Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV

Header Page 1 of 132.

a

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THANH NGA

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU
(CITRULUS LANATUS THUMB.)
CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH
VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015

Footer Page 1 of 132.


Header Page 2 of 132.

b

VIỆN
VIỆN HÀN
HÀN LÂM
LÂM KHOA
KHOA HỌC

HỌC VÀ
VÀ CÔNG
CÔNG NGHỆ
NGHỆ VIỆT
VIỆT NAM
NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn
Nguyễn Thị
Thị Thanh
Thanh Nga
Nga

NGHIÊN
NGHIÊN CỨU
CỨU TẠO
TẠO DÒNG
DÒNG CÂY
CÂY DƢA
DƢA HẤU
HẤU
(CITRULUS
LANATUS
THUMB.)
(CITRULUS LANATUS THUMB.)
CHUYỂN
CHUYỂN GEN
GEN KHÁNG

KHÁNG BỆNH
BỆNH
VIRUS
ĐỐM
VÒNG
PRSV
VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV
Chuyên
Chuyênngành:
ngành:DiDitruyền
truyềnhọc
học
Mã
Mãsố:
số:6262424201012121

LUẬN
LUẬN ÁN
ÁN TIẾN
TIẾN SỸ
SỸ SINH
SINH HỌC
HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học

HÀ NỘI, 2015
HÀ NỘI, 2015

Footer Page 2 of 132.


Header Page 3 of 132.

i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, GS.TS. Lê Trần Bình đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Tường
Vân, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Phạm Thị Vân cùng tập thể cán
bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện
làm việc, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong
suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng
và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình học tập và bảo vệ luận án.
Tôi xin cảm ơn Trại Sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế, Viện Công nghệ Sinh học đã
hỗ trợ tôi trong việc trồng cây thu hạt giống trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, Ban Chủ
nhiệm Khoa Nông – Lâm cùng các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi,
giúp đỡ để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình,
bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Nga

Footer Page 3 of 132.


Header Page 4 of 132.

ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án
là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng
ý và cho phép của các đồng tác giả.
Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Nga

Footer Page 4 of 132.


Header Page 5 of 132.

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………….. 4
1.1. Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu…………………………... 4
1.1.1. Cây dưa hấu……………………………………………………………..

4

1.1.2. Các loại bệnh hại dưa hấu………………………………………..……... 10
1.1.3. Bệnh virus hại dưa hấu………………………………………….………

11

1.2. PRSV và PRSV gây hại trên dưa hấu……………………..……………... 13
1.2.1. Phân loại ………………………………………………………………..

13

1.2.2. Cấu trúc…………………………………………………………………. 14
1.2.3. Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh ……………………………………. 19
1.2.4. Biện pháp phòng trừ ……………………………………………………

20

1.2.5. PRSV gây bệnh trên dưa hấu…………………………………………… 20
1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus…..

21

1.3.1. Kỹ thuật RNAi………………………………………………………….. 21
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus……………..

26

1.3.3. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp……………………... 28
1.3.4. Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu ……... 29

Footer Page 5 of 132.


Header Page 6 of 132.

iv

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….

31

2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu…………………………………………….. 31
2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………………… 31
2.1.2. Chủng vi sinh vật, vector……………………………………………….. 31
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tư…………………………………………………

32

2.1.4. Hóa chất………………………………………………………………… 33

2.1.5. Địa điểm………………………………………………………………… 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………….

33

2.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu……………………….

34

2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào
cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ……………………………………….

39

2.2.3. Chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu…………………… 44
2.2.4. Phân tích cây chuyển gen kháng PRSV.................................................... 45
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………… 49
3.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu ………………………………… 49
3.1.1. Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi …………………………………… 49
3.1.2. Kết quả kích thích kéo dài chồi…………………………………………

54

3.1.3. Kết quả tạo rễ cho chồi …………………………………………………

55

3.1.4. Ảnh hưởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro…

56

3.1.5. Tổng kết quy trình tái sinh ……………………………………………..

58

3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen
vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………...… 59
3.2.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất

Footer Page 6 of 132.


Header Page 7 of 132.

v

chọn lọc Km.......................................................................................................

59

3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen....... 60
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen................... 61
3.2.4. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu …………………………………

63

3.2.5. Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ……………………….

65

3.2.6. Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu................................................. 67
3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu............................................

68

3.4. Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của
các dòng cây chuyển gen ...................................................................................

