Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
__________

Nguyễn Thị Giang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG
SỬ DỤNG NITƠ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
TẠO BIOFILM PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012
i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
__________

Nguyễn Thị Giang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG
SỬ DỤNG NITƠ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
TẠO BIOFILM PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành

:

Mãsố

60 42 30

:

Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2012
ii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM ............................................................ 2
1.1.

Giới thiệu chung về Biofilm ......................................................................... 2

1.2.

Các dạng tồn tại của biofilm ....................................................................... 3

1.2.1.

Trong tự nhiên ........................................................................................... 3

1.2.2.

Trong hệ thống thiết bị nhân tạo ............................................................... 4

1.2.3.

Trong cơ thể sinh vật ................................................................................. 4

1.3.
1.3.1.

Thành phần và cấu trúc của biofilm ............................................................ 4
Thành phần của biofilm............................................................................. 4

1.3.1.1. Các hợp chất ngoại bào ............................................................................... 4
Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS. ....................................................... 6
1.3.1.2. Lông, roi, tiêm mao và các phân tử bám dính ............................................ 6
1.3.2.
1.4.

Cấu trúc của biofilm .................................................................................. 8
Quá trình hình thành màng sinh vật ............................................................ 9

1.4.1. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sự hình thành màng sinh vật ................................. 9
1.4.2.

Các giai đoạn của quá trình hình thành màng sinh vật ........................... 11

1. 5. Vai trò của màng sinh vật............................................................................... 16
1.5.1.

Vai trò của việc hình thành biofilm với vi sinh vật ................................. 16

1.5.1. 1. Bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lợi của môi trƣờng ......................... 16
1.5.1.2. Tận dụng nguồn dinh dƣỡng của môi trƣờng ............................................ 17
1.5.1.3. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài ............................................................. 17
1.5.1.4. Trao đổi vật chất di truyền ........................................................................ 17
1.5.2. Ảnh hƣởng của biofilm đến đời sống con ngƣời .......................................... 18
1.6. Vấn đề xử lý nước thải ..................................................................................... 19
1.6.1. Thực trạng ô nhiễm nguồn nƣớc .................................................................. 19
1.6.2. Ô nhiễm nguồn nƣớc do nƣớc thải chăn nuôi .............................................. 20

iv


1.6.3. Xử lý nƣớc thải chăn nuôi ............................................................................ 21
1.6.3.1. Phƣơng pháp cơ học .................................................................................. 21
1.6.3.2. Phƣơng pháp hóa lý ................................................................................... 21
1.6.3.3. Phƣơng pháp sinh học ............................................................................... 22
1.7. Chu trình nitơ trong tự nhiên ......................................................................... 23
1.7.1. Khái quát về chu tr nh nitơ .......................................................................... 23
1.7.2. Quá trình nitrat hóa ....................................................................................... 24
1.7.3. Quá trình phản nitrat hóa ............................................................................. 25
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 26
2.1. Nguyên liệu .......................................................................................................... 26
2.2.

a chất, thiết bị ............................................................................................. 27

2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy ..................................................................................... 27
2.2.2.

Hóa chất ................................................................................................... 27

2.2.3.

Máy móc thiết bị...................................................................................... 28

2.3.

Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 28

2.3.1.

Phƣơng pháp ph n lập vi khu n .............................................................. 28

2.3.2.

Phƣơng pháp đánh giá khả năng h nh thành biofilm .............................. 29

2.3.3.

Phƣơng pháp chụp ảnh tr n k nh hiển vi điện tử qu t............................. 29

2.3.4.

Phƣơng pháp đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng tới sự hình thành biofilm . 30

2.3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................ 30
2.3.4.2. Ảnh hƣởng của pH .................................................................................... 30
2.3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm Gram ....................................................................... 30

2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ................... 30
2.3.5.1. Phƣơng pháp thử khả năng chuyển hóa amoni ......................................... 31
2.3.5.2. Phƣơng pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit ............................................ 31
2.3.6. Phƣơng pháp ph n loại dựa trên phân tích gen 16S rRNA ......................... 33
2.3.7. Phƣơng pháp thống kê sinh học .................................................................. 34

v


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 35
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm ................... 35
3.2. Đánh giá khả năng hình thành biofilm ............................................................ 37
3.2.1.

Khả năng tạo biofilm tr n môi trƣờng Winogradski 1 ............................ 37

3.2.2.

Khả năng tạo biofilm tr n môi trƣờng Winogradski 2 ............................ 39

3.3.

Đặc điểm hình dạng của các chủng vi khuẩn phân lập được ................... 41

3.4.

Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng nghiên cứu ..... 42

3.4.1.

Khả năng phát triển và tạo màng nổi....................................................... 42

3.4.2.

Ảnh hiển vi màng nổi của các chủng nghiên cứu ................................... 43

3.4.3.

Khả năng tạo biofilm bề mặt ................................................................... 44

3.5.

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo biofilm của các chủng phân lập 45

3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................... 45
3.5.2. Ảnh hƣởng của pH ....................................................................................... 47
3.6.

Phân loại các chủng vi khuẩn dựa trên gen 16S rRNA ............................. 48

3.7.

