tài lieu công nghe sinh hoc

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.ĐẶT VẤN ĐỀ:
Nhu cầu trồng chuối từ cây giống
Riêng ở nước ta việc đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa chưa cao do
việc trồng lan chưa được tổ chức một cách khoa học và chưa có đầu tư thích
đáng, yếu tố hạn chế là các giống lan được nhân lên với tốc độ chậm. Vì thế
công tác nhân giống in vitro cây lan lai bằng phương pháp nuôi cấy mô thực
sự cần thiết vì hệ số nhân giống cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt các
cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như các cây bố mẹ đã chọn lọc,
đồng thời sẽ làm giảm tác nhân gây hại cho cây giống và đem lại hiệu quả rất
thiết thực trong việc nâng cao chất lượng giống cây con. Vì thế việc ứng
dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống lan lai là rất cần thiết và
có thể tìm ra được nhiều màu sắc khác lạ trên các loài hoa lai tạo với nhau.
Hoa lan sinh sản một số lượng lớn, vì hạt lan rất nhỏ giống như hạt bụi có thể
có đến cả triệu hạt trong mỗi quả lan. Trước thực trạng trên chúng tôi đã tiến
hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan Dendrobium lai qua
phương pháp thụ phấn” được thực hiện nhằm xác định khả năng sinh trưởng
và phát triển của hạt lan lai qua thụ phấn.
2. Mục tiêu của đề tài:
- Tạo ra giống lan Dendrobium lai có khả năng sinh trưởng phát triển
tốt, cho hoa đẹp và lâu tàn.
- Nhân nhanh cây lan lai để có số lượng lớn cây con phục vụ cho vườn
trồng lan.
3. Giới hạn của đề tài:
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi đã thực hiện được
từng giai đoạn trong phòng thí nghiệm. Riêng phần ngoài vườn chúng tôi đã
chuẩn bị trước thí nghiệm thụ phấn.
1
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Một số đặc tính đại cương về họ lan (Orchidaceae)
2.1.1 Đặc điểm sinh học:

Trong số những cây cho hoa có hơn 16.000 loài và 700-800 giống
thuộc họ Orchidaceae đã được xác định (Begum, 2000), và có rất nhiều loài
được lai giống nhân tạo. Họ lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc
(Asteraceae) và là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm. Riêng ở Việt Nam lan
rừng được biết gồm hơn 750 loài khác nhau.
Khác với các cây trồng cạn, trồng trong môi trường nước (thủy sinh),
các loài phong lan (họ lan Orchidaceae) lại có đời sống kí sinh, bì sinh
(không cần đất) nhờ bộ rễ “ăn nổi” bám vào võ cây rừng nhiệt đới hoặc hút
chất dinh dưỡng từ mùn hữu cơ đang hoai mục (Trần Hợp, 1998).
Nhìn chung, họ Orchidaceae bao gồm các loài cây thân thảo, sống lâu
năm (đôi khi hoá gổ một phần ở gốc). Chúng sống ở đất, nơi hốc, vách đá,
hoặc sống phụ, sống hoại.... (Trần Hợp, 1998). Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer
sắp xếp đa số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm đơn thân (monopodial) như
các giống Vanda, ...và nhóm đa thân (sympodial) như các giống Cattleya,
Dendrobium, Cymbium...(Nguyễn Công Nghiệp, 1998). Ngoài ra cây lan còn
mang một số đặc tính đặc biệt như: hạt vô cùng nhỏ, số lượng nhiều và hầu
hết không có chất nuôi dưỡng; việc nẩy mầm và phát triển phải nhờ vào một
loài nấm mang tính kí sinh hơn là cộng sinh trong tự nhiên; mỗi hoa lan có 3
lá đài, 3 cánh hoa, trong 3 cánh hoa có một cánh ở giữa, phía dưới mang dáng
đặc biệt như một cái lưỡi gọi là môi. Môi hoa lan mịn như nhung, có khi kéo
2
dài ra hay uốn cong lên, cùng với đài và cánh hoa tạo thành nhiều hình thái
đặc biệt (Trần Văn Bảo, 1999).
2.1.2 Sự phân bố
Họ Orchidaceae phân bố từ cực Bắc như Thủy Điển, Alaska xuống tận
các đảo cuối cùng của cực Nam của Ostralia. Tuy nhiên trung tâm phân bố
của họ này ở trên các vĩ độ nhiệt đới , đặc biệt ở Châu Mỹ và Đông Nam Á.
Theo nghiên cứu của Dressler (1981), ở vùng nhiệt đới Châu Á có tới 6800
loài. Riêng ở Việt Nam có trên 800 loài , trong đó có nhiều loài hoàn toàn
mới trong hệ thực vật toàn cầu (Trần Hợp, 1998).

