Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn và enzyme thủy phân lignocellulose từ dữ liệu Metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê

Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LƢU HÀN LY

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN
VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE
TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN
TRONG DẠ CỎ DÊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LƢU HÀN LY

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN
VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE
TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN

TRONG DẠ CỎ DÊ
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Đỗ Thị Huyền
PGS.TS Nguyễn Lai Thành

Hà Nội – 2016

Footer Page 2 of 126.


Header Page 3 of 126.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn
khoa học của TS. Đỗ Thị Huyền và PGS.TS. Nguyễn Lai Thành. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố
dưới bất kỳ hình thức nào.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của
các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung
luận văn.
Học viên

Lƣu Hàn Ly

Footer Page 3 of 126.


Header Page 4 of 126.

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức
cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Thị Huyền – Viện
Công nghệ Sinh học và PGS.TS. Nguyễn Lai Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa
học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này. Xin được cảm ơn đề tài
Độc lập cấp nhà nước mã số ĐTĐLCN.15/14: “Nghiên cứu metagenome của một số
hệ sinh thái mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa hệ enzyme chuyển
hóa hiệu quả lignocellulose" do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, Bộ Khoa học Công
nghệ chủ quản đã hỗ trợ tôi về mọi phương diện để thực hiện nghiên cứu này.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Kĩ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh
học đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã
luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

Học viên

Lƣu Hàn Ly

Footer Page 4 of 126.

năm


Header Page 5 of 126.

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DNA

Acid deoxyribonucleic

RNA

Acid ribonucleic

PCR

Polymerase chain reaction

CBM

Carbohydrate binding module

GH

Glycosyl hydrolase

CE

Carbohydrate esterase

PL

Polysaccharide lyase

ORF

Open reading frame

KEGG

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

COG

Cluster of Orthologous Groups

CAZy

Carbohydrate-Active enZYmes

GO

Gene Ontology

OTUs

Operation taxonomic units

i
Footer Page 5 of 126.


Header Page 6 of 126.

MỤC LỤC
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... i
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. v
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1.

Lignocellulose và hệ enzyme phân giải lignocellulose ........................ 2

1.1.1. Cấu trúc lignocellulose ............................................................................ 2
1.1.1.1.

Cellulose........................................................................................... 2

1.1.1.2.

Hemicellulose ................................................................................... 3

1.1.1.3.

Lignin ............................................................................................... 4

1.1.2. Hệ enzyme phân giải lignocellulose ........................................................ 4
1.1.2.1.

Enzyme tiền xử lý ............................................................................. 5

1.1.2.2.

Hemicellulase ................................................................................... 6

1.1.2.3.

Cellulase........................................................................................... 7

1.1.2.4.

Hoạt động của cellulosome .............................................................. 9

1.2.

Hệ vi sinh vật dạ cỏ dê - nguồn khai thác lignocellulase tiềm năng 11

1.2.1. Cấu trúc hệ tiêu hóa ở dê ....................................................................... 11
1.2.2. Hệ vi sinh vật dạ cỏ động vật nhai lại ................................................... 12
1.2.3. Enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật dạ cỏ ... 16
1.3.

Metagenomics ...................................................................................... 19

1.3.1. Khái quát về phương pháp metagenomics ............................................ 19

1.3.2. Các phương pháp tiếp cận tìm gen mới bằng Metagenomics ............... 19
1.3.2.1.

Phân lập gen từ thư viện DNA metagenome .................................. 20

1.3.2.2.

Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu trình tự DNA metagenome . 21

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁPERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.1.

Đối tƣợng .................................................. Error! Bookmark not defined.

2.2.

Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ..... Error! Bookmark not defined.

2.2.1. Thiết bị................................................... Error! Bookmark not defined.
ii
Footer Page 6 of 126.


Header Page 7 of 126.

2.2.2. Dụng cụ vật tư tiêu hao ......................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Hóa chất sử dụng ................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ........................ Error! Bookmark not defined.

2.3.1. Phương pháp tách chiết và tinh sạch ..... Error! Bookmark not defined.
2.3.1.1.

Phương pháp thu mẫu vi khuẩn từ mẫu dịch dạ cỏ dêError! Bookmark not def

2.3.1.2.

Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA metagenomeError! Bookmark not d

2.3.1.3.

Phương pháp kiểm tra chất lượng DNA metagenomeError! Bookmark not def

2.3.2. Phân tích và khai thác dữ liệu DNA metagenome bằng các công cụ tin
sinh ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.2.1.

Giải mã và lắp ráp hệ gen................ Error! Bookmark not defined.

2.3.2.2.

Dự đoán chức năng gen ................... Error! Bookmark not defined.

2.3.2.3.

Phân tích thống kê............................ Error! Bookmark not defined.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬNERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
3.1.

Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome hệ vi sinh vật dạ cỏ dêError! Bookma

3.1.1. Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenomeError! Bookmark not defin
3.1.2. Tách chiết DNA metagenome ............... Error! Bookmark not defined.
3.2.

Phân tích dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dêError! Bookmark not d

3.3.

Đa dạng hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê ...... Error! Bookmark not defined.

3.4.

Đa dạng hệ enzyme phân giải lignocellulase từ vi khuẩn dạ cỏ dêError! Bookma

3.4.1. Đa dạng enzyme tiền xử lý trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ
cỏ dê ....................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4.2. Đa dạng enzyme hemicellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi
khuẩn dạ cỏ dê ....................................... Error! Bookmark not defined.
3.4.3. Đa dạng enzyme cellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ
cỏ dê ....................................................... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 22

iii
Footer Page 7 of 126.

