Bài 1 BC hóa sinh ĐỊNH TÍNH và KHẢO sát PROTEIN

Bài số: 1

Tên bài: ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT PROTEIN
Ngày TN: thứ 2 ngày 09 tháng 01 năm 2017


I.
Phản ứng màu Biure:
1. Nguyên tắc:
- Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide.
- Trong môi trường kiềm, các hợp chất có từ hai liên kết peptide trở lên có thể phả

ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, đỏ hay tím đỏ.
- Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide.
- Là phản ứng dùng để định tính Protein.5
2. Cách tiến hành:
- Điều chế biure từ ure. Cho ure vào ống nghiệm 1, đun sôi, sau khi đông cứng tạo
thành biure. Cho vào ống nghiệm 1 này 1mL NaOH 10%,1 giọt CuSO4 2%.
- Cho vào ống nghiệm 2 1mL dung dich protein trứng, 1mL NaOH 10% và 1 giọt
CuSO4 2%.
3. Kết quả:
- Ở ống nghiệm 1: kết tủa tan và tạo dung dịch trong suốt khi cho NaOH vào, sau đó
chuyển màu tím nhạt khi cho CuSO4 vào.
- Ở ống nghiệm 2: không xảy ra hiện tượng khi cho NaOH vào, sau đó chuyển màu
tím đậm khi cho CuSO4 vào.

ống nghiệm 1

ống nghiệm 2

4. Bàn luận: vì protein trứng có mạch peptide chứa nhóm –CO-NH- (liên kết

peptide) nhiều hơn Biure (có 2 liên kết –CO-NH-) nên màu của protein trứng đậm
hơn màu của biure

2


II.
Các phản ứng kết tủa của protein:
1. Kết tủa protein bằng muối trung tính:
a. Thực hành:

3mL dd protein trứng
+3mL (NH4)2SO4 bão hòa
Cho vào ống nghiệm 1. Lắc đều

Lọc

Tủa 1

Thu dd lọc trong
+ từ từ (NH4)2SO4 tinh thể
Cho đến khi không tan nữa
Cho vào ống nghiệm 2. Lắc đều

Tủa 2

b. Kết quả:
-

Tủa 1 thu được là Globulin.
Tủa 2 là Albumin.

c. Bàn luận:
3


-

-

2.
a.
b.
-

Kết tủa 1: Khi cho (NH4)2SO4 bão hòa vào thì muối sẽ tạo ra ion NH4 + và SO42-.
Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng, lúc này nồng độ của
(NH4)2SO4 ở trạng thái bán bão hòa. Globumin sẽ tủa trước vì nó có khối lượng
phân tử lớn nên dễ kết tủa.
Kết tủa 2: Khi lọc, ta được dung dịch albumin bán bão hòa. Khi thêm (NH4)2SO4
tinh thể cho đến khi không tan, lúc này (NH4)2SO4 ở trạng thái bão hòa nên sẽ làm
albumin kết tủa.
Kết tủa bằng acid hữu cơ:
Tiến hành: lấy vào 2 ống nghiệm, mối ống 1mL protein trứng. Thêm vào:
Ống nghiệm 1: 5 giọt TCA 10% lắc nhẹ.
Ống nghiệm 2: 5 giọt acid sunfosalisilic 10%, lắc nhẹ.
Kết quả:
Ống nghiệm 1: tạo dung dịch có màu trắng đục.
Ống nghiệm 2: tạo dung dịch có kết tủa nhiều hơn do acid sunfosalisilic là acid

mạnh hơn TCA.

ống nghiệm 1

ống nghiệm 2

c. Bàn luận: Vì acid sunfosalisilic có thể tủa protein, polypeptit và acid amin, còn

TCA chỉ có khả năng tủa protein. Nên ống nghiệm 2 sẽ nhiều tủa hơn.
3. Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng:
a. Tiến hành: Lấy 4 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm 1mL dd protein trứng, rồi

nhỏ từ từ các dung dịch sau

4


ống
nghiệm
1
2
3
4

Dung dịch nhỏ vào

Lần 1

Lần 2

Pb(CH3COO)2 2%
AgNO3 2%
FeCl3 0,5%
CuSO4 2%

Nhỏ 1 giọt theo
thành ống cho đến
khi xuất hiện kết tủa

Cho vào lượng thừa để
xem tủa tan

b. Kết quả:

-Ống 1: tủa tan.
- Ống 2: tủa không tan do bạc bền trong dung dịch.
- Ống 3: không có kết tủa do Fe không phải là kim loại nặng.
- Ống 4: tủa tan.

