Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Và Thành Phần Hóa Học Trong Rễ Cây Thổ Phục Linh (Smilax Glabra Roxb.) Của Việt Nam

Header Page 1 of 126.
i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
––––––––––––––––––

MAI HƢƠNG

NGHI£N CøU HO¹T TÝNH SINH HäC Vµ THµNH PHÇN
HãA HäC TRONG RÔ C¢Y THæ PHôC LINH
(SMILAX GLABRA ROXB.) CñA VIÖT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:

60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN QUỐC VƢỢNG

HÀ NỘI, 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 1 of 126.

/>

Header Page 2 of 126.
ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Nguyễn
Quốc Vượng, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới mọi thành viên phòng Công nghệ
Hóa dược, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Đồng thời
tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới phòng hoạt chất sinh học - Viện Hóa sinh
biển, phòng thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học và tập thể cán bộ
Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ tôi thực hiện các nội dung của đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo Viện và cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi trong thời gian tôi học tập và hoàn
thiện luận văn này.
Cuối cùng, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới những
người thân trong gia đình, các anh chị em lớp CHST K15 những người đã
luôn ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Đề tài luận văn được thực hiện tại phòng Công nghệ hóa dược – Viện
Hóa sinh biển, theo tiến độ thực hiện đề tài VAST0402/13 – 14 thuộc Viện
Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hà Nội, Tháng 11 năm 2013
Tác giả luận văn

Mai Hƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 2 of 126.

/>

Header Page 3 of 126.

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ .............................................................. ix
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI............................. 3
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN......................................................................... 4
1.1. Thực vật học và tác dụng chữa bệnh của Thổ phục linh (Smilax
glabra Roxb.) ............................................................................................ 4
1.1.1. Thực vật .......................................................................................... 4
1.1.2. Tác dụng chữa bệnh ........................................................................ 6
1.2. Astilbin và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh .................. 8
1.2.1. Astilbin ............................................................................................ 8
1.2.2. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh ................................... 9
1.3. Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh ....................................... 13
1.4. Tình hình nghiên cứu cây Thổ phục linh trên thế giới và trong
nước ......................................................................................................... 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................. 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................. 17
CHƢƠNG 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 19
2.1. Phương pháp tạo các cao chiết và phân lập các hoạt chất ................... 19
2.1.1. Phương pháp tạo cao chiết ............................................................ 19
2.1.2. Các phương pháp phân lập ........................................................... 20
2.1.2.1. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography- TLC) ........... 20
2.1.2.2.Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer
chromatography – PTLC) ................................................................. 21
2.1.2.3. Sắc ký cột (Column chromatography- CC) .......................... 22

2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................ 22
2.2.1. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR) ..................................................... 22
2.2.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS) ................................................................ 23
2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................. 23
2.2.4. Phổ khối lượng (Mass spectrometry- MS) ................................... 24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 3 of 126.

/>

Header Page 4 of 126.
iv

2.3. Phương pháp HPLC xác định hàm lượng các hợp chất ....................... 24
2.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học của các cao chiết ........... 25
2.4.1. Hoạt tính độc tế bào invitro .......................................................... 25
2.4.1.1. Nguyên liệu ........................................................................... 25
2.4.1.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro ................................... 25
2.4.1.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào
(cytotoxic assay) ................................................................................ 25
2.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa ............................................................... 26
2.4.2.1. Phương pháp đo MDA.......................................................... 26
2.4.2.2. Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào
gan chuột ........................................................................................... 28
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ................................................................... 30
3.1. Phân lập astilbin, một số hợp chất và tạo các cao chiết TPLEtOH, TPPL-As40 .................................................................................. 30
3.1.1. Phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin trên sắc ký lớp mỏng
................................................................................................................. 30
3.1.1.1. Qui trình phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin

theo SKLM ......................................................................................... 30
3.1.1.2. Số liệu phổ của các chất phân lập được .............................. 32
3.1.2. Khảo sát một số vùng nguyên liệu Thổ phục linh ở miền Bắc ..... 33
3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát ..................... 33
3.1.2.2. Quy trình chung phân lập và xác định hàm lượng
astilbin từ rễ Thổ phục linh khô ........................................................ 35
3.1.3. Giám định thu mua mẫu và xử lý mẫu Thổ phục linh .................. 37
3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật ....................................................... 37
3.1.3.2. Thu mua và xử lý mẫu .......................................................... 37
3.1.4. Tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 ..................................... 38
3.2. Xác định hàm lượng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH,
TPL-As40 ................................................................................................ 39
3.2.1. Thiết lập thông số cho sắc ký lỏng ............................................... 39
3.2.2. Thiết lập chương trình chạy .......................................................... 40
3.2.3. Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng ....... 40
3.2.4. Thiết lập trình tự chạy cho các mẫu .............................................. 41
3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của hợp chất cần phân tích trong các mẫu .... 42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 4 of 126.