2.2 Đặc điểm sinh học của lan Dendrobium
2.2.1 Sự phân bố
Dendrobium là một giống lan có nhiều loài trong họ Orchidaceae,
giống Dendrobium gồm hơn 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á
nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu. Nếu như các
nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp của mình, thì
các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Dendrobium vô cùng
phong phú. Điều kiên sinh thái cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra
hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thích
nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
 Rễ:
Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp
với nhiều điều kiện sống như:
- Khi sống ở đất thì rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn (Trần hợp, 2000).
- Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên võ thân cây gỗ khác, nên
thân rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm
lại thành các bụi dày. Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ
cây gỗ, hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi một lớp mô hút ẩm dày,
3
bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu
xám bạc. Ngoài ra, nó còn có nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi
bị gió cuốn đi. Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung
của cả cơ thể. (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000).
- Ở loài sống hoại thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hút
chất dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau khi được nấm phân hủy). Nhiều
loài lại có hệ rễ đan thẳng thành một búi chằng chịt, nó là nơi thu gom mùn
của vỏ cây để làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng. (Trần hợp, 2000; Nguyễn
Công Nghiệp, 2000).
 Thân :

Dendrobium thuộc nhóm đa thân (sympodial). Đây là nhóm gồm
những cây tăng trưởng liên tục mà có những chu kỳ nghỉ sau những mùa tăng
trưởng. Dendrobium vừa có thân thật vừa có giả hành. Giả hành tuy là thân
nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho
sự phát triển giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy
dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ
để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả hành có màu xanh
bóng, nên cùng với lá, nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Thường các loài
thuộc giống Dendrobium dùng cho mục đích kinh doanh là lan đa thân với
nhiều giả hành (Trần Hợp)
 Lá:
Phong lan đều là cây tự dưỡng, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống
lá, có rất nhiều kiểu lá khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng và cũng có cả
mọng nước..., có lá dẹt, lá dài và lá hình trụ. Về màu sắc, phiến lá thường có
màu xanh bóng, nhưng đôi khi hai mặt lá có màu sắc khác nhau (thường mặt
dưới lá có màu xanh đậm hay tía), mặt trên lại khảm thêm nhiều màu sặc sỡ.
(Trần Hợp)
 Hoa:
4
Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa cô độc. Các
chồi hoa không những mọc trên các giả hành mới mà có thể mọc trên các giả
hành củ. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm ch1inh giữa hoa, mang phần đực
ở phía trên và phần cái (đầu nhụy) ở mặt trước. Cột này thường dài, thẳng
hay cong về phía trước. Nhị đực gồm hai phần, bao phấn và hốc phấn. Bao
phấn nằm ở cột nhị nhụy. Còn hốc phấn thì lõm lại, mang khối phấn và
thường song song với bao phấn. Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với
nhau, rất cứng do có tinh bột, sáp hay chất sừng. Vì thế giống Dendrobium
khi ra hoa nó cho một số lượng cành hoa nhiều hơn bất kỳ một loài lan nào
khác, Chính vì thế ngày nay nó chiếm ưu thế trên thị trường hoa cắt cành.
Hầu như dòng họ của giống Dendrobium là những loài hoa rất lâu tàn, trung