69

3.4.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen T0..................................................... 69
3.4.2. Phân tích các dòng cây chuyển gen T1..................................................... 79
Chƣơng 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU….……………………. 83
4.1. Khả năng nuôi cấy in vitro cây dưa hấu……………………………….….

83

4.2. Khả năng chuyển gen ở dưa hấu…………………………………….……. 86
4.3. Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dưa hấu………………………...

90

4.4. Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung.............

94

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................................

96

1. KẾT LUẬN....................................................................................................

96

2. ĐỀ NGHỊ........................................................................................................ 97
SUMMARY....................................................................................................... 98
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Footer Page 7 of 132.


Header Page 8 of 132.

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Footer Page 8 of 132.

ADN

Axit Deoxyribonucleic

ARN

Axit Ribonucleic

BAP

6 - Benzyl Amino Purin

IAA

Indol - 3 - Axetic Axit

IBA

3 - Indol Butyric Axit

NAA

α - Naptalen Axetic Axit

bp

Base pair

CP

Coat protein

Nib

Nuclear Inclusion Body protein

HC-Pro

Helper component-proteinase

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene diamine Tetra-acetic Acid

LB

Luria-Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction

RNAi

RNA interference

miRNA

microRNA

siRNA

small interfering RNA

mRNA

messenger RNA

dsRNA

double-stranded RNA

RISC

RNA-induced silencing complex

Taq

Thermus aquaticus


Header Page 9 of 132.

Footer Page 9 of 132.

vii

PRSV

Papaya ringspot virus

Km

kanamycin

Cefo

Cefotaxime

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

gus

beta-glucuronidase


Header Page 10 of 132.

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu……………………………

9

Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu …………..

10

Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP…

36

Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP,
NAA…………………………………………………………………………… 36
Bảng 2.3. Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi……………………...

37

Bảng 2.4. Nồng độ IBA sử dụng trên MT tạo rễ ……………………………..

37

Bảng 2.5. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro ………………..

38

Bảng 2.6. Các nồng độ Km sử dụng................................................................... 39
Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trường ........................................................ 40
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi………………………….

50

Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi…...

53

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có
kích thước < 1cm…………………………………………………….…….…..

54

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA và môi trường cơ bản đến khả năng tạo rễ của
chồi dưa hấu………………………………………………………………...…. 56
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trường..

58

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi.................... 60
Bảng 3.8. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu……………………………..

64

Bảng 3.9. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu............

67

Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu........ 69

Footer Page 10 of 132.


Header Page 11 of 132.

ix

Bảng 3.11. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu..........

72

Bảng 3.12. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/CpNib-HCpro thế hệ T0 và WT ............................................................................

75

Bảng 3.13. Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1..... 80
Bảng 3.14. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/CpNib-HCpro thế hệ T1 và cây WT.......................................................................

Footer Page 11 of 132.

82


Header Page 12 of 132.

x

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của PRSV………………………………………………….

15

Hình 1.2. Bản đồ tổ chức genome của PRSV…………………………………. 15
Hình 1.3. Con đường tạo thành RNAi……………………………………….

25

Hình 2.1. Sơ đồ vector pCB-gusplus………………………………………….

31

Hình 2.1. Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro ……..…………….

32

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………………. 34
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm dưa hấu đến khả năng tái sinh chồi…... 50
Hình 3.2. Ảnh hưởng của vị trí trên lá mầm đến khả năng tái sinh chồi……… 50
Hình 3.3. Kết quả tái sinh chồi dưa hấu từ lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy………

52

Hình 3.4. Hình ảnh chồi có hình thái bất thường so với đối chứng…………… 52
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi.. 55
Hình 3.6. Kết quả tạo rễ cho chồi dưa hấu D2………………………………… 56
Hình 3.7. Kết quả thích ứng cây in vitro………………………………………

57

Hình 3.8. Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu………

59

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến biểu hiện gus............

61

Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus.................... 62
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus……….. 62

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến
biểu hiện Gus…………………………………………………………………..

63

Hình 3.13. Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dưa hấu....................................

65

Hình 3.14. Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dưa hấu chuyển gen.. ...

66

Footer Page 12 of 132.


Header Page 13 of 132.

xi

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen
nptII trên gel agarose 0,8%................................................................................. 67
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen T0
với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................................ 70
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu
PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%...........................................

71

Hình 3.18. Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro……….…

72

Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu
PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%...........................................

