rút hoặc phân tử giống vi rút
(Virus-like particles, VLPs), các thành phần này khó phân biệt với vi rút thực sự và đóng
vai trò quyết định trong sản xuất kháng nguyên và vắc xin. Nếu L2 bộc lộ cùng với L1,
nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhưng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ
capsid.L1 và L2 được tổng hợp và gắn trên bề mặt của tế bào sừng (nơi giải phóng các
vi rút mới được hình thành).
Mặc dù protein L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid
nhưng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của vi rút
do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với protein
ức chế khối u PML (promyelocytic leukemia protein), cần thiết cho giai đoạn đầu của
quá trình xâm nhiễm.
1.1.3 Phân loại HPV
1.1.3.1 Phân loại theo sự tƣơng đồng trình tự nucleotide gen E6, E7, L1
Theo Hội phân loại virus học quốc tế (Iternational Committee on the
Taxonomy of Viruses), họ Papillomaviridae gồm 15 loại khác nhau (ký hiệu: Alpha-,
Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon-, Zeta-, Theta-, Iota-, Kappa-, Lambda-, Mu-, Nu-, Xi-,
Omikron-, Pi-papillomavirus)[9, 18, 31].
HPV là nhóm papillomavirus gây bệnh trên người và là một trong những
virus có nhiều genotype nhất. Trong hơn 100 genotype được biết đến xác định được
khoảng 40 genotype có khả năng gây bệnh và lây truyền qua đường sinh dục[14]. Mỗi
type gồm có các phân type (Subtype) khác nhau và dưới phân type được chia thành các
biến thể (variant) còn gọi là chủng virus[32].
Việc xác định type HPV không dựa vào huyết thanh như các loại virus khác
(virus viêm gan, HIV...) mà dựa trên mức độ giống nhau của thành phần nucleotide
8
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
và mức độ tương đồng giữa các thành phần acid amin trên chuỗi gen E6, E7 và L1
do đó, các type của HPV thường được gọi là các genotype[18].
Khi một type HPV có ít nhất 10% trình tự vùng gen E6, E7, L1 khác với các
genotype đã biết trước đó thì được xác định là một genotype mới. Một subtype trong
genotype được xác định là phân nhóm mới khi bộ gen của chúng khác 2-10% so với
phân nhóm khác trong cùng một genotype đã biết. Nếu các subtype có vùng mã hóa
khác nhau1-2% hoặc khác 5% ở vùng không mã hóa thì được gọi là các biến thể[18].
Hình1.3. Cây phả hệ của 118 genotype của Papilomavirus dựa trên trình tự gen
vùng L1 ORF[18]
Hầu hết HPV gây bệnh trên người và động vật đều thuộc nhóm Alphapapillomavirus (thích ứng niêm mạc) hoặc thuộc nhóm Gamma-papillomavirus (thích
ứng ở biểu mô sừng)[21].
9
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
Mỗi genotype của HPV có một sự thích nghi cao với một loại biểu mô nhất
định và khả năng gây bệnh của các genotype khác nhau là không giống nhau trên tế bào
đích, điều này còn phụ thuộc vào cách tác động khác nhau của từng vùng gen virus đối
với protein bao phủ tế bào chủ ở những vị trí khác nhau trên cơ thể[14]. Chính vì vậy,
HPV còn có thể phân loại theo khả năng gây bệnh và vị trí gây bệnh.
1.1.3.2 Phân loại theomức độ tác động của HPV trên tế bào chủ (khả năng gây
ung thƣ)
Dựa vào khả năng gây ung thu, HPV được chia làm 3 nhóm[14, 30]:
+ Nhóm genotype HPV "nguy cơ thấp" (Low-risk type): những genotype
thuộc nhóm này chỉ gây mụn cóc hoặc khối u lành tính. ADN của chúng ở dạng vòng
nằm ngoài nhiễm sắc thể(NST) chủ. Các genotype HPV trong nhóm "nguy cơ
thấp" thường gặp là: HPV6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89 và CP6108.
