Nghiên cứu phân lập, tổng hợp, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của hợp chất murrayafoline a từ loài glycosmis stenocarpa (drake) của việt nam (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

Trần Quốc Toàn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TỔNG HỢP, CHUYỂN HÓA VÀ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT
MURRAYAFOLINE A TỪ LOÀI GLYCOSMIS
STENOCARPA (DRAKE) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62 44 01 17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017


Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công
nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường
2. TS. Trần Thị Thu Thủy
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Hội trường Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’,
ngày … tháng … năm 2017.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngay từ buổi bình minh của loài người, hợp chất thiên nhiên
đã đóng vai trò tối quan trọng trong đời sống hàng ngày của con
người. Ngày nay những hợp chất được phân lập từ động thực vật đã
được ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực của đời sống xã hội: sản
xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, thực phẩm, mỹ
phẩm,...Mặc dù công nghệ tổng hợp hóa dược hiện nay đã phát triển
mạnh mẽ, tạo ra được nhiều biệt dược nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong đi
rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược không vì thế mà
mất đi giá trị của chúng trong phòng và điều trị bệnh.
Vì vậy, nguồn dược liệu thiên nhiên vẫn là kho tàng quí giá
để tìm kiếm nhiều loại thuốc mới có hiệu lực cao. Có thể nêu ra một
vài ví dụ như vinblastin, vincristin là các hoạt chất phân lập từ cây
Dừa cạn (Catharanthus roseus họ Apocynaceae) chữa bệnh ung thư
máu, Taxoter-thuốc chữa ung thư vú, ung thư phổi là sản phẩm
chuyển hóa của một số ditecpenoit chiết xuất từ một số loài Taxus họ
Thông (Pinaceae).…..
Murrayafoline A, là một dẫn xuất carbazole phân lập từ một

số loài thuộc họ Rutaceae, đây một hợp chất có nhiều hoạt tính sinh
học quý báu đặc biệt là các hoạt tính kháng ung thư. Hiện nay trên
thế giới đã có nhiều nhóm nghiên cứu sâu hơn về hợp chất này. Tại
Việt Nam, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường đã
phát hiện sự có mặt của hợp chất này ở loài cơm rượu trái hẹp
(Glycosmis stenocarpa thuộc họ Rutaceae) và đã phát hiện hợp chất
này có hoạt tính kháng ung thư và kích thích tim mạch rất tốt.
Chính vì vậy, trong luận án này chúng tôi tập trung nghiên
cứu thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tổng hợp, chuyển hóa


và đánh giá tác dụng sinh học của hợp chất murrayafoline A từ
loài Glycosmis stenocarpa (Drake) của Việt Nam”.
2. Mục tiêu luận án:
Nghiên cứu phân lập từ rễ cây cơm rượu trái hẹp và tổng hợp
hợp chất murrayafoline A, tiến hành bào chế và chuyển hóa tạo dẫn
xuất, từ đó xác định các hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của
murrayafoline A và các dẫn xuất.
3. Luận án đã thực hiện những nội dung nghiên cứu sau:
-

Nghiên cứu quy trình phân lập Murrayafoline A từ rễ cây
cơm rượu trái hẹp.

-

Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất murrayafoline A.

-

Nghiên cứu chuyển hóa murrayafoline A thành các dạng
nano mixen và nano lyposome.

-

Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất triazole và chalcon của
hợp chất murrayafoline A.

-

Nghiên cứu các hoạt tính in vitro: gây độc tế bào, kháng
viêm, tim mạch của murrayafoline A và dẫn xuất tổng hợp
được.

-

Nghiên cứu hoạt tính in vivo: xác định độ an toàn (độc tính
cấp và bán trường diễn) và khả năng ức chế sự phát triển
khối u thực nghiệm của murayafoline A.

4. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 155 trang, được chia thành các phần như sau:
Mở đầu 02 trang; tổng quan 27 trang; phương pháp nghiên cứu và kỹ
thuật thực nghiệm 18 trang; kết quả và thảo luận 91 trang; kết luận
01 trang; các điểm mới của luận án 01 trang; danh mục các công
trình công bố 01 trang; tài liệu tham khảo 10 trang (gồm 129 tài
liệu). Luận án có 50 sơ đồ, 81 hình, 25 bảng.


NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

PHẦN 1 – TỔNG QUAN
Bao gồm hai chương, chương 1 là tổng quan về cây cơm
rượu trái hẹp: nguồn gốc thiên nhiên, hoạt tính sinh học & các dẫn
xuất của hợp chất murrayafoline A. Chương 2 là các phương pháp
tổng hợp carbazole được ứng dụng để tổng hợp murrayafoline A.
PHẦN 2 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC
NGHIỆM
Thực nghiệm & các kết quả được thực hiện và xác định tại
các phòng thí nghiệm thuộc các đơn vị: Viện Hóa học các hợp chất
thiên nhiên, Viện Hóa học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vật Liệu
– Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Khoa Dược –
Trường đại học Chungnam, Hàn Quốc; Đại học Aston Birmingham, Vương Quốc Anh.
2.1. Phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rƣợu trái hẹp (G.
stenocarpa)
Bột rễ (10 kg) G. stenocarpa khô được ngâm chiết với
metanol ở nhiệt độ 400C (3 lần x 30 l) sử dụng khuấy, lọc và cô cất
trong chân không. Phần cặn metanol được hoà trong 3