Header Page 8 of 126.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Thành phần cấu trúc của lignocellulose [75] .............................................. 2
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của lignin [65] ................................................................. 4
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống các enzyme tham gia thủy phân hemicellulase hoàn toàn 7
Hình 1.4. Sơ đồ hoạt động của các enzme tham gia thủy phân hoàn toàn cellulose . 8
Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum [1] ......................................... 10
Hình 1.6. Cấu trúc hệ tiêu hóa dê. ............................................................................. 12
Hình 3.1. So sánh DNA metagenome thu được từ các phương pháp tách chiết khác
nhau .......................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA của các mẫu DNA thu
được từ các phương pháp tách chiết khác nhauError! Bookmark not defined.
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome đã tách chiết và tinh sạch
bằng PSP kit ............................................. Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4. Thành phần dữ liệu thô DNA metagenomeError! Bookmark not defined.
Hình 3.5. Đồ thị phân bố chiều dài các đoạn contig . Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6. Thành phần các ngành vi khuẩn trong dữ liệu DNA metagenome dạ cỏ dêError! Boo
Hình 3.7. Thành phần vi khuẩn có khả năng thủy phân lignocellulose có mặt trong
dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dêError! Bookmark not defined.
Hình 3.8. Thành phần enzyme lignocellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi
khuẩn dạ cỏ dê ......................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.9. Thành phần các họ enzyme tiền xử lý trong dữ liệu DNA metagenome vi
khuẩn dạ cỏ dê ......................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.10. Thành phần các họ enzyme hemicellulase trong dữ liệu DNA
metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê................ Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11. Thành phần các họ enzyme cellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi
khuẩn dạ cỏ dê ......................................... Error! Bookmark not defined.

iv
Footer Page 8 of 126.


Header Page 9 of 126.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần chính của một số loại phế phẩm phụ lignocellulose [78] ....... 3
Bảng 2.1. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tàiError! Bookmark not defined.
Bảng 2.2. Các phương pháp tách chiết DNA được sử dụng trong nghiên cứuError! Bookmark
Bảng 2.3. Trình tự mồi 16S rDNA ............................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR ....................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenome sử dụng các phương pháp
tách chiết khác nhau ..................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.2. Kết quả đo quang phổ ............................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.3. Thành phần hệ vi sinh vật dạ cỏ dê .......... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.4. Số lượng ORFs phù hợp với các cơ sở dữ liệu khác nhauError! Bookmark not defin
Bảng 3.5. Đa dạng sinh vật (đã được định loại) trong dạ cỏ dêError! Bookmark not defined.
Bảng 3.6. Các loài vi khuẩn có khả năng tham gia thủy phân lignocellulose có mặt
trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dêError! Bookmark not defined.

v
Footer Page 9 of 126.


Header Page 10 of 126.

MỞ ĐẦU

Ngày nay, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên
liệu hóa thạch cũng như các hệ quả nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính.
Do đó, việc nghiên cứu sử dụng nguồn năng lượng carbonhydrate có khả năng tái
tạo là cần thiết. Một trong những nguồn carbohydrate dồi dào trên Trái Đất là
lignocellulose, có thể được tận dụng từ các phế thải nông nghiệp như lá cây, rơm rạ,
bã mía…Ở Việt Nam, lượng rơm rạ hàng năm đạt khoảng 30-40 triệu tấn nhưng chỉ
một lượng nhỏ đươ ̣c sử du ̣ng làm phân bón sinh h ọc, sản xuất nấm ăn còn chủ yếu
được đốt bỏ ngay trên cánh đồng gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Vì
vậy, việc chuyển hóa chúng thành các sản phẩm có giá trị không những có thể giảm
thiểu ô nhiễm môi trường mà còn góp phần giải quyết nhu cầu năng lượng quốc gia,
tạo nguồn thu nhập tại chỗ cho nông dân.
Tuy việc tận dụng nguồn lignocellulose có nhiều ưu điểm nhưng trên thực tế,
việc chuyển hóa lignocellulose trong công nghiệp hiện nay chủ yếu bằng các
phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, có giá thành cao và chưa thực sự hiệu
quả và khó xử lý các chất thải hóa học. Do đó, việc khai thác các enzyme phân giải
lignocellulose đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Hệ vi sinh vật
trong dạ cỏ của động vật nhai lại là nguồn khai thác enzyme tiềm năng. Nhiều gen
mã hóa cho hệ enzyme này đã được tìm thấy khá nhiều trong hệ tiêu hóa của dê
cùng với các gen mã cho những yếu tố quan trọng cấu thành hệ phân giải
cellulosome. Từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng của hệ vi
khuẩn và enzyme thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của vi
khuẩn trong dạ cỏ dê” với mong muốn khai thác được các enzyme lignocellulose
mới và có hiệu quả phân giải cao.

1
Footer Page 10 of 126.


Header Page 11 of 126.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Lignocellulose và hệ enzyme phân giải lignocellulose

1.1.1. Cấu trúc lignocellulose
Lignocellulose là nguồn sinh khối tái tạo dồi dào nhất với sản lượng hàng
năm trên thế giới đạt khoảng 200 tỉ tấn [80]. Phần lớn chúng có nguồn gốc từ phế
thải lâm nghiệp, nông nghiệp hoặc công nông nghiệp như mùn cưa, bã mía, giấy
vụn, thân và lá cây, rơm rạ, cỏ, lõi ngô, trấu, vỏ lạc… Các loại chất thải này tích lũy
hàng năm gây ra các vấn đề về môi trường. Tuy nhiên, do thành phần hóa học chủ
yếu hình thành nên lignocellulose là từ các loại đường nên chúng có thể được sử
dụng để sản xuất một số sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, axit
hữu cơ…
Các thành phần chính của lignocellulose bao gồm: cellulose (25–55%),
hemicellulose (8–30%) và lignin (18–35%) [113]. Về cơ bản, cellulose là bộ khung
cho sinh khối thực vật và được bao quanh bởi hemicellulose và lignin. Hàm lượng
của mỗi thành phần rất khác nhau giữa các loài thực vật, giữa các bộ phận khác
nhau và phụ thuộc vào tuổi của thực vật.

