Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ
KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE
THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số:
62420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2017


Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS Trương Quốc Phong
GS. TS Nguyễn Đăng Hiền

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
1. Do Thi Thu Ha, Ngo Thu Huong, Nguyen Dang Hien, Le Thi
Luan, Luong Trinh Thuy Linh, Truong Quoc Phong (2015)
Development of a lateral flow immunoassay strip for rapid
detection of rotavirus in fecal samples. Journal of Biology,
Vietnam Academy of Science and Technology. Vol 37(1SE):1217. DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se.6070
2. Do Thi Thu Ha, Truong Quoc Phong (2015) Cloning and
expression of gene coding for rotavirus VP6 protein in
Escherichia coli. Journal of Science and Technology Technical
Universities 105(A):10-14.
3. Trương Quốc Phong, Đỗ Thị Thu Hà (2015). Tối ưu mã di
truyền để biểu hiện protein VP6 của virus rota trong Escherichia
coli. Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, 13 (2A). 619-626
4. Do Thi Thu Ha, Luong Trinh Thuy Linh, Nguyen Thi Ngoc
Anh, Ngo Thu Huong, Nguyen Dang Hien, Truong Quoc Phong
(2015) Optimization of a lateral flow immunoassay test strip for
the sensitive detection of rotavirus in fecal samples. The
Proceeding of the 9th South East Asian Technical University
Consortium (SEATUC) Symposium, ISSN 1882-5796, pp. 219224.
5. Do Thi Thu Ha, Truong Quoc Phong (2015) Optimization of
culture conditions for high-level expression of human rotavirus
VP6 protein in Escherichia coli. The Proceeding of the 9th South

East Asian Technical University Consortium (SEATUC)
Symposium, ISSN 1882-5796, pp. 230-233.



MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Virus rota là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy nặng phải
nhập viện, thậm chí tử vong ở trẻ nhỏ trên toàn cầu cũng như ở Việt
Nam. ProteinVP6 nằm là lớp giữa của hạt virus, nhưng VP6 lại được
coi là tiểu phần quan trọng của hạt virus, không chỉ vì khối lượng lớn,
chiếm hơn 51% khối lượng hạt virus mà protein, VP6 là kháng nguyên
chung cho tất cả nhóm A, bảo tồn với độ tương đồng khoảng 92% về
trình tự axit amin giữa các chủng virus rota nhóm A. Do có tính bảo
thủ cho các chủng virus rota thuộc nhóm A nên protein VP6 được coi
như là một dấu chỉ sinh học xác định virus rota. Đã có nhiều nghiên
cứu protein VP6 như là một tiểu đơn vị để ứng dụng cho sản xuất vắc
xin, hay sản xuất protein VP6 TTH như một kháng nguyên tạo kháng
thể đặc hiệu cho phục vụ cho chuẩn đoán virus rota bằng phương pháp
ELISA hoặc sắc ký miễn dịch. Xuất phát từ những cơ sở lý luận và
thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: " Nghiên cứu
tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng
phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota”
- Mục tiêu đề tài
- Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp của virus rota
- Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6
- Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử phát hiện nhanh virus
rota dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch
2.Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein Vp6 tái tổ

hợp (TTH).
- Tạo chủng E.coli BL21(DE3) mang pET22(b)::vp6 và nghiên cứu
điều kiện biểu hiện VP6 TTH dạng dại và tối ưu hóa gen tổng hợp.
- Lựa chọn điều kiện thu hồi kháng nguyên VP6 TTH và nghiên cứu
đặc tính của VP6.
- Nghiên cứu gây miễn dịch thu kháng thể đặc hiệu kháng VP6 TTH.
- Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tạo que thử phát hiện nhanh rota
vius.
3. Những đóng góp mới của luận án
- Thành công trong việc tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp có đặc tính
tương tự VP6 tự nhiên của virus rota
- Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota
- Ứng dụng kháng thể tạo que thử chẩn đoán rota vius
1


4.

Bố cục của luận án
Luận án gồm 149 trang, trong đó phần đặt vấn đề 02 trang, tổng
quan tài liệu 48 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang,
kết quả nghiên cứu 52 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang, phụ lục 12
trang, tài liệu tham khảo 9 trang với 177 tài liệu tham khảo. Trong luận
án có 7 Bảng và 73 Hình
Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN
THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
Theo thông kê bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên nhân gây
bệnh tật và tử vong cho trẻ em ở các nước đang phát triển.Ước tính đến
tháng 4 năm 2016, tố chức Y tế thế giới (WHO) ước tính trên toàn cầu

trung bình có 215.000 trẻ dưới 5 tuổi tử vong nguyên do tiêu chảy bởi
virus rota. Ở Việt Nam mãi đến năm 1980 mới nghiên cứu và xác định
virus này là nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em, theo
thống kê dịch tễ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh tiêu chảy cấp do virus rota
chiếm trên 50% trong tổng số trẻ mắc tiêu chảy cấp phải nhập viện
hàng năm, số trẻ chết do virus rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ
dưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên nhân. Bình quân ở nước ta, 1 trẻ
dưới 5 tuổi mỗi năm mắc từ 0,8 - 2,2 đợt tiêu chảy.
1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA
Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt,
được cấu tạo nên bởi 6 protein cấu trúc
(VP1 tới VP7) và 6 protein phi cấu trúc
(NSP1-NSP6) do 11 mảnh gen mã hóa.
Protein VP2 và VP6 tạo nên các hạt hai
lớp được phủ bởi lớp protein VP7,
1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA
1.3.1 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử
1.3.2 Phương pháp điện di
1.3.3 Phương pháp RT-PCR hoặc real time-PCR
1.3.4 Phương pháp giải trình tự gen
1.3.5 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
1.3.6 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa (latex agglutination)
1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatograpic)
1.4 ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA
1.4.1 Gen tổng hợp VP6:
2