/>

Header Page 5 of 126.
v

3.3. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của
các cao chiết ............................................................................................ 45
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào các cao chiết TPL-EtOH, TPLAs40 ........................................................................................................ 45
3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa ........................................... 47
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 49

4.1. Astilbin và một số hoạt chất tách được từ rễ Thổ phục linh ................ 49
4.2. Khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ TPL tại miền Bắc…….……….58
4.3. Cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40…………………………………….58
4.4. Hàm lượng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40.......... 58
4.4.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng astilbin ..................... 59
4.4.2. Đánh giá hàm lượng hợp chất astilbin trong mẫu cao chiết Thổ
phục linh .................................................................................................. 61
4.5. Hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch
chiết ......................................................................................................... 63
4.5.1. Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư KB,
LU-1, MCF-7 .......................................................................................... 63
4.5.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết ................................. 65
KẾT LUẬN .................................................................................................... 67
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 76

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 5 of 126.

/>

Header Page 6 of 126.
vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ

Ac

Nhóm axetyl

ACN

Axetonnitrin

n-Bu

Nhóm n-butyl

BALB/c

Chuột bạch tạng

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 (Cacbon-13 Nuclear

C-NMR

Magnetic Resonance)

CC

Sắc ký cột (Column chromatography)

DCM

Diclometan

DMF

N,N-Dimethylformamit

DMSO

Dimethylsulfoxid ((CH3)2SO)

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ED50

Nồng độ bảo vệ tối thiểu 50%

EMME

Ethoxymethylenmalonat

ESI-MS

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization
Mass Spectrometry )

Et

Nhóm etyl

EtOAc

Etyl axetat

EtOH

Etanol

1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Proton (Proton Nuclear Magnetic

H-NMR

Resonance Spectroscopy)
HMBC
HPLC
HTCO

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear
Multiple Bond Correlation)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Hoạt tính chống oxy hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 6 of 126.

/>

Header Page 7 of 126.
vii

HSQC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (Heteronuclear
Single Quantum Coherence)

IC50

Nồng độ ức chế 50% (Imhibitory Concentration 50%)

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

KB

Tế bào ung thư biểu mô (Human Epidemoid Carcinoma)

LU-1

Tế bào ung thư phổi (Human Lung Carcinoma)

MCF-7

Dòng tế bào ung thư vú người (MCF-7 Human breast
adenocarcinoma cell line)

MTT

3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoli bromua

MCPBA

m-Chloroperbenzoic acid

MDA

Malonyl dialdehyd

MS

Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

Me

Nhóm metyl

n-hx

n-hexan

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy)

OD

Mật độ quang (Optical Density)

PTLC

Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer
chromatography)

Ph

Nhóm phenyl

SRB

Sulforhodamine B

TBA

Thiobarbituric acid

TLC

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography)

TPL

Thổ phục linh

TPL-As40

Mẫu astilbin thô

TPL-EtOH

Mẫu cặn chiết cồn

UV-VIS

Phổ tử ngoại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 7 of 126.

/>

Header Page 8 of 126.
viii

s

Singlet

br

Broad

d

Doublet

dd

Doublet of doublets

t

Triplet

dm

Doublet of multiplets

q

Quartet

ppm

Parts per million

m

Multiplet

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 8 of 126.

/>

Header Page 9 of 126.

ix

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ
Danh mục bảng
Bảng 3.1: Hệ dung môi phân tích mẫu theo thời gian .................................... 41
Bảng 4.1: Cấu trúc phân tử của 3 hợp chất tách được rễ thổ phục linh .......... 50
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ TPL tại 8 tỉnh miền Bắc...58
Bảng 4.3: Đường chuẩn, r2, LOD, LOQ của các chất astilbin ........................ 61
Bảng 4.4: Kết quả định lượng hàm lượng của astilbin trong các mẫu ........... 62
Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư KB ..... 63
Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1 .. 64
Bảng 4.7: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 ..... 64
Bảng 4.8: Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa ................................... 65
Danh mục hình vẽ
Hình 1.1: Cây thổ phục linh ........................................................................ 4
1.2: Công thức cấu tạo của astilbin ..................................................... 9
Hình 1.3. Dihydroflavonol được tách từ rễ thổ phục linh ............................ 10
Hình 1.4: Một số các flavonoid khác được tách ra từ RSG ......................... 11
Hình 1.5: Các phenylpropanoid glycoside được tách từ RSG ...................... 11
Hình 1.6: Lignan glycoside được tách từ RSG ........................................... 12
Hình 1.7: Các polyphenol, phenolic acid và glycoside của nó được tách ra từ
RSG ........................................................................................................ 12
Hình 1.8: Các cấu từ phenolic mới được tách từ RSG................................. 18
Hình 3.1: Sơ đồ tách astilbin và các hợp chất gần trên SKLM ..................... 31
Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu Thổ phục linh ở các vùng ............................... 35
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh khô .......................... 36
Hình 3.4: Mẫu Thổ phục linh thân lá và củ tươi ......................................... 37
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 9 of 126.

