KHẢO sát THÀNH PHẦN hóa học cây đại BI (BLUMEA BALSAMIFERA) họ cúc (ASTERACEAE)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----o0o-----

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY ĐẠI BI (BLUMEA BALSAMIFERA)
HỌ CÚC (ASTERACEAE)
Chuyên ngành: Hóa Lý Thuyết và Hóa Lý
Mã số: 604431

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ THANH MAI

Tp.Hồ Chí Minh – 2010


Con xin chân thành cảm ơn Bố, Mẹ đã sinh con ra, nuôi nấng, dạy dỗ con và đã
tạo điều kiện thuận lợi nhất để con theo đuổi và hoàn thành khóa học. Đặc biệt xin kính
tặng thành quả này cho Mẹ của con, Mẹ đã giúp đỡ, lo lắng cho con rất nhiều trong
suốt thời gian con đi học và kể cả lúc con đi làm, lập gia đình riêng. Xin cảm ơn công
ơn sinh thành và nuôi dưỡng của Bố Mẹ
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai cô hướng dẫn, Cô Nguyễn Thị Thanh
Mai và Cô Nguyễn Anh Thy đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ em rất nhiều về vật chất, về
tinh thần, đã truyền đạt rất nhiều kinh nghiệm quý báu cho em. Xin chân thành cảm ơn
Thầy Nguyễn Trung Nhân đã giúp đỡ, chỉ bảo, đóng góp nhiều ý kiến để hoàn thiện
quyển luận văn, cảm ơn Thầy đã cho em mượn dụng cụ trong suốt quá trình làm thực
nghiệm.
Trong quá trình làm đề tài em cũng đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các Thầy

Cô trong khoa hóa và bộ môn hóa lý. Xin cảm ơn Thầy Tôn Thất Quang đã chỉ bảo
những kinh nghiệm giải phổ. Cảm ơn Cô Hồ Thị Cẩm Hoài đã tạo nhiều điều kiện
thuận lợi trong quá trình em làm thực nghiệm ở phòng Hóa Lý Hữu Cơ.
Xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo trường CĐ GTVT III, nơi tôi đang công tác, đã
hỗ trợ về mặt vật chất, cảm ơn các thầy cô, đồng nghiệp của tôi ở khoa cơ bản - cơ sở
đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi về thời gian, động viên ủng hộ tinh thần tôi rất nhiều.
Cảm ơn các em Nguyễn Xuân Hải, Vũ Năng An đã qua lại giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm luận văn.
Xin cảm ơn em gái tôi đã động viên, giúp đỡ chị rất nhiều.Và sau cùng xin dành
lời cảm ơn đến người Thầy, người bạn đời của tôi (giờ đang đi học ở xa) đã giúp tôi tìm
kiếm tài liệu và có những chỉ dẫn quý báu trong việc hoàn thành quyển luận văn này.


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
MỞ ĐẦU
1. TỔNG QUAN
1.1 Mô tả thực vật .......................................................................................... 1
1.1.1 Tên gọi............................................................................................ 1
1.1.2 Mô tả thực vật................................................................................. 1
1.1.3 Phân bố sinh thái ............................................................................ 4
1.1.4 Tính vị và công năng ...................................................................... 4
1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ....... 6
1.3 Hoạt tính ức chế enzym XO (Xanthine oxidase)................................. 16
1.3.1 Enzym XO .................................................................................... 16
1.3.2 Vai trò enzym XO trong bệnh gút và các bệnh lý khác ............... 16

1.3.3 Triệu chứng bệnh gút.................................................................... 18
1.3.4 Điều trị bệnh gút........................................................................... 19

2. NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 21
2.1 Giới thiệu chung .................................................................................... 21
2.2 Biện luận và kết quả ............................................................................. 21
2.2.1 Khảo sát phổ của hợp chất (1) .................................................. 23