Mảnh protein vỏ VP6 virus được mã hóa từ dsRNA 6 có trọng
lượng 1356 bp, protein tổng hợp 44,8 kDa chứa 397 axit amin. mRNA

virus chứa cấu trúc ở đầu 5’-methylated cap nhưng khuyết đuôi polyA.
Thay vào đó mRNA có đầu kết thúc 3’ chứa chuỗi UGACC và được
bảo tồn trong tất cả 11 gen của virus.
1.4.2 Đặc điểm protein VP6
Các tiểu đơn vị VP6 là một khối
cuộn gấp nếp β với đầu N và đầu C tạo
thành một hệ gấp α lớn. Hai vùng A và
B đều tham gia giữ ổn định cấu trúc
tam phân của VP6, VP6 là một protein
chứa ion kim loại Zn2+, axit amin
His153 được bảo tồn nghiêm ngặt
trong nhóm virus rota A và không có
mặt trong nhóm huyết thanh virus rota
khác
1.5 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP
PROTEIN TÁI TỔ HỢP
1.5.1 Ảnh hưởng của chất cảm ứng
1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp protein tái tổ hợp
1.5.3 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
1.5.4 Ảnh hưởng của tối ưu hóa các codons
1.6 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN
1.6.1 Thu nhận và làm tan thể vùi
1.6.2 Tinh sạch VP6 bằng cột sắc ký ái lực Ni2+
1.6.3 Tái cuộn gấp VP6 tái tổ hợp
1.6.4 Định lượng định tính và đánh giá hoạt tính protein VP6
1.7 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘNG VẬT
1.7.1 Chọn lọc động vật
1.7.2 Quy trình gây miễn dịch và giám sát động vật
1.8 CÁC KIT THƯƠNG MẠI CHO CHUẨN ĐOÁN VIRUS
ROTA

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.2 Plasmid
2.1.3 Các cặp mồi sử dụng
2.1.4 Các kháng thể sử dụng
3


2.1.4.1 Kháng thể cho tạo que thử
2.1.4.2 Kháng thể cho Western Blot và ELISA
2.1.5 Hóa chất và thiết bị máy móc
2.1.5.1 Vật liệu, hóa chất
2.1.5.2 Thiết bị máy móc cơ bản
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Các phương pháp vi sinh
Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp giống vi sinh vật.
Phương pháp tạo tế bào khả biến.
2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp tách chiết RNA tổng số (QIAgen RNA extract Kit).
Phương pháp RT-PCR và PCR. Phương pháp tách chiết plasmid.
Phương pháp ghép nối gen vào vector tách dòng. Biến nạp vào tế bào
E.coli. Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn. Thiết kế
vector biểu hiện pET22b(+) mang gen vp6. Phương pháp tinh sạch
DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit. Điện di DNA
trên gel agarose. Phương pháp biểu hiện gen. Điện di biến tính trên
gel polyacrylamide-SDS.
2.2.3 Các phương pháp hóa sinh protein
2.2.3.1 Phương pháp tách chiết protein thể vùi
2.2.3.2 Phương pháp thu nhận và làm tan thể vùi

2.2.3.3 Phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực his-tag và
tái cuộn gấp
2.2.3.4 Phương pháp Western Blot
2.2.3.5 Phương pháp ELISA
2.2.4 Phương pháp miễn dịch học
2.2.4.1 Phương pháp sản xuất kháng thể
2.2.4.2 Phương pháp chẩn độ hiệu giá kháng thể kháng protein VP6
tái tổ hợp bằng phương pháp ELISA
2.2.4.3 Phương pháp tinh sạch IgG bằng cột sắc ký ái lực gắn protein
A-Sepharose
2.2.4.4 Phương pháp soi hiển vi miễn dịch
2.2.5 Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch
2.2.6 Các phương pháp tin sinh
Nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp: Kiểm tra mồi bằng phần
mềm FastPCR. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen đích
bằng phần mềm Nebcutter. Phân tích trình tự gen bằng phần mềm
NCBI(Blast,…). Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng
4


ExPASy.Dự đoán cấu trúc VP6 bằng phần mềm RaptorX. Xác định độ
sạch của protein VP6 sau khi tinh sạch bằng phần mềm Quantity One
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6
TRONG E. COLI
3.1.1 Tách dòng gen vp6 từ virus rota
3.1.1.1 Khuếch đại gen vp6
Gen vp6 được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu VP6nat F và
VP6nat R, khuôn là RNA virus rota. Qua Hình 3.1 sản phẩm PCR ta
thấy xuất hiện một băng DNA với kích thước khoảng 1,2 Kb, kích

thước này phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen mã hóa
protein VP6 theo thiết kế. Từ kết quả trên chúng tôi kết luận đã khuếch
đại thành công đoạn gen mã hóa protein VP6 bằng kỹ thuật RT – PCR.

Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm
Hình 3.2: Sản phẩm PCR thu
khuếch đại gen vp6 trên gel
được từ 6 dòng với cặp mồi
agarose 0,8%. Đường chạy M:
VP6nat đặc hiệu. Đường chạy 1thang DNA chẩn 100 bp
7 : Sản phẩm PCR từ 7 ḍng.
(Thermo Scientific). Đường
Đường chạy M: DNA chẩn 100bp
chạy 1: sản phẩm RT-PCR
(Thermo Scientific).
khuếch đại gen vp6
3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 trong vector pJET1.2
Sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại gen vp6 được tinh sạch và
gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt. Sau khi được biến nạp vào tế
bào E.coli DH5α, plasmid pJET1.2::vp6 được tách từ 7 khuẩn lạc ngẫu
nhiên được sử dụng làm khuân cho PCR với cặp mồi VP6nat F và
VP6nat R sử dụng enzyme Taq polymerase. Kết quả điện di đồ xuất
hiện một băng duy nhất có kích thước ~1,2kDa (Hình 3.2). Cho nên có
thể khẳng định băng sản phẩm PCR trên phổ điện di đồ là từ đoạn gen
vp6 được chèn vào, chứng tỏ các dòng kiểm tra đều mang gen đích
vp6.
5


