Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)


MỤC TIÊU
1. Trình bày được nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2. Trình bày được nguyên tắc và ứng dụng của các kỹ thuật
của HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion, sắc ký loại cỡ.
3. Mô tả và trình bày nguyên tắc, cấu tạo và ứng dụng của
một số detector thường dùng trong máy HPLC.


TÀI LIỆU THAM KHẢO


TÀI LIỆU THAM KHẢO


SẮC KÝ LỎNG
Pha động
Lỏng

Pha tĩnh
- Rắn
- Lỏng

High Performance Liquid Chromatography

Các bộ phận của máy HPLC


Bình chứa dung môi giải ly cột
• Có 4 bình dung môi (đường dung môi) → rửa giải theo tỷ lệ

mong muốn
• Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh,
có cái nắp bảo vệ, nắp có lỗ hở thông với khí trời.

• Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn một nút
lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và giữ ống luôn
ở dưới mặt thoáng của chất lỏng.

• Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí
hoà tan trong pha động, gọi là khử bọt khí (degassing: chạy
siêu âm, sục khí trơ như heli...)


Dung môi dùng cho HPLC

• Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được điều khiển
bằng hệ thống điều khiển.
• Có hai kiểu chương trình dung môi


Dung môi dùng cho HPLC
Có hai kiểu sử dụng pha động trong việc giải ly:
• Giải ly đơn nồng độ (đẳng dòng - isocratic elution)

• Giải ly nồng độ tăng dần tuyến tính (gradient elution):

Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch
đệm (pha trong nước), methanol, acetonitril hoặc hỗn hợp của
các loại trên.


Dung môi dùng cho HPLC
Lưu ý:
• Tất cả dung môi phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn
HPLC (HPLC grade solvent), không có lẫn bụi bẩn và phải
được khử không khí.
• Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và khử khí
(sục mạnh khí helium vào bình hoặc đặt bình đã được mở
nắp vào một bồn siêu âm)
• Nếu máy sử dụng đầu dò UV, dung môi sử dụng phải trong
suốt đối với bước sóng mà đầu dò UV đang hoạt động để
phát hiện mẫu chất.


Bơm cao áp
• Áp suất cao lên đến 7000 psi (48,3 MPa) để bơm một dung
môi (pha động) để xuyên ngang qua một pha tĩnh (được
nhồi thật chặt bởi những hạt thật mịn) với một vận tốc không
đổi, thường vào khoảng 0,5-4,0 ml/phút.
• Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung
môi hữu cơ và các dung dịch đệm.


Cột sắc ký, cột bảo vệ

• Thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo
• Cột nhồi thường: dài 10-30 cm, đường

kính trong 4-10 mm, cỡ hạt 5 hoặc 10
um. Số đĩa lý thuyết dao động 40000
đến 60000/m.

• Microcolumn: dài 3-7,5 cm, đường kính
trong 1-2 mm, cỡ hạt 3 hoặc 5 pm. Có
trị số N đến 100000 đĩa/m. Ưu điểm nổi

bật của chúng là chạy sắc ký tốn ít
dung môi và ít thời gian.


Cột sắc ký, cột bảo vệ
• Chất nhồi: chế tạo từ silica (silic dioxyd)
• Ngoài ra, còn có các chất nhồi khác như nhôm oxyd, polyme
xốp, nhựa trao đổi ion... tuỳ thuộc vào loại hình sắc ký.
• Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó phải được cho

đi ngang qua một cột bảo vệ (guard column), sử dụng để lọc
bỏ những tạp chất còn sót lại.
• Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại
nhưng kích thước hạt lớn hơn. Cột bảo vệ không đắt tiền
nên cần được thay mới thường xuyên.


Cột sắc ký, cột bảo vệ
• Trong sắc ký lỏng, vận hành thiết bị thường ở nhiệt độ

phòng không cần điều nhiệt cột.
• Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì
nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C)

• Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho
cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số
< 0,05°C
• Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ
bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ


Bộ phận tiêm mẫu
• Ống chứa mẫu (sample loop), là van có hai cổng, giúp định

hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai
con đường khác nhau.


Bộ phận tiêm mẫu
• Mẫu khảo sát (ở áp suất thường) được tiêm vào máy nhờ
một kim tiêm. Gạt van theo chiều quy định, ống chứa mẫu

được nối thông vào bên trong máy, pha động lỏng thổi
ngang qua đoạn ống chứa mẫu, cuốn hết các chất mẫu nằm
trong ống đi vào trong máy.

• Khi máy đang hoạt động đều, pha động lỏng đi xuyên ngang
qua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao.
• Khi con đường này hoạt động thì đường kia thông ra không

khí bên ngoài máy, được khí thổi sạch để sẵn sàng chứa
một mẫu mới cho lần phân tích sau.