2.2.2 Khảo sát phổ của hợp chất (2) .................................................. 27
2.2.3 Khảo sát phổ của hợp chất (3) .................................................. 30
2.2.4 Khảo sát phổ của hợp chất (4) .................................................. 34
2.2.5 Khảo sát phổ của hợp chất (5) .................................................. 37
2.2.6 Khảo sát phổ của hợp chất (6) .................................................. 40
2.2.7 Khảo sát phổ của hợp chất (7) .................................................. 44
2.3 Kết quả thử hoạt tính enzym XO ......................................................... 47
2.3.1 Hoạt tính ức chế enzym XO của các mẫu cao thô........................ 47
2.3.2 Hoạt tính ức chế enzym XO của các phân đoạn từ cao EtOAc.... 48
2.3.3 Hoạt tính ức chế enzym XO của các phân đoạn từ cao CHCl3 .... 49
2.3.4 Hoạt tính ức chế enzym XO của các hợp chất cô lập................... 50

3. THỰC NGHIỆM ........................................................................................... 53
3.1 Điều kiện thực nghiệm........................................................................... 53
3.2 Ly trích cao thô ...................................................................................... 54
3.3 Quá trình cô lập ..................................................................................... 56
3.3.1 Cao CHCl3 .............................................................................. 56
3.3.2 Cao EtOAc .............................................................................. 58
3.4 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO.......................................... 60
3.4.1 Nguyên tắc ............................................................................. 60
3.4.2 Chuẩn bị hóa chất.................................................................... 60

3.4.3 Chuẩn bị mẫu .......................................................................... 62
3.4.4 IC50 và cách xác định ........................................................................62

4. KẾT LUẬN...............................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
s

: Singlet, mũi đơn

d

: Doublet, mũi đôi

dd

: Doublet of doublet, mũi đôi đôi

J

: Coupling constant, hằng số ghép spin

SKC

: Sắc ký cột

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

BHA

: Butylated hydroxyanisole

BHT

: Butylated hydroxytoluene

DPPH

: 2,2-Diphenyl-1- picryhydrazyl

CHCl3

: Cloroform

MeOH

: Metanol

DMSO

: Dimetyl sulfoxid

EtOAc

: Etyl acetat

ROIs

: Reactive oxygen intermediates

XO

: Xanthine Oxidase

I

: Inhibitory (ức chế)

IC50

: Inhibitory concentration (nồng độ ức chế 50%)

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1- Thành phần hóa học của lá cây đại bi................................................... 15
Bảng 2.1 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (1) trong dung môi DMSO-d6 .......................... 25
Bảng 2.2 - So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi DMSO-d6 và hợp
chất quercetin 3,7,3’- trimetyl eter trong dung môi DMSO-d6 ..............
............................................................................................................ 26
Bảng 2.3 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (2) trong dung môi CDCl3 và CD3OD.............. 28
Bảng 2.4 - So sánh phổ 1H-NMR của hợp chất (2) trong dung môi CDCl3 và CD3OD
và hợp chất quercetin-3,3’,4’-trimetyl eter trong dung môi CCl4 và C6D6
.......................................................................................................... 29
Bảng 2.5 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (3) trong dung môi DMSO-d6........................... 32

Bảng 2.6 - So sánh phổ 1H-NMR và

13

C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi

DMSO-d6 và hợp chất 5,7,3’,5’-tetrahydroxyflavanon trong dung môi
DMSO-d6 ............................................................................................ 33
Bảng 2.7 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (4) trong dung môi CDCl3 và CD3OD............. 35
Bảng 2.8 - So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (4) trong dung môi CDCl3
và CD3OD và hợp chất dihydroquercetin-7,4’-dimetyl eter trong dung môi
DMSO-d6 . .......................................................................................... 36
Bảng 2.9 - Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz),

13

C-NMR (100 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (5) trong dung môi DMSO-d6........................... 38


Bảng 2.10 - So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất (5) trong dung môi DMSO-d6 và hợp
chất dihydroquercetin trong dung môi DMSO-d6 ............................. 39
Bảng 2.11 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (6) trong dung môi CDCl3 và CD3OD......
.......................................................................................................... 42
Bảng 2.12 - So sánh phổ 1H-NMR và