Hai dòng khuẩn lạc có kết quả PCR tốt tiếp tục được xử lý với hai

enzyme giới hạn BamHI và SalI. Kết quả điện di Hình 3.3A thấy xuất
hiện hai băng DNA rõ nét có kích thước lần lượt là 1,2kb và 2,9kb, thể
hiện cho kích thước của gen vp6 và vector pJET1.2.
Đồng thời kết quả cắt bằng enzyme NheI kết quả nhận thấy đường
chạy xuất hiện hai sản phẩm với trọng lượng là 337 và 831 bp tương
đương với tổng trọng lượng của gen vp6 (1168 bp) ( Hình 3.3 B). Từ
các kết quả trên chúng tôi khẳng định plasmid pJET1.2 đã nhận gen
vp6 là plasmid tái tổ hợp pJET1.2::vp6, và chúng tôi lựa chọn plasmid
này cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3: Kết quả chọn dòng bằng xử lý
plasmid pJET::vp6 với enzyme cắt hạn chế
BamHI/SalI. (A) Đường chạy 1, 2: plasmid
trước cắt. Đường chạy 1RE và 2RE: xử lý
với enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI. (B)
Đường chạy 3: sản phẩm PCR từ dòng 1 xử
lý với enzyme cắt hạn chế NheI. Đường chạy
M: DNA chẩn 100 bp (Thermo Scientific).
Gen vp6 trên plasmid của dòng 1 được phân tích bằng giải trình tự gen
vp6 trong vector tách dòng pJET1.2::vp6,trình tự gen vp6 được phân
tích. Trình tự này đã được đăng ký trên ngân hàng gen của NCBI với
mã số KR261090.1
So sánh trình tự gen lên ngân hàng dữ liệu để tìm trình tự tương đồng,
kết quả phân tích trình tự gen vp6 trên ngân hàng dữ liệu có độ tương
đồng về trình tự gen vp6 là 99% với typ virus rota nhóm A G1P[8],
G3P[8], G4P[8], G9P[8] AB605599.1, JN258829.1, KT921117.1,
KT921018.1, KT920886.1, KJ559167.1, KJ559068.1, KJ559057.1,
KF371996.1, KJ559101.1, EF426125.1, EF426122.1, KC687050.1,
KJ559253.1, KJ412714.1, GQ477099.2, Q477096.2, EF472944.1,
EU372748.1, EF426121.1. 98% với các virus rota KT988220.1,
KT988209.1, KT988165.1, KT988154.1, KT988143.1, KJ454599.1,

KJ454598.1
So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein VP6 phân tích với
các chủng virus rota 100% độ tương đồng với chủng ALH21152.1 và
99% với các chủng
AIL83499.1, AFI59853.1, AHZ91014.1,
AGM46790.1,
AGF86310.1,
ACV85661.2,
AEO45626.1,
ADK46567.1,
ABA34211.1,
ANN82937.1,
ANN82935.1,
ANC33794.1, ALQ76591.1, AJA72632.1.
6


3.1.2 Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen mã hóa protein
VP6
3.1.2.1 Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen mã hóa protein
VP6 tự nhiên (VP6nat)
Gen vp6 được cắt khỏi vector pJET1.2::vp6 bằng hai enzyme giới hạn
BamHI/SalI và chuyển đoạn gen vp6 vào vector pET22b(+) tại hai vị
trí enzyme giới hạn tương ứng tạo vector biểu hiện pET22b ::vp6.
Vector pET22b(+)::VP6nat đã được ghép biến nạp vào E.coli
BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Các thể biến nạp được sàng
lọc bằng cách nuôi cấy trên môi trường LB-Amp. Tách plasmid và cắt
kiểm tra bằng hai enzyme giới hạn BamHI/SalI (Hình 3.5).

Hình 3.5: Kết quả xử lý 2

plasmid pET22b(+) và
pJET1.2::VP6nat
bằng
BamHI/SalI. Đường chạy
1: Vector tách dòng
pJET1.2::VP6nat được xử
lý
bằng
BamHI/SalI.
Đường chạy 2: Vector biểu
hiện pET22b(+) được xử
lý bằng BamHI/SalIM:
thang DNA chẩn 500 bp
(Thermo Scientific).

Hình 3.6: Kết quả sàng lọc dòng E.coli
BL21(DE3) bằng phương pháp PCR và
cắt giới hạn. (A). Sản phẩm PCR. (B).
Sản phẩm cắt bằng enzyme hạn chế .
Đường chạy 1, 2, 3: Sản phẩm PCR của
các khuôn plasmid từ 3 clones tương
ứng. M: thang DNA chuẩn 100 bp
(Thermo Scientific).Đường chạy 4:
Plasmid pET22b(+)::vp6nat cắt bằng
cặp enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI.
Đường
chạy
5:
Plasmid
pET22b(+)::vp6nat. M: thang DNA

chẩn 500 bp (Thermo Scientific).
Vector biểu hiện pET22b::vp6 sau khi xử ký với hai enzyme giới
hạn BamHI/SalI cho hai băng DNA có kích thước lần lượt là 1,2kb và
5,4 kb; trong đó băng 1,2kb là tương đương với kích thước của gen vp6
và băng 5,4kb tương đương với kích thước của vector pET22b(+).
Ngoài ra, để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen vp6 trong vector biểu
hiện, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen vp6 từ plasmid
7


pET22b::vp6 bằng cặp mồi VP6 F/R cho sản phẩm PCR có một băng
DNA duy nhất có kích thước khoảng 1,2kb trên bản gel điện di agarose
0,8% (Hình 3.6A), khi kiểm tra bằng xử lý enzyme giới hạn (Hình
3.6B) kết qua như mong đợi sản phẩm chứ đoạn gen vp6~1,2 kb.Như
vậy, vector biểu hiện pET22b::vp6 đã được thiết kế thành công.
3.1.2.2 Nghiên cứu biểu hiện protein VP6nat trong E.coli BL21(DE3)
Để xác định protein tạo ta là dạng protein tái tổ hợp và đặc hiệu chúng
tôi tiến hành thực hiện phương pháp WB với kháng thể kháng histidine
và kháng thể kháng VP6 thương mại. Kết quả được trình bày ở Hình
3.8 và 3.9. Ở cả hai bản WB đều thấy xuất hiện băng tín hiệu rõ nét có
kích thước khoảng 47kda, kích thước này phù hợp với kích thước dự
đoán của VP6nat.

Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự biểu
hiện của 6xHis-VP6nat của chủng
E.coli
BL21(DE3)/pET22::vp6.
(A) Nhuộm ink màng , (B) Western
Blot. Đường chạy 1, 3 là protein
tổng

số
từ
E.coli
BL21(DE3)/pET22. Đường chạy
2,4: Dịch protein tổng số từ E.coli
BL21(DE3)/pET22::vp6nat

Hình 3.9: Kết quả kiểm tra sự
biểu hiện protein VP6nat với
mAb anti-vp6 (Abcam).(A)
Màng nhuộm ink. (B)
Western Blot. Đường chạy 1,
2: Protein tổng số từ
BL21(DE3)/pET22::VP6nat .
Đường chạy M: thang protein
chẩn (iNtRON)

 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến tổng hợp protein VP6nat
Lượng protein VP6nat tổng hợp cao nhất khi nồng độ IPTG là 0,3
mM. Nồng độ IPTG này cũng nằm trong dải phù hợp với các công bố
khi cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp ở E.coli.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hợp protein VP6nat
Tại nhiệt độ biểu hiện 370C cho thấy khả năng tổng hợp protein
VP6nat là cao nhất (17,1%) và được lựa chọn sử dụng trong nghiên
cứu tiếp theo.
8


 Ảnh hưởng của thời gian đến biểu hiện protein VP6nat
Hàm lượng protein VP6 cao nhất là 9,3% tại thời điểm 4 giờ sau

khi cảm ứng. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thời điểm thu nhận protein
VP6 là 4 giờ sau khi cảm ứng để phục vụ nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.3 Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen mã hóa protein
VP6 tối ưu (VP6opt)
3.1.2.3.1 Tối ưu hóa gen vp6 phù hợp hệ biểu hiện E.coli
Kết quả axit amin suy diễn nhận thấy, sau khi tối ưu condon trình
tự amino acid không đổi, điều này đảm bảo cho protein tổng hợp bảo
tồn tính chất của VP6 protein từ virus rota.
3.1.2.3.2 Tách dòng gen vp6 tối ưu trong vector pET22(b+)
Tương tự quy trình tách dòng trên pET22b(+) với gen vp6 tự
nhiên, chỉ khác với gen vp6opt là nguồn tổng hợp hóa học (hãng
GenScrip). Gen vp6opt được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu
VP6optF/R và tinh sạch bằng kit purelink PCR (invitrogen) khi sau xử
lý tạo đầu sole với cặp enzyme BamHI/ SalI. Đoạn gen này được nối
ghép vào vector pET22b(+). Sản phẩm nối gen vp6opt vào vector
pET22b(+) được biến nạp vào tế bào E.coli BL21(DE3), trải trên đĩa
LB-Amp, ủ và chọn các khuẩn lạc mọc trên mặt thạch làm khuẩn lạc
dự tuyển.
Hình 3.15: Kết quả chọn dòng bằng xử lý
enzyme cắt hạn chế BamHI/ SalI và PCR với
cặp mồi VP6opt. Đường chạy 1: plasmid
pET22b(+)::vp6opt . Đường chạy 2: plasmid
pET22b(+)::vp6opt đã được xử lý với cặp
enzyme cắt hạn chế BamHI/ SalI . Đường chạy
3: Sản phẩm PCR với cặp mồi VP6opt F/R.
Đường chạy M: thang DNA chẩn 500bp
(Fermentas)
Kết quả điện di (Hình 3.5) sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn
BamHI/SalI thấy xuất hiện một băng có kích thước 1,2kb (vp6opt) và
một băng có kích thước khoảng 5,4kb (pET22b). Và kết quả sản phẩm

cắt bằng enzyme hạn chế BamHI/ SalI cũng trùng với băng của sản
phẩm PCR với cặp mồi VP6opt F/R.
 Kiểm tra trình tự gen vp6 tối ưu trên vector biểu hiện pET22b(+)
Kết quả giải trình tự cho thấy trình tự gen vp6opt mức độ tương đồng
so với trình tự lý thuyết được tối ưu hóa chính xác 100%. Vậy có thể
9


nói rằng chúng tôi đã thành công trong việc tạo cấu trúc biểu hiện gen
vp6opt trong plasmis pET22b(+). Kết quả khung đọc mở tổng hợp
VP6opt dự đoán bao gồm 430 axit amin tương đương 47kDa.
 Dự đoán cấu trúc vp6 bằng phần mềm RaptorX
Sử dụng phần mềm RaptorX để kiểm tra trình tự axit amin của gen
vp6opt có nối đuôi 6His-tag tại đầu C và pelB đầu N, và đồng thời xét
trình tự VP6opt không mang His-tag và pelB.

Hình 3.17: Cấu trúc 3D của protein VP6 tái tổ hợp được dự đoán bằng
phần mềm RaptorX. (A): Trình tự axit amin của gen VP6opt không
mang his-tag và pelB ở đầu C và N. (B): Trình tự axit amin của gen
VP6opt có nối đuôi 6His-tag tại đầu C và pelB đầu N. (87 – 96) và
(231 – 240): vị trí dự đoán 2 epitope LLGTTLLNLD và
FEHIVQLRRAL
 Dự đoán trình tự epitope bằng phần mềm SVMtriP
Chúng tôi nhận thấy có khả năng tồn tại 2 epitope là
LLGTTLLNLD, FEHIVQLRRAL cao nhất trong trình tự axít amin
của protein VP6 TTH (score >=0,9).Định vị trình tự LLGTTLLNLD
(87-96) phía gần đầu N, thuộc vùng xoắn α và trình tự
FEHIVQLRRAL (231-240) nằm ở vùng gấp nếp β trên cấu trúc
monomer của cấu trúc dự đoán trên Hình 3.17. Trên trimer, hai trình từ
này đều nằm trong vùng dự đoán chứa epitope của protein VP6 virus

rota thuộc tác giả Aiyegbo, et al., (2013). Trình tự pElB và His-tag
không xuất hiện epitope chứng tỏ sự có mặt của 2 trình tự này không
ảnh hướng đến khả năng gây miễn dịch của kháng nguyên. Từ kết quả
phân tích trên, chúng tôi có thể khẳng định protein VP6 TTH có đủ khả
năng gây miễn dịch tạo kháng thể
3.1.2.4 Nghiên cứu biểu hiện gen vp6 tối ưu (VP6opt )
Vậy từ kết quả western blot kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-tag
kết luận rằng đã tạo được cấu trúc vector tái tổ hợp chứa đoạn gen
10


vp6opt và biểu hiện được protein tái tổ hợp chứa đuôi dung hợp histag.