( Từ phải sang trái trình tự 4 ống nghiệm 1,2,3,4).
c. Bàn luận:
- Muối của các kim loại nặng gây biến đổi cấu trúc không gian của protein gây tủa.

-

Tủa tan lại là do sự hấp phụ các ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân protein
làm cho protein tích điện dương.
Muối kim loại nặng tạo tủa và làm biến tính protein do sự phá hủy cấu trúc bậc 2, 3
của protein.

4. Kết tủa protein bằng nhiệt:

Cách tiến hành và kết quả thu được như sau:
Ống
nghiệm
1
2
3

Protein
trứng
2mL
2mL
2mL

4

2mL

5

2mL

CH3COOH
1%

CH3COOH
10%

NaOH

10%

NaCl bão
hòa

Đun sôi
Đun sôi
Đun sôi

1 giọt
5-8 giọt
5-8 giọt
5-8 giọt

Gia nhiệt Kết quả

Đun sôi
5-6 giọt

Đun sôi

kết tủa
Có kết tủa
Dd trong
suốt, ko tủa
Dd màu
vàng
Có kết tủa
lớn
5

(Từ phải sang trái lần lượt là các ống nghiệm từ 1 đến 5).
•
-

Bàn luận:
Ống nghiệm 1: Do protein bị biến tính mất đi cấu trúc nên tạo tủa.
Ống nghiệm 2: Trung hòa ít, lượng H+ ít nên tạo tủa.
Ống nghiệm 3: Lượng H+ nhiều làm cho các phần tử protein tích điện dương nên
không có kết tủa xảy ra.
Ống nghiệm 4: NaOH gây ra tích điện âm với protein.
Ống nghiệm 5: NaOH bão hòa sẽ trung hòa acid và giúp hút nước và trung hòa
điện tích của protin lên dễ dàng tủa.

5. Xác định điểm đẳng điện của protein:

Cách tiến hành: cho vào 4 ống nghiệm dung dịch Na2HPO4 và acid citric, lắc đều sau
đó thêm albumin và cồn vào, tiếp tục lắc nhẹ. Để yên trong 5 phút. Tỉ lệ và kết quả thu
được như bảng sau:
Ống
nghiệm

Na2HPO4
0.2M
(mL)

1
2
3

4

0.50
0.68
0.96
1.32
•

Acid
citric
0.1M
(mL)
1.50
1.32
1.04
0.68

pH tương
ứng

Lượng dd
Albumin
1% (mL)

Rượu
ethylic
(mL)

Kết quả

3,2
3,7
4,7
5,7

1
1
1
1

1
1
1
1

Hơi vẩn đục
Hơi vẩn đục
Hơi vẩn đục
Vẩn đục nhiều nhất

Bàn luận: - do ống nghiệm 4 vẫn đục nhiều nhất (pH tương ứng là 5,7) nên điểm
đẳng điện là ở ống nghiệm 3 có pH tương ứng là 4,7. Vì tại điểm đẳng điện protein
dễ dàng bị kết tủa khi thêm vào 1 lượng nhỏ các chất gây tủa.
6


(Từ phải sang trái lần lượt là các ống nghiệm từ 1 đến 4)

6. Đông tụ sữa bằng protease:
a. Nguyên tắc: xác định hoạt độ đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm

đông tụ một thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định.
b. Tiến hành:
-

-

Giã quả dứa, thu dung dịch nước dứa.
Cho vào ống nghiệm 5mL dung dich sữa gầy, đặt vào bể điều nhiệt đến khi đạt 50
độ C.
Cho vào 1 lượng enzym (nước dứa), lắc đều.
Tiếp tục giữ ở 50 độ C đến khi xuất hiện những hạt sữa nhỏ. Thời gian tính từ lúc
bắt đầu cho enzym vào.
c. Kết quả đo và tính toán:
Thể tích dung dịch sữa :5mL
Thể tích enzym: 0.1mL
Thời gian đông tụ: 3 phút 30 giây.

Kết quả tính:
7


E=

Trong đó: E: hoạt lực đông tụ sữa (ĐV/mL)
Vs: thể tích dd sữa (mL)
T: thời gian đông tụ sữa (phút)
VE: thể tích enzym sử dụng (mL)
K: độ pha loãng dung dịch enzym

8