/>

Header Page 10 of 126.
x

Hình 3.5: Hình ảnh mẫu Thổ phục linh tươi tại Tuyên Quang ..................... 38
Hình 3.6: Sơ đồ tạo cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-Đường ............. 39
Hình 3.7: Sơ đồ trình tự chạy các mẫu ....................................................... 42
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh AE trên cột Zorbax Eclipse ..... 43
XDB C18 (4,6 x 150nm, 5µm) ................................................................... 43
Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- đường trên cột Zorbax Eclipse
XDB C18 (4,6 x 150nm, 5µm) ................................................................... 43
Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- AS4O trên cột Zorbax Eclipse
XDB C18 (4,6 x 150nm, 5µm) ................................................................... 44
Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- EtOH trên cột Zorbax Eclipse
XDB C18 (4,6 x 150nm, 5µm) ................................................................... 44
Hình 4.1: Chất 1 (Astilbin) ...................................................................... 50
Hình 4.2: Phổ 1H-NMR của astilbin .......................................................... 52
Hình 4.3: Phổ 13C-NMR của astilbin ......................................................... 52
Hình 4.4: Engeletin .................................................................................. 53
Hình 4.5: Phổ 1H-NMR của engeletin........................................................ 54
Hình 4.6: Phổ 13C-NMR của engeletin....................................................... 54
Hình 4.7: 3-O-caffeoyl-shikimic acid ........................................................ 55
Hình 4.8: Phổ 1H-NMR của chất 3 ............................................................ 56
Hình 4.9: Phổ 13C-NMR của chất 3 ........................................................... 57
Hình 4.10: Phổ HMBC của chất 3 ............................................................ 57
Hình 4.11: Sắc ký đồ của hợp chất astilbin tại bước sóng 291 nm trên cột
Zobax eclipse XDB C18 ............................................................................ 60
Hình 4.12: Đồ thị đường chuẩn astilbin ..................................................... 60
Hình 4.13: Sắc ký đồ của mẫu thổ phục linh-As4O và astilbin trên cột Zorbax

eclipe XBD C18 (4,6 x 150 nm, 5µm) ........................................................ 61
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 10 of 126.

/>

Header Page 11 of 126.
1

MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có một hệ thực
vật vô cùng phong phú, đa dạng và là một nguồn tài nguyên thiên nhiên vô
cùng quý giá. Thực vật được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, trong đó
hàng nghìn loại thực vật đã được sử dụng làm thuốc.
Do sự phong phú về chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam từ thực vật
ngày càng có giá trị to lớn trong việc chữa bệnh. Ngày nay bên cạnh các loại
thuốc tổng hợp hóa học thì việc sử dụng các loại cây cỏ, thảo mộc để điều chế
thuốc cũng được phát triển rộng rãi và ngày càng được ưa chuộng. Nhiều loại
thuốc được sản xuất từ dược liệu Việt Nam như Berberin, Palmatin… Ngoài
ra các hợp chất thiên nhiên được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu
… Từ đó đặt ra yêu cầu về việc hiểu rõ thành phần, cấu trúc hóa học cũng như
hoạt tính sinh học của các cây thuốc càng được đề cao.
Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học
của các loài cây thuốc tại Việt Nam, nhằm mục đích sử dụng chúng một cách
hợp lí, khoa học và hiệu quả đang ngày càng có tầm quan trọng hơn. Các cây
thuốc quí trong các bài thuốc dân gian đã và đang được quan tâm nghiên cứu
đầy đủ về hoạt chất và hoạt tính sinh học, trong khuôn khổ các đề tài cấp Viện
Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, cây Thổ phục linh đã được lựa

chọn nghiên cứu.
Thổ phục linh (Smilax glabra) vốn là một loại cây mọc hoang ở các vùng
miền núi ở nước ta. Từ rất lâu đời, trong Y học cổ truyền Việt Nam, thổ phục
linh được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh về gân cốt, trị giun
sán, ung nhọt, giải độc, chống viêm …Theo Y học cổ truyền Trung Quốc thì
rễ của thổ phục linh có tác dụng giải độc, làm giảm mất nước, có thể được sử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 11 of 126.

/>

Header Page 12 of 126.
2

dụng để điều trị bệnh trùng xoắn, viêm da, bệnh giang mai, bệnh brucella, cấp
tính do vi khuẩn kiết lỵ…Trên thế giới cũng đã có rất nhiều nghiên cứu về tác
dụng chữa bệnh của cây thổ phục linh.
Trên cơ sở này, chúng tôi đã quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu hoạt
tính sinh học và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax
glabra Roxb) của Việt Nam” để tiến hành nghiên cứu.
- Bố cục của luận văn:
Luận văn gồm 74 trang, trong đó có 8 bảng và 32 hình. Phần mở đầu 2
trang; kết luận và kiến nghị 2 trang; tài liệu tham khảo 5 trang. Nội dung của
luận văn được chia làm bốn chương chính:
- Chương 1: Tổng quan (15 trang: từ trang 4 đến trang 18)
- Chương 2: Các phương pháp nghiên cứu (11 trang: từ trang 19 đến
trang 29)
- Chương 3: Thực nghiệm (gồm 19 trang: từ trang 30 đến trang 48)
- Chương 4: Kết quả và thảo luận (gồm 18 trang: từ trang 49 đến trang

66).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 12 of 126.

