Nghiên cứu tính đối kháng của aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
LÊ THIÊN MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------

LÊ THIÊN MINH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2014
HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THIÊN MINH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THIÊN MINH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS
KHÔNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHÒNG CHỐNG AFLATOXIN
TRÊN NGÔ VÀ LẠC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU
2. PGS. TS. NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

Hà Nội - 2015

i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa
Hà Nội, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ tạo điều
kiện cho tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận án của mình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thuỳ Châu - Nguyên
trưởng Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông
nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm – Trưởng bộ
môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học & CNTP, trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian tôi
thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Đinh Duy Kháng - Trưởng phòng
Vi sinh vật học phân tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và ủng hộ tôi trong quá trình thực
hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phụ trách đào tạo, Viện đào tạo sau đại
học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh.
Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị và
các bạn đồng nghiệp ở Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ Sinh học sau thu hoạch - Viện
Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Phòng Vi sinh vật phân tử - Viện
Công nghệ sinh học và Bộ môn Vi sinh, Hóa sinh, Sinh học phân tử - Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ
quý báu đó.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự động viên, khích lệ
của bạn bè trong và ngoài Viện đã dành cho tôi.
Hà Nội, ngày 27 tháng 01 năm 2015

Lê Thiên Minh


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng
tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực
và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Hà nội, ngày 27 tháng 01 năm 2015
Tập thể giáo viên hướng dẫn

Tác giả

Lê Thiên Minh


iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. flavus
A. parasiticus
ADN
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
AOAC

ARN
AVF
AVN
AVNN
DHDMST
DHOMST
DHST
DMST
dNTP
EDTA
EtBr
FAO
FDA
HAVN
HPLC
NOR
OAVN
OMST
PCR
PDA
SDS
SDS-PAGE
ST
TCA
TE
TLC
Tm
v/p
v/v
VAL

VERA
VERB
VHA
vvm
w/v
WHO
X

Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus
Axit deoxyribonucleic
Aflatoxin B1
Aflatoxin B2
Aflatoxin G1
Aflatoxin G2
Association of analytical communities
Axit ribonucleic
Averufin
Averantin
Averufanin
Dihydro demethylsterigmatocystin
Dihydro-O-methylsterigmatocystin
Dihydro sterigmatocystin
Demethylsterigmatocystin
Deoxiribonucleotit triphosphat
Axit etylen diamin tetra axetic
Ethydium bromit
The Food and Agriculture Organization of the United Nations
Cục quản lý Thực ph m và Dược ph m Hoa kỳ
5’ hydroxyaverantin

high performance liquid chromatography
Norsolorinic acid
Oxoaverantin
O-methylsterigmatocystin
Polymerase chain reaction
Potato Dextro Agar
Sodium dodecyl sulfate
Điện di trên gel polyacrylamit có chứa sodium dodecyl sulfate
Sterigmatocystin
Axit trichloroaxetic
Tris EDTA
Thin layer chromatography sắc ký lớp mỏng
Nhiệt độ tan chảy
vòng / phút
Thể tích/thể tích
Versiconal
Versicolorin A
Versicolorin B
Versiconal hemiacetal acetate
thể tích/thể tích/phút
Trọng lượng /thể tích
Tổ chức Y tế thế giới
Axit amin bất kỳ


iv

Danh môc c¸c b¶ng
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin

8

2

Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản thực phẩm

12

3

Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò

12

4

Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

13

5

Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus

14

6

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp mẫu A. flavus DA2

40

7

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng A. flavus từ ngô, lạc ở một số tỉnh Việt

44

Nam
8

Bảng 3.2 Khả năng tạo aflatoxin của các chủng A. flavus phân lập từ ngô và

45

lạc
9

Bảng 3.3a Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu ngô
và lạc

47

10

Bảng 3.3b Đặc điểm hình thái của các chủng A. flavus phân lập từ các mẫu
ngô và lạc

48

11

Bảng 3.4a Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các

49

mẫu ngô và lạc
12

Bảng 3.4b Đặc điểm cấu trúc vi học của các chủng A. flavus phân lập từ các

50

mẫu ngô và lạc
13

Bảng 3.5 Khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus phân lập

52

14

Bảng 3.6 Hiệu quả giảm aflatoxin B1 của chủng A. flavus AF14 nuôi cấy trên

54

môi trường ngô bằng các chủng A. flavus không sinh aflatoxin
15

Bảng 3.7 Mật độ tế bào A. flavus DA2 và A. flavus AF14 khi nuôi hỗn hợp theo

55

tỉ lệ 1:1
16

Bảng 3.8 Trình tự các cặp mồi

58

17

Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả PCR với các mồi đã sử dụng

60

18

Bảng 3.10 nh hưởng của A. flavus DA2 đến trọng lượng c thể chuột

63

19

Bảng 3.11 Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 tạo được trên các môi

66

trường khác nhau


v
20

Bảng 3.12 Khả năng tạo bào tử chủng A. flavus DA2 của nhiệt độ nuôi cấy

67

khác nhau
21

Bảng 3.13

nh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng tạo bào tử của

68

chủng A. flavus DA2
22

Bảng 3.14 Thời điểm thu bào tử của chủng A. flavus DA2

69

23

Bảng 3.15 nh hưởng của t lệ tiếp giống tới mật độ bào tử A. flavus DA2

70

24

Bảng 3.16 nh hưởng của độ dày khối ủ tới mật độ bào tử chủng A. flavus

71

DA2
25

Bảng 3.17 Mật độ bào tử A. flavus DA2 trong các chất mang ở các thời gian

72

bảo quản khác nhau
26

Bảng 3.18 Khả năng cạnh của chế phẩm A.flavus DA2 ở các t lệ khác nhau

76

bằng sắc ký TLC
27

Bảng 3.19 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 khi bón vào đất ở các