Khả năng chuyển h a nitơ ......................................................................... 51

3.7.1. Khả năng chuyển hóa amoni ........................................................................ 52
3.7.2. Khả năng chuyển hóa nitrit .......................................................................... 53
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 63

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

BNNPTNT

Bộ Nông nghiệp phát triển
nông thôn

EPS

Extracellular Polymeric Substances

Mạng lƣới ngoại bào

LB

Luria Broth agar

Môi trƣờng LB

OD

Optical Density

Mật độ quang học

PE

Polyethylen

Nhựa polyethylen

PVC

Polyvinyl chloride

Nhựa polyvinyl chloride

QCVN

Quy chu n Việt Nam

SEM

Scanning Electron Microscope

Ảnh hiển vi điện tử quét

UV

Ultra violet

Tia cực tím

vii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS. .......................................................6
Bảng 2. Số lƣợng vi khu n phân lập đƣợc tại các địa điểm nghiên cứu. ...............36

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Màng sinh vật của Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia và
Flavobacterium spp. trên bề mặt thép không gỉ ..................................................................8
H nh 2. Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm. ....................................................12
H nh 3. Các giai đoạn của sự tạo thành biofilm ................................................................15
Hình 4. Hoạt động trao đổi chất bên trong biofilm ..........................................................15
Hình 5. Chu tr nh nitơ trong tự nhiên ................................................................................24
Hình 6. Các vị trí lấy mẫu .................................................................................................26
Hình 7. Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ trại
nuôi lợn xã T n Ƣớc tr n môi trƣờng Winogradski 1. ......................................................37
Hình 8. Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ hệ
thống thoát nƣớc xã Dƣơng Nội tr n môi trƣờng Winogradski 1. ....................................38
Hình 9. Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ trại
nuôi vịt xã Trung Tú tr n môi trƣờng Winogradski 1. ......................................................39
Hình 10. Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ
trại nuôi lợn xã T n Ƣớc tr n môi trƣờng Winogradski 2. ...............................................40
Hình 11. Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ hệ

thống thoát nƣớc xã Dƣơng Nội tr n môi trƣờng Winogradski 2. ....................................40
Hình 12. Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ
trại nuôi vịt xã Trung Tú trên môi trƣờng Winogradski 2.................................................41
Hình 13: Hình dạng các chủng vi khu n nghiên cứu. .......................................................42
Hình 14. Khả năng tạo biofilm nổi của các chủng nghiên cứu .........................................43
Hình 15. Ảnh hiển vi màng nổi của các chủng vi khu n...................................................44
Hình 16. Khả năng tạo biofilm trên vật liệu nhựa .............................................................45
Hình 17. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng tạo biofilm ...........................................46
Hình 18. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tạo biofilm ....................................................48
Hình 19. Vị trí phân loại chủng T2.2 với các loài có quan hệ họ hàng gần .....................49
Hình 20. Vị trí phân loại chủng H2.2 với các loài có quan hệ họ hàng gần .....................50
Hình 21. Vị trí phân loại chủng T4.1 với các loài có quan hệ họ hàng gần ....................51
Hình 22. Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng H2.2 và T4.1 ................................52
Hình 23. Khả năng chuyển hóa nitrit của chủng LD2.2 và T2.2.......................................53

vii


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

MỞ ĐẦU
Nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao quá mức cho phép khi đƣợc thải ra sông, hồ
sẽ gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng làm nƣớc có màu, mùi khó chịu ảnh hƣởng đến môi
trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khoẻ cộng đồng. Do vậy, việc phải loại bỏ nitơ đến
mức tối thiểu từ các nguồn nƣớc ô nhiễm trƣớc khi đƣa ra môi trƣờng là cần thiết.
Trong số các loại nƣớc thải ô nhiễm, nƣớc thải chăn nuôi là một trong những loại
nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao, có khả năng g y ô nhiễm môi trƣờng và là sinh
sống phát triển của nhiều nhóm sinh vật gây bệnh và cũng là loại nƣớc thải ô nhiễm

khó xử lý.
Có nhiều phƣơng pháp xử lý nitơ khác nhau nhƣ áp dụng các phƣơng pháp
hoá học, vật lý nhƣng phƣơng pháp xử lý mang tính bền vững, thân thiện với môi
trƣờng vẫn là các phƣơng pháp sinh học với sự tham gia của các nhóm vi sinh vật
trong tự nhiên.
Trong tự nhiên, hầu hết các tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với nhau tạo
thành một cộng đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lƣới các
hợp chất ngoại bào, hình thành cấu trúc màng sinh vật (biofilm). Biofilm giúp cho
vi sinh vật tồn tại và quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng
sinh vật, có thể tận dụng đƣợc nhiều nguồn dinh dƣỡng.
Việc nghiên cứu khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi
sinh vật phân giải nitơ trong nƣớc thải nói chung và nƣớc thải chăn nuôi nói riêng là
một hƣớng đi mới nhằm nâng cao hiệu quả trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng cũng
nhƣ góp phần tìm hiểu sự đa dạng sinh học trong tự nhiên.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm
sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân
lập tại Việt Nam.”

1


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM
1.1.

Giới thiệu chung về Biofilm

Khái niệm màng sinh vật đƣợc hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám
dính và phát triển trên bề mặt các môi trƣờng khác nhau thông qua mạng lƣới chất
ngoại bào do chính chúng tạo ra [32], [57]. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề
mặt môi trƣờng vô sinh hay hữu sinh và là một hiện tƣợng phổ biến xuất hiện trong
tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Các tế bào
vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi
việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự
giảm tỷ lệ tăng trƣởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó.
Khả năng bám d nh của vi sinh vật là một quá trình phức tạp đƣợc điều hòa bởi các
đặc điểm khác nhau về môi trƣờng nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào
[56]. Vi khu n bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động
cụ thể từ môi trƣờng sống nhƣ nguồn chất dinh dƣỡng và oxy.
Quá trình tạo thành màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong
việc chuyển từ đời sống tự do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh
vật, bao gồm cả việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất
chống lại các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học gây hại [82].
Sự hình thành màng sinh vật đƣợc coi là một trong số những cơ chế tồn tại
của vi sinh vật, tại đó vi khu n tận dụng đƣợc các nguồn dinh dƣỡng và nhận
đƣợc sự bảo vệ trong các điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, bức xạ cực tím hoặc
những chất độc hại. Mặt khác có thể coi hệ thống màng sinh vật là một mạng
lƣới nhiều gen, tại đó các vật liệu di truyền có thể dễ dàng đƣợc trao đổi qua lại
giữa các tế bào vi sinh vật [65].
Biofilm có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều
loài vi sinh vật khác nhƣ nấm, tảo, xạ khu n, vi khu n. Trong biofilm các tế bào tập
hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khu n lạc. Thành phần này đóng vai trò quan
trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy định
đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các
hợp chất ngoại bào cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi, lông
nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể.