/>

Header Page 13 of 126.
3

MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
- Mục đích của đề tài
Mục đích của đề tài là nghiên cứu cơ sở khoa học tạo tiền đề cho các nghiên
cứu tạo chế phẩm giá trị cao từ rễ Thổ phục linh với các mục tiêu đề ra là:
- Phân lập hoạt chất chính astilbin và một số hoạt chất khác trong rễ cây
Thổ phục linh.
- Tạo các cao chiết với hàm lượng astilbin cao.
- Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất astilbin các mẫu cao
chiết.
- Thử hoạt tính sinh học về độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của
các cao chiết.
- Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Các kết quả của đề tài là cơ sở
cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc điều chế chế phẩm chống oxy hóa có
giá trị cao từ rễ Thổ phục linh, nguồn nguyên liệu quí và phong phú ở nước ta.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 13 of 126.

/>

Header Page 14 of 126.
4

CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1. Thực vật học và tác dụng chữa bệnh của Thổ phục linh (Smilax
glabra Roxb.)
1.1.1. Thực vật
Thổ phục linh thuộc:
- Họ Khúc khắc (Smilacaceae).
- Chi Khúc khắc (Smilax).

Hình 1.1: Cây thổ phục linh
Nguồn internet
Thổ phục linh có tên khoa học là Smilax glabra (Roxb.) hay còn gọi là
Khúc khắc, Kim cang, khau đâu, cẩu ngổ lực (Tày), mọt hoi dòi (Dao), D‟rang
lò (Châu Mạ), tơ pớt (K‟Ho), lái (K‟Dong), Smilax gabre, squine (Pháp). Thổ
phục linh thuộc chi Khúc khắc (Smilax) là chi của khoảng hơn 200 loài dây
leo hay thân thảo trong thực vật có hoa, nhiều loài trong số đó là các cây thân
gỗ hay có gai. Các loài trong chi Smilax mọc thành dạng cây bụi, tạo ra bụi
rậm dày đặc khó xuyên qua. Chúng thuộc họ Smilacaceae. Tên gọi
Sarsaparilla là tên chung cho nhiều loài thuộc họ Khúc khắc (Smilacaceae).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 14 of 126.

/>

Header Page 15 of 126.
5

Có rất nhiều loài của họ Smilax mang chung một tên là Sarsaparilla như loài
officinalis, aristolochiaefolia, glabra, febrifuga, ornata, regelii, japicanga
mọc ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới nhưng giống nhau về hình dáng, về
tính năng và thành phần hóa học cũng như sử dụng. Họ Khúc khắc
(Smilacaceae) bao gồm khoảng 350 loài, được phân bố tại những vùng khí
hậu ôn hòa, nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam mỹ, Jamaica, Caribbean,
Mexico, Honduras, tây Ấn Độ, Mianma, nam Trung Quốc, Ðài Loan, Lào,
Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Trong đó Smilax glabra (Roxb.) phân bố
chủ yếu ở Trung Quốc, Ðài Loan, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam.[1]
Thổ phục linh là loại cây leo, sống lâu năm, trườn dài 4-5m (có thể tới
10m), phân nhiều cành. Cành nhỏ, mềm, không gai, lá mọc so le, hình bầu dục
hoặc trái xoan, dài 5-11cm, rộng 1-5cm, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên sang
bong, mặt dưới bệch như có phấn trắng, khi khô lá có màu hat dẻ rất đặc sắc,
gân chính 3, cuống lá dài 1cm mang tua cuốn mảnh và dài do lá kèm biến đổi.
Cụm hoa mọc ở kẽ lá, cuống rất ngắn hoặc gần như không cuống, mang 1
tán đơn gồm nhiều hoa màu vàng nhạt, cuống hoa mảnh như sợi chỉ, dài 1cm
hoặc hơn. Hoa đực và hoa cái riêng rẽ, hoa đực có lá đài hình tim dày, cánh hoa
bầu hơi khum, nhị không cuống, bao phấn thuôn, hoa cái giống hoa đực. Sinh
trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm. Tuy nhiên chỉ những
cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa, quả. Quả mọng, hình cầu, đường
kính 6-7mm gần như 3 cánh, chứa 3 hạt, khi chin màu đen.
Mùa hoa : Tháng 5-6, mùa quả : tháng 8-12, thu hoạch vào mùa hạ và mùa
thu. Tái sinh tự nhiên tốt từ hạt hoặc các phần rễ củ còn lại sau khi bị chặt phá.
Ở Việt Nam, Thổ phục linh phân bố rải rác khắp các tỉnh ở miền núi
cũng như trung du và 1 vài đảo lớn. Một số tỉnh được coi là có nhiều Thổ
phục linh phân bố tập trung như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái
Nguyên, Hòa Bình, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Footer Page 15 of 126.