Hình 3.19: Kết quả kiểm tra sự biểu Hình 3.20: Kết quả kiểm tra sự
hiện của 6xHis-VP6opt của chủng E. biểu hiện protein VP6 với
coli BL21(DE3)/ pET22::vp6. (A) Điện mAb anti-vp6 (Abcam). (A):
di protein tổng số trên trên gel Màng nhuộm ink. (B): Kết quả
polyacrylamid 12%. (B) Western Blot. Westernt. Đường chạy 1, 2:
Đường chạy 1,3: Dịch protein tổng số Protein tổng số từ E.coli
từ E.coli BL21(DE3)/pET22.
BL21(DE3)/pET22::VP6opt .
Đường chạy 2,4: Dịch protein tổng số Đường chạy M: protein chẩn
từ E.coli BL21(DE3)/pET22::vp6opt. (GiangNam-stain iNtRON).
Đường chạyM: protein chẩn (Thermo
Scientific, Mỹ)
Kết quả WB đánh giá độ đặc hiệu của protein VP6opt với kháng
thể kháng VP6 tự nhiên cũng cho thấy chúng tôi đã tạo được protein
VP6 virus rota tái tổ hợp trên hệ biểu hiện E.coli
BL21(DE3)/pET22b(+).
 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến tổng hợp VP6opt

Hàm lượng protein VP6 tái tổ hợp đạt cực đại (37,2%) tại ngưỡng
IPTG 0,1mM và được lựa chọn là nông độ để nghiên cứu tiếp theo.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hợp protein VP6opt
Tất cả trạng thái protein VP6 thể hiện là thể vùi ở các nhiệt độ,
lượng protein VP6 ở nhiệt độ 300C (40%) và 370C (40,4%) tổng hợp
ra gần tương đương nhau, chúng tôi chọn nhiệt độ 300C này cho các
nghiên cứu tiếp theo.
 Ảnh hưởng của thời gian đến biểu hiện protein VP6opt
Hàm lượng protein VP6 đạt cực đại sau 5 giờ cảm ứng (36,5%), so
với thời điểm sau 4 giờ cảm ứng (36,2%) thì lượng protein ở 5 giờ cao
11


không đáng kể. Chúng tôi chọn điều kiện thu protein tái tổ hợp VP6opt
ở thời điểm sau 4 giờ tổng hợp làm cơ sở cho các nghiên cứu khác
nhau.
3.1.3
Đánh giá so sánh biểu hiện VP6nat và VP6opt
Với các điều kiện tổng hợp protein đã thưc hiện, chúng tôi tiến
hành đánh giá khả năng biểu hiện của protein VP6nat và VP6opt trên
cùng một bản gel và phương pháp sử dụng và phần mềm QuantyOne
Bio-Rad.
Hình 3.24: So sánh khả năng biểu
hiện protein VP6 tự nhiên và tối ưu
trên cùng hệ biểu hiện. Đường chạy
1: Protein tổng số từ E.coli
BL21(DE3)/ pET22::VP6opt . Đường
chạy
2;
E.coli

BL21(DE3)/
pET22::VP6nat . Đường chạy M:
protein
chẩn
(GiangNam-stain
iNtRON). Lượng protein nạp trên
giếng của mỗi mẫu 15μg/ giếng
Yếu tố so sánh
VP6 tự nhiên
VP6 tối ưu
Độ tương đồng protein
100%
Điều kiện biểu hiện protein:
0,3 mM
0,1 mM
- Nồng độ ITPG:
370C
300C
- Nhiệt độ:
4 giờ
4 giờ
- Thời gian:
Trạng thái protein biểu hiện
Thể vùi
Thể vùi
Có ái lực với kháng thể đơn dòng
+
+
kháng VP6 (Abcam-USA)
% protein VP6 (Quanty One)

9,3
36.3
Lượng VP6 tổng hợp (mg/ml dịch
0,058
0,24
nuôi)
Bảng 3.1: Đánh giá so sánh biểu hiện VP6nat và VP6opt trên
cùng 1 hệ biểu hiện
Từ kết quả Hình 3.23 và Bảng 3.1 thấy rằng khả năng biểu hiện
protein của gen vp6 tự nhiên và vp6 được tối ưu hóa là rất khác nhau.
Khả năng tạo thành protein VP6 của gen tối ưu gấp gần 4 lần gen ở tự
nhiên. Chúng tôi chọn hệ biệu hiện E.coli BL21(DE3)/pET22::vp6opt
ưu thế này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 THU NHẬN PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH
12


3.2.1 Tách chiết protein VP6
Hình 3.25: Kết quả xử lý và hòa tan
protein bằng 3 phương pháp. Đường chạy
VB: protein tổng số biến tính bằng sóng
viba. Đường chạy UR: protein tổng số biến
tính bằng Urea. Đường chạy MC: protein
tổng số biến tính trong hỗn hợp có βMercaptonethanol. Đường chạy M: thang
protein chẩn (GiangNam-stain iNtRON)
3.2.2 Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực qua cột Histrap và tái
cuộn gấp
Tinh sạch protein VP6 bằng cột sắc ký ái lực Histrap HP (GE).Kết
quả tinh sạch bằng sắc ký ái lực được trình bày ở Hình 3.26. Protein
VP6 tinh sạch bằng 3 phương pháp đều đạt độ sạch cao ~90%, lượng

protein thu hồi ~0,24 mg .
Hình 3.26: Kết quả tinh sạch
protein VP6 bằng sắc ký ái lực
thông qua tương tác giữa 6xHis và
Ni2+. (A): Protein không bám cột.
(B): protein VP6 tinh sạch. Các
đường chạy MC, VB và UR tương
ứng với các phương pháp xử lý.
Đường chạy M: thang protein chẩn
(GiangNam-stain iNtRON).
Protein VP6 tiếp tục được kiểm tra trạng thái tái cuộn gấp bằng
phương pháp ELISA gián tiếp với kháng thể đơn dòng kháng VP6
thương mại. Kháng thể đơn dòng sẽ nhận biết epitope lập thể của
VP6opt. Kết quả ELISA được trình bày bằng Hình 3.26 và 3.27.