2


Luận văn Thạc sỹ Sinh học
1.2.

Nguyễn Thị Giang

Các dạng tồn tại của biofilm

Biofilm là một dạng tồn tại của sinh vật không chỉ xuất hiện ở trong phòng
thí nghiệm mà còn có ở nhiều nơi khác nhau. Biofilm thƣờng đƣợc tìm thấy trên bề
mặt các vật liệu rắn (đất, đá, các vật liệu dạng rắn…) nơi ngập nƣớc hoặc bề mặt
nơi tiếp xúc với dung dịch nƣớc. Biofilm có thể h nh thành tƣơng tự nhƣ mảng nổi
trên bề mặt chất lỏng và trên bề mặt của lá, đặc biệt là ở nơi có độ m cao. Với đầy
đủ các nguồn dinh dƣỡng cho quá tr nh sinh trƣởng, một biofilm sẽ nhanh chóng
phát triển đạt k ch thƣớc lớn (có thể quan sát phát hiện thấy bằng mắt thƣờng).
Biofilm có thể đƣợc tạo thành bao gồm chỉ một loài vi sinh vật hoặc cũng có thể
gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau, nhƣ vi khu n, nấm và tảo; mỗi nhóm thực
hiện chức năng trao đổi chất ri ng, nhƣng có quan hệ chặt chẽ với nhau. Do vậy
trong thực tế có thể bắt gặp nhiều dạng biofilm đƣợc tạo thành từ các vi sinh vật
khác nhau [54].
1.2.1. Trong tự nhiên
Biofilm có thể tồn tại ở khắp nơi. Chúng thƣờng đƣợc thấy ở những sinh
cảnh có nƣớc, chất dinh dƣỡng và bề mặt. Từ những sa mạc băng ở Nam Cực đến
những khe đá s u hàng ngàn kilomet dƣới lòng đất cũng có sự xuất hiện của màng
sinh vật [67].
Các rừng mƣa nhiệt đới, nơi có độ m cao là điều kiện thuận lợi cho sự
phát triển phong phú của màng sinh vật, nhƣ r u và những cặn bám dƣới đáy ao,
hồ, hay những mảng r u, địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề

mặt ao, hồ… [67].
Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình
thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish
desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá, vách núi có màng sinh vật
phát triển xuất hiện những vết màu [67].
Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khu n có trong màng
sinh vật bám ở rễ cây. Màng sinh vật đƣợc tạo ra bởi vi khu n cố định nitơ
Rhizobium trong rễ cây có thể giúp ngăn ngừa bệnh cho cây trồng [82].

3


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

1.2.2. Trong hệ thống thiết bị nhân tạo
Trong các thiết bị nhân tạo, màng sinh vật thƣờng xuất hiện ở các dụng cụ dẫn
nƣớc và chứa nƣớc gây tắc nghẽn đƣờng ống, rò rỉ nƣớc hay ô nhiễm môi trƣờng.
Biofilm làm giảm nhiệt trong hệ thống làm mát hoặc hệ thống sƣởi nƣớc [21].
Biofilm trong hệ thống kỹ thuật biển, chẳng hạn nhƣ ống dẫn dầu ngoài khơi,
ống dẫn ga công nghiệp có thể dẫn đến sự ăn mòn đáng kể. Ăn mòn chủ yếu là do
các yếu tố vô sinh. Tuy nhiên, ít nhất 20% nguy n nh n g y ra ăn mòn là do các vi
sinh vật đã bám vào bề mặt kim loại [72].
1.2.3. Trong cơ thể sinh vật
Màng sinh vật có trong rất nhiều bệnh nhiễm trùng của cơ thể, ƣớc tính
khoảng 80% các bệnh nhiễm trùng [61].
Các quá trình truyền nhiễm có li n quan đến biofilm nhƣ nhiễm trùng đƣờng
tiết niệu, nhiễm trùng ống thông, nhiễm trùng tai giữa, hình thành các mảng bám
răng, vi m nƣớu, nhiễm trùng trong bệnh xơ nang ... [68], [44].

Một số nghiên cứu ghi nhận rằng màng sinh vật có thể giúp chữa lành vết
thƣơng ở da và giảm tại chỗ hiệu quả kháng khu n trong chữa bệnh hoặc điều trị
nhiễm trùng vết thƣơng da [28].
Màng sinh vật cũng có thể xuất hiện trên các bề mặt của các thiết bị cấy ghép
nhƣ các ống thông, van tim nhân tạo…[52].
1.3.

Thành phần và cấu trúc của biofilm

1.3.1. Thành phần của biofilm
Về cơ bản màng sinh vật đƣợc cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một
loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lƣợng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng
khối lƣợng biofilm, 97% là nƣớc, 3-6% còn lại là các hợp chất polymer ngoại bào
(EPS) và ion [13].
1.3.1.1. Các hợp chất ngoại bào
Các hợp chất ngoại bào thƣờng có ở vi khu n và vi khu n cổ, tảo và nấm
[79]. Đƣợc tiết ra bởi các vi sinh vật trong suốt quá tr nh sinh trƣởng hoặc ph n giải
tế bào, EPS gồm có các hợp chất hữu cơ nhƣ polysaccharide, protein, axit nucleic,
lipid, axit uronic và các đại phân tử sinh học khác [18], [79]. Sau nƣớc,