Đầu dò (Detector)
• Đầu dò theo dõi dòng chảy của dung môi giải ly cột để biết
khi nào thì các hợp chất đi ra khỏi cột.
• Mỗi loại đầu dò có một nguyên tắc hoạt động khác nhau,

đều nhằm đạt đến mục đích cuối cùng bằng một tín hiệu
điện tử và tín hiệu này phải tỉ lệ với một số tính chất của
chất phân tích, thí dụ mức hấp thu UV, chỉ số khúc xạ...
• Mức độ đáp ứng của đầu dò phải tỉ lệ với số lượng của mỗi
chất phân tích hiện diện trong hỗn hợp mẫu phân tích.
• Lựa chọn loại đầu dò tùy loại hợp chất muốn phân tích và
các hợp chất đó có các đặc trưng hoá học nào.


Đầu dò (Detector)

Một đầu dò HPLC lý tưởng đạt một số tiêu chuẩn:
• Độ bền cao. Không làm hư hại mẫu phân tích
• Có độ nhạy cao và cho kết quả có tính lặp lại
• Cho đáp ứng tương đồng đối với những chất phân
tích có cấu trúc hoá học tương đồng
• Không thay đổi khi có sự thay đổi nhiệt độ hoặc áp
suất
• Có thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc của
dòng chảy của dung môi giải ly.
• Dễ sử dụng.

Không có một loại đầu dò nào thoả mản hết các yêu cầu
Đầu dò khối phổ và đầu dò điện hoá


Đầu dò (Detector)

Các loại đầu dò HPLC:
• Đầu dò theo dõi một tính chất hóa học đặc trưng của
các chất phân tích mà dung môi giải ly không có. Các
tính chất đó là: sự hấp thu UV (ultraviolet absorbance),
hiện tượng huỳnh quang (fluorescence).
• Đầu dò theo dõi sự hiện diện một khối vật chất trong
dung môi giải ly, khối vật chất đó chính là hợp chất
phân tích: chỉ số khúc xạ (refractive index), hằng số
điện môi (dielectric constant).
• Đầu dò kết hợp: tại thời điểm phát hiện, một lượng
dung môi có chứa mẫu được loại bỏ bớt: phương
pháp ion hóa ngọn lửa (FID) hoặc bằng khối phổ
(Masse spectroscopy).


PHÂN LOẠI DỰA VÀO BẢN CHẤT
TƯƠNG TÁC
•

Sắc ký phân bố (partition chromatography)

•

Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-solid

chromatography)
•

Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

•

Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)
VD: nguyên lý sắc ký trao đổi ion
(acide amine)
pH2

SO3

-

+

Na

H3N

+

COOH

Ion-exchange Resin

SO3

-

H3 N
Na

+

+
-

COO

pH4.5

Sắc ký loại trừ kích thước


PHÂN LOẠI DỰA VÀO BẢN CHẤT
TƯƠNG TÁC
Loại cột

Tính chất của hợp chất có thể phân tích

Cột pha thường,
pha đảo,
pha tạo nối

- Có trọng lượng phân tử nhỏ (<2000).
- Không có mang điện tích.

- Có thể có tính phân cực hoặc không.
- Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ
hoặc nước.
- Có trọng lượng phân tử nhỏ (<2000).
- Phân tử có mang điện tích.
- Loại hợp chất hòa tan trong nước.
- Có trọng lượng phân tử nhỏ hoặc lớn.
- Không có mang điện tích.
- Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ
hoặc nước.

Cột trao đổi ion

Cột sắc ký gel


Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Có thể phân thành hai dạng tuỳ thuộc vào pha tĩnh:
• Sắc ký lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các
hạt chất mang rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ

chất phân tích liên quan đến sự phân bố giữa 2 pha lỏng.
• Sắc ký pha liên kết (Bonded-phase chromatography - BPC):
Ở đây, pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang
rắn (silica, alumina...).
• Sắc ký pha liên kết chiếm ưu thế dần thay thế cho sắc ký
lỏng - lỏng.


Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Pha tĩnh
• Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd
(silica). Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng với dẫn

chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.
• Ở đây R có thể là mạch thẳng có 18 hoặc 8 carbon hoặc các
nhóm chức hữu cơ khác như amin mạch thẳng, nitril,
hydrocarbon thơm. Tính chất phân cực của pha tĩnh thay đổi
tuỳ thuộc vào gốc R. Dựa vào gốc R này người ta phân ra
hai nhóm: Pha tĩnh phân cực và pha tĩnh không phân cực


Pha tĩnh-Pha đảo

Pha tĩnh bình thường của LC

(Stationary Phases for Reversed-Phase LC)

(Stationary Phases for Normal LC)

 Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl)
hoặc C18 (n-octyldecyl).
 Pha động là H2O + dung môi hòa tan
(acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol)
 Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh
nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm
tăng thời gian chạy mẫu

 Pha động tương đối không phân cực:
Hexane, Isopropyl eter, toluene…

 Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa
ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha
động sẽ giảm thời gian chạy mẫu


Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Chon pha tĩnh và pha động
Ba thành phần tương tác với nhau: pha tĩnh, pha động và chất
phân tích.

Cần chọn điều kiện để cân bằng lực tương tác giữa ba thành
phần này. Độ phân cực của các thành phần là chỉ tiêu mô tả
định tính lực tương tác.
• Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan.
• Với pha động: Dựa vào trị số P’
• Với chất phân tích: Dựa vào nhóm chức.