PHÂN TÍCH PROTIDE ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
MÔN KIỂM NGHIỆM CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

PHÂN TÍCH PROTIDE
GVHD: Hoàng Xuân Thế
SVTH: Nguyễn Thị Tiết Mến
Phong

2208152004 Trần Bảo

2208150009

Nguyễn Phạm Thúy Trinh
Lê Tường Vi

2208150018

2208150022


PROTIT THÔ
• Protit là những chất hữu cơ mà thành phần cấu tạo
gồm C,H,O và N, có khi còn có thêm P và S.
• Protit bao gồm các axit amin và những hợp chất
(petit, protein) khi thủy phân cho 1 hoặc nhiều
loại axit amin.

PROTIT THÔ
Phương pháp Kendan (Kjeldahl): Xác định hàm lượng Nitơ tổng
Nguyên lý:
•

Vô cơ hóa thực phẩm bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Dùng một
kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình
thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng một axit.

•

Xác định bằng phương pháp Kjendanl

trên máy cất đạm Pacnat Vacne (Panazz- Wagner).
•

Xác định hàm lượng nitơ toàn phần là

xác định hàm lượng N trong tất cả các hợp chất
có chứa nitơ.


PROTIT THÔ
 Lấy mẫu: Tùy hàm lượng protein có trong thực phẩm hoặc tùy theo
dạng sản phẩm cách lấy mẫu như sau:
• Sản phẩm khô
Hàm lượng protein nhiều: cân 0,3 – 0,5g mẫu trên cân phân tích. Hàm
lượng protein ít: cân 1 – 2g mẫu trên cân phân tích. Sản phẩm khô sau khi
cân gói vào giấy lọc không tro, cho vào bình hút ẩm.

• Sản phẩm ướt
Tùy mẫu có ít hay nhiều protein mà cân lượng mẫu, thường cân 1g vào
cốc. Chuyển mẫu vào bình Kiendan, cho nước cất tráng cốc và cho vào
bình Kiendan (dùng càng ít nước càng tốt).
• Sản phẩm lỏng (nước mắm, nước chấm…)
Dùng pipet lấy chính xác 2 - 5 ml mẫu cho vào bình Kiendan


PROTIT THÔ
 Vô cơ hóa mẫu
- Thêm vào bình Kiendan đã chứa mẫu 1g K2SO4, 2g CuSO4, 3ml H2SO4 đậm đặc, dùng ít

nước sạch tráng sạch cổ bình, đặt miệng phễu lên miệng bình Kiendan, cặp bình Kiendan vào
giá, đáy bình đặt nghiêng một góc 450 đặt trên bếp điện hay đèn cồn.
- Đun nhẹ, sau vài phút chuyển sang
đun mạnh cho đến khi toàn bộ dung dịch
trong bình Kiendan có màu xanh
của sunfat đồng hay xanh vàng thì ngừng.
- Để nguội bình đến nhiệt độ phòng, chuyển
sang bình định mức 100 ml, tráng bình Kiendan
bằng nước cất rồi thêm nước cất đến
vạch định mức, lắc đều.


PROTIT THÔ
Cất mẫu
Tiến hành trên máy cất đạm.
- Đun xong, để nguội rồi lắp bình Kiendan vào máy cất đạm.
- Hút 20ml H2SO4 0,1N cho vào bình tam giác 250ml, 5 – 10 ml nước cất và 2-3 giọt chỉ thị
fenolftalein rồi đặt bình vào đầu dưới sinh hàn của máy cất đạm, sao cho đầu ống sinh hàn phải