4


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

polysaccharide và protein là các thành phần chính của EPS và rất khác nhau về
thành phần, cấu trúc, tính chất [35].
Phần lớn các polysaccharide của EPS là polyanion bởi sự có mặt của cả axit

uronic (v dụ nhƣ D - glucuronic, D - galacturonic, và axit mannuronic)và liên kết
ceton của pyruvate [74]. Ở những protein ngoại bào, nhiều axit amin khác nhau
mang điện t ch m. Có nhiều nhóm chức hóa học nhƣ carboxyl, phosphate, sulfate
trong các axit amin [79]. T nh chất này rất quan trọng bởi nó cho ph p các ph n tử
polysaccarit ngoại bào li n kết đƣợc với các ion dƣơng hóa trị II nhƣ Ca2+ và Mg2+.
Từ đó h nh thành li n kết ch o giữa các sợi polymer và tạo ra lực li n kết lớn hơn
trong cấu trúc màng sinh vật. Trong trƣờng hợp của một số vi khu n gram dƣơng
nhƣ Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lƣới ngoại bào có thể hoàn toàn
khác nhau và gồm chủ yếu là các ion dƣơng.
Sutherland đã ghi nhận hai thuộc t nh quan trọng của mạng lƣới ngoại bào.
Thứ nhất, thành phần và cấu trúc của các polysaccarit xác định cấu tạo ch nh của
mạng lƣới ngoại bào. V dụ, cấu trúc bộ khung của mạng lƣới ngoại bào ở nhiều vi
khu n chứa nhiều li n kết 1,3 hoặc 1,4-β-D-fructan và có xu hƣớng làm cho nó
cứng chắc hơn, t bị biến dạng và trong một số trƣờng hợp trở n n k m hòa tan hoặc
không hòa tan. Các li n kết khác trong ph n tử polysaccarit nhƣ li n kết 1,2 hoặc
1,6- β -D-glucan giúp cấu trúc mạng lƣới ngoại bào trở n n linh hoạt hơn. Thứ hai,
mạng lƣới ngoại bào của màng sinh vật thƣờng không đồng nhất, có thể thay đổi
theo không gian và thời gian [74].
Leriche và cộng sự [53] đã sử dụng liên kết đặc hiệu của lectin với một loại
đƣờng đơn để đánh giá sự phát triển của màng sinh vật ở các vi sinh vật khác nhau.
Kết quả nghiên cứu cho thấy các sinh vật khác nhau sản xuất một lƣợng chất ngoại
bào khác nhau và lƣợng chất ngoại bào này tăng l n theo thời gian. EPS có thể liên
kết với các ion kim loại, các cation hóa trị hai hay các đại ph n tử khác nhƣ protein,
ADN, lipid…[36]. Điều kiện dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy cũng đƣợc chứng
minh là có ảnh hƣởng đến sự sản xuất chất ngoại bào. Nghiên cứu cho thấy sự dƣ
thừa nguồn carbon sẵn có và sự thiếu hụt hàm lƣợng nitơ, kali, photpho trong môi
trƣờng nuôi cấy đã thúc đ y quá trình tổng hợp EPS [74].
EPS cung cấp thành phần gel ngậm nƣớc cao mà nhờ đó các tế bào vi sinh
vật có thể thiết lập những liên kết hiệp đồng bền vững. Sự t ch nƣớc trong mạng

5


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

lƣới chất ngoại bào là rất lớn, do đó nó ngăn chặn sự khô hạn của màng sinh vật
trong tự nhiên. Toàn bộ sự gắn kết và bám d nh cũng nhƣ h nh thái, cấu trúc, chức
năng sinh học và những đặc t nh khác nhƣ cơ chế ổn định, sự lan truyền, sự thấm
hút bề mặt và những đặc tính quang học của vi khu n đƣợc quyết định bởi EPS, nhờ
vậy các sinh vật tạo màng chống lại tác nhân bất lợi từ môi trƣờng.
Mạng lƣới chất ngoại bào cũng góp phần vào đặc t nh kháng kháng sinh của
màng sinh vật bằng cách cản trở sự vận chuyển lƣợng chất kháng sinh qua màng và
nguy n lý có thể thông qua việc liên kết trực tiếp với các chất này [34].
Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS [37].
Chức năng của
hợp chất ngoại bào

Thành phần của EPS

Chức năng trong biofilm

Polysaccharide trung tính
Cấu trúc

Cấu tạo nên biofilm
Hợp chất dạng tinh bột

Kênh dẫn

Hoạt hóa

Polysaccharide t ch điện hoặc
kị nƣớc

Kênh dẫn ion, kênh dẫn nƣớc

Các enzym ngoại bào

Phân hủy các hợp chất hữu cơ

Chất lƣỡng cực

Tƣơng tác bề mặt

Màng bao

Xuất bào, kênh dẫn nƣớc

Lectin

Đặc trƣng, nhận dạng

Axit nucleic

Thông tin di truyền, cấu trúc

Hoạt hóa bề mặt

Thông tin di truyền

Hoạt hóa quá trình Hợp chất hữu cơ chịu nhiệt
oxy hóa khử
của vi khu n
Chất dinh dƣỡng

Thu nhận electron
Nguồn cung cấp cacbon, nitơ,

Các loại polymer

photpho

1.3.1.2. Lông, roi, tiêm mao và các phân tử bám dính
Cơ sở phân tử nào mà các tế bào có thể bám để tạo thành màng biofilm và
các cơ chế phân tử nào quyết định tính ổn định của biofilm còn chƣa đƣợc sáng tỏ.

6


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

Sự phức tạp này là do có nhiều yếu tố cấu thành nên biofilm nhƣ EPS, ADN,
protein, lông, roi, tiêm mao…
Các polysaccharide ngoại bào đƣợc tổng hợp để gắn kết vi khu n và kết nối
chúng trên bề mặt nhƣng bằng chứng thực nghiệm đã chứng tỏ rằng những protein
nhƣ protein ngoài màng, lông, các enzyme cần thiết cho giai đoạn đầu của sự gắn vi
khu n lên bề mặt
Chức năng ch nh của lông, roi trong sự h nh thành màng sinh vật là giúp cho