Hình 1.1. Thành phần cấu trúc của lignocellulose [73]

1.1.1.1. Cellulose
Cellulose là m ột polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n.
Các đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết
β-1,4-glucoside với số lượng lên tới hơn 10.000. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép
hình thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi
cellulose xếp song song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose [21].
Ở thực vật, cellulose là thành phần chính tạo nên thành tế bào. Chúng đóng
góp từ 15-30% sinh khối khô của thành tế bào sơ cấp và trên 40% đối với thành tế

2
Footer Page 11 of 126.


Header Page 12 of 126.

bào thứ cấp. Cấu trúc của cellulose ở thành tế bào thực vật được chia thành cấu trúc
tinh thể và cấu trúc vô định hình. Cấu trúc tinh thể chiếm khoảng 2/3 tổng số
cellulose với nhiều liên kết hydro nên bền vững trước tác động của enzyme và vi
sinh vật [96]. Trong khi đó, cellulose vô định hình có cấu trúc lỏng lẻo, dễ bị thủy
phân bởi các enzyme cellulase.
1.1.1.2. Hemicellulose
Bảng 1.1. Thành phần chính của một số loại phế phẩm phụ lignocellulose [76]
Cellulose
(% khối lƣợng)

Hemicellulose

Lignin

(% khối

(% khối

lƣợng)

lƣợng)

Rơm lúa mạch

33,8

21,9

13,8

Lõi ngô

33,7

32,9

6,1

Thân ngô

35,0

16,8

7,0

Thân cây bông

58,5

14,4

21,5

Rơm kiều mạch

39,4

27,1

17,5

Rơm lúa

36,2

19,0

9,9

Rơm

37,6

30,5

19,0

Thân đậu nành

34,5

24,8

19,8

Bã mía

40,0

27,0

10,0

Thân cây hoa hướng dương

42,1

29,7

13,4

Rơm lúa mì

32,9

24,0

8,9

Hemicellulose là polymer mạch thẳng, có nhánh với thành phần đơn phân đa
dạng bao gồm năm loại phân tử đường chính: D-glucose, D-galactose, D-mannose,
D-xylose, L-arabinose cũng như một số thành phần khác như D-glucuronic acid và
4-O-methyl-D-glucuronic acid với số lượng đơn phân dưới 200 và có thể bị acetyl

hóa [60]. Phụ thuộc vào thành phần đơn phân chủ yếu cấu tạo nên khung đường,
hemicellulose được chia thành nhiều loại như xylan, mannan, glucan,
glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan, galactomannan, galactoglucomannan,
β-glucan hoặc xyloglucan. Những loài thực vật khác nhau thì có thành phần

3
Footer Page 12 of 126.


Header Page 13 of 126.

hemicellulose khác nhau. Những thực vật thuộc họ Cỏ (Poaceae) như lúa, lúa mì và
kiều mạch có thành phần khung cấu trúc chủ yếu là glucuronoarabinoxylan [12],
các loại cây gỗ mềm và cây gỗ cứng có thành phần hemicellulose lần lượt là
acetylated (galacto) glucomannan (hay còn gọi là arabinoglucuronoxylan) và
glucuronoxylan [84].
1.1.1.3. Lignin
Khoảng trống giữa cellulose và hemicellulose lấp đầy bởi chất keo dính
lignin [97]. Lignin có cấu trúc phân tử phức tạp với các chuỗi polymer của phenol
propane (ví dụ như p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol) liên
kết chéo với nhau. Lignin trong thành phần thành tế bào thực vật có chức năng như
một hàng rào bảo vệ, giúp thực vật chống lại các tác động vật lý, hóa học và sâu
bệnh ở môi trường ngoài. Tuy nhiên, thành phần này ngăn cản tiếp xúc của cellulase
và hemicellulase với cơ chất làm giảm hiệu quả phân giải lignocellulose.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của lignin [63]

1.1.2. Hệ enzyme phân giải lignocellulose
Enzyme thủy phân lignocellulose được tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật, bao
gồm vi khuẩn và nấm. Trong tự nhiên, sinh khối lignocellulose được phân hủy hoàn

4
Footer Page 13 of 126.


Header Page 14 of 126.

toàn bởi hỗn hợp các enzyme thủy phân từ vi sinh vật trong khu hệ đặc trưng như ở
ruột mối, dạ cỏ bò và một số môi trường khắc nghiệt. Những khu hệ này có thể ưa
khí hoặc kị khí, chỉ bao gồm vi khuẩn hoặc chỉ bao gồm nấm hoặc có cả nấm và vi
khuẩn [106].
Lignocellulose gồm ba thành phần chính: lignin, hemicellulose và cellulose
tương ứng với ba nhóm enzyme phân giải riêng biệt là nhóm các enzyme tiền xử lý,
glycosyl hydrolase bao gồm hemicellulase và cellulase.
1.1.2.1.

Enzyme tiền xử lý

Lignin là thành phần chiếm tỉ lệ nhỏ trong thành phần thành tế bào thực vật
nhưng có vai trò quan trọng đảm bảo tính vững chắc và tăng sức đề kháng của thực
vật với các mầm bệnh. Tuy nhiên, lignin lại gây cản trở quá trình phân giải
lignocellulose do ngăn cản hemicellulase và cellulase tiếp xúc với cơ chất đặc hiệu
của chúng. Quá trình tiền xử lý có mục đích chính là phân giải lignin, nới lỏng các
liên kết giữa hemicellulose và cellulose. Trong công nghiệp, để phá vỡ cấu trúc của
lignin, người ta thường sử dụng phối hợp các biện pháp vật lý (nghiền, cắt hoặc xử
lý nhiệt độ và áp suất cao) và biện pháp hóa học (axit hoặc kiềm). Tuy nhiên, những
biện pháp này có giá thành cao, tiêu tốn nhiều năng lượng và ảnh hưởng xấu tới môi
trường [96]. Do đó, các biện pháp sinh học đang nhận được nhiều quan tâm và
nghiên cứu.
Tới nay, nhiều nghiên cứu đã được công bố về một số chủng vi sinh vật như

nấm sợi, nấm mục và một số loại vi khuẩn có khả năng sản xuất các enzyme phân
giải lignin, gọi chung là các ligninase. Các enzyme này được chia làm hai họ: (1)
phenol oxidase (laccase) và (2) peroxidase, gồm có lignin peroxidase (LiP),
manganese peroxidase (MnP) và peroxidase đa năng. Vi sinh vật phân giải lignin
hiệu quả nhất đến nay được xác định thuộc họ nấm mục trắng [18]. Taniguchi và
cộng sự đã đánh giá hiệu quả tiền xử lý của rơm lúa bằng bốn loại nấm mục trắng
(Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora
và Pleurotus ostreatus) dựa trên những thay đổi về số lượng và thành phần cấu trúc
rơm rạ sau xử lý cũng như tính nhạy cảm với enzyme thủy phân [98]. Kết quả là P.
ostreatus có khả năng thủy phân chọn lọc lignin và làm tăng hiệu quả của cellulase
5
Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.