lít

MeOH/H2O (tỉ lệ 1 : 1). Và chiết phân bố bằng dung môi n – hexan,
thu được cặn chiết tương ứng là các cặn hexan (254 g)
Phân lập theo phương pháp sắc ký: Cặn chiết n-hexan được tiến
hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/EtOAc. Thu lấy
phân đoạn giàu murrayafoline A rồi kết tinh lại trong hệ nhexan/EtOAc (50/1 : v/v), lọc rửa phần chất rắn thu được
murayafoline A với hiệu suất 0,2% so với nguyên liệu
Phân lập theo phương pháp cất cuốn hơi nước: cặn chiết n-hexan
được bổ sung nước và tiến hành sục hơi nước, được ngưng tụ và dẫn

qua một bình chứa hỗn hợp dung môi n-hexan/EtOAc 9:1 (HA). Thu
lấy pha hữu cơ, làm khan, đuổi dung môi rồi kết tinh trong dung dịch
n-hexan/EtOAc (50/1), thu được 28,5 g Mu-A tinh sạch. Hiệu suất
đạt 0,285 % so với nguyên liệu ban đầu
2.2. Tổng hợp toàn phần murrayafoline A:
Đi từ chất đầu sẵn có trên thị trường là 5-metyl-2nitrophenol, từ hợp chất này tiến hành metyl hóa nhóm chức phenol
tạo 2-metoxy-4-metyl-nitrobenzen, khử hóa nhóm chức nitro tạo chất
trung gian chìa khóa 2-metoxy-4-metylanilin, sau đó tiến hành tạo
murrayafoline A theo hai phương pháp. Phương pháp 1: đóng vòng
carbazole trực tiếp với 1,2 diclobenzen bằng hệ xúc tác Pd(OAC)2,
dung môi NMP trong môi trường kiềm (phương pháp Ackerman),
hiệu suất thấp (<10%). Phương pháp 2: qua giai đoạn trung gian tạo
bisaryl bằng phản ứng với bromobenzen, sau đó đóng vòng carbazole
bằng phản ứng oxi hóa với xúc tác Pd(OAC)2, dung môi là axit
piruvic trong môi trường kiềm (K2CO3) (phương pháp Fagnou), hiệu
suất tốt (70% từ chất đầu -metyl-2-nitrophenol)
2.3. Tổng hợp dạng phức hợp mixen của murrayafoline A:
Chuẩn bị pha phân tán: Murrayafoline A được hòa tan bằng
hệ Hexan/EtoAc. Hỗn hợp bao gồm murrayafoline A/PEG
6000/EG/dầu đậu nành/H2O theo tỉ lệ xác định được đưa vào thiết bị
tạo nhũ trong thời gian 3 tiếng, tại nhiệt độ phòng. Sau đó sản phẩm
để qua đêm và được đem đi ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong thời
gian 30 phút. Sản phẩm là hỗn hợp đồng nhất ở dạng lỏng đồng nhất
có màu vàng nhạt có nồng độ murrayafoline A 100 mg/mL.
2.4. Tổng hợp dạng phức hợp liposome của murrayafoline A:
Hỗn hợp photpholipid và murrayafoline A (5/1 w/w) được
hòa tan trong hệ dung môi CM (Cloroform : Methanol = 9/1 v/v) với


nồng độ 10mg/ml. Một hỗn hợp lipid sử dụng để bọc là hệ

DSPC/cholesterol/PEG 2000 được hòa tan trong hệ CM rồi loại bỏ
dung môi trong chân không. Lipid được hydrat hóa trong hệ đệm
PBS (pH 7,0) với tỉ lệ 2,25 mg/ml ở 55 độ C và được khuấy trộn nhẹ
nhàng. Các hạt liposome được tạo thành bằng cách siêu âm trong 1
phút, tiến hành 3 lần để thay đổi kích thước hạt.
2.5. Tổng hợp các dẫn xuất dãy 1,2,3 – triazole của
murrayafoline A.
Tổng hợp Tổng hợp 1-methoxy-3-methyl-9-(3-bromo)propyl-9H-carbazole) (7) và 1-methoxy-3-methyl-9-(propen-2-yl)9H-carbazole (104): Hòa tan murrayafoline A trong dung môi THF
khan, bổ sung NaH và 1,3-dibromopropane, khuấy hỗn hợp ở nhiệt
độ phòng trong dòng khí trơ trong 72h. Chiết hỗn hợp bằng CH2Cl2,
làm sạch sau đó đem cặn thu được tách bằng sắc ký trên cột silica gel
với hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc : 6/1 (v/v) để thu được
các sản phẩm.
Tổng

hợp

1-methoxy-3-methyl-9-(3-azido)-propyl-9H-

carbazole (105):Hỗn hợp dung dịch của hợp chất 1-methoxy-3methyl-9-(3-bromo)-propyl-9H-carbazole

trong

acetonitrile

và

sodium azide (0,75 g; 11,25 mmol) được đun hồi lưu trong 72 h cho
đến khi chất đầu phản ứng hết. Làm lạnh hỗn hợp bổ sung 50 ml
EtOAc, rửa hỗn hợp lần lượt bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa (3 x 50

ml) và nước (50 mL). Tách phần dung môi hữu cơ bằng phễu chiết
rồi làm khô bằng Na2SO4 và đuổi dung môi làm khô bằng máy cô
quay chân không dưới áp suất giảm. Cặn thu được đem sắc ký trên
cột silica gel với dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc : 5/1 (v/v) cho
chất rắn màu trắng (2,11 g; hiệu suất 96%).