vi sinh vật di chuyển trong môi trƣờng nƣớc tốt hơn, tạo n n những tƣơng tác ban
đầu giữa bề mặt và tế bào.
De Flaun, De Weger cùng các cộng sự [29], [31] đã chứng minh sự thiếu
vắng của lông roi làm suy giảm khả năng x m nhiễm của Pseudomonas fluorescens
l n rễ c y khoai t y, lúa m và làm giảm độ bám d nh tế bào của P. aeruginosa và P.
fluorescens l n bề mặt polystyrene [63]. Tƣơng tự, nghi n cứu tr n các chủng
Vibrio cholerae và Escherichia coli đột biến thiếu lông roi đã cho thấy không có sự
h nh thành màng sinh vật nhƣ ở các dạng hoang dại của chúng vẫn thực hiện tr n bề
mặt nhựa polyvinylchloride (PVC) [77].
Ti m mao và các ph n tử bám d nh li n kết với ti m mao cũng có vai trò
quan trọng trong sự bám d nh và x m nhiễm bề mặt. Nghi n cứu của Schmoll và
cộng sự [71] tr n chủng vi khu n g y bệnh E. coli cho thấy biểu hiện của gen sfaA,
một gen mã hóa cho các ph n tử bám d nh ti m mao, đƣợc điều hòa tăng cƣờng khi
có sự tiếp xúc của vi khu n với bề mặt. Ở E. coli, khả năng bám d nh bề mặt giảm
đi khi có sự đột biến ở gen sinh tổng hợp csgA và gen sinh tổng hợp ti m mao type I
fim H, một loại ti m mao chứa các ph n tử đặc hiệu với mannose [66]. Tƣơng tự,
đột biến gen tổng hợp ti m mao hemagglutinin có độ nhạy cao với mannose ở V.
cholerae cũng làm giảm độ bám d nh bề mặt [76].
Nhƣ vậy, có thể nói rằng các loài vi sinh vật có lông roi và ti m mao cũng sẽ
có ƣu thế hơn trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định - nơi có điều
kiện thuận lợi cho việc h nh thành màng sinh vật, đồng thời giúp cho việc bám d nh
ban đầu của tế bào với bề mặt tốt hơn [33].

7


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

1.3.2. Cấu trúc của biofilm
Tolker-Nielsen và Molin chỉ ra rằng mỗi cộng đồng vi khu n tạo màng là
duy nhất [76] mặc dù một vài cấu trúc tạo nên có thể không tƣơng đồng. Theo cách
hiểu đó, thuật ngữ biofilm đã bị nhầm lẫn vì biofilm không phải là một lớp chất cặn
liên tục trên bề mặt. Thay vào đó, các biofilm rất không đồng dạng, gồm có các vi
khu n lạc của các tế bào vi khu n đƣợc bọc trong một màng EPS và tách riêng với
các vi khu n lạc khác bởi các kênh dẫn truyền nƣớc [54]. H nh 1 cho thấy biofilm
của Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia và Flavobacterium spp. hình
thành trên một bề mặt bằng thép trong hệ thống nƣớc sạch của phòng thí nghiệm.
Hình 1 mô tả một cách rõ ràng các k nh nƣớc và t nh không đồng nhất của một
biofilm với sự tham gia của các vi sinh vật khác nhau.
.

Hình 1. Màng sinh vật của Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia và
Flavobacterium spp. trên bề mặt thép không gỉ [32]
Mạng lƣới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh
dẫn truyền nƣớc bên trong màng sinh vật. Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch,
nƣớc có thể lƣu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dƣỡng
đƣợc khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng, đồng thời loại đi
những chất thải không cần thiết .
Các sinh vật tạo biofilm cũng có thể có ảnh hƣởng rõ rệt đến cấu trúc
biofilm. Jame và cộng sự [46] cho rằng độ dày của biofilm có thể bị ảnh hƣởng
bởi số lƣợng sinh vật cấu thành. Trong môi trƣờng tinh khiết, màng sinh vật của

8


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

P. aeruginosa và K. pneumoniae có thể dày từ 15 – 30 μm. Trong khi đó, màng
sinh vật của cùng một loài th dày 40 μm.
Cấu trúc biofilm không đồng nhất cả về không gian và thời gian. Nó liên tục
thay đổi bởi các quá trình xảy ra ở cả bên trong và ngoài màng. Tolker – Nielsen và
cộng sự đã nghi n cứu vai trò của các tế bào chuyển động trong cấu trúc biofilm
trong dòng tế bào bằng cách kiểm tra sự tƣơng tác của P. aeruginosa và P. putida
trên kính hiển vi laser quét. Khi bổ sung 2 chủng này vào dòng tế bào, mỗi vi khu n
ban đầu tạo thành các vi khu n lạc. Theo thời gian, các khu n lạc có sự xâm lấn vào
nhau. Từ cấu trúc nhỏ gọn của vi khu n lạc biến đổi sang cấu trúc lỏng lẻo hơn,
ngƣời ta quan sát thấy các tế bào bên trong khu n lạc đang chuyển động. Sự chuyển
động cuối cùng dẫn đến sự phân tán khu n lạc, phá vỡ cấu trúc biofilm [75].
1.4. Quá trình hình thành màng sinh vật
1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành màng sinh vật
Mặt phân cách rắn – lỏng giữa một bề mặt và một môi trƣờng lỏng (nhƣ
nƣớc, máu) tạo một môi trƣờng lý tƣởng cho sự gắn và phát triển của các vi sinh
vật. Sự gắn kết không thể diễn ra nếu không xem xét tới ảnh hƣởng của giá thể, đặc
tính của môi trƣờng lỏng và tính chất của tế bào.
Ảnh hưởng của giá thể
Bề mặt rắn có thể có vài đặc điểm quan trọng trong quá trình gắn.
Characklis đã lƣu ý rằng mức độ quần tụ của vi khu n tăng khi độ thô ráp của bề
mặt tăng. Điều này đƣợc giải th ch là do ở bề mặt thô nhám, lực tƣơng tác giữa
các tế bào với bề mặt giảm đi và diện t ch tiếp xúc đƣợc tăng l n đáng kể so với
các bề mặt trơn nhẵn [22].
Tính chất hóa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến tốc độ và
mức độ bám d nh của tế bào l n bề mặt. Hầu hết các nghi n cứu cho thấy rằng các
vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nƣớc, không ph n cực nhƣ teflon và nhựa
nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt một vật liệu ƣa nƣớc nhƣ thủy tinh hay kim loại.
Ngay cả khi những kết quả nghi n cứu vào các thời điểm khác nhau có m u thuẫn
v không tồn tại một phƣơng pháp chu n nào để xác định bề mặt kỵ nƣớc [19], [40].