77

t lệ khác nhau
28

Bảng 3.20. nh hưởng của các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sự phát triển

80

sinh khối của A.flavus DA2
29

Bảng 3.21 Mức độ nhiễm nấm mốc A.flavus trên đất trồng ngô, lạc tại một số

82

tỉnh Việt Nam
30

Bảng 3.22 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin

84

trong đất trồng ngô sử dụng chế phẩm AF
31

Bảng 3.23 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên

86

ngô bắp ở giai đoạn trước thu hoạch
32

Bảng 3.24 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và aflatoxin của chế phẩm AF trên

89

ngô sau thời gian bảo quản 6 tháng
33

Bảng 3.25 Khả năng cạnh tranh của chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin

91

trong đất trồng lạc được bón chế phẩm AF
34

Bảng 3.26 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên

92

lạc củ ở giai đoạn trước thu hoạch
35

Bảng 3.27 Hiệu quả giảm nấm mốc và aflatoxin của chủng A.flavus DA2 trên
lạc sau thời gian bảo quản 6 tháng

93


vi

Danh môc c¸c h×nh
STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin

6

2

Hình 1.2 Aflatoxin tư ng tác đồng hóa trị với vật chất di truyền

9

3

Hình 1.3 Khuẩn lạc A.flavus

15

4

Hình 1.4 Hệ sợi A.flavus quan sát dưới kính hiển vi

15

5

Hình 1.5 C chế sinh tổng hợp aflatoxin

17

6

Hình 1.6 Hàm lượng aflatoxin trên hạt bông giảm khi t lệ AF36 tăng

29

7

Hình 3.1 Sắc ký đồ phân tích aflatoxin tạo bởi chủng A. flavus AF14

52

8

Hình 3.2 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin B1 của chủng A. flavus

53

DA2
9

Hình 3.3 Kiểm tra hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A.flavus

54

nuôi cấy trên c chất ngô bằng sắc ký bản mỏng (TLC)
10

Hình 3.4 Chủng A. flavus DA2 cạnh tranh và lấn át chủng A. flavus AF14

56

trên đĩa thạch
11

Hình 3.5 Chất lượng ADN tổng số trên gen agarose 1,5%

59

12

Hình 3.6 Sản phẩm multiplex PCR của chủng A.flavus DA2 và A. flavus

59

AF14
13

Hình 3.7 Khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15

61

thế hệ
14

Hình 3.8 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A.flavus

61

DA2 sau 5, 10 và 15 thế hệ
15

Hình 3.9 Đường cong sinh trưởng của chủng A.flavus DA2

65

16

Hình 3.10 Khả năng cạnh tranh của A.flavus DA2 ở các t lệ khác nhau

75

17

Hình 3.11 Khả năng đối kháng của chế phẩm A.flavus DA2 ở các thời điểm

78

cấy khác nhau
18

Hình 3.12 Khả năng đối kháng của chủng A.flavus DA2 khi có mặt của
thuốc bảo vệ thực vật

81


vii
19

Hình 3.13 Nấm mốc nhiễm trên đất trồng ngô

83

20

Hình 3.14 Khuẩn lạc chủng A.flavus phát quang phân lập từ đất trồng ngô

85

được bón chế phẩm AF tại xã Tam Hồng, Yên Lạc, Vĩnh Phúc (8/20076/2008)
21

Hình 3.15 Khả năng kiểm soát aflatoxin trên ngô trước thu hoạch của chế

87

phẩm AF

22

Hình 3.16 Bắp ngô ở ruộng sử dụng hai lần chế phẩm AF

88

23

Hình 3.17 Bắp ngô ở ruộng không sử dụng chế phẩm AF

88

24

Hình 3.18 Ngô sử dụng và không sử dụng chế phẩm AF sau thời gian bảo

90

quản 6 tháng
25

Hình 3.19 Chủng A. flavus phát quang và không phát quang phân lập trên

92

đất trồng lạc
26

Hình 3.20 Lạc sử dụng và không sử dụng chế phẩm AF sau thời gian bảo
quản 6 tháng

94


MỤC LỤC
Trang
L IC M

N

L IC M

O N.

.
.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT..
D NH MỤC CÁC B NG.
D NH MỤC CÁC HÌNH NH,
M

..

i
ii
...iii
..iv

Ồ THỊ

.. ..vi

ẦU

. ...4

CHƯ NG I. TỔNG QU N TÀI LIỆU ................................................................................ 6
1.1 TỔNG QU N VỀ FL TOXIN ................................................................................... 6
1.1.1 Cấu tạo ................................................................................................................... 6
1.1.2 Tính chất hóa lý...................................................................................................... 7
1.1.3 ộc tính của aflatoxin ............................................................................................ 8
1.1.4 Thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ............................................................. 9
1.1.5 Giới hạn aflatoxin cho phép trong nông sản thực phẩm ...................................11
1.2 ASPERGILLUS FLAVUS ..........................................................................................13
1.2.1 ặc điểm hình thái ................................................................................................13
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của A. flavus .................................15
1.2.3 iều kiện sinh aflatoxin ........................................................................................16
1.3 PHÕNG CHỐNG SỰ NHIỄM FL TOXIN ................................................................19
1.3.1 Biện pháp canh tác nông nghiệp .........................................................................19
1.3.2 Biện pháp sau thu hoạch......................................................................................20
1.3.3 Biện pháp sinh học ...............................................................................................21
1.4 PHÕNG CHỐNG
FL TOXIN BẰNG CHỦNG A.FLAVUS KHÔNG SINH
AFLATOXIN ....................................................................................................................22
1.4.1 Cơ chế kiểm soát nấm mốc và aflatoxin bằng các chủng A.flavus không sinh
aflatoxin ..........................................................................................................................22
1.4.2 Tuyển chọn các chủng A. flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân đối kháng
........................................................................................................................................24
1.5 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM NẤM A. FLAVUS KHÔNG SINH ỘC TỐ