+ Nhóm genotype HPV "nguy cơ cao" (High-risk type): gồm những
genotype có khả năng tích hợp ADN vào hệ gen người, làm rối loạn quá trình nhân lên
của tế bào chủ gây ra hiện tượng tăng sinh và bất tử hóa tế bào hính thành các khối u
lành tính. Những genotype có khả năng gây ung thư thường gặp gồm HPV 16, 18, 31,
33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 và HPV 26, 53, 66. Theo các nghiên cứu
trên toàn thế giới, HPV là nguyên nhân gây ra 100% của các ca ung thư cổ tử cung
Trong đó HPV16, HPV18 là nguyên nhân dẫn đến 70% các ca ung thư cổ tử cung, 4167% các tổn thương tế bào biểu bìmức cao (HSIL) và 16-32% các tổng thương mức
thấp (LSIL) của ung thư cổ tử cung, tiếp theo là nhóm HPV31, 33, 35, 45, 52, 58 gây
20% các ca ung thư cổ tử cung[41].
+ Nhóm genotype HPV "chưa xác định nguy cơ" (Unknown-risk type): gồm đa
số các genotype HPV chưa xác định được khả năng gây ung thư như HPV 2a, 3, 7, 10,
13, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 91.
1.1.3.3 Phân loại theo vị trí gây bệnh của HPV (khả năng kích ứng của HPV trên
tế bào đích)
Theo vị trí gây bệnh, HPV được chia thành 3 nhóm[14]
+ Nhóm HPV thích ứng biểu mô sừng: những genotype HPV ở nhóm này có
khả năng xâm nhiễm trên da, hình thành các dạng hạt cơm thông thường (HPV 2, 4, 26,
27, 29, 57), hạt cơm phẳng (HPV 1, 2, 4), hạt cơm Butcher (HPV7). Tổn thương
thường xuất hiện ở vùng da mặt, cổ và tay chân. Đặc biệt, một số genotype HPV ở
10
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
nhóm này còn cả khả năng gây loạn sản biểu bì dạng hạt cơm (HPV 2, 3, 5, 8, 9, 10,
12, 14, 15, 17, 19, 20, 25, 36, 37, 46, 47, 50), một dạng bệnh lý nghiêm trọng có khả
năng dẫn đến ung thư da và thường xuất hiện trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch.
+ Nhóm thích ứng tế bào niêm mạc, không phải là niêm mặc đường sinh dục:
gồm HPV có khả năng gây bệnh ở niêm mạc miệng, hầu họng (HPV 6, 11, 13, 32), gây đa
bướu gai hô hấp tái diễn. Một số HPV là nguyên nhân gây bệnh lý lành tính (khối u sùi)
hoặc gây bệnh lý ác tính (ung thư) vùng hậu môn, ung thư phổi (HPV 6, 11, 16, 18, 33,
52).
+ Nhóm gây kích ứng tế bào niêm mạc đường sinh dục: nhóm HPV này gây
ra các bệnh lý tại đường sinh dục như sùi mào gà (HPV 6, 11, 42, 43, 44, 54), ung thư
cổ tử cung, ung thư dương vật, ung thư âm hộ, ung thư âm đạo (HPV 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82).
Bảng 1.1.Các type HPV và các bệnh có liên quan[20]
Typea HPV
Bệnh lý
Các mụn cơm bàn chân
1, 2, 4, 63
Các mụn cơm phổ biến
2, 1, 7, 4, 26, 27, 29, 41, 57, 65, 77, 3, 4,10, 28
Các mụn cơm phẳng
3, 10, 26, 27, 28, 38, 41, 49, 75, 76
Các thương tổn về da khác (ví dụ: các
nang biểu bì, ung thư thanh quản)
6, 11, 16, 30, 33, 36, 37, 38, 41, 48, 60, 72, 73
Tạo hột cơm loạn sản biểu bì
2, 3, 10, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 36, 37, 38, 47, 50
U nhú đường hô hấp có định kỳ
6, 11
Siêu loạn sản biểu bì trung tâm của Heck
13, 32
U nhú liên kết/ ung thư
6, 11, 16
Tân loạn sản nội bì tử cung
Không chuyên biệt
30, 34, 39, 40, 53, 57, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69
Nguy hại thấp
6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 74
Nguy hại cao
16, 18, 6, 11, 31, 34, 33, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52,
56, 58
Ung thư cổ tử cung
16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68, 70
a
Genotype in đậm có tần xuất xuất hiện nhiều hơn so với các genotype in thường trong từng thể
bệnh.