9


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

Đặc tính của môi trường lỏng
Các đặc tính của môi trƣờng lỏng nhƣ pH, mức độ dinh dƣỡng, nồng độc ion,
nhiệt độ đóng vai trò quan trọng ảnh hƣởng đến tỷ lệ các vi sinh vật gắn vào giá thể.
Lớp gang ở bên trong của ống dẫn nƣớc bị thôi ra theo thời gian và điều kiện
nhiệt độ. Tỷ lệ hình thành màng sinh vật li n quan đến ảnh hƣởng của mùa và tốc
độ của dòng chảy. Nhiệt độ nƣớc ở các mùa là khác nhau. Tỷ lệ hình thành màng
sinh vật cao nhất xảy ra ở điều kiện nƣớc ấm (từ 15 – 250C) [32]
Fletcher và cộng sự [38], [39] cũng đã chứng minh sự gia tăng nồng độ của
một số cation (Na+, Ca2+, Fe3+, La+) ảnh hƣởng đến khả năng bám d nh của chủng
Pseudomonas fluorescens l n bề mặt thủy tinh, bằng cách làm giảm lực tƣơng tác
giữa các tế bào vi khu n với bề mặt k nh. Nghi n cứu của Cowan và cộng sự cho
thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dƣỡng tỷ lệ thuận với số lƣợng gắn kết của các tế
bào vi khu n l n bề mặt [26].
Tính chất của tế bào
Tính chất kỵ nƣớc của tế bào bề mặt, lông nhung, lông roi và EPS đều ảnh
hƣởng tới tốc độ gắn của các tế bào vi sinh vật.
Tính kỵ nƣớc của tế bào bề mặt quan trọng cho khả năng bám d nh bởi các
liên kết kỵ nƣớc có xu hƣớng tăng với một đầu không phân cực của một hoặc hai
phía của màng sinh vật. Hầu hết vi khu n đều mang điện t ch m nhƣng vẫn có các
thành phần kỵ nƣớc trên bề mặt. Lông nhung, một thành phần phụ của tế bào, cũng
tạo nên tính kỵ nƣớc của tế bào bề mặt. Hầu hết các lông nhung đều có tỷ lệ các axit
amin kỵ nƣớc [47]. Lông nhung đóng vai trò quan trọng trong tính kỵ nƣớc và khả

năng gắn của tế bào bề mặt. Một số vi khu n dƣới nƣớc có mang lông nhung cũng
đã đƣợc chứng minh là có liên quan tới việc bám của các vi khu n này vào các tế
bào động vật [23].
Những vi sinh vật có lông roi, lông nhung sẽ giúp cho việc di chuyển trong
môi trƣờng nƣớc tốt hơn n n có hiệu quả tạo biofilm cao hơn. Th nghiệm so sánh
giữa hai Pseudomonas fluorescens cho thấy chủng di động có khả năng h nh thành
biofilm nhanh hơn so với chủng không di động [49]. Đối với loài có lông roi, lông
nhung cúng sẽ có ƣu thế trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định nơi

10


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

có điều kiện thuận lợi cho việc h nh thành biofilm đồng thời giúp cho việc bám d nh
ban đầu của tế bào với bề mặt.
Tuy nhi n một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhƣng vẫn có khả năng
h nh thành biofilm mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp sẵn các chất ngoại bào nhƣ
lipopolysaccharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp (capsule), màng nhày
(slime) hay lớp cơ chất bao quanh tế bào [1]. Đặc t nh này tạo t nh tự kết d nh kết
d nh cho tế bào và chủ yếu có những loài vi sinh vật g y bệnh nhƣ Streptococcus
mutans, Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Bacillus anthracis [11].
1.4.2. Các giai đoạn của quá trình hình thành màng sinh vật
Sự hình thành màng sinh vật là một quá trình phát triển mà vi khu n chuyển
từ trạng thái động đơn bào sang một trạng thái tĩnh đa bào. Ở đó, sự sinh trƣởng,
phát triển của vi khu n có những đặc trƣng ri ng. Kết quả nghi n cứu sự h nh thành
biofilm ở nhiều loài vi khu n khác nhau cho ph p đƣa ra một mô h nh giả thuyết
chung về quá tr nh h nh thành biofilm. Mô h nh giả thiết cũng đƣợc điều chỉnh để

phù hợp với cả hai dạng sống cơ bản của vi sinh vật là di động và không di động.
Dựa tr n các phƣơng pháp ph n t ch di truyền học, proteomic và sinh học
phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà
khoa học đã đƣa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [25]. Trong mô hình
này, vi khu n hình thành nên các vi khu n lạc và đƣợc bao quanh bởi một mạng
lƣới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự
đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên
những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó, dịch tế bào
có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh
dƣỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng nhƣ loại bỏ các chất thải [73].