13

C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi

CDCl3 và CD3OD và hợp chất (2R,3R)-4’-O-metyldihydroquercetin
trong dung môi aceton - d6 .............................................................. 43
Bảng 2.13 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (7) trong dung môi CDCl3 và CD3OD......
......................................................................................................... 45
Bảng 2.14 - Kết quả hoạt tính ức chế enzym XO của các mẫu cao thô ................ 47
Bảng 2.15 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO từ các phân đoạn cao EtOAc..
............................................................................................................ 48
Bảng 2.16 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO từ các phân đoạn cao CHCl3..
............................................................................................................ 49
Bảng 2.17 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO của các hợp chất (3), (4), (6) và
(7) ..................................................................................................... 51

Bảng 2.18 - Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym XO của hợp chất (6) và (7). ..... 51


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 - Cây đại bi ............................................................................................... 2
Hình 1.2 - Hoa cây đại bi......................................................................................... 3
Hình 1.3 - Công thức cấu tạo của cryptomeridiol ................................................... 6
Hình 1.4 - Công thức cấu tạo các sesquiterpen ....................................................... 7
Hình 1.5 - Công thức cấu tạo của 5-hydroxy-7-metoxychromon ........................... 8
Hình 1.6 - Công thức cấu tạo của 5-hydroxy-3,7,3’,4’-tetrametoxyflavon ............ 8
Hình

1.7

-

Công

thức

cấu

tạo

của

(2R,3R)-3,5,3’-trihydroxy-7,4’-

dimetoxydihydroflavonol ............................................................. 8
Hình 1.8 - Công thức cấu tạo của 3-O-7’’-biluteolin .............................................. 9

Hình 1.9 - Công thức cấu tạo của dihydroflavonol ............................................... 11
Hình 1.10 - Công thức cấu tạo của 2 ester sesquiterpenoid .................................. 13
Hình 1.11- Các flavonoid cô lập từ cây đại bi và giá trị IC50 của chúng .............. 14
Hình 1.12 - Công thức cấu tạo của luteolin........................................................... 14
Hình 1.13 - Tinh thể urat đóng ở các khớp xương của người mắc bệnh gút......... 19
Hình 1.14 - Tổn thương ở tay của người mắc bệnh gút ........................................ 19
Hình 2.1 - Công thức cấu tạo của hợp chất (1)...................................................... 23
Hình 2.2 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (1) ....................................... 24
Hình 2.3 - Công thức cấu tạo hợp chất (2) ............................................................ 27
Hình 2.4 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (2) ....................................... 28
Hình 2.5 - Công thức cấu tạo hợp chất (3) ............................................................ 30
Hình 2.6 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (3) ............................. 31
Hình 2.7 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (3) ....................................... 32
Hình 2.8 - Công thức cấu tạo hợp chất (4) ............................................................ 34
Hình 2.9 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (4) ....................................... 35


Hình 2.10 - Công thức cấu tạo của hợp chất (5). .................................................. 37
Hình 2.11 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (5). .................................... 38
Hình 2.12 - Công thức cấu tạo của hợp chất (6). .................................................. 40
Hình 2.13 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (6). .......................... 41
Hình 2.14 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (6). .................................... 41
Hình 2.15 - Công thức cấu tạo của hợp chất (7) ................................................... 44
Hình 2.16 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (7) ........................... 45
Hình 2.17- Một số tương quan HMBC của hợp chất (7) ...................................... 46
Hình 2.18 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các
cao....................................................................................................... 47
Hình 2.19 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các
phân đoạn F2, F3, F4, F5 và F6 từ cao EtOAc................................... 49
Hình 2.20 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các

phân đoạn F2, F3 và F4 từ cao CHCl3 ............................................ 50
Hình 2.21 - Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) enzym XO theo nồng độ của các
hợp chất (3), (4), (6) và (7) ................................................................. 52
Hình 3.1 - Phản ứng tạo acid uric.......................................................................... 60
Hình 3.2 - Công thức cấu tạo của allopurinol ....................................................... 62


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 - Quá trình oxy hóa của hypoxanthine và xanthine bằng xúc tác XO... 16
Sơ đồ 1.2 - Tác nhân oxy hóa trung gian (ROIs) và sự tấn công lên các phân tử sinh
học.................................................................................................... 17
Sơ đồ 3.1 - Quy trình ly trích các cao từ cây đại bi ............................................... 55
Sơ đồ 3.2 - Quy trình cô lập hợp chất (1) và (2) từ cao CHCl3 ............................ 57
Sơ đồ 3.3 - Quy trình cô lập hợp chất (4 ) từ cao CHCl3 ...................................... 58
Sơ đồ 3.4 - Quy trình cô lập hợp chất (3), (6), (7) từ cao EtOAc......................... 59
Sơ đồ 3.5 - Quy trình cô lập hợp chất (5) từ cao EtOAc ....................................... 59
Sơ đồ 3.6 - Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO.......................................... 61