nhúng ngập vào dung dịch trong bình tam giác.
- Dùng pipet lấy 10ml dung dịch ở bình định mức cho vào bầu cất c của máy cất đạm, thêm vào
10 – 15 ml NaOH 30% (nhỏ vào 5 giọt chất chỉ thị fenolftalein 0,1% và cho từ từ NaOH 30%
qua phễu vào bình cất, nếu dung dịch trong bình cất chưa chuyển qua màu hồng thì cho thêm
NaOH đến khi xuất hiện màu hồng đậm), nút kín.
- Cho nước cất vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu a, mở nước làm lạnh chảy vào ống làm lạnh.
- Đun sôi dung dịch trong bình cầu khoảng 20 – 25 phút, dùng giấy quỳ thử khi nước ngưng
thoát ra không còn phản ứng kiềm là được. Cất xong dùng bình tia rửa sạch acid bám ở ống
ngưng nhúng trong bình tam giác.
Chuẩn độ: Chuẩn độ lượng H2SO4 0,1N dư trong bình tam giác bằng NaOH 0,1N đến khi
dung dịch trong bình tam giác chuyển sang màu hồng.
Cất mẫu trắng: Cất một mẫu trắng với lượng thuốc thử và thao tác như trên nhưng thay
100ml dung dịch trong bình định mức bằng 10ml nước cất.


PROTIT THÔ

 Tính kết quả


 Video Phương pháp Kendan (Kjeldahl): Xác định hàm lượng Nitơ tổng

/>

PROTEIN

A- PHƯƠNG PHÁP THƯỜNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN
1. Phương pháp Stutzer – Barnstein

Nguyên tắc:

• Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein ở dịch
chiết bằng CuSO4. Tách kết tủa, rửa sạch và định lượng nitơ
toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kendan.
2. Phương pháp dùng axit tricoaxetic
Nguyên tắc:
• Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein ở dịch
chiết bằng axit tricoaxetic. Tách kết tủa, rửa sạch và định lượng
nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kendan.


A- PHƯƠNG PHÁP THƯỜNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

3. Phương pháp sử dụng tananh
Nguyên tắc:
• Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein ở dịch
chiết bằng tananh. Tách kết tủa, rửa sạch và định lượng nitơ
toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kendan.
4. Phương pháp sử dụng natri sunfat và cồn ở môi trường axit
Nguyên tắc:
• Kết tủa protein bằng dung dịch natri sunfat bão hòa và cồn 78o
ở môi trường axit. Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch
lọc bằng phương pháp Ken-dan.
• Nitơ protein= Nitơ toàn phần – Nitơ phi protein


B- PHƯƠNG PHÁP BÁN VI LƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

1. Phương pháp sử dụng tananh
Nguyên tắc:
• Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein ở dịch chiết bằng

tananh. Tách kết tủa, rửa sạch và định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa
bằng phương pháp Kendan.
2. Phương pháp sử dụng uranyl axetat
Nguyên tắc:
• Kết tủa protein bằng dung dịch uranyl axetat. Định lượng nitơ trong kết
tủa bằng phương pháp Kendan.
3. Phương pháp sử dụng axit metaphophoric
Nguyên tắc:
• Kết tủa protein bằng dung dịch axit metaphophoric. Định lượng nitơ trong
kết tủa bằng phương pháp Kendan.


C- PHƯƠNG PHÁP VI LƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

Phương pháp so màu
Nguyên tắc:
• Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu +
+ thành một phức chất màu tím. (Phản ứng
biure)
• Màu sắc tỷ lệ với số lượng mạch peptit (-COOH)
của protein và gần như không phụ thuộc vào
những nồng độ tường đối giữa albumin và
globulin.


PROTEIN TIÊU HÓA BẰNG PEPSIN
Phương pháp định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin
Nguyên tắc:
• Sau khi loại protein tiêu hóa bằng pepsin + HCl, định
lượng nitơ trong phần không hòa tan bằng phương pháp

Kendan.
• Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng
hiệu nitơ toàn phần trừ nitơ của phần không tan.