11


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

Hình 2. Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [27].
1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2. Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3. Hình
thành mạng lƣới ngoại bào, 4. Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời
Sự tạo thành màng sinh vật, đƣợc mô tả ở hình 2, cũng giống nhƣ một quá
trình phát triển của vi sinh vật và cần phải trải qua một số bƣớc bao gồm: sự gắn
kết của các tế bào vi sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trƣởng và liên
kết các tế bào thành vi khu n lạc, sự tạo thành màng sinh vật trƣởng thành (hoàn
chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch
lỏng tế bào.
Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch
Màng sinh vật đƣợc bắt đầu hình thành khi các vi khu n cảm nhận đƣợc sự
thay đổi của điều kiện môi trƣờng gây ra sự di chuyển lên bề mặt. Những tín hiệu từ

môi trƣờng là rất khác nhau đối với từng loài vi khu n. P. aeruginosa và P.
fluorescens sẽ tạo thành biofilm dƣới mọi điều kiện mà chúng sinh trƣởng đƣợc
[64]. Một số chủng Escherichia coli K- 12 và Vibrio cholerae sẽ không tạo thành
biofilm ở môi trƣờng tối thiểu trừ khi đƣợc cung cấp th m các axit amin [66], [77].
Ngoài các yếu tố về dinh dƣỡng của môi trƣờng, các yếu tố khác nhƣ nhiệt độ, pH,
oxy, ion kim loại…cũng ảnh hƣởng tới sự h nh thành màng sinh vật.
Trƣớc khi vi sinh vật bám dính lên bề mặt, các phân tử hữu cơ, protein,
glycoprotein đã tiếp xúc và hình thành nên một màng điều kiện, đó là một khu vực
giàu dinh dƣỡng giúp thuận lợi cho sự trao đổi chất của các tế bào vi sinh vật [16].
Các bề mặt trong môi trƣờng thủy sinh thƣờng đạt đƣợc điều kiện cho sự hấp thụ

12


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

của các chất vô cơ và hữu cơ. Dƣới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính
lý hóa, các vi khu n có thể di chuyển hƣớng đến bề mặt bởi chuyển động Brown
hay hóa ứng động và hình thành mối tƣơng tác tạm thời với bề mặt thông qua các
lực tƣơng tác yếu nhƣ lực Van der Waals, lực hút tĩnh điện, liên kết hydro. Nhờ khả
năng di chuyển độc lập bằng co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao cũng nhƣ khả
năng tiết các chất ngoại bào đã giúp cho các tế bào riêng rẽ đƣợc bao bọc trong một
mạng lƣới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [64].
Tuy nhiên sự liên kết các tế bào này chƣa thật sự chặt chẽ do đó giai đoạn
đầu hình thành màng sinh vật một số tế bào có thể tách rời khỏi bề mặt để tiếp tục
đời sống tự do riêng lẻ. Armitage trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra rằng vi khu n
Rhodobacter sphaeroides không hoạt động ri ng lẻ để tạo h nh dạng màng sinh vật
nhƣ các một số loài mà chúng có thể tập hợp lại trong những chuỗi dài giúp khởi

động sự tạo thành màng ở những giai đoạn đầu [47].
Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch
Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không
những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trƣởng để hình thành
một màng sinh vật hoàn chỉnh. Vì vậy, giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất
ngoại bào nhằm làm tăng t nh bám d nh ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa
tế bào và giá thể. Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn
bám dính không thuận nghịch đƣợc thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi
bám dính. Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi đƣợc đánh giá là
quan trọng trong bƣớc đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận
động co rút đƣợc chỉ ra là cần thiết cho sự trƣởng thành của màng sinh vật trong
điều kiện tĩnh.
Cụ thể, nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khu n lạc trong
màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tƣơng tác giữa các vi khu n với
bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào, qua đó giúp tăng cƣờng mức độ bám
dính với bề mặt [64].
Giai đoạn 3: Hình thành mạng lƣới ngoại bào
Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục đƣợc tạo ra bởi các tế bào để liên
kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi
khu n lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể

13


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trƣờng. Kết quả là mật độ tế bào trong một
màng sinh vật cũng nhƣ lƣợng các polymer ngoại bào tạo ra tăng l n. Một mạng

lƣới màng sinh vật dần đƣợc hình thành [73].
Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh
Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình
trƣởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia của
các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào
ph n chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi
khu n lạc hay các cụm tế bào. Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về
không gian cũng nhƣ độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Một biofilm
hoàn chỉnh có cấu trúc giống nhƣ tháp h nh nấm đƣợc bao quanh bởi các kênh vận
chuyển nƣớc có tính th m thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh
dƣỡng và oxy vào b n trong biofillm cũng đƣợc quan sát. Các biofilm phát triển khá
chậm thƣờng cần vài ngày để đạt đƣợc cấu trúc hoàn chỉnh. Một biofilm trƣởng
thành đƣợc coi nhƣ một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi
trƣờng bao quanh, điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trƣờng bất lợi vi
khu n có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trƣờng mới phù hợp hơn [41].
Màng hoàn chỉnh là một cấu trúc phức tạp không đồng nhất của các khu n
lạc ƣu thể và hoạt động sinh trƣởng mạnh cùng với các ezyme, các sản ph m bài tiết
và các kênh nhỏ tạo thành một phần của cấu trúc tổng thể. Trong những trƣờng hợp
nhất định, biofilm sẽ tạo thành dạng cột nhƣ đƣợc nhìn thấy ở hình 3. Vi khu n
chuyển động hóa ứng động và sử dụng tín hiệu cảm biến để kết nối thông tin với
nhau. Các loài khác nhau sử dụng các phân tử khác nhau cho sự kết nối này. Cũng
có những bằng chứng cho thấy các khu n lạc ở gần bề mặt màng sinh vật hoạt động
khác với những khu n lạc khác trong màng. Điều đó chỉ ra rằng, các khu n lạc bị
đột biến mất khả năng cảm biến hoặc chuyển động hóa ứng động không tốt sẽ mất
cấu trúc màng [47].

14


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

Hình 3. Các giai đoạn của sự tạo thành biofilm [47].
Khu vực ngoài màng sinh vật thƣờng tập trung nhiều oxy hơn vùng bên trong
hoàn toàn kỵ khí. Điều đó cho thấy, hoạt động trao đổi chất của vi khu n ở ngoài
màng cao hơn những vùng nhiều chất dinh dƣỡng ở trong màng (gần hoặc tiếp xúc
với dòng chất lỏng). Nhƣng số lƣợng vi khu n trong khu vực này thì khá nhỏ.
Ngƣợc lại, phần lớn vi khu n nằm b n trong màng đƣợc tìm thấy thƣờng hƣớng về
khu vực phía trong và không hoạt động (hình 4).