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nhiệt đới có hệ động thực vật phong phú và đa dạng, đặc
biệt là có nhiều cây cỏ với dược tính quý giá. Từ ngàn đời, nhân dân ta đã biết vận
dụng những dược tính từ nguồn dược liệu tự nhiên trong phòng ngừa và điều trị những
bệnh thông thường cho đến những bệnh nan y. Với ưu điểm ít tác dụng phụ đi kèm,
những bài thuốc từ thảo mộc vẫn chiếm ưu thế đáng kể trong thời đại Tây y phát triển
như hiện nay.
Ngày nay, cùng với việc nghiên cứu ly trích các hoạt chất có dược tính từ các
nguồn dược thảo để bào chế thành các chế phẩm có hàm lượng hoạt chất cao nhằm đáp
ứng và nâng cao hiệu quả trong điều trị bệnh, các nhà khoa học vẫn không ngừng khảo
sát và nghiên cứu thành phần hoá học của nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá này,

nhằm tìm tòi phát hiện những tính năng mới có thể ứng dụng trong y học.
Cây đại bi (Blumea balsamifera) từ lâu đã được biết đến như là một thần dược
trong chữa trị bệnh ho, viêm họng, đau lưng, thấp khớp, xông hơi giải cảm. Ngoài ra,
cây đại bi còn có đặc tính chữa bệnh viêm nhiễm, viêm gan... Bên cạnh đó, thử nghiệm
trên khả năng ức chế enzym XO, enzym đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra bệnh
gút, cho kết quả rất khả quan... Điều này đã thôi thúc chúng tôi mong muốn tìm hiểu
thêm về thành phần hóa học của cây đại bi, nhằm góp phần đi sâu vào ứng dụng trong
chữa trị căn bệnh thời đại phổ biến hiện nay - bệnh gút.


PHẦN TỔNG QUAN

9


CHƯƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN
1.1- Giới thiệu các hợp chầt Phenol và dẫn xuất.
Phenol có nhiều dẫn xuất phụ thuộc vào nhóm thế gắn lên vòng hương
phương của Phenol. Các dẫn xuất họ Phenol vừa do các phản ứng phân huỷ của
thực vật, các hợp chất hữu cơ có trong tự nhiên , vừa do hoạt động sản suất của các
nhà máy tạo ra.
Theo Tổ chức bảo vệ môi trường của Mỹ - ( EPA ) [ 24] hiện có 11 hợp chất
Phenol gây ô nhiễm môi trường chủ yếu hiện nay là: 4-Cloro-3-Methylphenol, 2Clorophenol, 2,4-Diclorophenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,4-Dinitrophenol, 2-Methyl4,6-Dinitrophenol,

2-Nitrophenol,

4-Nitrophenol,

Pentaclorophenol,

2,4,6-

Triclorophenol và Phenol.
Ngoài ra, còn nhiều dẫn xuất họ Phenol khác như : Pyrocatechol, Resorcinol,
3-NitroPhenol, 1,3-Diclorophenol, 2,3,4,6-Tetraclorophenol …. Các dẫn xuất họ
Phenol đều rất độc, chỉ một lượng rất nhỏ trong nước ( > 1 ppb ) cũng đã ảnh hưởng
rất lớn đến sức khoẻ của con người cũng như các loài sinh vật sống trong môi
trường nước. Khi nồng độ của Phenol và các dẫn xuất nhỏ hơn 1 ppb tuy có độc
tính thấp cũng ảnh hưởng nhiều đến mùi vị, màu sắc của nước và đời sống của các
loài sinh vật trong nước.
1.1.1- Tính chất vật lí và tính chất hóa học của các hợp chất Phenol[1-2,24]
1.1.1.1- Tính chất vật lí của các hợp chất Phenol.
Phenol có công thức phân tử là C6H5OH. Đa số các hợp chất Phenol tồn tại
dạng rắn ở nhiệt độ phòng như Phenol, Nitrophenol, các dẫn xuất Clorophenol (
gồm 2 nhóm thế –Cl trở lên) …, một số hợp chất Phenol khác tồn tại ở dạng lỏng
như Cresol, mono-Clorophenol ( gồm chỉ một nhóm thế –Cl ).
Bảng 1.1: Tính chất vật lí của một vài hợp chất Phenol.
Khối
STT