11
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
1.2 HPV và ung thƣ cổ tử cung
1.2.1 Tình hìnhnhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới
HPV là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất gây ra các bệnh lây
truyền qua đường tình dục đối với cả nam giới và nữ giới trên khắp thế giới. Theo kết
quả báo cáo của tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), trên toàn thế giới có
khoảng 6,6% phụ nữ độ tuổi từ 15 đến 74 nhiếm HPV và khoảng 80% phụ nữ nhiễm
HPV ít nhất một lần trong suốt đời sống tình dục của họ[16].Vào năm 1976, Harold zur
Hausen, một nhà virus học người Đức đã chỉ ra mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung
thư cổ tử cung. Kể từ đó, đã có rất nhiều nghiên cứu dịch tễ học, nghiên cứu in vitro
chứng minh mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung[19]. Ung thư cổ tử
cung chiếm trên 25% trong tổng số các ca ung thư trên phụ nữ ở các quốc gia phát triển,
là nguyên nhân đứng sau ung thư vú gây tử vong cho phụ nữ trên thế giới[20]. Ước tính
vào năm 2002 trong 1 triệu ca mắc bệnh ung thư nói chung có khoảng 500.000 trường
hiện hợp đang mắc ung thư cổ tử cung và 275.000 người đã tử vong vì căn bệnh này
chiếm 1/10 số phụ nữ bị tử vong do tất cả các dạng ung thư[13].
Hình 1.4. Tỷ lệ nhiễm HPV ở nữ giới trên thế giới[41]
Theo lứa tuổi, nhóm tuổi dưới 25, tỷ lệ nhiễm HPV ở châu Âu chiếm tỷ lệ
cao nhất (50%), tiếp đó đến Trung Á (38%), Châu Úc và Châu Á (21%). Ở nhóm tuổi
từ 35 đến 50, tỷ lệ nhiễm HPV có sự thay đổi ở các khu vực, đặc biệt ở khu vực châu Phi
và châu Âu. Châu Âu có tỷ lệ nhiễm HPV giảm rõ rệt theo độ tuổi tăng dần của phụ nữ
(15%) nhưng ngược lại, Châu Phi lại có tỷ lệ nhiễm HPV tăng cao
hơn so với phụ nữ trẻ tuổi dưới 25 (20%)[16]
12
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
Theo giới, HPV nhiễm phổ biến nhất trong các phụ nữ trẻ ở độ tuổi hoạt
động giới tính (khoảng từ 18-30 tuổi). Có chiều hướng giảm rõ rệt ở sau 30 tuổi. Tuy
nhiên ung thư cổ tử cung lại phổ biến ở phụ nữ trên 35 tuổi hơn các phụ nữ dưới 35
tuổi qua đó đề xuất rằng sự nhiễm HPV xảy ra ở các lứa tuổi trẻ và phát triển chậm
chạp qua thời gian dài thành ung thư cổ tử cung[15]. Nam giới cũng là nguồn mang
HPV có hoặc không biểu hiện thànhcác triệu chứng nhưmụn cóc sinh dục, ung thư
dương vật, ung thư hậu môn v.v. Tỷ lệ nhiễm HPV chung ở nam trên toàn thế giới trung
bình khoảng 7,9%, dao động từ 3,5 - 45% tùy theo độ tuổi và các quốc gia khác nhau,
trong đó tỷ lệ các type HR-HPV từ 2,3% đến 34,8% và HPV 16 là type thường gặp
nhất. Tỷ lệ nhiễm type LR-HPV từ 2,3% đến 23,9%. Tình trạng đa nhiễm các type
HPV ở nam cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao (3,422,6%). Như vậy, tỷ lệ nhiễm chung ở nam (7,9%) thấp hơn so với ở nữ (17,9%).
Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng dân cư nữ thay đổi theo
vùng địa lý, nghiên cứu (năm 2015) trên 6 tỉnh thành từ năm 2000 đến năm 2006 cho thấy
tỷ lệ nhiễm virus HPV chung là 7,9%, cao nhất ở Cần Thơ (14,0%) và thấp nhất ở Hà
Nội (5,3%), tỷ lệ nhiễm của từng vùng được trình bày trong Bảng 1.2[36]. Trong một
nghiên cứu của Thẩm Chí Dũng và cộng sự (2013) trên phụ nữ độ tuổi 18-45 tại Hà Nội
và Hồ Chí Minh, ước tính tỷ lệ nhiễm HPV chủng nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) là 8,2%. Tỷ lệ phụ nữ nhiễm HPV ở Hà Nội cao hơn Hồ
Chí Minh,ADN HPV đã được dò tìm ra trong khoảng 9.7% phụ nữ Hà Nội và 6.8%
phụ nữ ở thành phố Hồ Chí Minh[27, 37].Tốc độ mắc ung thư cổ tử cung xâm lấn
(invasive cervical carcinoma-ICC) ở thành phố Hồ Chí Minh - phía nam Việt Nam cao
hơn gấp 4 lần tỷ lệ mắc ở Hà Nội - phía bắc Việt Nam[1-2].
Bảng 1.2.Tỷ lệ nhiễm HPV trên một số tỉnh thành phố tại Việt Nam[36]
Tỉnh/ Thành phố
Cỡ mẫu
Hà Nội
3,994
Hồ Chí Minh
4,020
Cần Thơ
750
Đắk Lắk
Thái Nguyên
Thừa Thiên-Huế
472
750
750
13
Tỷ lệ nhiễm
(95%CI)
5.6
10.5
14.0
9.9
9.4
7.9
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
1.2.2 Đƣờng lây truyền của HPV
HPV có thể được lây truyền trực tiếp qua da, niêm mạc hay các vết thương
hở từ người bệnh sang người lành trong đó lây truyền qua đường tình dục chiếm đa số.
Hoạt động tình dục đồng giới hoặc khác giới qua đường sinh dục, miệng và hậu môn đều
là nguyên nhân lây truyền trực tiếp HPV.Nguy cơ lây nhiễm HPV tăng theo số lượng
bạn tình của mỗi cá thể.
HPV còn có thể được lây truyền qua tiếp xúc với da, từ da sang niêm mạc
hoặc từ niêm mạc sang niêm mạc dưới dạng dịch tiết của mụn cơm, qua nước bọt hoặc
qua các vật dụng như khăn mặt, quần áo mang HPV của người bệnh.
Ngoài ra HPV cũng lây truyền từ mẹ sang con trong quá trình chu sinh, dịch
tiết nhiễm HPV từ đường sinh dục của mẹ lây truyền trực tiếp và niêm mạc mắt, miệng
và đường hô hấp trẻ sơ sinh và là nguyên nhân của các bệnh lý dai dẳng tại đường hô
hấp do HPV[1].
1.2.3 Các bệnh lý thƣờng gặp do HPV, cách phòng chống và điều trị
1.2.3.1 Các bệnh lý thƣờng gặp do nhiễm HPV
Nhiễm HPV là nguyên nhân dẫn đến rất nhiều bệnh lý như là các bệnh lý
lành tính: mụn cơm, loạn sản thượng bì dạng hạt cơm, u nhú thực quản, sùi mào gà, đa
bướu gai hô hấp tái diễn; Các bệnh lý ác tính: ung thư da không phải u hắc tố, ung thư
dương vật, ung thư cổ tử cung, ung thư hậu môn, ung thư vùng hầu họng, ung thư phổi.
1.2.3.2 Cách phòng nhiễm HPV
Vắc xin phòng HPV: Do không nuôi cấy được, vắc xin HPV được sản xuất
bằng quá trình tái tổ hợp tạo các hạt giả virus (virus-like-particles, VLPs) cấu trúc
giống HPV gồm các kháng nguyên L1, L2 ở lớp vỏ capsid nhưng không mang vật chất
di truyền bên trong. Hiện nay có hai loại vắc xin được sử dụng phổ biến trên thế giới là
Gardasil® (đặc hiệu với type 6, 11, 16, 18; sử dụng cho nữ 9-26 tuổi và cho nam 11-26
tuổi chưa từng quan hệ tình dục) và Cervarix® (đặc hiệu HPV type 16, 18; sử dụng cho
nữ từ 10 đến 45 tuổi). Cả 2 loại vắc xin này đã được FDA công nhận và được sử dụng
rộng rãi trên thế giới để phòng nhiễm HPV. Tháng 12/2014 tổ chức FDA của Mỹ đã công
bố thêm một loại vắc xin mới là Gadasil® 9, sử dụng cho nữ giới 9-26 tuổi và nam giới
9-15 tuổi; ngoài khả năng phòng nhiễm các genotype HPV 6, 11, 16, 18 như Gadasil®
thông thường thì Gadasil® 9 còn phòng ngừa thêm các genotype HPV nguy cơ caokhác
như 31, 33, 45, 52 và 58[42].