73

Hình 3.20. Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV…………………………………….. 74
Hình 3.21. Các mức độ biểu hiện bệnh ở lá dưa hấu chuyển gen......................

76

Hình 3.22. Một số hình ảnh về tính kháng bệnh PRSV của các dòng dưa hấu
chuyển gen.......................................................................................................... 78
Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen D2.7
thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................

79

Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen L2.3
thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................

Footer Page 13 of 132.

80


Header Page 14 of 132.

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng có giá trị dinh
dưỡng và thương mại cao, được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,
trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nam Á, châu Phi, vùng biển
Caribê và miền Nam nước Mỹ. Trong quá trình sản xuất dưa hấu, cây rất dễ bị
nhiễm các bệnh do vi khuẩn, virus hay do nấm gây ra, ảnh hưởng nghiêm trọng đến
năng suất và chất lượng quả. Trong các nguyên nhân gây bệnh, virus là một trong
những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng dưa hấu.
Có hơn 10 loại virus gây bệnh khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó virus
đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W - PRSV-W) là một trong những
virus gây hại nặng nề nhất. Chiến lược kiểm soát virus chủ yếu dựa vào thuốc trừ
sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ để tiêu diệt cỏ
dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp này
chỉ có tác dụng phòng bệnh, khi cây đã bị nhiễm virus thì các phương pháp kiểm
soát trên không còn tác dụng. Biện pháp có hiệu quả nhất trong việc phòng và
chống bệnh virus hại thực vật nói chung là tạo ra các giống cây trồng kháng bệnh
virus. Tuy nhiên, các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus một cách tự
nhiên không nhiều. Các phương pháp chọn giống truyền thống cũng đã đạt được
một số thành công trong việc ứng dụng các nguồn gen thực vật có khả năng kháng
tự nhiên đối với virus vào việc lai tạo để tạo giống kháng virus, tuy nhiên hiệu quả
còn chưa cao. Tạo cây trồng chuyển gen mang gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ
chính virus tỏ ra thực sự có hiệu quả trong việc tạo tính kháng virus cho cây trồng.
Trong những năm gần đây, đã có những thành công trong việc tạo ra nhiều
loại cây trồng có khả năng kháng lại virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen thông
qua RNA interference (RNAi). Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách
chuyển đoạn gen đích có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense

Footer Page 14 of 132.


Header Page 15 of 132.

2

hoặc cấu trúc RNA kẹp tóc bổ sung với chính nó. Hiện nay, RNAi là kỹ thuật triển
vọng được nghiên cứu ứng dụng trong việc tạo tính kháng virus ở thực vật.
Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.) chuyển gen
kháng bệnh virus đốm vòng PRSV”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây dưa hấu Việt Nam.
- Tạo dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng với virus PRSV.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng
tái sinh in vitro các giống dưa hấu thu thập được.
3.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào các
giống dưa hấu dựa vào gen chỉ thị gus trong vector pCB-gusplus sử dụng phương
pháp Agrobacterium;
3.3. Chuyển gen kháng virus PRSV vào dưa hấu thông qua việc sử dụng
chủng Agrobacterium tumefaciens CV58C1 chứa vector pK7GWIW2(II)/CP-NibHCpro
3.4. Phân tích cây chuyển gen và đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt
Nam của các dòng cây chuyển gen thu được.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng thành công nguyên lý làm
câm gen RNAi và kỹ thuật chuyển gen ở thực vật để tạo được các dòng dưa hấu
kháng bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV gây ra. Khả năng kháng virus của dòng cây
chuyển gen đã được di truyền ổn định sang thế hệ T1.

Luận án đã đạt được các đóng góp cụ thể như sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh vào 4 giống dưa hấu.

Footer Page 15 of 132.


Header Page 16 of 132.