và hemicellulase. Một số vi khuẩn cũng có thể được sử dụng cho tiền xử lý nguyên
liệu lignocellulose. Nhóm nghiên cứu của Kurakake đã cho thấy khả năng thu hồi
đường từ giấy văn phòng lên tới 94% khi tiền xử lý sinh học giấy văn phòng với hai
chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis và Bacillus circulans ở điều kiện tối ưu
[61].
1.1.2.2.

Hemicellulase

Nhóm enzyme phân giải hemicellulose rất phong phú do thành phần đa dạng
của hemicellulose. Hemicellulase chia thành ba nhóm chính dựa trên khả năng phân
cắt của nó: glycoside hydrolase (thuộc vào 29 họ GH) thủy phân liên kết glycoside,
carbohydrate esterase (thuộc khoảng 9 họ CE) thủy phân liên kết ester và
polysaccharide lyase (thuộc khoảng 5 họ PL) cắt liên kết glycoside [95]. Ngoài ra,

hemicellulase có thể được gọi tên theo loại cơ chất thủy phân đặc trưng của chúng.
Do có thành phần phức tạp nên quá trình phân hủy hemicellulose đòi hỏi sự tham
gia của nhiều loại enzyme và phụ thuộc vào thành phần hemicellulose. Xylanase
thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với nhau, giải phóng các phân tử
ngắn xylooligomer, gồm có endo-xylanase và exo-xylanase. Trong khi endoxylanase phân cắt liên kết β-1,4-xyloside trong mạch xylan thì exo-xylanase thủy
phân liên kết β-1,4-xyloside ở các đầu tự do. Sản phẩm của các enzyme này là
xylobiose sẽ được tiếp tục thủy phân thành đường đơn xylose bằng enzyme βxylosidase. Với hemicellulose cấu tạo chủ yếu từ mannan, β-mannanase sẽ tham gia
thủy phân galacto-glucomannan và giải phóng các tiểu phần β-1,4-manno-oligomer.
Sau đó các tiểu phần này có thể bị thủy phân thành các đơn phân mannose bởi
enzyme β-mannosidase.Cùng với đó, các nhóm bên cũng sẽ bị phân cắt bởi một số
hemicellulase

khác

như:

α-L-arabinofuranosidase,

glucuronidase, xyloglucan hydrolase và pectinase.

6
Footer Page 15 of 126.

α-L-arabinanase,

α-D-


Header Page 16 of 126.

Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống các enzyme tham gia thủy phân hemicellulase hoàn toàn [20]
Ví dụ về sự phân cắt arabinoxylan. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme

1.1.2.3.

Cellulase

Sự phá hủy chất keo dính lignin và các chuỗi hemicellulose là điều kiện cần
thiết cho phép các enzym cellulase tiếp cận tối đa với cellulose để thực hiện quá
trình thủy phân cellulose tạo đường đơn glucose. Cellulase là enzyme thuộc lớp
glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất polysaccharide và
oligosaccharide được tìm thấy trong tự nhiên (cellulose, tinh bột, chitin, xylan,
laminarin và cellobiose). Cellulase được chia thành ba nhóm lớn là exoglucanase
hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và β-glucosidase
(EC 3.2.1.21). Exoglucanase di chuyển dọc theo sợi cellulose và cắt cellulose thành
cellobiose. Trong khi đó, endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên liên kết β-1,4glucoside bên trong sợi cellulose còn β-glucosidase có khả năng thủy phân
cellobiose thành glucose cũng như cắt glucose ra khỏi cellooligosaccharide. Những
enzyme này hỗ trợ nhau trong quá trình thủy phân cellulose bằng cách tạo ra những
vị trí tiếp cận cho nhau, loại bỏ vật cản và hạn chế ảnh hưởng của các chất ức chế
[28].

7
Footer Page 16 of 126.


Header Page 17 of 126.

Hình 1.4. Sơ đồ hoạt động của các enzme tham gia thủy phân hoàn toàn cellulose [20]
Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme

Cellulase có cấu trúc gồm hai phần: vùng xúc tác (Catalytic domain_CD) và
một hoặc nhiều vùng liên kết với carbohydrate (Carbohydrate binding
modules_CBMs) nối với nhau bởi đoạn peptide ngắn. Vùng CBM có nhiệm vụ neo
bám vùng xúc tác với cơ chất, từ đó làm tăng hiệu quả thủy phân cho enzyme.
Chúng có thể nằm ở đầu N hoặc đầu C của vùng CD [112]. CBM từ các enzyme
khác nhau và nguồn sinh vật khác nhau được phân chia thành các họ dựa trên độ
tương đồng về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều. Ở nấm hiếu khí,
CBM luôn thuộc họ 1 với kích thước nhỏ (khoảng 30-35 amino acid). Trong khi đó,
CBM của cellulase vi khuẩn có kích thước lớn khoảng 100 đến 150 amino acid,
thường thuộc họ 2 hoặc 3 [43]. Vùng xúc tác của cellulase có thể có hoạt tính
endoglucanase hoặc exoglucanase (riêng β-glucosidase không có thành phần CBM
[112]). Tùy thuộc hoạt tính xúc tác mà domain này có cấu hình lõi khác nhau.
Trung tâm hoạt động của endoglucanase có dạng rãnh. Do đó, một chuỗi cellulose
có thể đi vào trung tâm xúc tác ở vị trí ngẫu nhiên và các liên kết sẽ bị phân cắt dọc
theo chuỗi cellulose. Ngược lại, vùng hoạt động của exoglucanase cấu trúc theo
dạng “đường hầm”, tạo bởi một vòng dài các phân tử protein cuộn xung quanh vị trí
xúc tác [19]. Kết quả là, cơ chất chỉ có thể được đưa vào từ một đầu của trung tâm

8
Footer Page 17 of 126.


Header Page 18 of 126.

xúc tác, sự thủy phân liên kết diễn ra bên trong “đường hầm” và giải phóng sản
phẩm cellobiose từ đầu còn lại.
1.1.2.4.