/>

Header Page 16 of 126.
6

vùng tây Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, và các tỉnh Tây Nguyên.
Thổ phục linh là cây ưa sáng, chịu hạn tốt và có thể sống được trên nhiều loại
đất, thường mọc lẫn với nhiều loại cây khác trong các quần hệ thứ sinh trên
đất sau nương rẫy, đồi cây bụi, rừng đang phục hồi do khai thác kiệt. Thổ
phục linh cũng hay gặp dưới tán rừng thông thưa hay chưa khép tán. Độ cao
phân bố dưới 1000m, hoặc 1500m (ở Thái Lan). Cây ưa khí hậu nóng và ẩm
của vùng nhiệt đới, đồng thời cũng có thể chịu lạnh tốt ở nhiệt độ tối thấp
tuyệt đối 4 hoặc 30C (ở vùng Trùng Khánh – Cao Bằng và Quản Bạ - Hà
Giang). Thổ phục linh sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa nhiều
hàng năm, song lượng cây con tái sinh tự nhiên từ hạt không nhiều. [1]
Thổ phục linh mọc hoang ở miền núi nhưng trồng được ở trung du và
đồng bằng.
Cây có thể nhân giống bằng đầu mầm thân rễ hoặc hạt vào đầu xuân.
Thổ phục linh cần có giá leo, nếu trồng quy mô nhỏ, nên trồng gần bờ rào.
Cây sống khỏe không cần chăm sóc nhiều.
1.1.2. Tác dụng chữa bệnh
Theo Y học cổ truyền Việt Nam, rễ của Thổ phục linh có tác dụng kiện tỳ
vị, cường gân cốt, trừ phong thấp, lợi cơ khớp, cầm tiêu chảy, trị cốt thống,
ung nhọt độc, giải độc thủy ngân. Theo y học Trung Quốc rễ của Thổ phục
linh được sử dụng cho việc giải độc, làm giảm mất nước do ra mồ hôi, lợi
tiểu, nó có thể được sử dụng để điều trị bệnh trùng xoắn, viêm da, bệnh giang
mai, bệnh brucella, cấp tính do vi khuẩn kiết lỵ, viêm thận cấp và mãn tính
trong. Bên cạnh đó, nó cũng được dùng cho vấn đề về da, chẳng hạn như bệnh

vẩy nến và eczema mãn tính. Nó cũng là một trong những thành phần chính
trong cao Quế Lâm một loại thực phẩm chức năng truyền thống ở miền Nam
Trung Quốc và Hồng Kông. Thực phẩm này được cho là để giúp giảm thiểu
các tác động của ẩm nhiệt, ích âm, giữ thân nhiệt và làm sạch các chất độc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 16 of 126.

/>

Header Page 17 of 126.
7

trong máu, nó còn được cho là thực phẩm đặc biệt giúp cải thiện hoặc chữa
bệnh rối loạn da. Thổ phục linh được ví như linh chi dưới đất, thường được
dân đào lấy củ tươi ngâm rượu uống để bồi bổ cơ thể, khỏe mạnh gân cốt
và bổ thận. Rễ Thổ phục linh được thái mỏng phơi khô là 1 vị thuốc có
trong hầu hết các thang thuốc đông y do khả năng tăng cường hiệu quả và
tác dụng của các loại thuốc khác. Trên thế giới, nhiều loài Thổ phục linh
thuộc họ Smilax với tên Sarsaparilla đã được sử dụng trong thương mại ở
dạng rễ củ thái mỏng sấy khô hoặc dạng cao dịch chiết etanol dùng làm đồ
uống trong sinh hoạt hàng ngày.
Thân rễ Thổ phục linh có hoạt tính trị giun, sán lá gan nhỏ, và kháng siêu vi
khuẩn, lợi tiểu, chống viêm. Thử nghiệm trên chuột , tác dụng chống viêm rõ rệt
đối với giai đoạn viêm cấp tính cũng như mạn tính thực nghiệm trong mô hình
phù bàn chân gây bằng kaolin và mô hình hạt thực nghiệm gây bằng amian,
đồng thời có tác dụng gây thu teo tuyến ức chuột cống, ức chế miễn dịch, nâng
cao được tỷ lệ chuột lang sống qua cơn choáng phản vệ, làm giảm nhẹ cơn dị
ứng trong thí nghiệm tiêm mẫn cảm chuột lang bằng kháng nguyên và sau đó
gây dị ứng nhẹ bằng cách đưa kháng nguyên vào đường hô hấp trong buồng khí.

Thổ phục linh có những tính chất của một thuốc chống viêm steroid. [1]
Ngoài ra, Thổ phục linh còn có tác dụng kháng histamine. Nước sắc của
một bài thuốc gồm Thổ phục linh và 15 dược liệu khác được chứng minh có
hoạt tính đối kháng với các tác dụng gây khó thở và co giật trên chuột lang hít
khí dung histamine, và với tác dụng gây hạ áp trên động vật tiêm histamine.
Trong thử nghiệm in vitro, Thổ phục linh làm giảm co thắt cơ trơn ruột chuột
lang cô lập gây bởi histamine và acetylecholin. Trong thử nghiệm in vitro,
thuốc có tác dụng ổn định màng hồng cầu của aspirin. Cao chiệt với methanol
ức chế mạnh hoạt tính của protein kinase C trên thực nghiệm. Flavonocid của
Thổ phục linh có tác dụng ức chế enzym oxy hóa khử peroxydase và catalase
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 17 of 126.