TRONG PHÕNG CHỐNG FL TOXIN ..........................................................................26
1


1.5.1 Sản xuất chế phẩm A. flavus không sinh aflatoxin ............................................26
1.5.2 ánh giá hiệu quả của chế phẩm A. flavus không sinh aflatoxin ở quy mô
phòng thí nghiệm và nhà kính ......................................................................................27
1.5.2 ánh giá hiệu quả của chế phẩm A. flavus không sinh aflatoxin ở quy mô
đồng ruộng .....................................................................................................................28
1.5.3 ánh giá tác động của chế phẩm ........................................................................30
1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chế phẩm ..................................................31
CHƯ NG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................33
2.1 VẬT LIỆU, HÓ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.................................................33
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................33
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ nghiên cứu .............................................................................33
2.1.4 Môi trường nghiên cứu ........................................................................................34
2.2 PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................34
2.2.1 Phương pháp lấy mẫu ..........................................................................................34
2.2.2 Phương pháp phân lập .........................................................................................35
2.2.3 Sàng lọc sơ bộ các chủng sinh và không sinh aflatoxin bằng phương pháp
phát quang .....................................................................................................................36
2.2.4 Phân tích aflatoxin bằng sắc k bản m ng .........................................................36
2.2.5 Phân tích aflatoxin bằng sắc k l ng cao áp ......................................................36
2.2.6 Nuôi cấy nấm mốc A. flavus cho việc nghiên cứu khả năng tạo aflatoxin .......36
2.2.6 Xác định khả năng cạnh tranh của các chủng A. flavus không sinh aflatoxin
đối với chủng A. flavus sinh aflatoxin..........................................................................37
2.2.7 Nghiên cứu khả năng tạo bào tử của chủng A. flavus D 2 ở các điều kiện nuôi
cấy khác nhau ................................................................................................................37
2.2.8 Quy trình nuôi cấy nấm mốc A. flavus D 2 ở qui mô phòng thí nghiệm ..........38
2.2.9 Tạo chế phẩm chứa bào tử chủng A. flavus D 2 (chế phẩm F) .....................38

2.2.10 ịnh lượng mật độ bào tử A. flavus trong chế phẩm .......................................38
2.2.11 Xác định sự có mặt của một số gen trong cụm gen mã hóa cho các enzym
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin của các chủng A. flavus bằng kỹ
thuật multiplex PCR .......................................................................................................38
2.2.12 Thử nghiệm tính an toàn của chủng A.flavus DA2 ...........................................40
2.2.13 Xác định tỉ lệ giữa chủng sinh aflatoxin với chủng A.flavus DA2 không sinh
aflatoxin ..........................................................................................................................41

2


2.2.14 Xác định thời điểm sử dụng chế phẩm .............................................................41
2.2.15 ánh giá ảnh hưởng của một số loại thuốc bảo vệ thực vật...........................41
2.2.16 ánh giá sự cạnh tranh của A.flavus DA2 trong đất trồng ngô, lạc ................41
2.2.17 ánh giá hiệu quả giảm mật độ A.flavus sinh độc tố và aflatoxin của chế
phẩm F trên ngô ở giai đoạn trước và sau thu hoạch ..............................................42
2.2.18 ánh giá hiệu quả giảm mật độ A.flavus sinh độc tố và aflatoxin của chế
phẩm F trên lạc ở giai đoạn trước và sau thu hoạch ...............................................43
2.2.19 Phương pháp xử l thống kê số liệu: theo phần mềm Microsoft Excel .............43
CHƯ NG III. KẾT QU VÀ TH O LUẬN .......................................................................44
3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG A. FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM
CHỦNG S N XUẤT CHẾ PHẨM F ...............................................................................44
3.1.1 Phân lập các chủng Aspergillus flavus trên ngô, lạc .........................................44
3.1.2 Sàng lọc các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin ............................45
3.1.3 Phân loại các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin phân lập được .46
3.1.4 Tuyển chọn các chủng A. flavus không sinh aflatoxin ......................................51
3.1.5 ánh giá khả năng cạnh tranh của các chủng A. flavus không sinh aflatoxin .53
3.1.6 Kiểm tra sự có mặt một số gen trong cụm gen mã hóa cho các enzym tham
gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin của chủng A. flavus DA2 ..........................57
3.1.7 Tính ổn định về khả năng không sinh aflatoxin của chủng A. flavus DA2 .......61

3.1.8 ánh giá tính an toàn của chủng A. flavus D 2 trên động vật thí nghiệm .......62
3.2 NGHIÊN CỨU S N XUẤT CHẾ PHẨM A. FLAVUS DA2 .........................................65
3.2.1 Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy bề mặt sản xuất bào tử chủng A. flavus DA2
quy mô phòng thí nghiệm .............................................................................................65
3.2.2 Nghiên cứu sản xuất bào tử chủng A.flavus D 2 ở quy mô pilot .....................70
3.2.3 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm F từ chủng A.flavus DA2 ...........................72
3.3 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM

F ..............................................................75

3.3.1 Nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................................75
3.3.2 Nghiên cứu ở quy mô đồng ruộng ......................................................................82
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................................95
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................................95
TÀI LIỆU TH M KH O ...................................................................................................96

3


MỞ ĐẦU
Aflatoxin là những chất chuyển hóa có độc tính cao, được sinh tổng hợp chủ yếu bới
các loài nấm mốc Aspergillus. Các độc tố này tồn tại trong nông sản thực phẩm, không
những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm mà còn là một trong những nguyên nhân
gây nên những căn bệnh nguy hiểm cho người và động vật như viêm gan cấp tính, ung thư
gan, suy dinh dưỡng ở trẻ em.
Việc kiểm soát hàm lượng aflatoxin có mặt trong nông sản thực phẩm đã được
nghiên cứu từ rất lâu với nhiều biện pháp khác nhau, mỗi biện pháp đều có những ưu
nhược điểm nhất định nhưng chưa có biện pháp nào đạt được hiệu quả như mong đợi. Một
số biện pháp truyền thống như xử lý sau thu hoạch, chọn tạo giống cây trồng kháng nấm
sinh aflatoxin… chỉ cho phép phát hiện nấm mốc ở giai đoạn muộn, khi nấm mốc đã phát

triển sinh độc tố và tồn tại trong các sản phẩm thực phẩm. Những năm gần đây, xu hướng
sử dụng chính những chủng nấm đối kháng Aspergillus flavus không sinh độc tố có tính
cạnh tranh cao làm tác nhân kiểm soát đang được phát triển và tỏ ra khá hiệu quả. Chế
phẩm nấm Aspergillus flavus đối kháng đã được nghiên cứu, ứng dụng và cấp bằng sáng
chế, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở một số quốc gia như Mỹ, Ấn Độ, Trung
Quốc... Ví dụ: chủng NRRL 21882 và AF36 do các nhà khoa học thuộc bộ Nông nghiệp
Mỹ tạo ra đã có tác dụng giảm trên 90% hàm lượng aflatoxin trên ngô và bông.
Để thu nhận được các chủng A. flavus đối kháng không sinh độc tố, bên cạnh những
biện pháp phân lập truyền thống dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, còn có một
phương pháp mới dựa trên kỹ thuật PCR đã được phát triển để hỗ trợ cho công việc sàng
lọc này. Hầu hết các gen trong cụm gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin của
nấm mốc đã được sáng tỏ và trình tự ADN của chúng cũng đã được xác định là cơ sở khoa
học rất thuận lợi cho việc áp dụng phương pháp này trong sàng lọc các chủng mục tiêu.
Việt Nam nằm trong miền khí hậu nhiệt đới nóng, ẩm là điều kiện rất thuận lợi cho
các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm vào cây trồng ngay từ giai đoạn canh tác, trong
suốt quá trình bảo quản và chế biến nếu không có biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt. Cho
đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về ứng dụng các chủng nấm mốc
A. flavus không sinh độc tố để phòng chống nấm mốc và độc tố aflatoxin trên ngô, lạc. Mặt
khác, khả năng đối kháng của các chủng nấm mốc không sinh độc tố thường thay đổi theo
điều kiện khí hậu và hệ sinh thái từng vùng nên việc ứng dụng các chế phẩm nấm đối
kháng được sản xuất ở nước ngoài trên đồng ruộng Việt Nam không dễ dàng và đem lại

4


hiệu quả không cao. Do đó, việc tạo lập một chế phẩm nấm A. flavus đối kháng từ những
chủng phân lập được trên các nguồn tự nhiên bản địa chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả giảm
thiểu sự nhiễm aflatoxin.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đối
kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và

lạc”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau đây:
Mục đích nghiên cứu
Kiểm soát sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng chế phẩm Aspergillus flavus không
sinh aflatoxin.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có khả năng
cạnh tranh cao và ổn định với các chủng A. flavus sinh aflatoxin.
2. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và tạo chế phẩm bào tử từ chủng Aspergillus flavus
không sinh aflatoxin.
3. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nhằm giảm
thiểu sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở quy mô phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng.
Những đóng góp mới của luận án
1. Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng cơ chế cạnh tranh sinh học bằng
chủng A. flavus không sinh aflatoxin trong kiểm soát aflatoxin nhiễm trên ngô và lạc.
2. Luận án nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để làm sáng tỏ bản chất sinh học
phân tử của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân lập từ ngô (Việt Nam). Chủng
A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin.
3. Luận án đã nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm bào tử chủng A. flavus DA2 đạt
sản lượng cao (109CFU/g) với công nghệ đơn giản, giá thành rẻ. Chế phẩm có tác dụng
giảm sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên ngô, lạc ở giai đoạn đồng ruộng và trong quá
trình bảo quản từ 86,55% đến 97%, đảm bảo tính khả thi cao khi đưa ra ứng dụng ở quy
mô lớn.