Hoạt động của cellulosome

Để tăng cường hiệu quả phân giải sinh khối lignocellulose và giảm giá thành
xử lý, chúng ta cần nghiên cứu các enzyme có hoạt tính mạnh và cơ chế hoạt động
của chúng. Trong tự nhiên, lignocellulose được chuyển hóa hoàn toàn bởi hỗn hợp
các enzyme lignocellulase sản xuất từ nhiều loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm và vi
khuẩn kị khí hoặc ưa khí. Dựa trên cấu trúc, các enzyme này được chia thành hai
nhóm là enzyme tự do và cellulosome. Enzyme tự do được sản xuất bởi cả hai
nhóm vi sinh vật ưa khí và yếm khí. Trong khi đó, cellulosome chỉ được tiết ra từ
nhóm vi sinh vật kị khí. Cellulosome là một phức hệ đa enzyme thủy phân hiệu quả
cellulose. Phức hệ này được nhóm nghiên cứu của Bayer, Lamed và cộng sự phát
hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn chịu nhiệt yếm khí Clostridium thermocellum khoảng
đầu những năm 1980 [62]. Từ đó, nhiều công trình đã hé lộ thêm kiến thức về tính
chất, độ đa dạng và cơ chế tương tác của chúng với thành tế bào thực vật và xác
định được thêm nhiều loại vi sinh vật có khả năng sản xuất cellulosome, trong đó có
nhiều loài nấm và vi khuẩn kị khí cư trú trong dạ cỏ như Butyrivibrio fibrisolvens,
Clostridium cellobioparum, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens,
Neocallimastix patriciarum [25].
Cấu trúc của cellulosome được đặc trưng bởi hai thành phần: vùng protein
khung không có khả năng xúc tác (scaffodin) và vùng enzyme. Hai thành phần
chính này được lắp ghép thành cellulosome hoàn chỉnh nhờ ái lực liên kết cao của
cohesin trên protein khung với dokerin thuộc miền mang hoạt tính xúc tác. Tất cả
các enzyme thuộc cellulosome đều chứa dockerin. Dockerin có kích thước khoảng
70 axit amin với hai đoạn lặp (khoảng 22 axit amin) và thường định vị ở đầu C của
enzyme trong phức hệ. Cohesin là trình tự dài 150 axit amin, phân bố lặp ngẫu
nhiên trên protein khung [32]. Tương tác cohesin-dockerin đóng vai trò quan trọng
trong sự hình thành cellulosme và có tính đặc hiệu cao. Ví dụ, protein khung của C.
thermocellum chứa 9 cohesin loại I và một cohesin loại II ở đầu C. Tuy nhiên,
cohesin loại II không nhận biết dockerin loại I nằm ở vùng xúc tác mà nhận biết
9
Footer Page 18 of 126.

Header Page 19 of 126.

dockerin loại II định vị trên protein bề mặt tế bào vi khuẩn. Cohesin/dockerin loại I
không thể tương tác được với dockerin/cohesin loại II đã đảm bảo phức hệ được lắp
ráp chính xác và phân biệt với liên kết trên bề mặt tế bào [64]. Ngoài ra, tương tác
này còn mang tính đặc trưng cho loài. Nhóm nghiên cứu của Page và cộng sự
(1997) đã chứng minh được dockerin của enzyme cellulosome ở C. cellulolyticum
không nhận biết và liên kết với cohesin của scaffoldin ở C. thermocellum [78].
Protein khung trong cellulosome đóng nhiều vai trò liên kết: (1) liên kết phức
hệ cellulosome (2) liên kết với cơ chất đặc hiệu và (3) liên kết với protein trên bề mặt
tế bào. Protein khung có thể chứa số lượng cohesin khác nhau từ 1 đến 11 (thường
trên 4) dẫn đến nhiều loại enzyme khác nhau có thể được liên kết vào cellulosome.
Các enzyme của cellulosome gồm có cellulase, hemicellulase, pectinase, chitinase và
nhiều enzyme phụ trợ giúp phân giải thành tế bào thực vật. Vì vậy, cellulosome có
khả năng thủy phân hiệu quả hơn hẳn các enzyme thủy phân tự do đơn lẻ. Trong khi
cohesin giúp liên kết với các enzyme thủy phân thì vai trò liên kết với cơ chất thuộc
về yếu tố CBM. Đến nay, tất cả yếu tố CBM thuộc scaffoldin của cellulosome được
nghiên cứu đều nằm trong họ CBM3. Đây là họ CBM có liên kết mạnh với bề mặt
cellulose tinh thể, giải thích cho tính đặc hiệu của cellulosome với cơ chất của chúng
[6].

Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum [1]

10
Footer Page 19 of 126.


Header Page 20 of 126.

Thành phần scaffoldin (CipA) liên kết với thành tế bào vi khuẩn thông qua tương tác giữa cohesin
loại II và dockerin loại II. CipA chứa một CBM giúp phức hệ bám vào cơ chất và cohesin loại I
liên kết với dockerin loại I của đơn vị xúc tác.