/>

Header Page 18 of 126.
8

máu chuột và huyết thanh người. Thử nghiệm độc tính cấp và bán trường
diễm cho thấy Thổ phục linh hầu như không độc. [1]
Cao chiết với methanol từ thân rễ Thổ phục linh với liều 100 mg/kg thể
trọng, tiêm phúc mạc, đã làm hạ glucose máu của chuột nhắt trắng bình
thường 4 giờ sau khi tiêm, và cũng làm giảm glucose máu chuột nhắt gây đái
tháo đường không phụ thuốc insulin. Tuy nhiên, Thổ phục linh không có hiệu
quả trên glucose – máu chuột nhắt gây đái tháo đường với streptozotocin (đái
tháo đường phụ thuộc insulin có hạ insulin máu). Thổ phục linh cũng nhận sự
tăng glucose máu do epinephrine trên chuột nhắt. Như vậy, tác dụng hạ
glucose máu của Thổ phục linh có thể làm tăng độ nhạy cảm của các thụ thể
đối với insulin.
Cao lỏng chế từ Thổ phục linh phối hợp với cà gai leo hoặc hy thiêm

được dùng điều trị thấp khớp, đã tỏ ra có tác dụng tốt đối với chứng đau nhức,
nhất là với những bệnh khớp không có tiêu chuẩn chẩn đoán. Kết quả tốt nhất
và tương đối nhanh đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn. Trên lâm sang,
bài thuốc gồm Thổ phục linh và 7 dược liệu khác được dùng điều trị bệnh
chân voi là hậu quả của bệnh giun chỉ. Thuốc làm số lần sốt tái phát giảm, cơn
sốt nhẹ hơn.
1.2. Astilbin và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh
1.2.1. Astilbin
Công thức phân tử: C21H22O11; Trọng lượng phân tử 450g/mol.
Astilbin là một flavanonol, một dạng của flavonoid có dạng đồng phân 2Rtrans, dạng neoisoastilbin là đồng phân (2S - cis) và isoastilbin là dạng đồng
phân (2R - cis). Astilbin được tìm thấy trong nhiều họ như Hypericaceae,
Smilacaceae… như hình 1.2:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 18 of 126.

/>

Header Page 19 of 126.
9

1.2: Công thức cấu tạo của astilbin
Tên IUPAC: (2R,3R)-2-(3‟,4‟-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3- [(2S,3R,4R,
5R, 6S) -3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-1-yl] oxy-2,3- dihydrochromen-4-ol.
Tên thường gọi là: Astilbin; Taxifolin-3-O-α-L-rhamnopyranoside.
Dạng đồng phân này của astilbin được phân lập từ rễ của cây thổ phục
linh Smilax glabra Roxb. Astilbin được xem là hoạt chất chính trong rễ Thổ
phục linh. Astilbin được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc, nó có tác
dụng trừ sâu, kháng khuẩn và làm lành vết thương. Những nghiên cứu mới
đây đã chỉ ra astilbin có tác dụng chống ung thư [20], tác dụng bảo vệ gan

[26], chống oxy hóa [19] và kháng khuẩn [21].
1.2.2. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh
Trong dịch chiết nước của rễ Thổ phục linh, polysaccharide chiếm hàm
lượng rất lớn đến 32% trọng lượng mẫu khô, điều này giải thích vì sao rễ Thổ
phục linh đã từng được sử dụng thay lương thực khi nạn đói xuất hiện ở
Trung Quốc. Rất nhiều các cấu tử có hoạt tính sinh học trong rễ Thổ phục
linh, chúng quyết định dược học của rễ Thổ phục linh, đã được phân lập.
Trong đó, lớp chất các flavonoid được xem là các cấu tử hoạt tính chính,
ngoài ra là các hợp chất phenylpropanoid glycoside, lignan glycoside, các
polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó bao gồm là các resveratrol,
các axit hữu cơ và một số các hợp chất khác. Tổng cộng có đến khoảng 40
hợp chất đã được phân lập từ rễ Thổ phục linh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 19 of 126.