Bảo vệ nhóm chức amin amine: Hỗn hợp prop-2-yn-1amine (0,4 g; 7,26 mmol) và (Boc)2O (1,58 g; 7,26 mmol) được hòa
tan trong dung dịch THF/H2O (16ml, 1/1 : v/v); hỗn hợp được khuấy
nhiệt độ phòng trong 48 h. Sau khi phản ứng kết thúc, chiết hỗn hợp
bằng EtOAc (3 x 10ml). Rửa pha hữu cơ với dung dịch NaHCO3 5%
(10 ml), nước (2x10 m), sau đó làm khô với Na2SO4, và đuổi dung
môi dưới áp suất giảm. Cặn chất rắn thu được đem sắc ký cột silica
gel (n-hexane / EtOAc, 95: 5) thu được một chất rắn màu trắng ( hiệu
suất 94%).
Bảo vệ nhóm chức alcohol: Một hỗn hợp prop-2-yn-1-ol
(0,9 mmol) trong DMF (0,5 ml), t-butyldiphenylsilyl clorua
(TBDPS) (0,3 ml) và imidazol (74 mg) được cho vào bình cầu dung
tích 10 ml. Hỗn hợp được khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng, sau khi
phản ứng kết thúc, bổ sung 0,5 ml nước cất rồi chiết với diethyl ether
(4x1 mL). Làm khô pha hữu cơ bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới
áp suất giảm. Cặn chất rắn được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel (
dung môi rửa giải n-hexan/ EtOAC; 95: 5) thu được một hợp chất
dạng dầu không màu ( hiệu suất 96%).
Tổng hợp dẫn xuất 1,2,3-triazole của murrayafoline A: Các
dẫn xuất 1,2,3-triazole của murrayafoline A (106-a, b, d, f, g, h) được
tổng hợp bằng phản ứng Click. Quy trình như sau: dung dịch azide
(1 đương lượng; 0,1 g), alkyne (1,2 đương lượng) trong t-BuOH (2
ml); dung dịch sodium ascorbate (200 mol%) trong nước (1 ml) và
CuSO4;5H2O (20 mol%) trong nước (1 ml), tất cả được cho vào bình

cầu đáy tròn dung tích 10 ml trong khí quyển trơ. Hỗn hợp được
khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, bổ sung
dung dịch NH4OH (5ml) rồi chiết hỗn hợp bằng EtOAc (2 x 4 ml).
Pha hữu cơ được rửa bằng nước (5ml), làm khô bằng Na2SO4 và cô


cạn dưới áp suất giảm. Cặn chất rắn được tinh chế bằng sắc ký cột
silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc, thu được các
hợp chất 1,2,3-triazole của murrayafoline A.
Tổng

hợp

3-(1-methoxy-3-methyl-9H-carbazol-9-

yl)propane-1,2-diol (107): Hỗn hợp các chất bao gồm 1-methoxy-3methyl-9-(propen-2-yl)-9H-carbazole (45 mg; 0,18 mmol) trong
THF/H2O (10/1; 1 mL); NMP (63 mg; 3 eq) và OsO4 (4 % trong
nước; 23 ml; 0,36 mmol) được cho vào bình cầu dung tích 10 ml.
Hỗn hợp được khuấy ở 30oC trong 2h, Sau khi phản ứng kết thúc, bổ
sung dung dịch NaHSO3 20%, sau đó chiết hỗn hợp bằng EtOAc.
Phần hữu cơ được rửa bằng nước muối bão hòa và làm khô bằng
Na2SO4 sau đó đuổi dung môi. Phần cặn còn lại được tinh chế trên
cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là (CH2Cl2/MeOH : 9/1), thu
chất rắn màu trắng (36 mg, hiệu suất 70 %).
2.6. Tổng hợp các dẫn xuất chalcon của murrayafoline A:
Tổng hợp 1-methoxy-3-formylcarbazole (2): Hòa tan 422
mg (2 mmol) murrayafoline A bằng 55 ml CH3OH. Bình cầu được
bọc kín bằng giấy bạc để tránh ánh sang, khuấy đều rồi thêm 1,13 g
(2,5 eq.) DDQ. Hỗn hợp được khuấy 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung
dịch này được loại bỏ MeOH, hòa tan bằng CH2Cl2 và rửa với nước

cho đến khi dịch nước không màu. Lớp hữu cơ được làm khan, loại
bỏ dung môi thu được murrayaine thô chất này được làm sạch bằng
sắc ký cột silica gel dùng hệ n-Hexan:EtOAc 4:1 thu được
murrayanine với hiệu suất 32%
Tổng hợp các chalcon của murrayafoline A: Khuấy đều
một dung dịch gồm 225 mg (1 mmol) murrayanine và 1 mmol các
hợp chất chứa nhóm acetyl trong 10 ml ethanol tuyệt đối. Khi hỗn
hợp đồng nhất tiến hành nhỏ giọt 1 ml dung dịch NaOH 20 % vào.