3

2. Đã tối ưu hóa được quy trình chuyển gen vào 2 giống dưa hấu nghiên cứu.
3. Chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro vào 2 giống dưa hấu
nghiên cứu nhằm tạo tính kháng đối với PRSV Việt Nam.
4. Đã tạo được 2 dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với
PRSV Việt Nam, khả năng kháng virus của 2 dòng cây chuyển gen này đã
được di truyền ổn định sang thế hệ T1.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này là cơ sở khoa học cho việc
nghiên cứu tái sinh invitro, chuyển gen vào các giống dưa hấu khác có nguồn gốc
Việt Nam.
Bên cạnh đó, kết quả luận án đã khẳng định khả năng tiếp nhận đoạn gen
chuyển trong chuyển gen của 2 giống dưa hấu nghiên cứu (D2 và L2), làm cơ sở để
chuyển các gen mục tiêu theo những mục đích khác vào 2 giống dưa hấu này như
chuyển gen làm tăng tính chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường, chuyển
gen kháng các virus khác,…
Các dòng dưa hấu chuyển gen mang cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro có khả
năng kháng với PRSV tạo được trong nghiên cứu này rất có triển vọng để làm giống
hoặc lai tạo giống mới theo mục đích tạo giống kháng với PRSV.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 138 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 26

trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17 trang, kết quả 33 trang, thảo luận 13
trang, kết luận 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo
19 trang với 159 tài liệu tham khảo, tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 3
trang. Trong luận án có 7 bảng và 21 hình.

Footer Page 16 of 132.


Header Page 17 of 132.

4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây dƣa hấu và bệnh hại dƣa hấu
1.1.1 Cây dƣa hấu
Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trọng thuộc họ bầu bí.
Quả dưa hấu có giá trị dinh dưỡng và thương mại cao, có thể dùng ăn trực tiếp, làm
salad, nước ép, kẹo và ăn hạt. Ở vùng sa mạc, người ta sử dụng dưa hấu như một
nguồn cung cấp nước cho cơ thể (Niao et al., 2005). Giá trị dinh dưỡng của dưa hấu
không chỉ bởi vị ngọt, mát của nó mà còn vì quả dưa hấu chứa một hàm lượng lớn
chất xơ, nhiều loại vitamin và khoáng chất, hạt dưa hấu rất giàu chất béo và protein
(Niao et al., 2005; Swain & Powell, 2004). Hiện nay, dưa hấu được trồng phổ biến ở
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông
Nam Á, Châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ (Niao et al., 2005;
Swain & Powell., 2004; Ellul et al., 2007).
1.1.1.1. Nguồn gốc
Dưa hấu có nguồn gốc từ sa mạc Kalahari ở Châu Phi. Năm 1857,
Livingstone (Nhà thám hiểm người Scotland thế kỷ 19, một trong những người đầu
tiên khám phá khu vực Châu Phi) đã quan sát thấy dưa hấu mọc tràn lan ở sa mạc

Kalahari và ngày nay người ta vẫn có thể tìm thấy những loài được coi là tổ tiên của
dưa hấu ở Châu Phi, được gọi là Tsamma melon (Swain & Powell, 2004).
Việc thu hoạch dưa hấu đã được mô tả trong chữ tượng hình ở các tòa nhà cổ
xưa của Ai Cập hơn 4000 năm trước, hạt giống dưa hấu cũng được tìm thấy trong
các lăng mộ của các Pharaoh Tutankhamen. Từ Ai Cập, dưa hấu lan rộng ra khắp
các nước dọc theo biển Địa Trung Hải theo các chuyến tàu chở hàng. Đến thế kỷ 10
dưa hấu đã được du nhập vào Trung Quốc – một trong những quốc gia sản xuất dưa
hấu lớn nhất thế giới hiện nay. Đến thế kỷ 13, dưa hấu được tìm thấy ở châu Âu và
thế kỷ 16, dưa hấu được tìm thấy ở châu Mỹ. Thuật ngữ “watermelon” lần đầu tiên

Footer Page 17 of 132.


Header Page 18 of 132.

5

được đề xuất bởi John Mariani vào năm 1615 trong từ điển thực phẩm và đồ uống
của Mỹ (Davis et al., 2004; Niao et al., 2005; Adrian, 2008). Ở Việt Nam, dưa hấu
được biết đến từ câu chuyện truyền thuyết Mai An Tiêm.
Citrullus colocynthis được xem là một trong những tổ tiên của dưa hấu hiện
nay. Loại dưa hấu này có quả nhỏ, đường kính tối đa là 7,5 cm, thịt quả màu trắng,
có vị đắng, hạt nhỏ có màu nâu. C. colocynthis là loại dưa hấu hoang dã được trồng
xen với sắn, ngô, khoai lang ở nhiều quốc gia ở miền Bắc và miền Đông của Châu
Phi như Ả rập, Nigieria, Ai cập, Iran, Namibia,… Tổ tiên của dưa hấu không có vị
ngọt, thậm chí đôi khi có vị đắng, thịt quả cứng và màu trắng giống như colocynthis
(Swain & Powell, 2004; Guner et al., 2004).
1.1.1.2. Phân loại
Dưa hấu thuộc:

Bộ Cucurbitales
Họ: Cucurbitaceae
Chi: Citrullus
Loài: C. lanatus, C. colocynthis, C. ecirrhorus và C. sp

Tên tiếng Anh: Watermelon.
Tên Trung Quốc: Tây Hoa.
1.1.1.3. Đặc điểm hình thái
Dưa hấu là cây thân leo, có bộ rễ lan xa nên dù ở vùng khô cằn cũng có thể
cho ra loại trái cây chứa đến 90% nước, làm cho dưa hấu trở thành nguồn hyđrat
hoá quan trọng ở những nơi khan hiếm nước.
Quả dưa hấu có vỏ cứng, là loại quả phổ biến và có giá trị quan trọng nhất
trong họ Bầu bí. Quả dưa hấu rất đa dạng về hình dạng và màu sắc. Màu sắc vỏ quả
dưa hấu cũng thay đổi từ màu xanh sáng đến xanh đậm, có hoặc không có sọc. Về
màu sắc thịt quả có màu đỏ, màu hồng, màu vàng, màu cam và màu trắng. Hạt dưa
hấu cũng rất đa dạng về kích cỡ (lớn, trung bình, nhỏ) và có màu đen, màu nâu và

Footer Page 18 of 132.


Header Page 19 of 132.

6

màu trắng. Về hình dạng, trên mặt phẳng cắt dọc, quả dưa hấu có các hình dạng
chính như sau: thuôn dài, oval và tròn.
Trong các loại dưa hấu, dưa hấu ruột đỏ, hạt đen là phổ biến nhất, tiếp theo là
dưa hấu ruột vàng, dưa hấu mini, dưa hấu không hạt. Mặc dù việc tạo ra dưa hấu
không phải ruột đỏ khó khăn hơn nhưng hiện nay chúng đã có mặt phổ biến trên thị
trường.

1.1.1.4. Đặc điểm sinh trƣởng phát triển
Dưa hấu là loại cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng, phát triển kéo dài trong điều
kiện thời tiết ấm áp, khô ráo và đầy đủ ánh nắng. Cây dưa hấu rất nhạy cảm với
nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của dưa hấu ở vào khoảng 25-30oC,
cho hoa nở và thụ phấn là 25oC, và cho quả lớn và chín là 30oC. Dưa hấu có rễ mọc
sâu, chịu úng kém, nhất là khi cây đã trổ bông và đậu quả. Khi bị úng, dưa hấu dễ bị
thối rễ, có thể dẫn đến cây bị chết hoặc khó trổ bông, thụ phấn và đậu quả, và khi đã
đậu quả thì lại dễ thối, chất lượng kém. Ẩm độ không khí cao dễ phát sinh bệnh.
Dưa hấu có thể trồng được trên nhiều loại đất, tuy nhiên đất phải thoát nước
tốt, cơ cấu nhẹ, tầng canh tác sâu, không quá phèn. Các vùng đất cát gần biển, đất
phù sa ven sông là những vùng đất lý tưởng để trồng dưa hấu. Đất cát pha có đặc
điểm là tơi xốp, nhiệt độ đất dễ tăng cao, dễ thoát nước rất có lợi cho bộ rễ dưa hấu
phát triển, chất lượng dưa tốt, tốn ít công chăm sóc. Nơi đất cao, thoáng, không bị
bóng râm che, không bị gió bão, pH trong khoảng 5 – 7 là thích hợp để trồng dưa
hấu.
Dưa hấu có thể được trồng quanh năm ở những vùng gần xích đạo. Ở Việt
Nam, dưa hấu được trồng quanh năm ở các tỉnh phía Nam, tập trung vào các vụ
chính như: vụ dưa noel (gieo hạt tháng 9), vụ dưa hấu tết (gieo hạt tháng 11), vụ
dưa hè thu (gieo trồng trong suốt mùa mưa),… Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng 2
vụ chính: vụ dưa hè thu (gieo hạt trong tháng 3) và vụ đông xuân (gieo hạt trong
tháng 10, một số tỉnh miền Núi phía Đông Bắc gieo hạt vào tháng 12).

Footer Page 19 of 132.