bình từ 1÷2 tháng. (Trần Hợp, Nguyễn Công Nghiệp, 1998).
 Quả:
Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc. Khi
chín quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở
một số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra
khỏi vỏquả khi vỏ này mục nát.
 Hạt:
Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một máng lưới nhỏ,
xốp chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ bé, trọng lượng toàn bộ hạt
trong một quả nặng chỉ bằng 1 phần mười đến một phần ngàn milligam.
(Trần Hợp)
2.2.3 Giá trị kinh tế, tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan
trong nước và quốc tế.
* Trong nước:
Việt Nam được đánh giá là nước có tiềm năng lớn trong sản xuất
phong lan. Nhưng một thực tế hiện nay là: trong khi nhu cầu hoa lan nội địa
và nhu cầu xuất khẩu đang ở mức cao thì Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ
5
đồng mỗi năm để nhập phong lan từ các nước láng giềng để đáp ứng nhu cầu
nội địa. Trong những tháng đầu năm 2007, mặc dù kim ngạch nhập khẩu lan
cắt cành đã giảm đáng kể so với những tháng trước nhưng vẫn ở mức khá
cao. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải Quan, kim ngạch nhập khẩu
phong lan cắt cành qua đường chính ngạch của nước ta trong tháng 2/2007 là
26,515 nghìn USD, giảm 20,17% so với tháng 1/2007 nhưng vẫn tăng
51,76% so với tháng 12/2006. Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của
Việt Nam trong thời gian qua là Thái Lan với gần 100% lượng lan cắt cành.
Trên thực tế, tình hình sản xuất phong lan hiện nay ở Việt Nam còn
chưa tương xứng với tiềm năng. Qua khảo sát, hiện mới chỉ có một số công
ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt,
Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50-60ha/một doanh

nghiệp. Một vài địa phương khác cũng tiến hành trồng phong lan nhưng mới
dừng ở quy mô gia đình, trên diện tích từ vài m
2
đến vài nghìn m
2
, cá biệt chỉ
có vài hộ trồng trên 1-2ha chứ chưa có vùng quy hoạch trồng lan tập trung
ứng dụng công nghệ hiện đại.
Mặc dù trong thời gian qua, Viện di truyền Nông nghiệp Việt Nam
cũng đã bước đầu thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan
theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan, một số địa phương khác như
Sa Pa, Phú Yên đã tiến hành khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhân
giống, hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan, riêng Trung tâm giống và kỹ
thuật cây trồng của Phú Yên họ đã tạo ra khoảng 300.000-500.000 cây phong
lan giống. Song để phát huy tối đa tiềm năng của ngành phong lan trong
nước, đáp ứng nhu cầu nội địa và hướng ra xuất khẩu ngành công nghiệp hoa
lan của Việt Nam cần phải quan tâm nhiều đến vấn đề về tạo giống, công
nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu
tư mở rộng cơ sở hạ tầng. Đó cũng chính là những vấn đề đặt ra cho ngành
phong lan nước ta được đề cập trong Đề án phát huy tiềm năng xuất khẩu hoa
của Việt Nam trong giai đoạn 2006-2015. (Hồng Nga – TC Nông thôn mới,
6
số 197, tr 19)
Theo các chuyên gia về lan, nghề trồng lan sẽ đem lại một số lợi nhuận
không nhỏ cho người dân, nếu trồng phong lan cắt cành loài Dendrobium và
Mokara, mỗi ha đất trồng có thể có thể cho thu nhập 500-1 tỷ đồng/năm, cao
hơn nhiều lần so với trồng lúa và một số hoa màu khác. Chỉ tính riêng tại
TP.HCM, năm 2003 doanh thu từ kinh doanh hoa lan đạt 200-300 tỷ đồng.
Nhưng chỉ trong qúi 1/2006, con số này đã tăng lên mức 400 tỷ đồng. Ngoài
ra, các cơ sở kinh doanh hoa lan cũng tăng từ 264 cơ sở năm 2003 lên 1.000