Công thức

lượng

phân tử

phân
tử

Tính tan

Trạng thái vật lý

Điểm

Điểm

trong

chảy

sôi

nước
(20oC)

10


OH

1

94

chất lỏng hoặc chất
rắn

43oC

181oC

9.3g/100g

-

C6H5OH
Phenol
OH

2

OH

110,1

chất rắn màu vàng

110oC

182oC

110,1

chất rắn màu trắng

105oC

245.5oC 43g/100g

139,11 tinh thể màu vàng

114oC

279.0oC -

C6H4(OH)2
Resorcinol
OH
OH

3

C6H4(OH)2
Pyrocatechol
OH

4

NO2

C6H5NO3
p-nitrophenol

1.1.1.2- Tính Chất Hoá Học Của Các Hợp Chất Phenol
Phenol là dẫn xuất của Hydrocarbon thơm do sự thế một nguyên tử -H trong
nhân bằng một nhóm -OH. Tuỳ theo các nhóm thế gắn lên vòng hương phương của
Phenol mà có các dẫn xuất khác nhau. Hầu hết các hợp chất Phenol đều có tính
acid.

11

Các nhóm thế thường được gắn lên vòng hương phương của Phenol là: nhóm
–Nitro, nhóm – Methyl hoặc nhóm –Cloro …. Vòng hương phương của Phenol có
thể gắn đồng thời nhiều nhóm thế giống nhau hoặc khác nhau.
Một vài loại phản ứng mà các hợp chất Phenol thường tham gia :
- Phản ứng Eter hoá.

OH

-H

O-

CH3Cl

O-CH3

Phenol

PhenylMetyl Eter

- Phản ứng Ester hoá.
OH

CH3-CO-Cl

Phenol

OOC-CH3

+ HCl

Phenylacetate

- Phản ứng tạo thành muối trong môi trường kiềm.
OH + OH-

O-

Phenol

+

H2O

Ion Phenolate

- Phản ứng trên vòng hương phương như phản ứng Nitro hoá, Halogen hoá,
Alkil hoá, Sulfon hóa ….
Phản ứng Nitro hoá: MonoNitro hóa Phenol có thể thực hiện với acid
Nitric loãng tại nhiệt độ phòng.
NO2
OH
Phenol

HNO3

OH
O-Nitrophenol

12


Với acid Nitric đậm đặc, sự đa Nitro hóa Phenol tạo thành 2,4,6Trinitrophenol.
NO2

HNO3đđ
O 2N

OH

OH
NO2

Phenol

2,4,6-Trinitrophenol

Phản ứng Halogen hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng trí hoán với nước brom
ở vị trí orto và para để tạo trầm hiện màu trắng là 2,4,6-Tribromophenol. Đây cũng
là phản ứng biểu tánh thông dụng để nhận biết Phenol.
Br
+ 3 Br2 ( H2O )

OH

Br

OH

Br

Phenol

2,4,6-Tribromophenol
Phản ứng Alkil hoá: Phenol phản ứng với halogenur alkil với xúc tác là
AlCl3 hoặc AlBr3
OH

CH3
CH3Cl / AlCl3

+ HCL

OH
o-Methylphenol

Phenol

Phản ứng Sulfon hóa: Phenol dễ dàng cho phản ứng sulfon hoá tạo thành sản
phẩm trí hoán orto hoặc para. Sản phẩm chính tuỳ thuộc vào điều kiện nhiệt độ
phản ứng.
SO3H
250C

OH
Phenol

OH
o-Sulfonphenol

H2SO4 đđ , 100 0C

H2SO4 đđ
1000C

HO3S

OH
p-Sulfonphenol

13


Phản ứng Oxid hoá. Các hợp chất Phenol dễ bị Oxid hoá tạo thành các hợp
chất Quinon như Benzoquinon. Tác nhân Oxid hoá có thể là Oxi trong không khí.
OH
Phenol