Header Page 20 of 132.

7

1.1.1.5. Tình hình sản xuất dƣa hấu

Năm 2012, trên thế giới có khoảng 34,7 triệu ha diện tích trồng dưa hấu, giảm
2,88% so với năm 2011 (35,7 triệu ha). Trung Quốc là nước sản xuất dưa hấu lớn
nhất với khoảng 18,2 triệu ha (51,2%), tiếp theo là Thổ Nhĩ Kỳ (165 nghìn ha), Iran
(145 nghìn ha), Liên bang Nga (125 nghìn ha), Brazil (95 nghìn ha), Ukrane (61
nghìn ha), Ai cập (57 nghìn ha), Mỹ (50 nghìn ha),… Năng suất dưa hấu năm 2012
đạt 30,34 tấn/ha, tăng 4,37% so với năm 2010 (29,07 tấn/ha), sản lượng đạt 105,4
triệu tấn, tăng 0,67% so với năm 2011 (104,5 triệu tấn). Trong đó, Trung Quốc sản
xuất 70,2 triệu tấn (chiếm 66,6% tổng sản lượng dưa hấu trên toàn thế giới), đứng
sau Trung Quốc là các quốc gia như Thổ Nhĩ Kỳ 4,04 triệu tấn, Iran 3,8 triệu tấn,
Brazil 2,07 triệu tấn, Mỹ 1,77 triệu tấn, Ai cập 1,87 triệu tấn (FAO, 2014).
Năm 2012, Việt Nam có khoảng 31 nghìn ha (tăng 14% so với năm 2011 –
27,2 nghìn ha) diện tích đất trồng dưa hấu, năng suất trung bình đạt 15,16 tấn/ha
(tăng 6,39% so với năm 2011), tổng sản lượng đạt 470 nghìn tấn, tăng 0,43% so với
năm 2011 (FAO, 2014). Dưa hấu được trồng rất phổ biến ở vùng đồng bằng sông
Cửu Long đặc biệt là Long An và Tiền Giang, Quảng Ngãi, năng suất đạt từ 15-25
tấn/ha. Ở miền Bắc, dưa hấu được trồng nhiều ở một số tính như Vĩnh Phúc, Thái
Bình, Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Hòa Bình, Bắc Kạn,…
1.1.1.6. Giá trị dinh dƣỡng và thƣơng mại của dƣa hấu
Dưa hấu được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: thực phẩm, mỹ phẩm,
dược phẩm và hóa phẩm. Vì có giá trị dinh dưỡng rất cao, dưa hấu được xếp vào
nhóm 10 thực phẩm tốt nhất. Người ta không chỉ yêu thích dưa hấu bởi vị ngọt, mát
của nó mà còn bởi trong dưa hấu chứa một hàm lượng lớn các vitamin và khoáng
chất, một lượng nhỏ protein và chất béo (Niao et al., 2005; Adrian, 2008). Theo
khuyến cáo của Hoa Kỳ, 280 gram thịt quả dưa hấu cung cấp 25% nhu cầu vitamin
C và 20% nhu cầu vitamin A, 8% nhu cầu kali, 4 % nhu cầu sắt và 2% nhu cầu
canxi mỗi ngày cho con người. Thịt quả dưa hấu rất giàu lycopene (2300 – 7200 µg
/ 100 g), là chất chống oxi hóa mạnh có tác dụng làm giảm nguy cơ ung thư tuyến

Footer Page 20 of 132.

Header Page 21 of 132.