Thực hiện hành vi tình dục an toàn: Việc sử dụng bao cao su cũng là biện
pháp giúp hạn chế các bệnh lây truyền qua đường tình dục và góp phần phòng lây
14
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
nhiễm HPV tuy nhiên bao cao su không phòng tránh lây nhiễm HPV qua tiếp xúc da
hoặc qua đường miệng.
1.2.3.3 Điều trị
Đa số HPV xâm nhiễm vào tế bào chủ chỉ tồn tại trong thời gian ngắn,
khoảng 90% HPV bị đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đáp ứng miễn dịch
(IgA) trong 12 đến 36 tháng đầu sau nhiễm.
Những tổn thương tại chỗ ở biểu mô trên da và niêm mạc được điều trị lạnh,
phương pháp lazer hoặc bằng phương pháp cắt vòng bằng điện.Ở những bệnh nhân ung
thư do HPV, phẫu thuật là phương pháp được sử dụng chủ yếu. Xạ trị và hóa trị được sử
dụng để ngăn chặn lây lan sau phẫu thuật hoặc trong trường hợp bệnh nhân không thể phẫu
thuật được.
1.2.4Chu kỳ nhân lênvà cơ chế gây bệnh của HPV
1.2.4.1 Chu kỳ nhân lêncủa HPV
Chu kỳ nhân lêncủa HPV liên quan chặt chẽ với tế bào biểu mô vật chủ,được
chia làm 4 giai đoạn[11]:
(1) Giai đoạn xâm nhập: Vị trí đầu tiên HPV xâm nhập vào là lớptế bào đáy
ở những vị trí dễ tổn thương. Ở giai đoạn này, số lượng vi rút thấp và tồn tại ở dạng
episomal tách rời với gen của tếbào vật chủ.
(2) Giai đoạn tiềm tàng: ADN HPV có thể tồn tại rất lâu với số lượng ítvà
không sao chép, không tạo các hạt virus. Các gen E1, E2 rất cần thiết chosự nhân lên
của vi rút ở giai đoạn này.
(3) Giai đoạn nhân bản mạnh: Cùng với quá trình nhân lên và biệt hóatừ
lớp tế bào đáy lên các tế bào ở lớp trên, các tế bào sừng bị nhiễm HPV mớihình thành
cũng di chuyển lên các lớp trên, các gen muộn HPV được bộc lộvà khởi động giai đoạn
tăng sinh của vi rút, ADN HPV được nhân lên trong tếbào chủ. Chu kỳ nhân lên của vi
rút không kèm theo hiện tượng chết hoặcphân hủy tế bào do vậy không gây hiện tượng
viêm và sản xuất các cytokinetiền viêm. Các gen E5, E6, E7 tác động hỗ trợ cho hoạt
động nhân lên của virút đồng thời tăng hoạt động tổng hợp ADN của tế bào chủ và ngăn
hiệntượng appotosis.
(4) Giai đoạn giải phóng: Ở lớp tế bào sừng ngoài cùng, gen L1 và L2có vai
trò hình thành vỏ capsid cho ADN của vi rút. Các hạt vi rút mới đượchình thành giải
phóng ra bề mặt tế bào sừng.Quá trình biểu hiện gen và quá trình phát triển nhân lên
của vi rút xảyra trong nhân tế bào chủ, liên quan chặt chẽ với quá trình tăng sinh của tế
bàochủ ở lớp tế bào đáy mà không có giai đoạn HPV di chuyển
15
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
trong máu. Tuynhiên, HPV ADN vẫn có thể được tìm thấy trong các tế bào bạch cầu
đơnnhân máu ngoại vi, trong các tế bào di căn của bệnh nhân ung thư doHPV, các
trường hợp đồng nhiễm HIV. Điều này được giải thích do trong quátrình biểu hiện gen
và trong quá trình nhân nhân bản mạnh của vi rút đã xảyra hiện tượng đứt gãy đoạn gen
E2 và gen E6.