Khuấy hỗn hợp nhận ở nhiệt độ phòng cho đến khi các chất đầu đã
chuyển hóa hết. Hỗn hợp được hòa trong nước đá và trung hòa bằng
dung dịch HCl 10%, khuấy đều. Lọc, rửa bằng nước, làm khô và tinh
chế bằng sắc ký cột/silica gel dùng n-hexane:EtOAc
2.7. Đánh giá tác dụng sinh học của murrayafoline A và các dẫn
xuất.
Hoạt tính in vitro:
-

Hoạt tính gây độc tế bào: được thực hiện trên các dòng tế bào
KB, LU-1, LNCaP, HL-60, Hep-G2 và SK-MEL-2

-

Hoạt tính kháng viêm: thực hiện trên tế bào tủy xương hình sao
(BMDCs). Mỗi hợp chất đều được thử hoạt tính trên các
interleukin-6 & 12, yếu tố hoại tử TNF-α sinh ra trong BMDCs

-

Hoạt tính tim mạch: được đánh giá trên tế bào cơ tâm thất chuột,
xác định khả năng tăng tính co bóp và lưu lượng ion Ca2+ type L
(ICa,L) của murrayafoline A

Hoạt tính in vivo: Được tiến hành theo phương pháp của Abrham
(1978) và và theo Quyết định về việc ban hành “Quy chế đánh giá
tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền” của Bộ Y tế Việt Nam, số:
371/BYT-QĐ ngày 12 tháng 3 năm 1996.
-

Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng, có trọng lượng 18-22

g, 4-5 tuần tuổi.


PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu murrayafoline A
3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng murrayafoline A bằng
HPLC.
Đường chuẩn có R2 = 0,9995, hệ dung môi CH3CN/H2O
(60:40, v/v); cột: Gemini 5u C-18 100A; 250 x 4.6 mm 5 µm;
detector : UV/VIS-151 GILSON; Thời gian chạy: 25 phút/mẫu; Thể
tích bơm: 20 μl. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng
murrayafoline A chiếm hàm lượng 0,38% ± 0,003 trong rễ cây cơm
rượu tính theo trọng lượng khô
3.1.1. Phân lập từ rễ cây cơm rƣợu trái hẹp
Murrayafoline A được phân lập theo hai phương pháp: sắc
ký và cất cuốn hơi nước. Kết quả cho thấy phương pháp cất cuốn hơi
nước cho hiệu suất cao hơn phương pháp sắc ký (75% & 52,6% so
với tổng lượng murrayafoline A có trong mẫu rễ khô)

3.1.2. Tổng hợp toàn phần murrayafoline A.
Murrayafoline A được tổng hợp theo hai phương pháp với sơ đồ
minh họa sau:


Các hợp chất được chứng minh cấu trúc bằng phổ cộng
hưởng từ hạt nhân
49: 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δH (ppm): 2,39 (s, 3 H, CH3); 3,92
(s, 3 H, CH3), 6,06 (br. s, 1 H, NH), 6,75–6,78 (m, 2 H, Ar-H), 6,96
(t, J = 7,3 Hz, 1 H, Ar-H), 7,15 (d, J = 7,5 Hz, 2 H, Ar-H), 7,25–7,35
(m, 3 H, Ar-H).
Murrayafoline A: 1H NMR (500MHz, CDCl3), δH (ppm): 2,65 (s, 3
H, CH3), 4,06 (s, 3 H, OCH3), 6,83 (s, 1 H, Ar-H), 7,28–7,35 (m, 1
H, Ar-H), 7,48–7,50 (m, 2 H, Ar-H), 7,60 (s, 1 H, Ar-H), 8,14 (d, J =
7.8 Hz, 1 H, Ar-H), 8,27 (br. s, 1 H, NH).
3.2. Xây dựng dạng phức hợp của murrayafoline A.
Mixen: Trong cấu trúc mixen này, murrayafoline A tan trong dầu
đậu nành và hỗn hợp này được phân tán thành các giọt nhỏ có kích
thước cỡ nano, sau đó các hạt này được bao phủ bởi PGE 6000 và
hydrat hóa thành dạng cấu trúc mixen bền vững trong môi trường
nước.
Kết quả xác định cấu trúc hạt bằng ảnh FE-SEM và thế zeta cho thấy
hạt có kích thước trong khoảng 30-50 nm và thế zeta đo được của
mẫu đạt ~ -38 mV đảm bảo tính bền vững/ổn định của hệ


b
a
Ảnh FE-SEM, phân bố kích thước và thế zeta của hệ mixen chứa
Mu-A.

Ảnh FE-SEM, phân bố kích thước và thế zeta của hệ liposome
chứa Mu- A.
Liposome: Trong cấu trúc liposome tạo thành, các phân tử
murrayafoline A có tính chất không phân cực (tan tốt trong pha dầu)
nên sẽ nằm giữa lớp lipid kép. Kích thước của liposome - Mu-A là từ
91,6 đến 144,3 nm, như vậy kích thước trung bình của hạt bằng
117,0 nm. Chỉ số polydispersity (PDI) là 0,299 ± 0,054, trong đó chỉ
ra rằng các liposome có phân bố kích thước đồng nhất. Liposome
bọc Mu-A đạt được sự ổn định với thế Zeta trong khoảng -33,2 ±
2,37 mV


3.3. Chuyển hóa tạo dẫn xuất 1,2,3-triazole của murrayafoline A
Các bước tạo dãy chuyển hóa chứa nhóm 1,2,3-triazole của
murrayafoline A:

Các sản phẩm tạo thành được xác định cấu trúc bằng các dữ kiện phổ
cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối lượng
7 HRMS (m/z): 331,0572
H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 7,99 (d, J = 7,5 Hz, H-5);

1

7,48 (s, H-4); 7,43 (m, H-6 & H-7); 7,18 (dd, J = 7,5 và 1,5 Hz, H-8);
6,73 (s, H-2); 4,69 ( t, J = 6,5 Hz, 10-CH2); 3,95 (s, OCH3); 3,37 ( t,


J = 6,5 Hz, 12-CH2); 2,50 (s, CH3); 2,39 ( quin., J = 6,5 Hz, 11CH2).
104 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH 8,01 (d, J = 7,5 Hz, H-5); 7,49

(s, H-4); 7,40 (d, J = 7,5 Hz, H-7); 7,33 (d, J = 7,5 Hz, H-8); 7,18 (d,
J = 7,5 Hz, H-6); 6,74 (s, H-2); 6,01 (m, 11=CH); 5,21 (d, J = 5,0
Hz, 10-CH2); 5,06 (dd, J =10,0 & 1,5 Hz, 12=CH2); 4,93 (dd; J =
17,0, 1,5 Hz, 1H); 3,95 (s, OCH3); 2,51 (s; CH3).
105 HRMS (m/z): 294,148
106a 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH (ppm): 8,01 (d, J = 7,5 Hz, H5); 7,70 (s, H-COOH); 7,49 (s, H-4); 7,41 (m, H-7 & H-5’); 7,25 (d,
J = 7,5 Hz, H-6); 7,19 (d, J = 7,0 Hz, H-8); 6,74 (s, H-2); 4,69 (t, J =
7,0 Hz, 12-CH2), 4,37 (t, J = 7,0 Hz, 10-CH2); 3,91 (s, OCH3); 2,51
(overlapped, CH3 & 11-CH2).
106b HRMS (m/z): 435,243
H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH (ppm): 8,01 (d, J = 7,5 Hz, H-5);

1

7,49 (s, H-4); 7,41 (t, J = 7.,5 Hz, H-7); 7,32 (br, H-5’); 7,26 (d, J =
7,5 Hz, H-6); 7,19 (t, J = 7,5 Hz, H-8); 6,74 (s, H-2); 4,69 (t, J = 7
Hz, 12-CH2); 4,35 (d, J = 6 Hz, 6’-CH2); 4,30 (t, J = 7 Hz, 2H); 3,93
(s, OCH3); 2,51 (s, CH3); 2,51 (quin., J = 7,0 Hz, 11-CH2); 1,43 (s,
C-(CH3)3).
106c CTPT: C20H23N5O
HRMS (m/z): 349,190
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 8,0 Hz, H-

1

5); 7,76 (s, H-5’), 7,48 (s, H-4); 7,40 (m, H6&H7); 7,16 (m, H-8);
6,83 (s, H-2); 4,72 (t, J = 7.0 Hz, 12-CH2); 4,44 (t, J = 7,0 Hz, 10CH2); 3,98 (s, 6’-CH2); 3,95 (s, OCH3); 2,50 (s, CH3); 2,46 (quin., J
= 7,0 Hz, 11-CH2).
106e CTPT: C20H22N4O2

HRMS (m/z): 350,1743
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 7,5 Hz, H-

1

5); 7,47 (s, H-4); 7,39 (t, J = 7,5 Hz, H-7); 7,31 (s, H-5’); 7,23 (d, J =
7,5 Hz, H-6); 7,17 (t, J = 7,5 Hz, H-8); 6,72 (s, H-2); 4,73 (s, 6’CH2); 4,65 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2); 4,28 (t, J = 7,0 Hz, 10-CH2); 3,90
(s, OCH3); 2,53 (br, 1H); 2,50 (s, CH3); 2,46 (quin., J = 7,0 Hz, 11CH2).
106f CTPT: C25H22F2N4O (hiệu suất 94%).
HRMS (m/z): 432,167
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 7,5 Hz, H-

1

5); 7,47 (s, H-4); 7,42 (t, J = 7,5 Hz, H-5’); 7,40 (t, J =7,5 Hz, H7)7,27 (m, H-6, H7’&H-11’); 7,19 (t, J = 7.5 Hz, H-8); 6,76 (m, H9’); 6,72 (s, H-2); 4,73 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2); 4,33 (t, J = 7,0 Hz,
10-CH2); 3,89 (s, OCH3); 2,56 (quin., J = 7,0 Hz, 11-CH2); 2,50 (s,
CH3)
106g CTPT: C26H23F3N4O
HRMS (m/z): 464,182
H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,00 (d, J = 8,0 Hz, H-

1

5); 7,98 (s, H-7’); 7,95 (d, J = 7,5 Hz, H-9’); 7,57 (d, J = 7,5 Hz, H11’); 7,50 (m, H-10’); 7,46 (s, H-4); 7,40 (t, J = 8,0 Hz, H-7); 7,28
(s, H-5’); 7,25 (d, J = 8,0 Hz, H-6); 7,19 (t, J = 8,0 Hz, H-8); 6,72 (s,
H-2); 4,73 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2); 4,34 (t, J = 7,0 Hz, 10-CH2); 3,89
(s, OCH3); 2,56 (quin., J = 7,0 Hz, 11-CH2); 2,49 (s, CH3).
106h CTPT: C30H32F2N6O
HRMS (m/z): 546,292