8

tụy, tuyến tiền liệt và dạ dày… Hàm lượng lycopene của dưa hấu ruột đỏ cao hơn so
với cà chua, bưởi đào và ổi (Compton et al., 2004; Rimando & Perkins-Veazie,
2005; Swain & Powell, 2004). Ngoài ra dưa hấu còn chứa hàm lượng lớn chất xơ, có
tác dụng chống một số bệnh về tiêu hóa như táo bón, trĩ, làm giảm hàm lượng
cholesterol và giảm nguy cơ bị các bệnh tim mạch cho cơ thể (Niao et al., 2005)
Dưa hấu giàu L-citrulline, một axit amin có thể được chuyển hóa thành Larginine - một axit amin không thay thế, đóng vai trò quan trọng trong việc chữa
lành vết thương, loại bỏ amoniac ra khỏi cơ thể và tham gia tổng hợp nitric oxit
(NO) - chất đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như tập hợp tiểu
cầu và điều chế quá trình miễn dịch của cơ thể. Các nghiên cứu cho rằng có sự gia
tăng tế bào limpho – tế bào đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch sau
khi uống arginine (Febres et al., 2008; Fire et al., 1998).
Ở các vùng khác nhau trên thế giới, dưa hấu được sử dụng theo những cách
khác nhau. Dưa hấu thường được dùng làm món tráng miệng sau bữa ăn, làm salad,
nước ép, kem, thạch hoa quả và dùng cùng với một số loại rượu như vodka, rum…
Tại miền Nam nước Nga, bia được làm từ nước ép dưa hấu hoặc nước ép dưa hấu
có thể được đun sôi để uống như một loại siro. Tại Iraq và Ai cập và nhiều quốc gia
khác ở Châu Phi, dưa hấu được sử dụng như một loại thực phẩm chủ yếu, là nguồn
cung cấp nước cho cơ thể và làm thức ăn chăn nuôi.

Footer Page 21 of 132.


Header Page 22 of 132.

9

Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng trong dƣa hấu
(nguồn: USDA)
STT

Thành phần

1

Năng lượng

127 kJ (30 kcal)

2

Đường

7,55 g

3

Chất xơ

0,4 g

4

Chất béo

0,15g

5

Protein

0,61g

6

Vitamin A

28 µg

7

Vitamin B1

0,033 mg

8

Vitamin B2

0,021 mg

9

Vitamin B3

0,178 mg

10

Vitamin B5

0,221 mg

11

Vitamin B6

0,045 mg

12

Vitamin B9

3 µg

13

Vitamin C

8,1 mg

14

Vitamin E

0,05 mg

15

Vitamin K

0,01 µg

16

Can-xi

7 mg

17

Sắt

0,24 mg

18

Magie

10 mg

19

Phốt pho

11 mg

20

Kali

112 mg

21

Kẽm

0,1 mg

22

Natri

1 mg

23

Folate

3 µg

Footer Page 22 of 132.

Giá trị dinh dƣỡng trong 100g

Header Page 23 of 132.

10

1.1.2. Các loại bệnh hại dƣa hấu
Bệnh hại dưa hấu có thể gây ra bởi nấm, vi khuẩn, virus và một số tuyến trùng
(Bảng 1.2) (Kucharek et al., 2005).
Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dƣa hấu
Nhóm
phân loại

Nấm

Nấm

Footer Page 23 of 132.

STT

Sinh vật gây bệnh

Triệu chứng đặc trƣng

1

Pythium spp.

Úng nước, bạc lá, thối quả

2

Rhizoctonia spp.

3

Fusarium oxysporum f. s. p.
Niveum

Bạc lá, úng nước, thối gốc và
quả
Héo rũ thân, lá

4

Fusarium sp.

Thối vỏ quả

5

Didymella bryoniae

Chảy mủ, úng thân, lá, quả

6

Psuedoperonospora cubensis 2

Sương mai ở lá, cháy lá

7

Colletotrichum lagenarium

Cháy lá

8

Alternaria cucumerina

Cháy lá

9

Cercospora citrullina

Đốm và cháy lá

10

Phytophthora capsici

Thối quả, bạc lá, thối gốc

11

Sclerotium rolfsii

Thối gốc, hoa, quả, đốm

12

Sphaerotheca fuliginea

Bệnh phấn trắng

13

Colletotrichum orbiculare

Cháy lá, thân, quả, cuống lá

14

Botryosphaeria quercum
(Schw.)

Thối gốc

15

Cladosporium lagenarium

Vảy nấm

16

Corynespora cassicola

Đốm lá

17

Lasiodiplodia theobromae

Thối gốc, cháy lá

18

Erysiphe cichoracearum

Phấn trắng bề mặt

19

Macrophomia phaseolina

Thối gốc


Header Page 24 of 132.

Vi khuẩn

11

20

Phymatotrichum omnivorum

Thối rễ

21

Phytophthora sp

Thối gốc, quả

22

Thielaviopsis basicola

Thối rễ

23

Verticillium albo-atrum

Héo thân và lá

24

Pseudomonas lachrymans

Đốm sáng ở góc lá, thối quả

25
26

Acidovorax avenae subsp.

Citrulli
Erwinia spp.