Tóm lại, phức hệ cellulosome có những ưu thế vượt trội, làm tăng hiệu quả
thủy phân cellulose như sau:


Tổ chức phức hệ là tối ưu nhờ tỉ lệ và vị trí sắp xếp hợp lý giữa các

thành phần trong phức hệ


Cấu trúc không gian tối ưu, tránh tình trạng cản trở hoạt động giữa các

thành phần.


Không có cạnh tranh liên kết giữa các thành phần do toàn bộ phức hệ

liên kết với một vị trí duy nhất thông qua domain liên kết mạnh nhưng độ đặc
hiệu thấp, liên kết với phổ rộng vị trí trên thành tế bào thực vật.


Sự thủy phân diễn ra liên tiếp đến sản phẩm cuối nhờ hỗn hợp các

enzyme có hoạt tính khác nhau
1.2.

Hệ vi sinh vật dạ cỏ dê - nguồn khai thác lignocellulase tiềm năng

1.2.1. Cấu trúc hệ tiêu hóa ở dê
Dê thuộc lớp Thú (Mammalia) trong họ Bò (Bovidae), bộ Guốc chẵn
(Artiodactyla). Ở Việt Nam, dê đã được nuôi từ lâu nhằm mục đích lấy thịt và sữa,
trong đó các giống dê phổ biến là dê Cỏ, dê Bách Thảo, dê Boer...
Giống như phần lớn các đại diện khác cùng họ, dê là động vật ăn cỏ. Chúng
không có răng cửa cũng như răng nanh. Việc lấy thức ăn hoàn toàn phụ thuộc vào
phần lợi cứng trên, răng cửa dưới, môi và lưỡi. Để tiêu hóa và hấp thụ được nguồn
thức ăn nghèo dinh dưỡng này, dạ dày của dê có cấu tạo kép gồm bốn ngăn (túi): Ba
túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách) và túi thứ tư tương tự dạ dày của động vật dạ
dày đơn, gọi là dạ múi khế. Trong đó, dạ cỏ là dạ lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái
khoang bụng, từ cơ hoành đến xương chậu. Thành trong dạ cỏ tạo thành những nếp
gấp lớn và được bao phủ bởi các nhú gai. Đâyđược coi là một bể lên men kị khí, là
nơi cư trú của nhiều loài vi sinh vật. Hệ vi sinh vật này tiết ra một hệ các enzyme
phân giải phong phú biến dạ cỏ trở thành một bể lên men kị khí tự nhiên. Các quá
trình lên men chính được diễn ra ở đây nhờ các enzyme tạo bởi hệ vi sinh vật này.

11
Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.

Hình 1.6. Cấu trúc hệ tiêu hóa dê.
Từ trái qua phải lần lượt là dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ múi khế và dạ lá sách

1.2.2. Hệ vi sinh vật dạ cỏ động vật nhai lại
Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai lại rất đa dạng, bao gồm vi
khuẩn, vi khuẩn cổ, động vật nguyên sinh, nấm và thực khuẩn thể. Ở dạ cỏ hoạt
động bình thường, protein và carbohydrate được lên men bởi một hệ vi sinh vật

phức tạp này tạo ra axit béo bay hơi (VFAs), NH4, CO2 và H2. Trong đó, VFA được
hấp thụ qua thành dạ cỏ là nguồn năng lượng chủ yếu cho động vật ăn cỏ. Vi khuẩn
là nhóm chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật (1010 - 1011 trên 1ml dịch dạ cỏ [56]).
Dựa trên môi trường sống, vi khuẩn dạ cỏ được chia thành 4 nhóm: (1) vi khuẩn
sống tự do trong pha lỏng; (2) vi khuẩn sống bám trên thức ăn; (3) vi khuẩn trên
biểu mô dạ cỏ và (4) vi khuẩn cộng sinh trên bề mặt động vật nguyên sinh [17, 69].
Trong đó, nhóm liên kết với thức ăn chiếm tỉ lệ cao tới 70% tổng số vi khuẩn và
đóng vai trò chủ đạo trong hoạt động của các enzyme phân giải endoglucanse và
xylanse [69, 71]. Dựa trên các gen đích (rrs hoặc mcrA), phân tích qPCR cho thấy
có khoảng từ 108 đến 1010 bản sao gen của vi khuẩn cổ trên 1 gram dịch dạ cỏ. Vi
khuẩn cổ dạ cỏ chủ yếu thuộc nhóm sinh metan. Chúng đóng vai trò trong việc duy
trì nồng độ H+ thấp nhờ việc chuyển hóa CO2, giúp duy trì môi trường pH gần trung
tính phù hợp cho quá trình phân giải lignocellulose. Nấm chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ
(khoảng 8%) trong thành phần sinh vật của hệ sinh thái dạ cỏ nhưng cũng có vai trò
nhất định trong quá trình phân giải thức ăn [48]. Hoạt động phối hợp nhịp nhàng
giữa các loài vi sinh vật trong dạ cỏ đem đến hiệu quả phân giải thức ăn cho động
vật ăn cỏ. Không có một thành viên nào trong quần xã sinh vật có thể độc lập
12
Footer Page 21 of 126.


Header Page 22 of 126.

chuyển hóa được hoàn toàn lignocellulose, tinh bột hay protein mà chúng cần hợp
tác tham gia vào một chuỗi quá trình phân giải cơ chất theo từng nấc để đưa đến sản
phẩm cuối cùng.
Ban đầu, các phương pháp định loại truyền thống dựa trên nuôi cấy như phân
lập, liệt kê và xác định đặc tính dinh dưỡng được sử dụng để nghiên cứu độ đa dạng
của hệ vi sinh vật dạ cỏ của động vật nhai lại. Nhóm nghiên cứu của Dehority và
Grubb sau khi phân lập và nuôi cấy vi khuẩn trong dạ cỏ dê (Capra hircus) chỉ xác