H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 8,01 (d, J = 7.5 Hz, H-

1

5); 7,49 (s, H-4); 7,40 (t, J = 7,5 Hz, H-7); 7,33 (s, H-5’); 7,25 (d, J =
7,5 Hz, H-6); 7,19 (t, J = 7,5 Hz, H-8); 7,09 (m, H-14’); 6,95 (m; H-


17’); 6,89 (m, H-15’); 6,74 (s, H-2); 4,70 (t, J = 7,0 Hz, 12-CH2);
4,32 (t, J = 7,0 Hz, 10-CH2); 3,94 (s, OCH3); 3,67 (s, 11’-CH2); 3,54
(s, 6’-CH2); 2,49 (s, CH3); 2,48 (m, overlapped, 11, 7’, 8’ 9’&10’CH2).
107: 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 7,98 (d, J = 8,0 Hz, H5); 7,54 (d, J = 8,0 Hz, H-7); 7,48 (s, H-4); 7,40 (dd; J = 7,0; 1,0 Hz,
H-6); 7,15 (dd, J = 7,0 & 0,5 Hz, H-8); 6,84 (s, H-2); 4,72 (dd, J =
6,0 & 14,5 Hz, H-12); 4,53 (dd, J = 7,0 & 14,5 Hz, H-12); 4,15 (m,
H-11); 4,00 (s, OCH3); 3,54 (m, H-10); 2,50 (s, CH3).
3.3. Chuyển hóa tạo dẫn xuất chalcon của murrayafoline A

Các bước chuyển hóa tạo dẫn xuất chalcon của murrayafoline
A được mô tả theo sơ đồ trên. Có 5 dẫn xuất được tạo thành:

Các sản phẩm được chứng minh cấu trúc bằng các dữ
kiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều 1H-NMR và 13CNMR.


109a: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8,38 (d, J =

8,5Hz, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H ), 8,10 (d, J = 15,5
Hz, 1H), 8,06 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H), 7,59 (t, J = 8,5Hz,
1H), 7,53 (d, J = 8,0Hz, 1H), 7,42 (t, J = 7,5Hz, 1H), 7,23 (t, J =
7,5Hz, 1H), 7,05 (t, J = 7,5Hz, 1H), 7,01 (d, J = 8,5Hz, 1H'), (s, 3H)
109b: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8,21 (s, 1H),

8,13 (m, 3H), 7,94 (d, J = 15,5 Hz, H-β), 7,90 (d, J = 15,0 Hz, H-α),
7,57 (s, H-2), 7,52 (d, J = 8,0 Hz, H-8), 7,41 (t, J = 7,5 Hz, H-7),
7,21 (t, J = 7,5 Hz, H-6), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, H-3', H-5'). (s, 1-OCH3)
109c: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8.32 (s, H-6'),

8.21 (s, H-4), 8.16 (d, J = 8.0 Hz, H-5 ), 8.09 (d, J = 5.5 Hz, H-β),
8.01 (d, J = 15.0 Hz, H-α), 7.59 (s, H-2), 7.54 (m, H-8, H-4'), 7.01
(d, J = 8.5 Hz, H-3'), 4.44 (s, 2H, 5ꞌ-CH2-), 4.12 (s, 1-OCH3), 3.32 (s,
5ꞌ-CH2-OCH3)
109d: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H

: 8.11 (d, 1H, J

= 7.0 Hz, H-5 ), 8.10 (s, H-4), 7.79 (d, J = 16.5 Hz, H- β), 7.51 (d, J

= 8.5 Hz, H-8), 7.40 (dt, J1 = 1.0 Hz, J2 = 7.5 Hz, H-7 ), 7.38 (s, H2), 7.20 (dt, J1 = 1.0 Hz, J2=7.5 Hz, H-6), 6.89 (d, J = 16.0 Hz, H-α),
4.06 (s, 1-OCH3), 2.36 (s, -CH3)
109e: 1H-NMR (500 MHz, MeOD, ppm)

H:

8,36 (d, J = 9

Hz, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,14 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 8,07 (d, J = 15,5 Hz,
1H); 8,01 (d, J = 15 Hz, 1H); 7,61 (d, J = 1 Hz, 1H); 7,52 (d, J =
8Hz, 1H); 7,41 (td, J = 8,5 & 1,5 Hz, 1H); 7,22 (td, J = 7,5 & 1 Hz,
1H); 6,60 (dd, J = 9 & 2,5 Hz, 1H); 6,53 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 4,11
(s, 3H); 3,86 (s, 3H)


3.4. Nghiên cứu hoạt tính in vitro của murrayafoline A
3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Murrayafoline A có hoạt tính gây độc tế bào tốt đối với các
dòng KB, LU-1, LNCaP và HL-60 với các giá trị IC50 tương đương
với chất đối chứng là elipticine. Riêng đối với dòng tế bào Hep-G2,
hoạt tính gây độc của murrayafoline A thấp hơn so với elipticine
Hợp chất
KB
LU-1
LNCaP
HL-60
Hep-G2
Mu-A
0,97
0,74

0,68
0,64
3,97
Elipticine
0,89
0,72
0,70
0,66
0,97
Giá trị IC50 của mu-A với các dòng tế bào ung thư
3.4.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển khối u trên thạch mềm 3D
Murayafoline A ức chế hình thành khối u trên thạch mềm in
vitro với mật độ hình thành khối u giảm 48,21% so với đối chứng và
làm giảm kích thước của khối u tới 71,33% so với đối chứng.