Hình 4. Hoạt động trao đổi chất bên trong biofilm [47].
Giai đoạn 5: Tách rời
Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dƣỡng
của môi trƣờng nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các
phân tử này đƣợc giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dƣỡng, sự
tích tụ các sản ph m độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn
cung cấp cacbon, oxy. Trong một số trƣờng hợp, khi màng sinh vật đạt đến khối

15


Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

lƣợng và một mức cân bằng động tối đa th các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và
cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khu n lạc [62].
Một phần của hƣớng nghiên cứu về biofilm là tìm hiểu cơ chế của quá trình
tách rời. Một trong những tín hiệu của quá trình này là hiện tƣợng đói của tế bào, dù

vậy vấn đề này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ. Boyd và Chakrabarty cho rằng
enzyme lyase ph n giải alginate có thể đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn tách
rời của P. aeruginosa [10]. Họ đã cho thấy sự biểu hiện quá mức của enzyme phân
giải alginate có thể tăng tốc độ tách rời và làm bong các tế bào ra khỏi biofilm [19].
Một nghi n cứu của Allison và cộng sự đã chỉ ra rằng màng sinh vật của P.
fluorescens giảm khi giai đoạn ủ đƣợc k o dài và điều đó có thể là mất EPS [15].
1. 5. Vai trò của màng sinh vật
1.5.1. Vai trò của việc hình thành biofilm với vi sinh vật
Biofilm đƣợc h nh thành và xem nhƣ là một hình thức tồn tại phổ biến của
nhiều loài vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên bởi nó đem lại những lợi ích nhất
định cho sự tồn tại và phát triển của chính bản thân vi sinh vật.
1.5.1. 1. Bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lợi của môi trường
Các tế bào phải trải qua một số các thay đổi về h nh thái, đặc tính sinh lý
khi chuyển sang dạng biofilm và một trong những thay đổi quan trọng là việc
hình thành mạng lƣới các chất ngoại bào bao quanh. Mạng lƣới này giúp giữ lại
chất hữu cơ không hòa tan từ môi trƣờng nƣớc xung quanh tạo điều kiện cho vi
sinh vật sinh trƣởng, phát triển và mở rộng biofilm. Đồng thời nó cũng có vai
trò trong việc kiến tạo cấu trúc không gian 3 chiều đặc trƣng cho biofilm bằng
cách tạo nên một mức độ ổn định, một sự cân bằng nội môi cho các vi sinh vật
sinh sống trong biofilm [78].
Bên cạnh đó một vai trò quan trọng của mạng lƣới ngoại bào là đem lại khả
năng chống lại các tác nhân kháng khu n cho các tế bào sinh sống trong biofilm.
Theo Flemming vi khu n sống trong một biofilm có thể có khả năng kháng đối với
các tác nhân gây hại (chất kháng sinh, chất hoạt động bề mặt...) cao gấp 1000 lần so
với tế bào sống trôi nổi [35].
Mạng lƣới các hợp chất ngoại bào cũng đƣợc ghi nhận có khả năng giúp tế
bào chống lại tác động của kim loại nặng, các ion và chất độc, giúp tế bào tránh

16

Luận văn Thạc sỹ Sinh học

Nguyễn Thị Giang

khỏi rất nhiều yếu tố stress từ môi trƣờng nhƣ tia UV, pH, sốc th m thấu và sự khô
hạn [35].
1.5.1.2. Tận dụng nguồn dinh dưỡng của môi trường
Những kênh vận chuyển nƣớc nằm xen kẽ trong cấu trúc biofilm giữa các
vùng bao quanh vi khu n lạc đƣợc v nhƣ là một hệ thống tuần hoàn nguyên thủy.
Chúng hoạt động hiệu quả trong quá tr nh trao đổi chất với môi trƣờng xung quanh,
do đó làm tăng hiệu quả trong việc sử dụng nguồn dinh dƣỡng cũng nhƣ loại bỏ các
sản ph m chuyển hóa có khả năng g y độc hại. Nhờ vậy quá trình chuyển hóa trong
biofilm cũng mang những đặc trƣng khác so với dạng sống tự do [14].
Mặt khác biofilm đƣợc hình thành giúp vi sinh vật tận dụng đƣợc nguồn chất
hữu cơ bám d nh tr n bề mặt giá thể cũng nhƣ các cơ chất, chất dinh dƣỡng tạo ra từ
các loài vi sinh vật khác sống chung.
1.5.1.3. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài
Một biofilm có thể đƣợc hình thành do sự hợp tác cùng chung sống của
nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu trúc không gian phức tạp. Các
loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về dinh
dƣỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong biofilm. Chẳng hạn
nhƣ những vi sinh vật nằm phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí cao
trong khi những loài nằm ph a trung t m biofilm có xu hƣớng chịu đƣợc nồng độ
oxy thấp (vi hiếu khí).
Khả năng th ch nghi với nhiều điều kiện dinh dƣỡng khác nhau giúp các loài
vi sinh vật trong biofilm tận dụng đƣợc nguồn dinh dƣỡng từ môi trƣờng đồng thời
hỗ trợ lẫn nhau theo hƣớng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất.
Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm cũng có ảnh hƣởng lớn đến
chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên. Hầu hết các quá trình trong tự

nhi n đòi hỏi sự phối hợp của nhiều nhóm vi khu n có cơ chế trao đổi chất khác
nhau để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều
nhóm khác nhau cùng cƣ trú trong biofilm sẽ góp phần thúc đ y các quá trình này
diễn ra nhanh hơn [39].
1.5.1.4. Trao đổi vật chất di truyền
Quá trình truyền gen ngang (horizontal gene transfer) đóng vai trò quan
trọng trong việc thúc đ y sự tiến hóa của các cộng đồng vi sinh vật. Trong đó cơ

17