định được 11 nhóm vi khuẩn, trong đó có Butyrivibrio fibriosolvens, Streptoccous
bovis, Bacteroides ruminicola, họ Peptococcaceae, một số loài thuộc chi
Bacteroides và một số nhóm chưa thể định loại. Bằng phương pháp này, hơn 200
loài vi khuẩn và ít nhất 100 loài động vật nguyên sinh và nấm đã được xác định
trong dạ cỏ của một số động vật nhai lại. Tuy nhiên, những kết quả này không đại
diện được cho tính đa dạng của toàn bộ hệ vi sinh vật trong khu hệ bởi phần lớn vi
sinh vật trong dạ cỏ không thể nuôi cấy được. Với sự phát triển của công nghệ,
nhiều phương pháp nghiên cứu đa dạng không cần nuôi cấy đã ra đời như phân tích
trình tự gen 16S/18S rRNA, giải trình tự hệ gen, kĩ thuật dấu vân tay DNA (DNA
fingerprinting) hay Metagenomics. Ứng dụng phương pháp phân tích trình tự gen
16S rRNA hệ vi sinh vật dạ cỏ gia súc có trên dữ liệu Ribosomal Database Project
đến năm 2010, nhóm nghiên cứu của Kim và cộng sự (2011) công bố có 13.478
trình tự thuộc về khoảng 7.000 loài vi khuẩn và 3.516 trình tự thuộc về khoảng
1.500 loài vi khuẩn cổ, lần lượt chiếm khoảng 79% và 21% bộ dữ liệu trình tự phân
tích [54]. Đáng chú ý là nghiên cứu này chỉ ra rằng chỉ có 6,5% trình tự vi khuẩn và
1,7% trình tự vi khuẩn cổ thuộc về nhóm có thể nuôi cấy được cho thấy những hạn
chế của các phương pháp truyền thống dựa trên nuôi cấy khi đánh giá độ đa dạng
sinh vật. Ngoài ra, tiềm năng sinh vật trong hệ sinh thái dạ cỏ động vật nhai lại là rất
lớn do trong tổng số các loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ được phân tích mới chỉ có 88
loài vi khuẩn và sáu chi vi khuẩn cổ đã được biết đến.Theo kết quả này, các trình tự
vi khuẩn được phân chia thành 5.271 đơn vị phân loại (operation taxonomic
units_OTUs) ở mức độ loài (khoảng cách di truyền 0,03) đại diện cho 19 ngành
hiện có. Trong đó, các ngành Firmicutes (2958 OTUs), Bacteroidetes (1610 OTUs)
13
Footer Page 22 of 126.


Header Page 23 of 126.

và Proteobacteria (226 OTUs) là các ngành chiếm ưu thế, 16 ngành vi khuẩn còn

lại chỉ chiếm dưới 3% được xếp thành nhóm ngành thiểu số. Hơn 90% trình tự
thuộc ngành Firmicutes được xác định nằm trong lớp Clostridia, còn lại thuộc các
lớp Bacilli, Erysipelotrichi và nhóm chưa xác định. Trong lớp Clostridia, các họ
Lachnospiraceae, Ruminococcaceae và Veillonellaceae được tìm thấy nhiều nhất
với các chi phổ biến là Butyrivibrio, Acetivibrio, Ruminococcus, Succiniclasticum,
Pseudobutyrivibrio và Mogibacterium. Ngoài ra, phổ biến trong lớp Bacilli là chi
Streptococci. Đối với vi khuẩn thuộc ngành Bacteroidetes, hầu hết các trình tự
(88,5%) được xếp vào lớp Bacteroidia (15 chi), phần còn lại thuộc lớp
Sphingobacteria (2 chi) và nhóm chưa định loại được đến lớp. Trong lớp
Bacteroidia, chi Prevotella chiếm ưu thế với các loài chủ yếu là Prevotella
ruminicola, Prevotella brevis, Prevotella bryantii và Prevotella albensis. Tất cả
năm lớp của ngành Proteobacteria đều có mặt khi phân tích dữ liệu dạ cỏ. Lớp
Gammaproteobacteria chiếm khoảng 73% số lượng trình tự với các chi
Ruminobacter, Succinivibrio, Escherichia/Shigella và Pseudomonas (số lượng trình
tự mỗi chi chiếm khoảng 2% các trình tự Gammaproteobacteria). Ngoài ra, các
trình tự thuộc nhóm Cổ khuẩn cũng được xác định. Hầu hết các trình tự vi khuẩn cổ
trong dữ liệu được xác định thuộc ngành Euryarchaeota. Trong đó, hơn 90% trình
tự thuộc cổ khuẩn sinh metan chi Methanobrevibacter (>60%), Methanomicrobium
(~15%) và một nhóm cổ khuẩn không thể nuôi cấy được xếp vào nhóm rumen
cluster C (~16%). Hai nhóm Cổ khuẩn chi Methanobrevibacter chiếm ưu thế là M.
gottschalkii (bao gồm M. gottschalkii, M. thaueri và M. millerae) và M.
ruminantium (M. ruminantium và M. olleyae).
Nhiều loài nấm kị khí cũng được tìm thấy trong mẫu dịch dạ cỏ và phân của
động vật nhai lại. Nấm trong dạ cỏ chiếm khoảng 10% tổng số sinh khối, độ đa
dạng phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng và cơ thể vật chủ [58]. Chúng được xếp
vào ngành nấm mới riêng biệt Neocallimastigomycota. Nghiên cứu trên 267 287
trình tự, Liggenstoffer và cộng sự đã phân loại được một phần nhóm nấm này vào
các chi Neocallimastix, Piromyces, Anaeromyces, Caecomyces, Orpinomyces và
Cyllamyces [65]. Trong đó, chi Piromyces chiếm ưu thế với 36% số trình tự. Chi
14

Footer Page 23 of 126.


Header Page 24 of 126.