O2

O

O

+ H2 O

Benzoquinon

1.1.2- Nguồn gốc, độc tính, ảnh hưởng, liều lượng cho phép của Phenol
và dẫn xuất trong môi trường nước .[9 – 10, 23 – 28, 38 ]

1.1.2.1- Nguồn gốc, độc tính và ảnh hưởng của các hợp chất Phenol và dẫn
xuất.
Phenol và dẫn xuất có trong các ngành công nghiệp như dệt, nhuộm, nhựa,
thuốc, thuốc trừ sâu, chất chống oxi hoá, giấy, công nghệ dầu hoả …. Ngoài ra, hợp
chất Phenol cũng được sinh ra tự nhiên như sự phân hủy của thực vật, các hợp chất
hữu cơ …. Hầu hết các hợp chất Phenol khi được thải rửa từ các nhà máy đều đi
vào môi trường nước. Chúng không những gây ô nhiễm môi trường sinh thái mà
còn gây hại đến con người và các loài sinh vật sống trong nước. Con người nếu tiếp
xúc trong thời gian dài với các hợp chất Phenol có thể bị bệnh ung thư.
Các kết quả nghiên cứu [ 38 ] cho thấy Phenol và dẫn xuất có độc tính cao. Giá
trị LC50 ( nồng độ gây chết 50 % số cơ thể người hay động vật khi cơ thể đó được
đưa vào một lượng nhất định chất độc ) và EC50 ( nồng độ gây hại 50 % quần thể
trong điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng ) đối với giáp xác và cá vào khoảng 3
– 7 mg/l. Những ảnh hưởng chính đến cơ thể con người gồm tác động đến tim, gây
đau hệ hô hấp, gây nhiễm acid trong quá trình trao đổi chất, hỏng thận, sự tuần hoàn
máu, ảnh hưởng hệ thần kinh…. Liều thấp nhất có thể gây tử vong bằng đường tiêu
hoá là khoảng 4.8 g và trong thời gian không quá 19 phút. Những triệu chứng do hít
phải Phenol như chán ăn, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt….
Các hợp chất Phenol rất dễ bị phân hủy khi để ở nhiệt độ phòng, trong môi
trường tự nhiên ( từ vài ngày đến một tuần ) và phân huỷ rất nhanh dưới tác dụng
của ánh sáng mặt trời. Do vậy, trong quá trình xác định hay cất trữ, các hợp chất

14


Phenol cần được bảo quản trong bình chứa xẫm màu, để trong môi trường kín và có
nhiệt độ nhỏ hơn 4oC.
1.1.2.2- Hàm lượng cho phép của Phenol và dẫn xuất trong nước.
Bảng 1.2: Giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ Phenol và dẫn xuất
Hàm lượng Phenol tổng

Đối tượng

(mg/l)
Nước sinh hoạt

Nước bề mặt

0.001 mg/l

Nước dùng cho nông
nghiệp và nuôi trồng thủy

0.02 mg/l

sản
Nước ngầm

0.001 mg/l
Đổ vào các khu vực dùng
làm nguồn nước cấp cho

≤ 1 mg/l

sinh hoạt
Nước thải

Dùng làm nguồn nước
tưới tiêu, bơi lội, nuôi

≤ 2 mg/l

trồng thủy sản
Không được phép đổ ra
môi trường

≥ 5 mg/l

Theo điều luật 80/778/EC do cộng đồng Châu Âu ban hành thì hàm lượng
Phenol tổng cộng được phép hiện diện trong nước uống là 0.5 μg/l và 0.1 μg/l cho
mỗi chất
1.2- Một sồ phương pháp được dùng để xác định các hợp chất Phenol.
1.2.1- Phương pháp sắc kí [3-4, 8, 12,

17– 37 ]

1.2.1.1- Nguyên tắc.
Sắc ký là một kỹ thuật tách những hỗn hợp gồm nhiều chất thành các thành
phần đơn giản và định lượng từng chất.
Dựa vào ái lực của các cấu tử với pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là
chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký

15


có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản
hoặc là những hạt nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất cần phân tích ở lại.
Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và
pha động. Sự tác động này đối với từng chất khác nhau do đó chất cần phân tích có
thể ra nhanh hay chậm. Ngoài ra cột sắc ký phải đủ dài để sự tiếp xúc giữa chất cần

xác định và pha tĩnh được lặp lại nhiều lần. Quá trình di chuyển của pha động bên
trong cột sắc ký gọi là quá trình rửa giải.
1.2.1.2- Phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ (GC-MS)
Dẫn xuất t-butyldimethylsilyl giữa các chất họ Phenol với N-(tbutyldimethylsilyl) - N- methyl-trifluoroacetamid được xác định bằng phương pháp
sắc ký khí với đầu dò khối phổ bẫy ion (IT-MS). Ở chế độ tiêm không chia dòng,
2μL mẫu xác định được cho vào cột DB-5 MS 30 m × 0.25 μm cùng với chương
trình nhiệt thích hợp cho phép xác định 11 hợp chất Phenol trong nước sông và
nước biển ở giới hạn phát hiện từ 0.010 μg/l đến 0.045 μg/l. Tuy nhiên, phương
pháp này không cho phép xác định 2,4-Dinitrophenol và hợp chất methyl Phenol ở
hàm lượng vết.
1.2.1.3- Phương pháp sắc ký lỏng với dầu dò khối phổ (LC-MS)
Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao theo cơ chế sắc ký phân bố pha đảo. 15 hợp chất họ Phenol trong
nước và bùn được xác định bằng phương pháp LC-MS ở chế độ ion hóa hóa học tại
áp suất thường (APCI) dưới dạng ion âm. Với chương trình gradient dòng thích hợp
cho pha động gồm Metanol, Acetonitrin, acid Acetic 0.005%, việc tách và định
lượng đồng thời 15 hợp chất Phenol được tiến hành ở chế độ quét chọn lọc ion
(SIM). Phương pháp này có ưu điểm là cho phép nhận danh chính xác các hợp chất
Phenol nhờ đầu dò khối phổ, giới hạn phát hiện thấp trong khoảng từ 10-50 ng/l.
Tuy nhiên thiết bị phân tích lại đắc tiền.
1.2.1.4- Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò UV
o-Cresol, m-Cresol, Phenol, Resorcinol, Cathechol và Hidroquinon trong
nước tham gia phản ứng tạo dẫn xuất với Benzoyl clorua trong vòng 15 phút. Các
dẫn xuất Benzoyl này được chiết bằng dung môi Diethylether, sau đó được xác định

16


bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ở bước sóng 232 nm với pha động gồm
Acetonitrin-Tetrahydrofuran-nước (54:6:40,v:v:v). Phương pháp đơn giản này cho

phép xác định hàm lượng Phenol trong rượu và nước uống với giới hạn phát hiện từ
0.05 đến 0.50 μg/l, hiệu suất thu hồi trong khoảng 81 - 94%, độ lập lại của phương
pháp cao, thời gian phân tích ngắn.
1.2.1.5-. Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò điện hóa
Đầu dò điện hóa là một trong những đầu dò rất chọn lọc do mỗi chất có khả
năng oxi hóa hoặc khử tại mỗi thế khác nhau.
Đầu dò điện hóa được ứng dụng rộng rãi vì chúng đơn giản, không đắt tiền.
Tuy nhiên chúng có khuyết điểm là khó sử dụng, thời gian cân bằng rất dài, nhạy
đối với tốc độ dòng và pH. Bề mặt điện cực dễ bị nhiễm bẩn nên cần hoạt hóa lại
điện cực sau một thời gian ngắn sử dụng.
Nguyên tắc hoạt động của đầu dò điện hóa là tại một giá trị thế áp thích hợp,
quá trình oxi hóa hay khử của chất điện hoạt tại bề mặt điện cực làm việc sẽ sinh ra
dòng điện. Dòng điện đó được sử dụng như tín hiệu phân tích và tín hiệu tỷ lệ trực
tiếp với nồng độ chất điện hoạt đi qua đầu dò. Dòng điện sinh ra trong pin điện hóa
được tính theo định luật Faraday: Q = nFN
Q: Số Coulomb
n: số điện tử bị mất đi hoặc nhận được.
N: số phân tử chất phân tích
F: 96500 C / 1 mol electron
Đầu dò điện hóa có gồm ba điện cực: điện cực chỉ thị, điện cực so sánh và
điện cực hỗ trợ. Thế làm việc được đo giữa điện cực chỉ thị và điện cực so sánh.
Nhờ vào hoạt tính điện cực của các hợp chất Phenol, phương pháp sắc ký
lỏng pha đảo với cột C18 và đầu dò điện hóa thường được sử dụng để xác định hàm
lượng vết các chất họ Phenol bằng các loại điện cực khác nhau. Với thành phần pha
động gồm dung dịch đệm có pH thích hợp và Acetonitrin hoặc Metanol, giá trị thế
áp ở điện cực làm việc lớn hơn +1V, cho phép xác định hàm lượng vết của các hợp
chất Phenol trong nước và trong thực phẩm. Các phương pháp này có ưu điểm là độ
nhạy cao và ít chất gây nhiễu.