Có nhiều cơ chế giải thích sự lẩn trốn của HPV khỏi đáp ứng miễn dịchcủa
vật chủ, gây nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến sự biến đổi tế bào. Gen E6 vàE7 của HPV
nhóm "nguy cơ cao" làm cơ thể suy giảm khả năng sản xuấtinterferon, cytokine, ức chế
đáp ứng miễn dịch tự nhiên tiêu diệt vi rút và điềuhòa miễn dịch. Gen E6 có khả năng
gắn vào yếu tố 3 điều hòa interferon(IRF-3) gây ức chế chức năng hoạt hóa của yếu tố
này. Đồng thời, gen E7phản ứng với IRF-1 gây ức chế sự sao chép đối với yếu tố thúc
đẩy IFN-1.Mặc dù, HPV có khả năng lẩn trốn khỏi cơ chế đáp ứng bảo vệ của cơthể vật
chủ nhưng hầu hết các trường hợp nhiễm HPV diễn ra ngắn và tổnthương có thể tự hết
trong vòng 1 năm hoặc dưới tác động của đáp ứng của hệmiễn dịch cơ thể. Khoảng 91%
HPV bị loại bỏ tự nhiên trong năm đầu saunhiễm và 70% xảy ra trong năm thứ hai. Tuy
nhiên, một tỷ lệ nhỏ HPV có
thểtồn tại dai dẳng ở lớp tế bào đáy và là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi tế bào.
Hình 1.5. Chu kỳ nhân lên của HPV[21]
16
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
1.2.4.2 Cơ chế gây bệnh của HPV
HPV lây truyền chủ yếu qua đường tình dục, có khả năng gây biến đổi tế bào
và dẫn đến ung thư qua các bước sau[6, 10]:
(1)
Xâm nhập chuỗi gen của HPV vào tế bào chủ: Bộ gen của HPV xâm
nhập vào chuỗi gen của vật chủ ở dạng episome (ADN dạng vòng ở ngoài NST vật chủ)
đối với nhóm LR-HPV hoặc tích hợp ADN vào NST vật chủ đối với nhóm HR-HPV.
Ở dạng episome, vùng gen mã hóa E2 không bị biến đổi. Nồng độ protein E2 tăng
lên cùng với sự tăng cường sao chép ADN HPV gây hiện tượng tăng sinh tế bào đồng
thời ức chế giải mã vùng gen mã hóa sớm và ức chế hoạt động của gen E6, E7. Khi E6,
E7 bị ức chế sẽ hoạt hóa con đường p53 và yếu tố ức chế hình thành khối u pRb giúp
tế bào sửa chữa hoặc chết theo chương trình phụ thuộc vào mức độ của sự tác động phá
hủy. Do đó, có hiện tương tăng sinh một số lượng lớn tế bào nhưng vẫn dưới sự kiểm soát
của p53 và pRb.
Khi chuỗi gen HPV xâm nhập và NST của vật chủ sẽ làm hỏng và phá vỡ ORF
của gen E2 làm cho protein E2 không được tổng hợp và giải phóng gen E6, E7 khởi trạng
thái ức chế. Chính việc mất kiểm soát các gen E6, E7 đã gây ra những tổn thương
nghiêm trọng cho tế bào chủ. Hai oncogen E6, E7 sẽ tổng hợp ồ ạt các protein tương
ứng có khả năng gắn và làm giảm chức năng của các protein điều hòa chu kỳ của tế bào
p53 (protein ức chế khối u) và pRb; bất hoạt các cyclin của tế bào (cell cyclins) và các
kinase phụ thuộc cyclin (cyclin dependent kinases) đây là điều kiện quan trọng gây biến
đổi gen tế bào chủ[23].