Orpinomyces và Cyllamyces có số lượng ít nhất với 1,1% và 0,7% số trình tự. Tuy
nhiên, vẫn còn khoảng 38,3% trình tự chưa được phân loại, không tương ứng các
chi đã có.
Vi khuẩn được tìm thấy trong dạ cỏ của động vật nhai lại chủ yếu là vi khuẩn
Gram (-), số lượng vi khuẩn Gram (-) tăng lên khi tăng lượng thức ăn chứa nhiều
năng lượng. Hầu hết chúng chỉ sống được trong điều kiện yếm khí, pH tối ưu sinh
trưởng từ 6,0 đến 6,9 và nhiệt độ tối ưu là 39oC, phù hợp với điều kiện môi trường
trong dạ cỏ [51]. Thành phần vi khuẩn dạ cỏ thay đổi tùy theo loài động vật, tuổi và
thành phần thức ăn. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự pyrosequencing để xác định
thành phần vi khuẩn trong dạ cỏ của động vật nhai lại từ một đến hai năm tuổi, Jami
và cộng sự đã khẳng định quần thể vi khuẩn dạ cỏ được hình thành rất sớm sau khi
con non được sinh ra thông qua hiện tượng giảm số lượng các nhóm vi khuẩn hiếu
khí và vi khuẩn hiếu khí tùy ý đồng thời tăng nhóm vi khuẩn kỵ khí [47]. Hệ vi
khuẩn có thể truyền từ mẹ sang con non qua âm đạo, bề mặt vú, da hoặc nước bọt
và do đó phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa mẹ và con non. Một số nhóm vi
khuẩn cần thiết cho chức năng của dạ cỏ trưởng thành, đặc biệt là vi khuẩn phân
giải cellulose có thể được phát hiện ngay từ ngày tuổi đầu tiên, trước khi thực phẩm
rắn được tiêu thụ. Chế độ dinh dưỡng của động vật cũng ảnh hưởng đến thành phần
và số lượng của hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của chúng. Nhóm nghiên cứu của
Kocherginskaya đã phân tích độ đa dạng vi sinh vật dạ cỏ của bò ở hai chế độ ăn
khác nhau: chủ yếu là ngô và chủ yếu là cỏ khô [55]. Kết quả là hệ vi sinh vật giữa
hai nhóm tiêu thụ nguồn thức ăn khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Trong khi, vật
nuôi chủ yếu tiêu thụ ngô có lượng vi khuẩn nhiều và đa dạng hơn với nhóm
Cytophaga- Flavobacter-Bacteroides và Proteobacteria còn nhóm tiêu thụ cỏ khô
có độ đa dạng thấp hơn và vi khuẩn chiếm ưu thế là nhóm gram dương hàm lượng

G+C thấp. Nghiên cứu trên dạ cỏ trâu, Berseem và cộng sự đưa ra thành phần vi
sinh vật chủ yếu bao gồm Ruminococcus albusand và R. flavefaciens (59.8%),
Bacteroides succinogenes (Fibrobacter succinogenes) (19.2%), Butyrivibrio
fibrisolvens (11.1%), Clostridium lochheadi (3.8%) và C. longisporum (1.3%) [51].
Trong khi đó, phân tích thành phần vi khuẩn ở pha rắn và pha lỏng trong dạ cỏ dê
15
Footer Page 24 of 126.


Header Page 25 of 126.

(Capra hircus), nhóm nghiên cứu của Cunha chỉ ra nhóm vi khuẩn ưu thế ở cả hai
pha là Firmicutes và Bacteroidetes [16]. Tuy nhiên, khi phân tích gần 1500 trình tự
từ dữ liệu DNA metagenome hệ vi sinh vật cũng từ dạ cỏ dê, Lim và cộng sự lại
đưa ra kết quả nhóm vi khuẩn Prevotella ruminicola 23, Butyrivibrio proteoclasticu
B316 và Butyrivibrio fibrisolvens chiếm số lượng nhiều nhất [66]. Dù thành phần vi
khuẩn ưu thế khác nhau nhưng nhìn chung đây đều là những vi khuẩn có khả năng
sản sinh ra các enzyme phân giải lignocellulose, thành phần chính trong thức ăn của
động vật nhai lại
1.2.3. Enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật dạ cỏ
Vi sinh vật trong hệ tiêu hóa nói chung và trong dạ cỏ nói riêng là đối tượng
nghiên cứu rộng rãi trong suốt 50 năm qua. Nhiều nhóm nghiên cứu đã phân lập và
xác định được các chủng vi sinh vật có trong dạ cỏ của một số động vật nhai lại
khác nhau. Trong số đó, nhiều loài được chứng minh là có khả năng phân hủy
lignocellulose, chủ yếu là nấm và vi khuẩn kị khí như Anaeromyces mucronatus,
Caecomyces

communis,

Cyllamyces

aberensis,

Fibrobacter

succinogenes,

Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus, Butyrivibrio fibrisolvens,
Prevotellaruminicola,

Eubacterium

cellulosolvens

và

Eubacterium

ruminantium…[18, 56]. Cùng với đó, những enzyme phân giải có nguồn gốc từ các
vi sinh vật này cũng được phát hiện và nghiên cứu.
Varel và Dehority (1989) đánh giá hệ vi khuẩn trong dạ cỏ bò đã cho thấy F.
succinogenes, R. flavefaciens và R. albus chiếm tỉ lệ cao trong tổng số vi khuẩn
phân giải lignocellulose (lần lượt là 33%, 2,6% và 46%) [104]. Ngoài ra, khả năng
thủy phân cellulose của ba loại vi khuẩn này cao hơn nhiều so với các nhóm vi
khuẩn thủy phân khác cư trú trong dạ cỏ. Do đó, F. succinogenes, R. flavefaciens và
R. albus được coi là đại diện cho nhóm vi khuẩn dạ cỏ có khả năng phân giải
lignocellulose. Ngoài ra, Butyrivibrio fibrisolvens và Prevotella.sp cũng được chú ý
nhờ khả năng phân giải xylan.
Ba nhóm enzyme phân giải cellulose quan trọng là endoglucanase,
exoglucanase và β-glucosidase đều được phát hiện ở vi sinh vật phân giải

lignocellulose dạ cỏ. Những enzyme này thuộc 14 họ GH, chủ yếu là họ GH5 và 9.
16
Footer Page 25 of 126.