AXIT AMIN
ĐỊNH LƯỢNG NITƠ AXIT AMIN
1. Phương pháp Focmon
Nguyên tắc:
Xác định hàm lượng nitơ foocmon là xác định hàm lượng tống số các axit
amin và muối amôni có trong thực phẩm. Trong thực tế, lượng muối amoni
là rất ít, nên có thể xem như xác định nitơ foocmon chủ yếu là xác định các
acid amin.
Trong các phân tử acid amin đều có chứa nhóm amin và nhóm
cacboxyl (-COOH) có tính acid, nên trong dung dịch nó không thể hiện rõ
tính acid hay bazơ.
Nếu cho acid amin tác dụng với foocmon thì nhóm amin sẽ kết hợp
với foocmon thành nhóm – N = CH2 (metylenic) làm cho tính bazơ yếu
đi rõ rệt và tính axit tăng lên rõ rệt. Do đó có thể chuẩn độ được bằng chất
chuẩn kiềm và chất chỉ thị axit – bazơ để kết thúc quá trình định phân.


PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NITƠ AXIT AMIN
2. Phương pháp Pope – Stevens
Nguyên tắc:
Ở môi trường dung dịch đệm borat hoặc photphat,
các axit amin kết hợp với muối đồng thành một phức
chất axit amin – đồng hòa tan.
Định lượng Cu2+ trong phức chất theo phương pháp
này được định lượng bằng phương pháp gián tiếp từ

đó tính ra hàm lượng nitơ axit amin trong mẫu thử.


PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NITƠ AXIT AMIN
3. Phương pháp Van Slyke
Nguyên tắc:
• Axit amin khi gặp axit nitro sẽ giải phóng ra khí
nito ở thể tự do
• Khi nito được giải phóng, một nửa từ axit amin,
còn một nữa từ axit nitro
• Xác định thể tích nito ở điều kiện nhiệt độ và áp
suất, tra bảng tính sẵn sẽ có trọng lượng nito. Từ
đó suy ra hàm lượng nito axit amin trong 100g
chất thử.


TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 3708 – 90
THỦY SẢN – PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG NITƠ AXIT AMIN
 Tiêu chuẩn này thay thế TCVN 3708-81, qui định
phương pháp xác định hàm lượng nitơ axit amin đối
với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm
thủy sản.
 Tiêu chuẩn dựa trên nguyên tắc của phương pháp
Pope – Stevens


Nguyên tắc chung:
 Tạo điều kiện thích hợp để đồng phốt phát phản

ứng với axit amin tạo thành muối của axit amin
(1 ion đồng phản ứng với 2 gốc axit amin). Lọc
để loại đồng phốt phát thừa. Thêm axit axetic và
kali iodua và dịch lọc trong. Ion I- trong môi
trường axit khử ion Cu+, tạo ra I2 tự do. Chuẩn
độ lượng iot được tạo thành bằng dung dịch natri
thiosunfat 0,01M.


Tiến hành thử
 Dùng pipet lấy chính xác 5ml nước mắm đã pha loãng 20 lần
vào bình định mức dung tích 25ml, thêm 2 giọt thimolphtalein
0,25% và nhỏ từng giọt dung dịch natri hydroxyt 0,1N vào cho
đến khi dung dịch có màu xanh nhạt da nhạt da trời (pH=10).
Sau đó cho thêm 10 – 15 ml hỗn hợp đồng phốt phát, thêm nước
cất đến vạch mức. Lắc đều, li tâm hoặc lọc qua giấy lọc cứng
dày sao cho nhận được dịch trong suốt.
 Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 5
giọt axit axetic đậm đặc và khoảng 0,2 – 0,5g kaliiodua tinh thể,
lắc đều, dung dịch có màu vàng của iot.


Tiến hành thử
 Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosunfat 0,01M cho đến
khi dung dịch có màu vàng nhạt. Thêm 2 - 4 giọt dung
dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh. Chuẩn độ tiếp
cho đến khi dung dịch vừa mất màu. Ghi lượng dung dịch
natri thiosun-fat 0,01M dùng để chuẩn độ.
 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất cả lượng hóa chất và
các bước thí nghiệm như trên, thay dịch mẫu thử bằng

nước cất.