(2)
Gây bất tử hóa tế bào: Protein E6, E7 của các genotype nhóm HR-
HPV có khả năng kết hợp với ras. Protein ras là phân tử truyền thông tin nội tế bào, khi
ras được hoạt hóa làm tế bào phát triển, biệt hóa và duy trì sự sống. Gen mã hóa protein
ras được coi là gen gây ung thư phát hiện đầu tiên. Cơ chế của protein E6 gây bất tử tế
bào được chứng minh bằng khả năng liên kết với p53,làm cho p53 bị phân giải nhanh
chóng theo con đường phân giải ubiquitin nội bào (cellular ubiquitin lygase). Do đó
protein p53 không tham gia được vào quá trìnhdừng tế bào ở pha G1-S, không kích hoạt
được quá trình chết theo chu trình (apoptosis) và sửa chữa ADN không được diễn ra.
Điều này đồng nghĩa với sự nhân lên một cách không kiểm soát của các tế bào bị
nhiễm HPV[23]. Bên cạnh đó, protein E7 của HPV tham gia vào cơ chế gây bất tử tế
bào bằng cách liên kết với pRb khiến protein
17
Luận văn tốt nghiệp
Nguyễn Thanh Tâm - K22
này ít được phosphoril hóa, qua đó phá vỡ sự kết hợp của pRb với yếu tố sao chép
E2F-1 (transcription factor), giải phóng E2F-1, kích hoạt phiên mã các gen cần cho quá
trình chuyển từ pha G1 sang pha S,dẫn đến sự mất kiểm soát của tế bào ở giai đoạn
chuyển pha G1-S, thúc đẩy sự phân chia không ngừng nghỉ của tế bào.
(3)
Gây bất ổn định gen tế bào chủ: Bất thường quá trình phân bào có thể
gây ra bởi protein E6, E7 của các genotype nhóm HR-HPV mà không gặp ở nhóm LRHPV, gây mất alen ở một số gen nhất đinh có liên quan đến sự xuất hiện và tiến triển của
ung thư. E6 gây bất ổn định gen do khả năng ức chế chức năng p53 dẫn đến rối loạn quá
trình sửa chữa ADN bình thường, do đó các sai hỏng của gen sẽ không được sửa chữa.
E7 gây bất ổn định gen thông qua sự bất hoạt của pRb và khả năng tác động tới quá trình
tổng hợp trung thể dẫn đến hậu quả là sự phân chia
ADN không bình thường trong quá trình phân chia tế bào[26]
(4)
Biến đổi đáp ứng với phá hủy ADN: Gen E6 và E7 gây mất khả năng
đáp ứng của cơ thể với sự phá hủy ADN. Khi có sự phá hủy ADN cơ thể đáp ứng bởi quá
trình hoạt hóa p53 tạo protein điều hòa giai đoạn nghỉ giữa hai chu trình nhân lên của tế
bào. Chính vì thế E6, E7 có khả nẳng ức chế giai đoạn nghỉ giữa các lần phân bào thông
qua sự ức chế p53. E6 chỉ kết hợp và bất hoạt p53, nhưng E7 không chỉ gây rối loạn
chức năng của pRb-yếu tố điều hòa chu trình tế bào, mà còn bất hoạt p21 chất ức chế
kinase phụ thuộc cycline, yếu tố cần thiết xuất hiện do p53
hoạt hóa[7]
(5)
Tăng sinh và biệt hóa tế bào: HPV nhân lên theo quá trình biệt hóa
của tế bào đáy dưới dạng episome, đồng thời nhân lên trong các tế bào lớp trên tế
bào đáy
1.2.5 Các phƣơng pháp phát hiện HPV
1.2.5.1 Xét nghiệm mô bệnh học
Sau thời gian tồn tại tiềm ẩn trong cơ thể, HPV sẽ kích hoạt tế bào cổ tử cung
sinh sản nhanh dẫn đến các tổn thương dị sản tế bào ở mức độ nhẹ (CIN-1), vừa (CIN2), nặng (CIN-3) rồi đến ung thư cổ tử cung. Xét nghiệm mô bệnh học xác định sự có
mặt của HPV thông qua sự thay đổi đặc hiệu cho những tế bào nhiễm HPV. Nhược
điểm của phương pháp này là chỉ phát hiện được HPV trong trường hợp sự xâm nhiễm
của tác nhân đã gây ra những biến đổi tế bào, ở giai đoạn sớm hơn khi chưa có những
thay đổi tế bào thì không thể phát hiện bằng phương pháp này[3].
18