5


CHƯ NG I. TỔNG QU N TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
1.1.1 Cấu tạo
Aflatoxin là nhóm các hợp chất có nhân difuranocumarin, là sản phẩm trao đổi chất

chủ yếu của hai loài nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Theo Reddy
và Farid có khoảng 18 cấu trúc hóa học gần nhau của aflatoxin đã được xác định. Dựa trên
đặc tính lý hóa và tính độc khác nhau các aflatoxin được chia thành nhiều nhóm: B ( B1 ,
B2); G (G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1. Các loại aflatoxin này khác biệt về hóa học
không nhiều nhưng khác biệt về độc tính là rất lớn. Aflatoxin B1 và G1 có khả năng gây
ung thư cao hơn nhiều so với các loại aflatoxin còn lại. Trong các loại aflatoxin thì
aflatoxin B1 phổ biến nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, tiếp theo là G1, trong
khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn [115].
Công thức cấu tạo của một số aflatoxin [11]:
O

O

O
O

O

O

O

OCH3

O

O

Aflatoxin B1

O

O

O
O

O
OH

OH

OCH3

O

O

Aflatoxin M1
O

O

O

OCH3

O
Aflatoxin M2

O

O

OCH3

Aflatoxin B2

O

O

O

O
O

O

O

O

OCH3

O
Aflatoxin G2

Aflatoxin G1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số dạng aflatoxin
6

O

OCH3


1.1.2 Tính chất hóa lý
Các aflatoxin được hoà tan trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform,
methanol, acetone, acetonitrile và đặc biệt ở dimetylsulfoxit. Độ hòa tan của aflatoxin
trong nước dao động là 10-20mg/lít.
Aflatoxin tinh khiết rất bền với nhiệt. Tuy nhiên, sự có mặt của hơi nước và nhiệt
độ cao có thể phá hủy được aflatoxin sau một thời gian nhất định như sự phá hủy aflatoxin
trong dầu ăn, trong lạc rang hoặc trong dung dịch có pH 7. Mặc d chưa được nghiên cứu
chi tiết nhưng dường như nhiệt độ cao đã mở vòng lacton với phản ứng decacboxyl hóa.
Các aflatoxin tương đối không bền khi được để trong không khí dưới ánh sáng mặt trời và
tia tử ngoại, đặc biệt ở các dung môi có độ phân cực cao nên việc khử nhiễm aflatoxin
trong thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn [98, 99].
Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy trong điều kiện làm nóng khi thanh tr ng,
không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở nhiệt độ 120oC, phải đun 30
phút mới mất tác dụng độc). Do vậy, nó có thể tồn tại trong thực phẩm mà không cần sự có
mặt của nấm mốc tương ứng, đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên, các
aflatoxin có thể bị phá hủy hoàn toàn với việc xử lý bằng amoniac hay hypochlorit [98].
Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng dễ bị thủy phân trong môi
trường kiềm. Đặc tính này là quan trọng trong quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử
lý kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin của các sản phẩm. Tuy nhiên, nếu xử lý kiềm là nhẹ
thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu [22, 11].

nhiệt

độ cao (100oC), phản ứng decacboxyl mở vòng lacton hóa xảy ra d n đến sự mất nhóm OCH3 của vòng thơm. Phản ứng cũng xảy ra tương tự với amoniac và các hợp chất amin
khác [101].
Một số tác nhân oxy hóa như NaClO, KMnO4, Cl, H2O2, O3... phản ứng với
aflatoxin làm thay đổi cấu trúc phân tử của aflatoxin, cơ chế của phản ứng chưa được xác
định, tuy nhiên sự thay đổi cấu trúc phân tử đã được thể hiện qua sự mất tính chất phát
quang [101].
Các aflatoxin phát quang mạnh khi ở dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Tính chất này
cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ thấp ( 0,5 ng trên sắc kí bản mỏng). Nó cung
cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và
định lượng [6, 7]. Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin được trình bày theo bảng 1.1
[115].
7


Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa của các aflatoxin
Aflatoxin

1.1.3

Công thức

Khối lượng

Nhiệt độ nóng chảy

Màu huỳnh quang

o

phân tử

phân tử

( C)

B1

C17H12O6

312

268-269

Xanh da trời(B)

B2

C17H14O6

314

268-289

Xanh da trời(B)

G1

C17H12O7

328

244-246

Xanh lá cây(G)

G2

C17H14O7

330

229-231

Xanh lá cây(G)

M1

C17H12O7

328

297-299

Xanh tím

M2

C17H14O7

330

293

Xanh tím

ộc tính của aflatoxin
Aflatoxin là các chất có khả năng gây ung thư, gây đột biến gen, là tác nhân làm

giảm khả năng miễn dịch. Người có thể bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị
nhiễm hoặc ăn thịt các động vật được nuôi bằng ngũ cốc bị nhiễm aflatoxin. Các nghiên
cứu ở những v ng có tỷ lệ ung thư cao trên thế giới đều cho thấy nhiễm độc aflatoxin là
nguy cơ chính gây ung thư gan [99]. Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro-furan nên
aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất d n đến tử vong. Ngoài ra,
aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (AND, ARN) làm rối loạn
cấu trúc di truyền d n đến tổn thương gan và ung thư gan [95]. Cho đến nay, các luận
chứng khoa học công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn
sau: (1) Ức chế các polymerase là enzyme tham gia vào tổng hợp AND và ARN. (2) Làm
chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp AND. (3) Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA thông
tin. (4) Biến đổi hình dạng nhân tế bào. (5) Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein [63].
Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thể người nhiễm đến nay v n chưa được xác
định rõ ràng. Các nghiên cứu gần đây chỉ tìm thấy sự ảnh hưởng của các aflatoxin nhóm B
đến sự đột biến codon 249 của gen p53. Hiện tượng này d n đến nguy cơ gây ung thư cao
do gen p53 là một gen có tác dụng chế ngự việc tăng lên không bình thường của các tế bào,
hình thành nên các dạng u, bướu trong cơ thể [95].