3.4.3. Hoạt tính trên hệ tinh mạch

Vai trò trung gian của murrayafoline A đối với sự hoạt động và tốc
độ co của tế bào cơ tim khi có mặt chất ức chế.
Murrayafoline A làm tăng sự co cơ và ICa,L qua hoạt tính
PKC ( protein kinase C) ở các tế bào cơ tâm thất chuột và sự đáp ứng
trung gian bởi PKC khi có mặt murrayafoline A có thể một phần là
do yếu tố trung gian của CaMKII. Tác dụng gây co tế bào cơ của


murrayafoline A không bị ảnh hưởng ngay cả khi có mặt chất trung
hòa β-adierenoceptor (propanolol), chất ức chế protein kinase A
(KT5720 hoặc H-89), hoặc chất ức chế phospholipase C (U73122).
3.5. Kết luận về các kết quả thử nghiệm khả năng kháng u ung thư
in vivo

- Murrayafoline A có độc tính thấp với LD50 (4,24 ± 0,25)g
- Murrayafoline A có khả năng kháng khối u di căn và kéo dài tuổi
thọ cho chuột bị u thực nghiệm.
- Murrayafoline A có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư trong các khối u thực nghiệm trên mô hình chuột bị gây ung thư
in vivo.
* Murrayafoline A có khả năng kháng khối u di căn và kéo
dài tuổi thọ cho chuột bị u thực nghiệm. Ở liều 100mg/kgP/ngày
không những có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung
thư, làm cho thể tích khối u giảm đi 91,47% so với đối chứng không
sử dụng mà còn có khả năng diệt tế bào ung thư (16,67% chuột thí
nghiệm không còn u, khỏe mạnh trở lại, ăn uống và hoạt động bình
thường)
- Murrayafoline A cho thấy khả năng cảm ứng và tăng cường hoạt
động của enzyme casapse 3/7 rất mạnh khi khảo sát trong các mẫu
huyết thanh của chuột thí nghiệm. Mức độ cảm ứng tùy thuộc vào
liều hoạt chất sử dụng và thay đổi theo thời gian thí nghiệm.
- Murrayafoline A cho thấy có khả năng thay đổi một số chỉ tiêu
huyết học và enzme chức năng gan, thận theo chiều hướng tốt và ổn
định hơn so với đối chứng.
* Như vậy, bước đầu có thể xác định murrayafoline A là một hợp
chất ngăn ngừa và ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư theo cơ
chế chết tế bào theo lập trình (apoptosis).


3.6. Hoạt tính sinh học các dạng bào chế của murrayafoline A
3.6.1. Hoạt tính gây độc tế bào của hệ mixen-murrayafoline A
Murrayafoline A dạng mixen (10%) vẫn duy trì được hoạt
tính gây độc tế bào
Mu-A mixen

19,94

Mu-A tự do
3,97

Elipticine
0,97

Giá trị IC50 của Mu-A tự do và mixen với dòng tế bào Hep-G2
3.6.2. Hoạt tính của hệ liposome-murrayafoline A
* Hoạt tính gây độc tế bào in vitro
Murrayafoline A dạng tự do và dạng liposome đều thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào ung thư sắc tố SKMEL-2 và ugn thư phổi SK-LU-1
IC50 của Mu-A dạng liposome và dạng tự do đối với các dòng
tế bào SK-MEL-2 và SK-LU-1
Mẫu thử
IC50 values (µM)
SK-MEL-2
SK-LU-1
Liposome – Mu-A
9.69 ± 0.25
12.79±0.12
Mu-A
8.92± 0.16
10.67 ± 0.37
Ellipticine
(chứng
1.93 ± 0.14
2.49 ± 0.17
dương)

* Hoạt tính in vivo
Kết quả cho thấy liposome-Mu-A ức chế đáng kể sự phát
triển của khối u sau 30 ngày thí nghiệm so sánh với Mu-A tự do, và
đối chứng âm. Khối lượng khối u của nhóm điều trị Mu-A tự do và
liposome - Mu-A là 6181,58 ± 398,92 mm3 và 4280,25 ± 470,95
mm3, tương ứng, so với 7.742,67 ± 473,54 mm3 trong nhóm đối
chứng âm (p <0,01). Ngoài ra, trọng lượng cơ thể của chuột sử dụng
liposome-Mu-A cũng được cải thiện, trong đó chỉ ra rằng các
liposome-Mu-A làm giảm độc tính của thuốc.


tumor volume (mm3)

10000
8000
6000

negative control

4000

Mu- A

2000

Liposome-Mu- A

0
5

10

15

20

25

30

day

Sự tăng trưởng khối u sau khi điều trị với Mu-A tự do và Mu-A
liposome.
3.7. Hoạt tính sinh học các hợp chất dãy chuyển hóa tạo dẫn xuất
triazole của murrayafoline A.
3.7.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Chất
7
105
106a
IC50
15,82
18,93
15,16

106b
10,07

106e
13,74

Elipticine
1,28

Giá trị IC50 đối với dòng tế bào ung thư phổi LU-1 của một số hợp
chất
3.7.1. Hoạt tính kháng viêm