L1
L2

2

3

4
O D 450nm

1

0 .8
0 .7
0 .6

0 .5
0 .4
0 .3
0 .2
0 .1
0
PBS

VB

MC

U re a

Hình 3. 4: Kết quả ELISA đánh giá khả năng tái cuộn gấp của protein
VP6 TTH tinh sạch
13


OD 450nm

Giếng 1: Mẫu trắng (PBS). Giếng 2: Protein VP6 TTH tinh sạch từ
phương pháp VB. Giếng 2: Protein VP6 TTH tinh sạch từ phương
pháp MC. Giếng 3: Protein VP6 TTH tinh sạch từ phương pháp Urea
Từ các kết quả trên chúng tôi chọn phương pháp thu nhận và xử lý
protein VP6 bằng hỗn hợp đệm gồm PBS 1X pH 7,4, 0,5% SDS,
20mM β-mercaptonethanol và 5 mM DTT (MC). Tinh sạch kết hợp tái
cuộn gấp bằng sắc ký và thay đệm hòa tan bằng PBS pH 7,4 để thu
nhận protein VP6 tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chúng tôi tiến hành xử lý sơ bộ để sinh khối và thu protein thể vùi.

Sản phẩm protein thể vùi tiếp tục được xử lý theo 3 phương pháp khác
nhau. Kết quả Hình 3.25 cho thấy rằng cả 3 phương pháp đều thu được
protein dưới dạng tan và có hàm lượng VP6 khác nhau không nhiều.
3.2.3 Đánh giá đặc tính protein VP6 tinh sạch
Đặc tính của kháng nguyên được đánh giá thông qua phản ứng WB
và ELISA với kháng thể kháng VP6 thương mại. Các tín hiệu này
được so sánh với tín hiệu phản ứng với dịch ly giải protein tổng số
virus rota nhóm A, typ G1P[8] xem mức độ cấu trúc phù hợp. Kết quả
thể hiện ở Hình 3.28 và 3.29.

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

PBS

Hình 3.28: Kết quả kiểm tra sự đặc hiệu
của protein VP6 bằng phương pháp WB.
(A): Bản Western Blot. (B): Nhuộm ink
màng. Đường chạy 1,4: Protein tổng số
E.coli
BL21(DE3)/pET22::VP6opt.
Đường chạy 2,5: VP6opt tinh sạch sau

khi xử lý bằng phương pháp βmercaptonethanol. Đường chạy 3,6:
Protein tổng số ly giải từ virus rota A,
14

VP6 TTH

VP6 tự
nhiên

Hình 3.29: Kết quả ELISA
so sánh cấu hình cuộn gấp
của VP6opt và VP6 virus
rota. Giếng 1: Mẫu trắng
(PBS).
Giếng
2:
ProteinVP6opt tái tổ hợp.
Giếng 2: Dịch ly giải
protein từ virus rota


Hình 3.30: Hiệu giá
kháng thể kháng
VP6 protein virus
rota tại các thời
điểm lấy máu

Hiệu giá kháng thể (đơn vị)độph

typ G[1]P[8]. Đường chạy M: thang

protein chẩn (GiangNam-stain iNtRON)
Kết quả Hình 3.28 ta nhận thấy xuất hiện 1 vạch tín hiệu có kích
thước ~47kDa ở đường chạy 1 và 2 và ~45kDa ở đường chạy 3. Kết
quả có thể cho thấy có sự tương đồng về trình tự đặc hiệu giữa VP6opt
tái tổ hợp so với VP6 virus rota tự nhiên. Khi tiến hành phản ứng
ELISA chúng tôi cũng nhận được tín hiệu ở cả hai mẫu VP6 tái tổ hợp
và VP6 từ dịch ly dải protein vius rota.. Như vậy, VP6opt tái tổ hợp
sau tái cuộn gấp vẫn giữ được cấu trúc tự nhiên, có hoạt tính.
3.3 TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6OPT VIRUS
ROTA TÁI TỔ HỢP
3.3.1 Quy trình gây miễn dịch trên thỏ
3.3.2 Xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA
Kháng thể thu được sau 5 lần gây miễn dịch đã được xác đinh hiệu
giá và kết quả thể hiện trên Hình 3.30.
1000000

655,360

100000

81,920

10000

5,120
2,560

1000
100
10

4

10

163,840

2,560

40
20

1
Thỏ 11
Thỏ 13

M0

M1

M2

M3

M4

M5

Thời điểm lấy máu

Kết quả cho thấy, hiệu giá kháng thể đều tăng cao ở hai thỏ sau
mũi tiêm lần 2. Thỏ 13 cho hiệu giá cao hơn. Chúng tôi chọn huyết
thanh thỏ 13 để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3 Thu nhận và tinh sạch kháng thể bằng sắc ký ái lực cột
protein A-Sepharose
Huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch được tinh sạch qua cột
protein A. Kết quả sắc ký ái lực tinh sạch kháng thể IgG được thể hiện
ở sắc ký đồ Hình 3.31.Kết quả từ sắc ký đồ cho thấy xuất hiện hai đỉnh
tương đương với thời gian lưu là 1,55 phút và 50,85 phút. Đỉnh thứ
nhất được dự đoán là phân đoạn protein không bám cột, đỉnh thứ hai
được dự đoán là phân đoạn IgG được đảy ra khỏi cột bằng Glycine
0,1M. Để khẳng định chắc chắn, chúng tôi tiến hành chạy điện di kiểm
tra (Hình 3.33). Kết quả điện di cũng đã khẳng định protein thu được ở
đỉnh thứ 2 Hình 3.32 là IgG. Nồng độ protein thu được là 3,94 mg/ml.
Độ sạch xác định bằng phương pháp Quanti One-Biorad là 97%.
15