8


Hình 1.2 Aflatoxin tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền

1.1.4 Thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc
1.1.4.1 Thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các nước trên thế giới
Theo đánh giá của tổ chức nông lương thế giới (FAO) hàng năm có từ 25-50% nông
sản sau thu hoạch bị nhiễm mycotoxin trong đó chủ yếu là aflatoxin. Tỷ lệ này còn cao hơn
đối với các nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nơi 80% ngô bị nhiễm mycotoxin.
Ngoài các nông sản thực phẩm thì các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật cũng có
thể bị nhiễm mycotoxin do sử dụng các thức ăn có độc tố [67].
Các điều tra của Mỹ với trên 1500 m u ngô thu hoạch ở vụ m a của các năm 19691970, chủ yếu từ các nguồn thương mại, đã cho thấy từ 2-3% m u nhiễm aflatoxin B1 và
G1 ở khoảng từ 3-37 ppb. Trong nghiên cứu tiếp theo với 60 m u từ đông - nam của Mỹ
aflatoxin B1 đã được tìm thấy trong 21 m u ở mức từ 6-308 ppb.

Thái Lan, 35% m u

ngô nghiên cứu nhiễm aflatoxin B1với hàm lượng trung bình 400 ppb.

Uganda tỷ lệ

nhiễm là 40% với hàm lượng trung bình là 133 ppb. Đặc biệt ở đảo Sebu (Philippin), tỷ lệ
này là 97% với hàm lượng trung bình là 213 ppb [131].
Theo Goto và công sự, trong m a mưa năm 1984-1985 ở Thái Lan, 85% số m u ngô
thu thập từ các kho bảo quản đã nhiễm aflatoxin B1 với lượng 6,30-1310 ppb và 0,6 -767 ppb,
theo thứ tự [74]. Trong khảo sát của Makun và cộng sự cho thấy 29/50 m u đậu thu nhận ở
Nigeria nhiễm aflatoxin ở mức 63,5 - 106,2 μg/kg, 54% các m u bột mỳ chế biến ở các chợ
nhiễm độc tố với hàm lượng 102,9 - 198,4 μg/kg [97].

9


Trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15% của 361 m u có

aflatoxin giới hạn từ vết đến 50 g/kg. Stoloff đã tìm thấy aflatoxin ở 86,5% của 52 m u
trong các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một m u có 3.465g/kg.
Các aflatoxin đã tìm thấy ở 41% của 173 số m u lạc ở Sudan, 16 m u có trên 250 g/kg và
9% số m u có trên 1000 g/kg. ở Philippin, tất cả các m u bơ lạc được kiểm tra năm 19671969, có aflatoxin với giá trị 155 g/kg và giá trị trung bình 500 g/kg [123].
1.1.4.2 Thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở Việt Nam
Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là cây màu
quan trọng nhất được trồng ở nhiều v ng sinh thái khác nhau, đa dạng về m a vụ gieo
trồng và hệ thống canh tác. Cây ngô không chỉ cung cấp lương thực cho người, vật nuôi
mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Sản
xuất ngô cả nước qua các năm không ngừng tăng về diện tích, năng suất, sản lượng: năm
2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng trên 1 triệu ha; năm 2010,
diện tích ngô cả nước 1126,9 nghìn ha, năng suất 40,9 tạ/ha, sản lượng trên 4,6 triệu tấn.
Bên cạnh đó, trong số các cây công nghiệp ngắn ngày đang được trồng ở Việt nam, lạc là
cây thực phẩm, cây có dầu quan trọng trong số các loại cây có dầu hàng năm trên thế giới,
sản phẩm lạc có nguồn protein cao làm thức ăn cho người và gia súc, làm nguyên liệu cho
công nghiệp chế biến. Năm 2012 diện tích gieo trồng lạc trong cả nước đạt 220.000ha, sản
lượng đạt 470.600 tấn. Hàng năm Việt Nam xuất khẩu khoảng 40.000-45.000 tấn lạc đạt
kim ngạch xuất khẩu 24-26 triệu USD [17].
Tổn thất sau thu hoạch đối với cây ngô, lạc là khá lớn, trung bình từ 13 - 15%. Đặc biệt
việc sản xuất ngô, lạc trong vụ Xuân thường gặp rất nhiều khó khăn cho việc thu hoạch, bảo
quản, sơ chế ngô, lạc trong điều kiện mưa kéo dài trong giai đoạn cuối vụ thu hoạch. Ngô, lạc
nếu không được bảo quản hoặc bảo quản không đúng qui trình sẽ giảm chất lượng nghiêm
trọng, đặc biệt sẽ phát sinh các loại nấm Aspergillus sp. Sinh độc tố aflatoxin làm giảm
chất lượng cũng như hiệu quả kinh tế đồng thời gây bệnh ung thư gan cho người và động
vật.
nước ta cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và
aflatoxin trên ngô, lạc. Nguyễn Ph ng Tiến và cộng sự [9] đã nghiên cứu mức độ nhiễm
mốc trên ngô, kết quả là 38 m u bảo quản trong kho lương thực của thành phố Thanh Hóa
đã nhiễm nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium,
Sporotrichuro, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum. Tuy nhiên chưa có số liệu về