Hoạt tính của các hợp chất 7, 106c, và 105e với các interleukin IL12 P40 (a), IL-6 (b), và TNF-a (c) kích hoạt bằng LPS trên tế bào tua
- tủy xương BMDCs


Các chất 7, 106c, và 106e tại nồng độ 25 μM ức chế sự sinh
cytokine IL-12p40 trong tế bào sao kích hoạt bằng LPS với giá trị ức
chế lần lượt là 72.3%, 61.8% và 100%. Các chất khác có giá trị ức
chế thấp hơn (< 30%). Tại nồng độ 12.5μM, hoạt chất 106c ức chế
lần lượt 100%, 88.7% và 79.3%sự sản xuất IL-12p40, IL-6 và TNF-α
Như vậy, có thể thấy rằng, các dẫn xuất murrayafoline A
chứa nhân 1,2,3- triazole có hoạt tính kháng viêm tiềm năng.
3.8. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất là dẫn xuất
chalcon của murrayafoline A

% CS Hep-G2
% CS LU-1

108a
100
92,74

108b
82,46
94,22

108c
100
63,02

108d
12,26
24,22

108e
81,89
100

Giá trị %CS đối với các dòng tế bào Hep-G2 và LU-1
Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất dãy chalcon giảm so với
murrayafoline A. Điều này phù hợp với nhận định của Itoigawa và
cộng sự rằng nhóm metyl ở vị trí cacbon số 3 là rất quan trọng để
tăng hoạt tính chống ung thư đối với các hợp chất carbazole.


KẾT LUẬN
Trong luận án này chúng tôi đã đạt được các kết quả sau:
1. Kết quả nghiên cứu tạo nguồn murrayafoline A làm nguyên liệu
phục vụ các nghiên cứu hóa học và sinh học
* Từ thiên nhiên, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng hai quy trình
phân lập murrayafoline A từ rễ cây cơm rượu trái hẹp (Glycosmis

stenocarpa (Drake)). Trong đó quy trình phân lập theo phương pháp
kết hợp cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệu suất cao (75% so với tổng
lượng murrayafoline A có trong nguyên liệu).
* Đã nghiên cứu thực hiện hai phương pháp tổng hợp toàn phần
murrayafoline A từ nguyên liệu đầu là dẫn xuất nitro của m-cresol.
Trong đó quy trình thực hiện theo 4 bước, đi qua bước trung gian tạo
bisaryl cho hiệu suất tổng cộng cho cả quá trình tương đối tốt (~ 45%
so với chất đầu)
2. Đã tiến hành nghiên cứu bào chế tạo hai dạng tiểu phân phức hợp
có cấu trúc nano là mixen và liposome.
3. Đã tiến hành nghiên cứu chuyển hóa murrayafoline A ở trên hai vị
trí, thu được 17 dẫn xuất mới bao gồm:
- Chuyển hóa tại vị trí nguyên tử nitơ: thu được 1 dẫn xuất bromid, 1
dẫn xuất triazide, 1 dẫn xuất allyl, 1 dẫn xuất dihidroxy và 8 dẫn xuất
1,2,3-triazole
- Chuyển hóa tại vị trí nhóm metyl: thu được 5 dẫn xuất chalcon.
4. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh học của murrayafoline A
- Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của hợp chất murrayafoline A
được thực hiện trên 5 dòng tế bào ung thư là: KB, LU-1, LNCaP,
HL-60 và Hep-G2 với các giá trị IC50 lần lượt là 0,97;0,74; 0,68;
0,64 và 3,97.


- Murrayafoline A có khả năng ngăn chặn sự hình thành và phát triển
của tế bào ung thư trên mô hình thạch mềm 3D
- Hoạt tính trên hệ tim mạch: Murrayafoline A làm tăng sự co cơ và
ICa,L qua hoạt tính PKC ( protein kinase C) ở các tế bào cơ tâm thất
chuột
- Hoạt tính in vivo: - Hoạt chất Murrayafoline A có độc tính thấp với
LD50 (4,24 ± 0,25)g

- Murrayafoline A có khả năng kháng khối u di căn và kéo dài tuổi
thọ cho chuột bị u thực nghiệm.
- Murrayafoline A cho thấy khả năng cảm ứng và tăng cường hoạt
động của enzyme casapse 3/7 rất mạnh khi khảo sát trong các mẫu
huyết thanh của chuột thí nghiệm.
5. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các
dạng tiểu phân mixen & liposome của murrayafoline A. Kết quả cho
thấy:
- Các dạng tiểu phân phức hợp của murrayafoline A đều giữ được
hoạt tính gây độc tế bào ung thư.
- Dạng tiểu phân liposome-murrayafoline A tăng cường đáng kể hoạt
động kháng u và giảm độc tính hơn so với murrayafoline A tự do.
6. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm in
vitro của các dẫn xuất murrayafoline A. Các kết quả cho thấy:
- Các dẫn xuất chuyển hóa đều giảm hoạt tính gây độc tế bào so với
murrayafoline A
- Các dẫn xuất chuyển hóa 1,2,3-triazole có hoạt tính kháng viêm tốt
hơn so với murrayafoline A, trong đó hợp chất 106c thể hiện hoạt
tính kháng viêm tốt nhất, ức chế lần lượt 100%, 88,7% và 79,3% sự
sản xuất IL-12p40, IL-6 và TNF-α ở nồng độ 12,5 µM