/>

Header Page 20 of 126.
10

Các flavonoid [29-30]: Lớp hoạt chất chính trong rễ thổ phục linh là các
flavonoid, trong đó 12 flavonoid đã được tách ra thuộc về 5 loại hợp chất là
dihydroflavonol, dihydroflavone, flavonol, isoflavone và flavanol. Trong các
flavonoid được phân lập thì dihydroflavonol có hàm lượng chính bao gồm
khoảng

10

cấu

tử

là

astilbin

(3-O-α-L-rhamnoside-5,7,3',4'-

tetrahydroxydihydroflavonol)(1) hay (taxifolin-3-O-α-L-rhamnoside) và các
dạng đồng phân lập thể của nó là neoastilbin (2), isoastilbin(3),
neoisoastilbin(4),

taxifolin(5),

taxifolin-3‟-O-β-D-glucopyranoside

(6),

engeletin(7), stereoisomeride isoengeletin(8), smitilbin (9) và đồng phân lập
thể của nó là neosmitilbin(10) (Hình 1.3). Những flavonoid khác là các
flavone là quercetin (11), naringenin(12), isoflavone

7,6‟-dihydroxy-3‟-

methoxyisoflavone(13) và flavanol (-)-epicatechin (14) (Hình 1.4).

Hình 1.3. Dihydroflavonol đƣợc tách từ rễ Thổ phục linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Footer Page 20 of 126.

/>

Header Page 21 of 126.
11

Hình 1.4: Một số các flavonoid khác đƣợc tách ra từ RSG
Các hợp chất phenylpropanoid glycoside [9] là lớp chất thứ hai có 7 cấu
tử trong đó các cấu tử mới là smiglaside A-E (15-19) và 20-21 là các cấu tử
đã được mô tả trước đây (Hình 1.5).

Hình 1.5: Các phenylpropanoid glycoside đƣợc tách từ RSG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 21 of 126.

/>

Header Page 22 of 126.
12

Lignan glycoside: lignan glycoside (Hình 1.6) là chất mới (+)syringaresinol 4-O-β-D-glucopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside (hình 6)
đã được tách ra cùng với 12 cấu tử trên bởi Yuan (2003) [31]

Hình 1.6: Lignan glycoside đƣợc tách từ RSG
Các polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó [30]: Lớp chất
này bao gồm 9 cấu tử gồm các resveratrol, ( hình 1.7).

Hình 1.7: Các polyphenol, phenolic acid và glycoside của nó đƣợc tách ra

từ RSG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 22 of 126.

/>

Header Page 23 of 126.
13

Các axit hữu cơ bao gồm các butan diacid, palmitic acid, và 2,2dimethylsuccinic acid.
Các chất sterol gồm các β-sterol và stigmasterol. Cuối cùng là các hợp
chất khác như các fructoside, các hợp chất dị tố, các axit amine, protein, ….
1.3. Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh
Những nghiên cứu dược lý về Thổ phục linh đã bộc lộ dịch chiết methanol
hay dịch chiết nước của nó có nhiều hoạt tính như: chống ung thư; hạ đường
huyết; bảo vệ gan; điều hòa miễn dịch; chống viêm nhiễm, thấp khớp; kháng
vi khuẩn và diệt côn trùng; chống men HIV-1 và tổ hợp HIV-1.
Hoạt tính chống ung thư: Năm 2005, Thabrew và cộng sự [23] cũng
đã nghiên cứu dịch cô của Thổ phục linh ảnh hưởng độc tế bào trên tế bào gan
HepG2 với giá trị ED50 là 41µg/ml và giá trị ức chế 50% của sự tổng hợp
ADN là 29µg/ml. Năm 2008 [20], Sa và cộng sự đã công bố nghiên cứu về
dịch chiết của Thổ phục linh trong đó astilbin và smilagenin đã được xác định
như là cấu tử chính trong dịch chiết này bởi HPLC có hoạt tính chống lại sự
tái tạo tế bào ung thư gan dòng HepG2 và Hep3B.
Hoạt tính hạ đường huyết: Atsushi Kato và cộng sự, năm 1997, đã thí
nghiêm trên chuột KK-Ay, một trong những mẫu động vật bị đái tháo đường
không phụ thuộc insulin, với dịch chiết methanol của Thổ phục linh. Kết quả
cho thấy dịch chiết metanol của Thổ phục linh với liều 100 mg/kg thể trọng
làm giảm lượng đường trong máu ở chuột bình thường 4 giờ sau khi tiêm và

cũng làm giảm đường trong máu của chuột KK-Ay dưới điều kiện tương tự
(P<0.001) [13]. Cũng trong năm 1997, các kết quả nghiên cứu của Haraguchi
và cộng sự chỉ ra các dihydroflavonol (taxifolin) và glycoside của nó
(astilbin) cũng có hiệu quả với việc ngăn chặn sức căng thẩm thấu ngược
trong chứng tăng đường huyết[14].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 23 of 126.