10


mức nhiễm mycotoxin trong công trình này. Đậu Ngọc Hào và cộng sự đã nghiên cứu mức
nhiễm mốc và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa. Kết quả phân tích của
24 m u ngô hạt và 24 m u ngô bột cho thấy các m u này đã nhiễm A.flavus với tỷ lệ cao,
từ 50-80%. Trong đó, có 33% số m u ngô hạt đã nhiễm aflatoxin B1 từ 10-40ppb, 8,3% số
m u nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20ppb, 72% số m u ngô bột đã nhiễm aflatoxin B1 từ 25250ppb, 9,5% số m u ngô nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20ppb, 74,7% m u khô lạc nhiễm
aflatoxin[4]. Nguyễn Th y Châu và cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và
aflatoxin trên ngô và gạo ở một số địa phương cho thấy tần xuất nhiễm aflatoxin trên ngô ở
miền Nam và miền Bắc Việt Nam là cao từ 73,3% - 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin
trung bình là 63,8ppb [10, 11]. Năm 1990-1995 Viện Dinh Dưỡng đã kiểm tra 387 m u
lương thực thực phẩm nhận thấy có 73 m u (19%) bị nhiễm aflatoxin, trong đó có 68%
m u lạc và các sản phẩm từ lạc cũng có chứa loại độc tố này [16]. Phan Thị Kim và Cộng
sự đã tiến hành khảo sát phân tích trên 243 m u ngô, lạc và sản phẩm chế biến làm thức ăn
gia súc tại 03 xã thuộc huyện Tân Kỳ Nghệ An tháng 6/2002 đã phát hiện mức độ và nguy
cơ nhiễm Aflatoxin khá cao trên 90% số m u lấy tại các hộ gia đình đang được bảo quản bị
nhiễm aflatoxin, tỷ lệ vượt giới hạn cho phép theo quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin
có trong thực phẩm của Bộ Y tế là trên 23% (56/243m u) [14].
1.1.5 Giới hạn aflatoxin cho phép trong nông sản thực phẩm
Trước thực trạng nhiễm aflatoxin trên một số nông sản ở mức độ cao cũng như tính
độc của aflatoxin đối với sức khỏe con người và vật nuôi, gây thiệt hại về kinh tế. Chính vì
vậy, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn aflatoxin nhiễm trong
lương thực, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Theo tiêu chuẩn của cơ quan quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) giới hạn aflatoxin cho phép trong lạc để chế biến được
quy định ở mức 15 ppb (8 ppb cho B1), trong các loại hạt khác và quả khô để chế biến tiếp
là 10 ppb (5 ppb cho B1). Đối với ngũ cốc, quả khô và các loại hạt d ng để ăn ngay cho
người, tiêu chuẩn nghiêm ngặt hơn và quy định ở mức 4 ppb (2 ppb cho B1) [67]. Codex
đưa ra tiêu chuẩn riêng cho aflatoxinB1 là 7,5-10,5 ppb [33]. Giới hạn aflatoxin cho phép
trên nông sản thực phẩm được trình bày ở bảng 1.2.

11


Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép trên nông sản th c ph m

Nước

Giới hạn aflatoxin tối

Loại thức ăn

đa cho phép (ppb)
20

Mỹ
20

Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia
cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau
Hàm lượng tối đa cho phép trong thức ăn cho gia
súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu bột ngô

Châu Âu

5

Thực phẩm sử dụng cho người

Canada

15

Các sản phẩm thực phẩm chế biến từ lạc

Úc

15

Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và lạc

10

Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1

100

Nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi

Nhật
Trung

5 – 20

Ngũ cốc, đậu tương và dầu thực vật

Quốc

10 – 50

Trong các loại thực phẩm khác

30

Tất cả các loại lương thực, thực phẩm

120

Trong các sản phẩm từ lạc

Châu Á

Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định về hàm
lượng tối đa aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) trong
thức ăn cho gia súc, gia cầm theo quyết định Số 104/2001/QĐ/BNN (bảng 1.4) và quy
chuẩn kỹ thuật Quốc gia 2013/QCVN/BNNPTNT - Quy định giới hạn tối đa cho phép hàm
lượng độc tố nấm mốc trong thức ăn tinh hỗn hợp cho bò (bảng 1.3).
Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê và Bò

Hàm lượng aflatoxin tính theo microgam/kg
STT

1

(ppb) tối đa cho phép

Loại độc tố

Aflatoxin B1

Bê (<6 tháng tuổi)

Bò thịt (> 6 tháng tuổi)

50

100

200

500

Tổng số các aflatoxin
2
( B1+B2+G1+G2 )

12


Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

Aflatoxin B1

Aflatoxin tổng số

(ppb)

(ppb)

Gà con từ 1 – 28 ngày tuổi

< 20

<30

Nhóm gà còn lại

<30

<50

Không có

<10

Nhóm vịt còn lại

<10

<20

Heo con theo mẹ từ 1 – 20 ngày tuổi

<10

<30

Nhóm heo còn lại

<100

<200

Bò nuôi lấy sữa

<20

<50

Loại vật nuôi

Vịt con từ 1 – 28 ngày tuổi

1.2 Aspergillus flavus
Aflatoxin được tạo ra từ một số chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus như: A. flavus,
A. parasiticus, A. nomius, A. pseudotamarii, A. bombycis.... [106]. Trong đó, loài A. flavus
có khả năng sinh aflatoxin mạnh nhất trong môi trường tự nhiên và nhân tạo. Theo số liệu
của Schoroder và Boller, có từ 20-98% các chủng A. flavus phân lập có khả năng tạo
aflatoxin [119]. A. flavus phân bố ở khắp nơi trên trái đất: dưới đất, trên các nông sản thực
phẩm, đặc biệt là trên lạc và các sản phẩm chế biến từ lạc. Ngoài ra chúng còn được thấy
nhiều trên sợi bông, nhất là trên hạt bông và khô hạt bông, thức ăn gia súc, dăm bông, dồi
thịt và nhiều thức ăn khác…A. flavus xâm nhập vào nông sản, thực phẩm qua các điểm tiếp
hợp nhờ những chỗ do côn tr ng huỷ hoại gây ra. Tuy nhiên, ở cây lạc tươi A. flavus khó
xâm nhập, mà chúng xâm nhập khi củ lạc đã già, nhất là sau khi thu hoạch. A. flavus xâm
nhập vào hạt lạc chứa 15-20% nước, tức là vào thời gian đầu của việc làm khô [2].
1.2.1