Hình 3.31: Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ Hình 3.32: Phổ điện di tinh
huyết thanh thỏ sử dụng cột protein A- sạch kháng thể thỏ kháng
Sapharose (thể tích gel 2ml, vận tốc dòng VP6opt virus rota
1ml/phút)
3.3.4 Xác định độ đặc hiệu kháng thể
Độ đặc hiệu của kháng thể sau khi tinh sạch so với VP6 tái tổ hợp
và VP6 từ rota virus được đánh giá thông qua hai phương pháp WB và
ELISA. Kết quả thể hiện trên Hình 3.33 và 3.34.
Từ kết quả thu được ta nhận thấy các tín hiệu thu được bằng
phương pháp WB (B) đều xuất hiện vạch đặc hiệu tại 47kDa là trọng
lượng của VP6 tái tổ hợp và trọng lượng 45kDa của protein VP6 của
virus rota. Từ những kết quả này cho chúng ta thấy rằng, kháng thể thu

được là kháng thể đặc hiệu kháng VP6 tái tổ hợp và cả VP6 tự nhiên
của virus rota.
1.8

OD 450 nm

1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
VP6 tự nhiên

A
B
Hình 3.33: Kết quả Western blot kiểm tra
độ đặc hiệu của kháng thể kháng protein
VP6 tái tổ hợp.(A): Nhuộm ink màng
(B): Western blot. Đường chạy 1:
Protein
tổng
từ
chủng
E.coli
16

VP6 T T H

PBS

Hình 3.34: Kết quả ELISA
kiểm tra tính đặc hiệu của
IgGVP6opt
với protein
VP6opt tái tổ hợp và vp6
RRV. Giếng 1: Dịch ly giải
protein từ virus rota Giếng


BL21(DE3)/pET22::VP6opt . Đường 2: ProteinVP6opt tái tổ
chạy 2: Protein VP6 tinh sạch qua cột hợp. Giếng 3: Mẫu trắng
HistrapFF. Đường chạy 3: Protein tổng (PBS).
từ dịch ly giải virus rota.
Kết quả ELISA cũng cho thấy tín hiệu tương tự với cả hai mẫu
VP6 tái tổ hợp và VP6 từ dịch ly giải rota virus. Kết quả này cho thấy
kháng thể kháng VP6 tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên VP6 tự
nhiên.
 Đánh giá tính đặc hiệu của anti-VP6IgG bằng phương pháp
miễn dịch hiển vi
Protein VP6 là kháng nguyên nằm ở lớp capsit giữa của hạt virus
rota, các vùng epitop của kháng nguyên này bộc lộ qua các kênh trên
hạt và thường nằm tập trung vùng xoắn α (vùng A) của cấu trúc VP6.
Chúng tôi sử dụng phương pháp miễn dịch hiển vi để đánh giá khả
năng phát hiện và bắt cặp của kháng thể với VP6 trên hạt virus nguyên
vẹn. Kết quả thể hiện ở Hình 35.
Hình 3. 35: Đánh

giá khả năng nhận
biết của antiVP6IgG với các
vùng bộ lộ epiope
của VP6 protein
trên hạt virus rota
nguyên vẹn

Từ hình ảnh quan sát thấy, với chỉ thị là hạt nano vàng (kích thước
xấp xỉ 30nm) đã được gắn với anti-VP6IgG, các hạt nano vàng này vây
xung quanh hạt virus rota, điều này chứng tỏ anti-VP6IgG có ái lực với
các vùng bộc lộ VP6 trên hạt virus rota nguyên vẹn. Từ kết quả có thể
kết luận anti-VP6IgG đặc hiệu với kháng nguyên VP6 tự nhiên trên
virus rota. Vậy ngoài khả năng phát hiện protein VP6 ở dạng tự do,
kháng thể tạo ra có thể phát hiện VP6 qua các vùng bộc lộ epitope trên
hạt virus rota, điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Aiyegbo và
cộng sự
3.4TẠO QUE THỬ CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA
Que thử trong nghiên cứu này được thiết kế hoạt động theo nguyên
tắc sắc ký miễn dịch như đã mô tả trong phần tổng quan. Dựa vào các
tài liệu đã được công bố, các yếu tố cấu thành que thử được thiết để tạo
que thử ban đầu.
17


Điều kiện thiết lập tạo que thử
ban đầu có kết quả khả quan, vạch
tín hiệu lên rõ ràng trên mẫu âm tính
và dương tính. Để que thử hoạt động
hiệu quả hơn nữa chúng tôi nghiên
cứu các yếu tố ảnh hưởng đến que

thử.

Hình 3.36: Thử nghiệm thiết

lập que thử với điều kiện ban
đầu
Nghiên cứu điều kiện cộng hợp IgGVP6opt với phức PEG-

3.4.1
AuPNs
3.4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ IgGVP6opt cộng hợp – KT1
Trong nghiên cứu này, một dải nồng độ IgGVP6opt kháng VP6
virus rota được sử dụng để tạo cộng hợp với 20 µl AuNP-PEG là 0,1;
0,3; 0,5; 0,7; 1,1 µg IgGVP6opt /que, thí nghiệm lặp lại 2 lần kèm theo
kiểm chứng Kết quả biểu diễn ở Hình 3.37. Từ kết quả thu được,
chúng tôi chọn lựa các nồng độ 0,3 và 0,5 μg IgGVP6opt các nghiên
cứu tiếp theo với điều kiện cố định 2 vạch phun kháng thể 2 là 0,1μg
protein và kháng thể 3 là 0,3μg protein.

Hình 3.37: Ảnh hưởng nồng độ IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs.