/>

Header Page 24 of 126.
14

Hoạt tính bảo vệ gan: Năm 1997, Closa và cộng sự đã báo cáo hiệu
quả lợi ích của astilbin tới độc tố gan dưới tác dụng của CCl4 và cho thấy
astilbin có tác dụng bảo vệ gan cao hơn vitamin E [11]. Năm 1999, Xu và
cộng sự [27] đã phát hiện astilbin có tác dụng làm giảm đáng kể sự tổn
thương gan do tác dụng của picryl chloride. Các nghiên cứu cho thấy astilbin
cải thiện sự tổn thương gan qua hoạt động bất thường chọn lọc của tế bào
thẩm thấu gan hơn là bảo vệ màng tế bào gan. Astilbin làm giảm đáng kể sự
tổn thương gan do phản ứng quá mẫn tới picryl chloride trên chuột, tác dụng
bảo vệ này là làm rối loạn chức năng xâm nhập gan chứ không phải bảo vệ
màng tế bào gan. Trong năm 1999, những nghiên cứu về hoạt tính miễn dịch
của astilbin, smitilbin eurryphin, ... cũng được công bố [8]. Năm 2004, Wang
và cộng sự đã đánh giá hiệu quả của astilbin trên tế bào gan bị tổn thương
dưới tác dụng của concanavalin A (con A-induced hepatits). Astilbin đã ức
chế đáng kể sự tăng hoạt tính men chuyển amine, làm giảm sự sản suất αTNF, làm giảm sự thâm nhập viêm nhiễm, thoái hóa và hoại tử gan.[25]
Hoạt tính điều hòa miễn dịch: Một loạt các nghiên cứu về hoạt tính
điều hòa miễn dịch của các loại dịch chiết rễ thổ phục linh và astilbin đã được

công bố. Năm 1993 [33], Xu và cộng sự đã công bố dịch chiết nước của thổ
phục linh ức chế đáng kể phản ứng quá mẫn do tiếp xúc với picryl chloride.
Sau đó là các nghiên cứu sâu hơn về sự chuyển hóa, về cơ chế tác dụng hoạt
tính điều hòa miễn dịch của astilbin trên tế bào gan chuột, các kết quả nghiên
cứu cho thấy astilbin có cơ chế tác dụng ức chế miễn dịch khác so với
cyclosposin A và nó có tính chọn lọc cao [12] [28].
Hoạt tính chống viêm nhiễm, thấp khớp: Một trong những mô hình
được sử dụng rộng rãi nhất để nghiên cứu tính chất chống viêm nhiễm và
viêm khớp của các hợp chất là chất hỗ trợ điều trị viêm khớp (AA) áp dụng
trên chuột. Khi tiêm chất bổ trợ vào 1 chân của chuột không chỉ chân tiêm bị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 24 of 126.

/>

Header Page 25 of 126.
15

viêm (Viêm sơ cấp) mà chân còn lại cũng bị viêm (Viêm thứ cấp). Sử dụng
mô hình này Jiang và cộng sự (năm 1997) [15-16] đã đưa ra kết quả dịch chiết
nước của thổ phục linh ức chế đáng kể phù nề trên chân viêm thứ cấp của
chuột. Nó tác dụng một cách trực tiếp và theo cơ chế kháng CIR một cách
chọn lọc khác biệt so với hoạt tính không chọn lọc của các steroid trong điều
trị viêm thấp khớp. Các nghiên cứu xa hơn khả năng kháng viêm của astilbin được
so với cyclosporin A cho thấy astilbin tác dụng yếu hơn nhưng chọn lọc và không
có bất cứ biểu hiện độc tế bào nào. Cơ chế của nó bao gồm một sự áp đảo chọn
lọc lên chức năng lympho bào thông qua sự giảm sinh MMP và NO [6].
Hoạt tính kháng khuẩn và trừ sâu: Năm 2005, những thực nghiệm
của Cintra và cộng sự đã cho thấy astilbin ức chế đáng kể sự phát triển côn

trùng [23]. Năm 2006, Moulari và cộng sự, đã phát hiện astilbin có hoạt tính
kháng khuẩn mạnh với cả vi khuẩn gram âm (Acinetobacter sp., Moraxella
sp) và vi khuẩn gram dương (M. Luteus, S epidermidis) [17].
Hoạt tính kháng

protease HIV-1 và tổ hợp HIV-1: Năm 2006,

Tewtrakul đã công bố kết quả điều tra về hoạt tính kháng protease HIV-1 của
dịch chiết ethanol và dịch chiết nước của Thổ phục linh cho thấy dịch chiết
ethanol thể hiện hoạt tính kháng HIV-1 IN (là hoạt tính chống tổ hợp HIV-1)
với giá trị IC 50 là 6,7µg/ml và của dịch chiết nước là 8,5µg/ml [22].
Hoạt tính chống oxy hóa: Năm 2009, Cheung và cộng sự [32], đã công
bố kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết khác nhau
từ rễ Thổ phục linh và cấu tử chính trong nó là astilbin. Tác giả đã so sánh với
2 hợp chất tổng hợp chống oxy hóa thông thường là butyllated
hydroxyanisole (BHA) và butylated hydroxytoluene (BHT). Các kết quả đã
chỉ ra dịch chiết methanol của rễ Thổ phục linh có hoạt tính chống oxy hóa
đáng kể phụ thuộc vào nồng độ, còn các phân đoạn polysaccharide không thể
hiện bất kỳ một hoạt tính chống oxy hóa nào, astilbin cho hoạt tính chống oxy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 25 of 126.

/>