Kết quả
Hàm lượng nitơ axit amin (X11) tính bằng g/l, theo công thức:

Trong đó:
 V1 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml;
 V2 – Thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml;
 5 – Thể tích mẫu thử đã pha loãng 20 lần, tính bằng ml
 25 - Thể tích toàn bộ hỗn hợp dịch trước khi lọc, tính bằng ml;
 10 – Thể tích dung dịch lọc lấy xác định, tính bằng ml;
 0,00028 – Số g nitơ axit amin tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01M;
 1000 – Hệ số tính ra g/l;
 Chú thích:
 Để nhận được kết quả chính xác, cần loại bỏ hoàn toàn đồng phốtphat thừa, bằng cách lọc thật cẩn
thận hỗn hợp dịch mẫu thử sao cho nhận được dịch trong suốt.


 Video một số phương pháp định lượng acid amin

/>

AXIT AMIN
ĐỊNH LƯỢNG CÁC AXIT AMIN BẰNG SẮC KÍ TRÊN GIẤY

1. Tách protein ra khỏi thức ăn
Gồm ba giai đoạn:
.
Lựa chọn nguyên liệu:

-. Nên chọn nguyên liệu của thời vụ gần nhất, làm khô ở nhiệt độ thường.
-. Tránh lấy nguyên liệu đã để lâu và làm khô ở nhiệt độ cao.
.
Chuẩn bị nguyên liệu:
-. Cân từ 100g – 500g nguyên liệu khô ( tùy theo hàm lượng protein). Xay hoặc nghiền nhỏ thành bột,
loại chất béo và các sắc tố bằng benzen hau ete dầu hỏa hoặc bằng phương pháp soxhlet.
-. Nguyên tắc: Dựa vào tính tan hoàn toàn của chất béo vào dung môi hữu cơ.
Dùng dung môi hữu cơ trích ly chất béo có trong sản phẩm thực phẩm. Sau đó làm bay hơi hết dung
môi, chất béo còn lại đem cân, tính ra hàm lượng chất béo có trong sản phẩm thực phẩm.
-. Lọc qua giấy lọc, tráng rửa bột bằng dung môi mới. Trải bột và để khô ngoài không khí.
-. Xay hoặc nghiền nhỏ lại, bảo quản kín cho tới khi tiến hành tách protein.
.
Tách protein ra khỏi nguyên liệu:
-. Tùy theo nguyên liệu và tính chất của protein, cách tách protein có khác nhau.


AXIT AMIN
ĐỊNH LƯỢNG CÁC AXIT AMIN BẰNG SẮC KÍ TRÊN GIẤY

2. Thủy phân protein thành axit amin tự do

Cho vào bình định mức khoảng 30ml nước cất, cho từ từ HCl đậm đặc, vừa cho vừa lắc
đều. Để nguội, cho thêm nước cất vừa đủ 1000ml. Lắc đều.
Dung dịch axeton + HCl (Axeton 100ml+ HCl đậm đặc 1ml)
Dung dịch rượu izopropylic 10% (Rượu izopropylic10ml+ Nước cất vừa đủ 100ml)
 Tiến hành thủy phân: Cho vào ống nghiệm
+ Protein khô 100g
+ HCl

6N

Hàn kín ống nghiệm: Chú ý không để dịch thủy phân đầy ống. Đun cách dầu ở 1250C
hoặc để vào tủ sấy 1250C trong 24h. Loại HCl bằng cách cất trong chân không tới khi
chỉ còn cặn khô.
Hòa cặn trong bình định mức 10ml với dung dịch rượu izopropylic 10% vừa đủ 10ml.
Ly tâm, lấy phần trong ở trên, giữ trong tủ lạnh 1-2 tuần.


AMONIAC
I. Phương pháp định lượng hàm lượng amoniac

1. Phương pháp định lượng focmôn
Nguyên tắc: ammoniac trong thực phẩm dưới dạng tự do
hay muối amoni, khi gặp focmôn sẽ xảy ra phản ứng:
4NH4Cl + 6HCHO => (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl
Nếu dung dịch muối amoni trung tính và dung dịch
focmôn cũng trung tính thì HCl hình thành là hoàn toàn từ
muối amoni. Từ số lượng NaOH dùng để định lượng HCl
để tính ra hàm lượng nitơ amoni.