cơ sở, với lượng phong lan tiêu thụ trung bình mỗi năm lên tới 1 triệu cây.
Riêng phong lan mỗi năm ở thành phố này cũng đã tiêu thụ trên triệu cây
(nguồn:TTXVN).
Ở Việt Nam lan là họ thực vật đa dạng, phong phú trải dài từ Bắc vào
Nam, từ vùng đồng bằng thấp lên vùng núi cao và khu đảo (Trần Hợp, 2000)
nên lan đã được trồng từ lâu để làm cảnh trong nhà. Nhưng gần đây một số
nhà vườn bước đầu trồng lan dạng cắt cành chủ yếu cung cấp cho thị trường
trong nước nhưng cung vẫn chưa đủ cầu do sản xuất vẫn còn mang tính nông
nghiệp, trong đó nổi cộm là vấn đề giống không đủ chất lượng. Tuy nhiên,
hiện nay bình quân thu nhập lan cắt cành tại thành phố Hồ Chí Minh là 1
tỷ/ha/năm. (www.vnn.vn/kinhte).
Ngày nay, các nhà phong lan học và các nhà vườn trồng lan đang nổ
lực lai chéo các giống lan để tạo ra các giống mới nhằm đáp ứng được nhu
cầu ngày càng đa dạng của thị trường tiêu thụ hoa trong nước và ngoài nước,
mở ra hướng phát triển cho ngành hoa của địa phương.
Giá thành sản phẩm cây lan nuôi cấy mô tương đối thấp và lượng sản
phẩm tạo ra tương đối đồng loạt, độ đồng đều cao. Nếu tính giá thành một
chậu lan cấy mô (tính giai đoạn đang ươm ngoài nhà lưới khoảng 12.000 –
20.000đ/chậu lan, mỗi vò có 01 cây giống và chiều cao cây khoảng 10-
20cm). Trong đó giá thành sản xuất 01 cây lan con giai đoạn trong phòng thí
7
nghiệm có chiều cao trung bình 6 - 8cm, cây có 03 lá trở lên thì giá thành
khoảng 1.500đ/cây, còn một số nôi cung ứng và nhân giống gia công khoảng
2.000đ/cây. Qua chiết tính trên cho thấy công nghệ sản xuất và nhan giống
lan nuôi cấy mô là rất cần thiết, và có thể áp dụng phương pháp này nhằm tạo
ra nhiều giống lan mới, giá thành rẽ để đáp ứng như cầu trong tỉnh nói riêng,
cả trong nước và quốc tế nói chung.
Việt Nam là nước nằm gọn trong vành đai nhiệt đới Bắc bán cầu, chiều
dài theo hướng Bắc-Nam là 1.650km cho nên tạo được sự đa dạng về các
vùng khí hậu, từ đó dẫn đến đa dạng các loài hoa lan. Phát triển Nuôi trồng

và kinh doanh, xuất khẩu hoa lan bênh cạnh hiệu quả kinh tế còn mang lại
hiệu quả xã hội hết sức to lớn:
- Thu hút được một lực lượng lao động lớn từ những người về hưu đến
những người không có công ăn việc làm.
- Làm tăng lượng cây xanh đô thị và xung quanh vùng ven đô thị góp
phần cải thiện môi sinh.
- Nâng cao mức sống văn hóa tinh thần của người nuôi trồng và nhười
dân đô thị thưởng thức cái đẹp của hoa lan, của tự nhiên.
- Làm cho bộ mặt thành phố cũng như bộ mặt của đất nước ngày càng
đẹp và văn minh hơn.
* Thế giới:
Nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng ngày càng tăng, tỷ
lệ hàng năm của ngành sản xuất hoa thế giới 10% đạt khoảng 49 tỷ USD.
Một số nước như Thái Lan, singapo, Hawaii xem lan là một trong những mặt
hàng đem lại nguồn kim ngạch xuất khẩu lớn (Lê Phạm Trung, 1999; Nguyễn
Công Nghiệp, 2000). Trong đó Dendrobium được chọn làm giống chủ đạo
trong ngành sản xuất lan cắt cành do nó có những ưu điểm sau:
- Siêng bông, cho nhiều cành hoa, số lượng hoa trên một cành nhều
(tối thiểu 10 hoa/cành).
8
- Số lượng loài rất lớn nên chủng loại sản phẩm đa dạng, dễ thay đổi
theo thị hiếu của thị trường nên dạng hoa cắt cành này rất được ưa chuộng
trên thị trường Châu Á (Nguyễn Công Nghiệp, 2000).
Ngoài ra, Dendrobium còn được dùng vào các mục đích khác như:
- Thân cây dùng để làm rỗ ở Philippines, Indonesia và New Guinea giả
hành của Dendrobium tokai đã được sử dụng như thuốc tránh thai (Bose and
Bhattacharjee, 1999).
- Một bộ tộc ở Indonesia dùng lá Dendrobium sallacense nấu với cơm
như người Việt Nam ở Đồng bằng sông Cửu Long dùng lá dứa. Lá, giả hành
còn được dùng làm trà hay lấy sợi trong thân làm thành kiềng đeo tay... (Trần

Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2002).
Ở châu Á, năm 1987 Hồng Kông đứng đầu về xuất khẩu mặt hàng này,
nhưng thực tế Hồng Kông lại nhập hoa của các nước khác chuyên xuất nhiều
hơn là tự sản xuất để xuất khẩu. Thái lan và Nhật về kim ngạch xuất khẩu
tính đến năm 1987 đứng vào hàng thứ 8 của Châu Á. Nhưng hai nước này
đang phát triển mạnh sản xuất hoa, lan, cây cảnh. Tại Nhật, năm 1990 thu
nhập mặt hàng này gần 9 tỷ USD, dự kiến năm 1995 sẽ đạt 15 tỹ USD. Thái
Lan là nơi nổi tiếng sản xuất hoa lan, năm 1987 kimh ngạch xuất khẩu là
108,9 triệu USD, riêng hoa lan là 21 triệu USD, năm 1990 lên 26 triệu USD,
(Phan Thúc Huân).
Riêng Thái Lan đã xuất khẩu lên đến 610 loại hoa lan khác nhau
trong từng năm một. Nhiều giống hoa lan được nhân giống từ lan rừng cho
thấy Thái Lan là một trung tâm phân phối và sưu tập hoa lan của vùng Đông
Nam Á. Sự phát triển công nghệ sinh học nông nghiệp đạt được nhiều kết quả
trong sản xuất nông nghiệp đã đưa Thái Lan trở thành quốc gia hàng đầu thế
giới sản xuất về hoa đặc biệt là hoa lan. Thái Lan là quốc gia xuất khẩu đứng
thứ tư trên thế giới về hoa cắt cành trong năm 1993-1994.
Đối với các nước đang phát triển, kim ngạch xuất khẩu và kim ngạch
nhập khẩu hoa, lan, cây cảnh chỉ chiếm khoảng 25-30% tổng kim ngạch xuất
9
nhập khẩu của toàn thế giới. Tuy nhiên, một số nước đang phát triển đã có cơ
sở sản xuất và đã có bạn hàng tiêu thụ vững vàng như Thái land, Singapore,
Colombia, Kenya, Nam Phi. Inđônêxia, Côsta Rica. Đặc biệt Colombia trong
những năm gần đây đã phát triển ngành hoa lan, cây cảnh xuất khẩu một cách
nhảy vọt và đã đứng hàng thứ hai trên thế giới, chỉ sau Hà Lan.
Xếp
hạng
1992 1993 1994
Nước Triệu
USD

Nước Triệu
USD
Nước Triệu
USD
1
2
3
4
5
6
7
Hà Lan
Colombia
Israel
Ý
Thailand
Kenya
Khác
2,153.56
395.64
146.12
111.28
67.58
61.58
388.17
Hà Lan
Colombia
Israel
Thailand
Kenya

Ý
Khác
1,456.24
415.61
115.26
65.37
60.57
48.39
318.94
Hà Lan
Colombia
Israel
Thailand
Kenya
Ecuador
Khác
1,586.40
431.71
134.15
68.20
67.57
52.88
400.95
Tổng 3,323.82 Tổng 2,480.37 Tổng 2,741.86
(Nguồn: International Floriculture Trade Statistics 1995)
Năm 1994 khối lượng hoa cắt cành của Thái Lan xuất khẩu đến Nhật
Bản, Ý, Mỹ, Đức, Đài Loan và Hà Lan là 11.897 tấn. Bên cạnh hoa lan, Thái
Lan cũng xuất khẩu các loài hoa cắt cành khác.
2.3 Phương pháp vi nhân giống
2.3.1 Mục đích vi nhân giống

Nuôi cấy tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế
bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ: việc nuôi cấy được
duy trì dưới các điều kiện kiểm soát. Vi nhân giống là phương pháp nhân
nhanh với số lượng lớn và giảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
2.3.2. Các giai đoạn vi nhân giống
Vi nhân giống đã được chia thành 5 giai đoạn khác nhau (Debergh,
1991), mỗi giai đoạn có một chức năng riêng :
- Giai đoạn 0 : Chuẩn bị cây mẹ.
10
- Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy.
- Giai đoạn 2 : Nhân nhanh.
- Giai đoạn 3 : Sự ra rễ in vitro.
- Giai đoạn 4 : Sự thuần dưỡng.
Trong giai đoạn nhân nhanh, những mẫu cấy sẽ được cấy trên môi
trường thích hợp cho sự nhân chồi. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh
số lượng cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất
định, chồi bên và chồi ngọn sẽ được cảm ứng phát triển in vitro bằng cách
làm tăng sự phát triển của những chồi đang hiện hữu. Một mẫu cấy có một
chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay thành cụm chồi tùy thuộc vào loài
thực vật mà môi trường nuôi cấy. sau vài lần cấy truyền các chồi được tạo ra
và chuyển sang giai đoạn ra rễ (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên,
2002).
Do các chồi hoặc cây con thu được từ giai đoạn 2 còn nhỏ và chưa có
khả năng tự phát triển trên đất hoặc phân trộn nên chúng được chuyển sang
môi trường cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh. Giai đoạn 3 được
chia thành hai giai đoạn là giai đoạn kéo dài và giai đoạn kích thích tạo rễ và
tiền thuần dưỡng. Giai đoạn kéo dài nhằm cung cấp các chồi có kích thước
thích hợp cho giai đoạn tạo rễ, còn giai đoạn kích thích tạo rễ nhằm tạo rễ
cho các chồi in vitro thu được ở giai đoạn kéo dài (George, 1993).
2.3.3 Những thuận lợi của phương pháp vi nhân giống.

- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo
- Nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh.
- Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp
(nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con
quanh năm.
- Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro làm cây mẹ cho các bước
nhân giống tiếp theo.
11
2.4. Kỹ thuật nhân giống phong lan
Để tạo cây giống lan lai phục vụ cho công tác nuôi trồng có thể nhân
giống bằng hai cách: nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính.
2.4.1 Nhân giống hữu tính
Trong nhiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc
của hoa lan hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa
lưỡng tính, cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa
không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính cách bắt buộc. Sự thụ phấn
của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của
mùi thơm và ánh sáng hấp dẫn và những cấu tạo của hoa là những dấu hiệu
chỉ dẫn cho côn trùng trong quá trình thực hiện.
Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo
ra các giống lan lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thực hiện. Sự thụ
phấn của lan có thể cùng cây, có thể khác cây. Đối với lan ở các vườn nuôi
trồng, việc thụ phấn do con người thực hiện đuợc tiến hành như sau:
Dùng kim hay một cái kẹp nhỏ để làm dụng cụ thụ phấn.
Lấy và loại bỏ hai khối phấn bọc nhụy của cây lan được chọn làm cây
mẹ (cây cho phấn là cây cha, cây được thụ phấn là cây mẹ).
Lấy hai khối phấn của hoa cây được chọn làm cây cha, khối phấn hoa
lan thường có cấu tạo gót dính hay sáp cho nên khi thụ phấn cần dùng một
cái kim hay một cái kẹp nhỏ làm dụng cụ để lấy khối phấn ra khỏi hoa cây
cha cho dễ.

Đỉnh khối phấn lấy được ở hoa cây cha đặt vào phần lõm có chất keo
dính được gọi là đàn nhụy của hoa cây mẹ, khối phấn sẽ dính ngay vào đàn
nhụy của cây mẹ và sự thụ phấn được thực hiện. Sau khi thụ phấn toàn bộ
bầu của hoa cây mẹ phát triển hình thành nên quả của lan và tạo nên hạt lan
và hình thành những cây lan lai sau này.
12
Để có những cây hoa lai tạo đạt được các yêu cầu về mặt thẩm mỹ cần
quan tâm đến những chủng loài để khai thác làm nguồn gen ban đầu nhằm lai
tạo được các giống mới. Song song với những định hướng lai tạo giống mới,
cần tiếp tục nghiên cứu thêm lĩnh vực nhân giống vô tính để gia tăng số
lượng cây đạt các yêu cầu mong muốn. (Phan Thúc Huân)
2.4.2 Nhân giống vô tính
 Phương pháp tách chiết thông thường
 Phương pháp tách cây con
Khi rễ cây con được 6-10cm có thể tách để trồng riêng. Đây là cách
nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.
 Phương pháp giâm cây
Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt
các đoạn này vào một nơi nóng ẩm, chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất
hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới.
Các phương pháp nhân giống cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh
nghiệm của nông dân, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có
một số trở ngại như : chậm (tăng khoảng 2-4cây/năm); chất lượng giống
không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan
truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh,
1998).
 Phương pháp nuôi cấy mô
Phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất hiện nay có thể
nhân giống lan trên qui mô công nghiệp. So với phương pháp tách chiết
thông thường tốc độ phát triển 1 cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ

sản xuất một số lượng cây con gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm
(Nguyễn Công Nghiệp, 1998)
Bảng 2.1. Một số kết quả đạt được trong nhân giống một số loài
Dendrobium bằng phương pháp nuôi cấy mô (theo George, 1993)
13
Tên loài Mẫu cấy Kết quả Tác giả
Dendrobium
bigibbum Lindl
Các đoạn thân Tái sinh các chồi
bên
Kukylezanka and
Wojciechowska
(1983)
Dendrobium
laciniosum
Đỉnh sinh trưởng
của chồi ngọn và
chồi bên
Tạo sự khởi đầu
và nhân nhanh
tiền củ
(protocorm)
Lim-Ho (1982)
Dendrobium
superbiens
var.superba
Đỉnh sinh trưởng
chồi ngọn
Tạo protocorm và
nhân nhanh

protocorm
Lim-Ho (1982)
Dendrobium spp Đỉnh tược (shoot
tip)
Tạo protocorm và
tăng sinh nhanh
protocorm
Morel (1974)
Dendrobium spp Các ngọn chồi Tạo protocorm và
tăng sinh nhanh
protocorm
Morel (1965)
Dendrobium spp Ngọn chồi và
chồi bên
Tạo protocorm và
tái sinh cây con
Sagawa and
Kunisaki (1982)
Dendrobium Miss
Hawaii
Các mắt của cọng
hoa
Tái sinh chồi từ
mắt
Nuraini and
Mohd.Shaib
(1992)
Dendrobium spp. Các mắt thân của
cây trưởng thành
Cho sự kéo dài

chồi bên
Ball and Arditti
(1976)
2.5 Các yếu tố của môi trường cấy ảnh hưởng đến các giai đoạn
trong nuôi cấy in vitro.
Trong nuôi cấy in vitro sự tăng trưởng của cây phần lớn được xác định
bởi các thành phần của môi trường cấy. Thành phần chính của hầu hết môi
trường nuôi cấy mô là các thành phần khoáng, đường được xem là nguồn
cung cấp carbon và nước. Những thành phần khác có thể được bổ sung bao
gồm các chất hữu cơ, các chất điều hoà sinh trưởng, chất làm đặc môi trường.
14
Mặc dù các thành phần khác nhau trong môi trường thay đổi theo các giai
đoạn cấy và loài cây, môi trường MS (Murashige and Skoog) hầu hết được sử
dụng phổ biến nhất.
2.5.1. Khoáng đa vi lượng
Các khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô đều ở dạng các muối
vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các hổn hợp muối vô cơ.
Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong trao
đổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh của tế bào (Moxolov,
1987), do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Đạm được sử dụng trong nuôi cấy mô thường ở dạng ammonium (NH
4
+
) và
nitrate (NO
3
-
).
Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein,
acid nucleic và tham gia vào cấu trúc của màng. Lân thường được sử dụng ở

hai dạng ion là H
2
PO
4
-
và H
2
PO
4
2-
.
Nồng độ khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường
giảm xuống còn một nữa so với bình thường (tuỳ theo loài cây). Nguyên
nhân có lẽ là do nhu cầu về đạm trong giai đoạn này giảm xuống (Nguyễn
Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.5.2 Vitamin
Thực vật cần vitamine để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau,
các vitamine thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là:
Thiamine HCl (vitamine B1); Pyridoxine HCl (vitamine B6); Acid nicotinic ;
Myo-inositol (Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.5.3 Nguồn sắt
Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết
hợp với Na
2
– Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA). Ở dạng này sắt không
bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật.
15
(Trần Văn Minh - Viện Sinh học Nhiệt Đới)
2.5.4 Nguồn Carbon
Các nguồn carbon (sucrose; glucose hoặc fructose) là một thành phần

quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho
rằng sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự
phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao của cây con. Nồng độ
sucrose (20g/l và 30g/l) thường được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực
nuôi cấy mô lan. Sucrose thông thường được thêm vào môi trường để đẩy
mạnh sự tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. Theo
(Debergh,1991), sự vắng mặt của đường làm giảm những vấn đề về nhiễm
môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng một cách tự dưỡng trong
điều kiện in vitro khi nồng độ CO
2
và mật độ ánh sáng tăng lên.
2.5.6 Các chất hữu cơ
Nước dừa (CW-coconut water) được dùng thông dụng trong nuôi cấy
mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid,
chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế
bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa
thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vật
được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng
kích thích sự phát triển cây như chà là, chuối, mầm lúa mì... nhưng thông
thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng
nguồn gốc. (Trần Văn Minh - Viện Sinh học Nhiệt Đới)
2.5.7 Than hoạt tính
Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác
dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0.3% than
hoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả
chồi. Ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm
tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. (Nguyễn Đức Lương và
16