ặc điểm hình thái
A. flavus có màu vàng xanh lá cây, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (Czapeck hay

thạch Sabouraud) hình thái khuẩn lạc sau 24h nuôi cấy có màu vàng nhạt ở trung tâm, rìa
mép bờ có màu trắng mịn, sau 48h hình thành miền bào tử trung tâm, xuất hiện các khối
bào tử chín màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng, sau 72-96 giờ khuẩn lạc phát triển cực
đại. Đường kính khuẩn lạc đạt 4-5cm sau 6-7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, các bào tử
hình thành vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5-6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt
khuẩn lạc [1, 114].
13


A. flavus có khả năng sinh các loại độc tố B1, B2 và axit cyclopizoic (CPA) [1].
Theo kết quả đã nghiên cứu của nhiều tác giả, không phải tất cả các loại A. flavus đều có
khả năng sinh độc tố aflatoxin.

Pháp 25% số chủng A. flavus phân lập được từ lương

thực, thực phẩm và thức ăn gia súc tạo aflatoxin. Các chủng A. flavus tạo aflatoxin trên lạc
chiếm 96%, ở hạt bông chiếm 78%, ở lúa mạch chiếm 49% và ở gạo chiếm 35% [2]. Các
chủng v ng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn so với các chủng v ng ôn đới. Một số ý
kiến cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ cũng có bào tử trần màu xanh lục, ngay cả ở
các giống nuôi cấy lâu ngày, có thể bình 2 lớp, cuống sinh bào tử có vách, có gai, những
chủng sinh độc tố có sự phình to một phần sợi trên sợi nấm tạo thành những mắt nhỏ [2].
Tuy nhiên chỉ dựa vào đặc điểm hình thái sẽ rất khó để xác định chính xác những chủng A.
flavus có khả năng sinh hay không sinh aflatoxin.
Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái của A. flavus

Đặc điểm hình thái A. flavus
- Dạng khuẩn lạc

- Bọng đỉnh giá

Bề mặt: Dạng len

Hình dáng: hình cầu, trùy

Màu sắc: màu vàng xanh lá cây

Đường kính: 25 -45 (m)

Màu mặt sau: tím nhạt, nâu hồng

- Cuống thể bình

Giọt tiết: Có hoặc không có

Có mặt: Có hoặc không

Sắc tố hoà tan quanh khuẩn lạc: Không

Kích thước: 5-10  3,5 5,5 (m)

Đường kính: 6 -8 (cm)

- Thể bình
Hình dạng: Hình bình

- Cuống sinh bào tử
Bề mặt: Ráp hoặc nhẵn

Kích thước: 6,5-123-6 (m)
- Bào tử trần

Chiều dài: 500 -800 (m)
Đường kính: 15 – 20 (cm)

Hình dạng: Cầu, hình trứng

- Khối bào tử trần

Bề mặt: Có gai

Hình dạng: Tia toả tròn, cột

Đường kính trục lớn: 3 – 6 (m)

Đường kính: 300 -500 (m)
Chiều dài: 50-300 (m)

14


Hình 1.3 Khu n lạc A. flavus

Hình 1.4 Hệ sợi A. flavus quan sát dưới kính hiển vi

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của A. flavus
Nguồn cacbon: A. flavus có các enzyme thủy phân tinh bột, nhưng nguồn
hydrocacbon thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm này là
glucose và sacharose. Môi trường Czapeck – Dox có nguồn thức ăn cacbon dưới dạng
sacharose, thường được sử dụng làm môi trường nuôi cấy và phân loại A. flavus.
Nguồn nitơ: Có nhiều loại vi nấm không phát triển được trên môi trường chứa muối

amôn, do khi đồng hoá NH4+ trong môi trường sẽ tích luỹ các ion SO42-, HPO42- và Cl-…
làm hạ thấp pH của môi trường. Khi vi nấm đồng hoá NO3- môi trường sẽ tích luỹ các
cation K+, Na+ …do đó làm tăng pH môi trường. A. flavus có khả năng đồng hoá các loại
muối amon và nitrat. Ngoài ra chúng còn có khả năng sử dụng axit glutamic, prolin,
trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine, methionine [1].
Nguyên tố khoáng: Ngoài các nguồn dinh dưỡng chủ yếu trên để đảm cho sự tồn tại
và phát triển, A. flavus còn đòi hỏi một lượng cần thiết các nguyên tố đa lượng (P, K, S,
Mg, Ca), các nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…), các muối MgSO4, K2SO4,
KCl, FeSO4…cũng rất cần thiết cho sự phát triển của A .flavus [1].
Nhiệt độ: A. flavus là loại nấm mốc ưa nhiệt, có thể sinh trưởng và phát triển ở dải
nhiệt độ 20-60oC, toopt 25-35oC, dưới 12oC A. flavus không phát triển được hoặc phát triển
rất yếu [2].
pH: A. flavus có thể phát triển ở khoảng pH khá rộng (pH = 2 - 8) tuỳ thuộc vào loài.
Tuy nhiên pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là 4,5-6,5 [2].

15