Hình 3.38: Ảnh hưởng nồng độ IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs.
Tiếp tục nghiên cứu tiếp theo với các giá trị nồng độ kháng thể 0,3
và 0,5 μg IgGVP6opt với điều kiện cố định 2 vạch phun kháng thể 2 là
0,1μg protein và kháng thể 3 là 0,3μg protein. Từ kết quả của Hình
3.38 nhận thấy, khi xuất hiện thêm vạch kiểm chứng (control) tín hiệu
trên vạch kiểm tra thay đổi. Nồng độ kháng thể cộng hợp (KT1) 0,3μg
đều xuất hiện vạch nhưng cường độ yếu, có thể lượng kháng thể cộng
hợp không tương tác đủ với KT2 và KT3. Kết quả với nồng độ 0,5μg
18

xuất hiện tín hiệu rõ ràng chứng tỏ lượng KT1 đủ phản ứng với 2
kháng thể in trên que. Chúng tôi chọn kháng thể cộng hợp IgGVP6opt
nồng độ 0,5μg protein để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.1.2 Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp
Thí nghiệm xác định với một dải pH từ 3,5-6,0 cho thấy rằng tại
giá trị pH 4,0 cho vạch tín hiệu rõ nét nhất. Kết quả Hình 3.39, chúng
tôi tiến hành lựa chọn pH 4,0 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ EDC/NHS

Hình 3.39: Ảnh hưởng của pH cộng hợp IgGVP6opt với phức PEGAuNPs. KC: mẫu PEG-AuNPs. Que thử ứng với dãy pH cộng hợp
IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs

Hình 3.40: Ảnh hưởng nồng độ EDC/NHS tới cộng hợp IgGVP6opt
với phức PEG-AuNPs.
Xác định nồng độ EDC/NHS thích hợp cho phản ứng cộng hợp
cũng là một việc đáng quan tâm. Ở nghiên cứu này, một dải nồng độ
EDC/NHS được chúng tôi sử dụng để xúc tác cho phản ứng cộng hợp
kháng thể với hạt nano vàng là 0,1; 1; 10; 100; 1000; 10000 µM. Kết
quả ở Hình 3.40 cho thấy tại nồng độ 100µM thấy xuất hiện vạch tín
hiệu đậm nhất. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ EDC/NHS này để thực
hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tạo cộng hợp
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng tạo cộng hợp
giữa kháng thể và phức PEG-AuNPs, phản ứng tạo cộng hợp đã được
tiến hành ở ba nhiệt độ khác nhau (4oC, 28oC và 37oC) trong thời gian
19

là 90 phút và 24 giờ. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.41 cho thấy ở
mẫu 280C 90 phút cho vạch tín hiệu rõ nét nhất. Vì vậy nhiệt độ 280C
được lựa chọn để thực hiện nghiên cứu tiếp theo.
3.4.1.5 Ảnh hưởng thời gian gắn cộng hợp
Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng tạo cộng hợp
giữa kháng thể phức PEG-AuNPs, chúng tôi tiến hành phản ứng tạo
cộng hợp với thời gian như sau: 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút
ở nhiệt độ phòng 280C. Kết quả Hình 3.42 cho thấy sau 60 phút đều
xuất hiện vạch hồng tía, ở thời điểm 30 phút không xuất hiện vạch tín
hiệu. Vậy thời gian đủ tạo cộng hợp là 60 phút, chúng tôi chọn thời
gian này cho các nghiên cứu tiếp.

Hình 3.41: Ảnh hưởng nhiệt độ cộng hợp IgGVP6opt với phức PEGAuNPs.KC: mẫu PEG-AuNPs. Que thử từ những nhiệt cộng hợp PEGAuNPs-IgGVP6opt .

Hình 3.42: Ảnh hưởng thời gian cộng hợp IgGVP6opt với phức
PEG-AuNPs. KC: mẫu PEG-AuNPs. Que thử từ những nhiệt độ
280C cộng hợp PEG-AuNPs-IgGVP6opt ủ trong các thời gian 102,
90, 60 và 30 phút.
3.4.2 Nghiên cứu cố định kháng thể
Thí nghiệm cố định các yếu tố như: kháng thể cộng hợp
IgGVP6opt : 0,5μg/ que, kháng thể in vạch kiểm tra 0,3μg/ que. Kháng
thể in vạch kiểm chứng được phun que với các nồng độ 0,1, 0,2, 0,3,
0,4 và 0,5μg kháng thể/ que. Kết quả ở Hình 3.43.
20


Hình 3.43: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ vạch kiểm chứng (control
line) ảnh hưởng đến tín hiệu của que thử
Quan sát kết quả, chúng tôi nhận thấy: Khi càng tăng nồng độ vạch
kiểm chứng thì vạch đó cũng đậm dần lên. Cường độ mầu đồng đều

chấp nhận cho 2 vạch khi vạch phun kiểm chứng là 0,3μg kháng thể/
que thử. Chúng tôi chọn điều kiện này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.3 Tối ưu dịch ly giải mẫu
Do đặc trưng mẫu phân trẻ em khi tiêu chảy là nhớt, nhày, rất khó
lấy với số lượng đồng đều ở các thời điểm khác nhau nên chúng ta cần
xử lý mẫu phân trước khi nạp vào que thử để kiểm tra. Chúng tôi tiến
hành với 2 loại dung dịch chuẩn bị mẫu khác nhau, quy trình thử
nghiệm trên mẫu phân được trình bày chi tiết ở Mục 2.2.5.6. Kết quả
thể hiện ở Hình 3.44. Đệm hòa mẫu là SPS1: PBS 1X, 0,1M NaCl,
0,5% Tween 20 và SPS2: Sodium Borate 0,1M, 2% Triton X-100.

Hình 3.44: Ảnh hưởng của dịch ly giải mẫu tới tín hiệu của que thử
Kết quả nhận thấy, xét về thành phần đệm đều thấy có chất hoạt
động bề mặt (Tween, Triton X-100), chất này giúp mẫu bị phá vỡ,
nhanh chóng hòa vào đệm, ly giải các hạt virus chứa trong phân. Tín
hiệu khác nhau của 2 đệm này có thể do trong SPS1 chứa muối, các
phân tử muối tạo các cầu Na trong liên kết protein gây hiện tượng
dương tính giả. Đệm SPS2 cho kết quả tốt hơn, dung dịch chạy đều
trên màng, tín hiệu vạch rõ ràng, không xuất hiện vạch ở mẫu âm tính.
Chúng tôi chọn đệm SPS2 làm đệm hòa mẫu khi thử xác đinh trên mẫu
phân.
3.4.4 Đánh giá que thử
21