Đốm sáng lá, quả
Thối vỏ

Papaya ringspot virus type
27

Khảm lá và quả

mosaic virus 1)- PRSV

Virus
28

29

Virus

W (formally watermelon

30

Watermelon mosaic virus –
WMV
Zucchini yellow mosaic
virus – ZYMV
Tomato spotted wilt virus –
TSWV

Khảm lá và quả
Khảm lá và quả
Khảm lá

31

Cucumber mosaic virus - CMV

Khảm lá

32

Squash mosaic virus - SQMV

Khảm lá

33

Meloidogyne incognita

Hại rễ

Tuyến

34

Meloidogyne javanica

Hại rễ

trùng

35

Meloidogyne arenaria

Hại rễ

36

Rotylenchus reniformis

Hại lá

1.1.3. Bệnh virus hại dƣa hấu
Virus cũng là một nguyên nhân chính làm giảm năng suất cũng như chất lượng
dưa hấu. Các triệu chứng bệnh virus xuất hiện ở dưa hấu cũng như các cây trồng
khác trong họ bầu bí có thể phân thành 3 nhóm điển hình: (1) khảm lá, lá biến dạng,
hình dạng và màu sắc vỏ quả bị biến dạng; (2) Các lá già bị vàng, sau đó toàn bộ

Footer Page 24 of 132.


Header Page 25 of 132.

12

cây bị vàng lụi đi, lá thường dày lên bất thường; (3) Cháy lá. Trên thế giới, có hơn
10 loại virus gây ảnh hưởng khá nghiêm trọng cho dưa hấu, trong đó phổ biến và

gây hại nặng nề nhất là virus đốm vòng đu đủ (papaya ringspot virus type W PRSV-W), virus khảm dưa hấu (watermelon mosaic virus - WMV), virus khảm
vàng bí ngô (zucchini yellow mosaic virus -ZYMV và virus khảm dưa chuột
(cucumber mosaic virus -CMV và rất khó kiểm soát. Triệu chứng đặc trưng của 4
loại bệnh virus này khá giống nhau gây ra triệu chứng khảm và biến dạng ở lá và
quả, vì thế rất dễ gây nhầm lẫn khi nhận biết virus (Krubphachaya et al., 2007; Lê
Thị Ánh Hồng, 2002).
Trong công tác kiểm soát các bệnh virus hại cây trồng, việc sử dụng các loại
thuốc kháng sinh là không có tác dụng. Các biện pháp kiểm soát chủ yếu nhằm vào
việc đề phòng virus thông qua việc tiêu diệt các vector truyền bệnh, thường dùng là
phun thuốc trừ sâu để tiêu diệt các loại côn trùng truyền bệnh, sử dụng thuốc diệt cỏ
để tiêu diệt cỏ dại cũng như các thực vật khác mang mầm bệnh, tạo tính kháng đối
với virus cho cây trồng. Khi cây đã bị nhiễm virus, các phương pháp kiểm soát trên
không còn tác dụng. Trong các biện pháp phòng bệnh virus hại cây trồng hiện nay,
biện pháp có hiệu quả nhất là tạo ra tính kháng đối với virus cho cây.
Do dưa hấu là loại cây trồng rất nhạy cảm với nhiều loài vi khuẩn, nấm và
virus gây bệnh nên việc cải thiện khả năng kháng bệnh của dưa hấu bằng kỹ thuật di
truyền đã và đang rất được quan tâm nghiên cứu. Khả năng kháng tự nhiên đối với
một số loại virus đã được xác định trong một số loài dưa hấu hoang dã, như kháng
WMV 2 (Xu et al., 2004), ZYMV (Ling et al., 2009; Xu et al., 2004) hoặc PRSV-w
(Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), tuy nhiên quả của những loài dưa hấu này
lại có chất lượng kém, đòi hỏi phải mất nhiều năm để đánh giá, lựa chọn, lai tạo để
tạo giống có khả năng kháng được virus và chất lượng quả tốt. Các phương pháp
truyền thống đã tạo ra các giống dưa hấu có khả năng kháng bệnh thán thư, bạc lá,
bệnh héo do nấm Fusarium (Mohr, 1986; Crall et al., 1994), nhưng đối với một số
bệnh như bệnh đốm quả do vi khuẩn, bệnh đốm vòng đu đủ do PRSV, bệnh khảm
dưa hấu do WMV, bệnh khảm vàng bí xanh do ZYMV đang gặp rất nhiều khó khăn

Footer Page 25 of 132.