17

1.2.2-Phương pháp quang [ 5, 11, 13 ]
Phương pháp Trắc quang [ 13 ]: các hợp chất Phenol được cho phản ứng với 4Aminoantipyrin ở pH = 10 với sự hiện diện của Kali Hexacyanoferat (III) để tạo
phẩm màu Antipyrin. Đo độ hấp thu của dung dịch phẩm màu này trong pha nước ở
bước sóng 510 nm, qua đó xác định được nồng độ của các hợp chất Phenol. Phương
pháp này có giới hạn phát hiện trong khoảng từ 2 μg/l đến 10 μg/l.
Phương pháp Hoá phát quang

[ 5 ]

: các hợp chất Phenol làm giảm sự phát

quang hoá học của p-Chlorobenzen Diazonium Fluoroborat ( p-CBDA ) khi có mặt
H2O2 trong môi trường kiềm. Phản ứng giữa p-CBDA và H2O2 tạo ra hoá phát
quang mạnh trong môi trường kiềm. Các hợp chất Phenol có thể làm giảm cường độ
hoá phát quang của phản ứng này và khi nồng độ các hợp chất Phenol tăng lên,
cường độ hoá phát quang cũng giảm theo một cách tuyến tính. Qua đó xác định
được hàm lượng của các hợp chất Phenol có trong mẫu phân tích. Giới hạn phát
hiện của phương pháp này có thể đạt đến 1 μg/l.
Phương pháp Huỳng quang

[ 11 ]

: các hợp chất Phenol bị kích thích và

chuyển lên trạng thái năng lượng cao hơn. Ở trạng thái kích thích, điện tử kém bền,
chỉ tồn tại trong khoảng thời gian rất ngắn từ 10-13 đến 10-8 giây và có xu hướng giải
phóng năng lượng đã hấp thu để trở về trạng thái cơ bản ban đầu. Quá trình giải
phóng năng lượng sẽ phát ra ánh sáng. Đo lượng ánh sáng phát ra, qua đó xác định

được hàm lượng của các hợp chất Phenol có trong mẫu phân tích. Phương pháp
huỳnh quang có khoảng tuyến tính từ 0.05 μg/l đến 18 μg/l và có giới hạn phát hiện
là 0.02 μg/l.
1.2.3-Phương pháp cực phổ xung vi phân [ 28 ]
Trong dung dịch nền CaCl2, với sự hiện diện của các cation kim loại nặng
như Chì và Cadimi, hàm lượng các hợp chất nitrophenol, dinitrophenol và các dẫn
xuất nitrophenol khác trong mẫu nước sông và nước thải công nghiệp được xác định
đồng thời bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với điện cực thủy ngân. Phương
pháp này có ưu điểm là nhanh, độ nhạy cao, cho phép xác định đồng thời các kim
loại nặng thường hiện diện trong nước thải. Tuy nhiên việc sử dụng điện cực thủy
ngân độc hại lại là một hạn chế đáng kể của phương pháp.

18


1.3- Giới thiệu sơ lược về hệ thống sắc kí lỏng[ 3 -

4, 8, 17 – 23 ]

Sắc kí lỏng được dùng để tách hỗn hợp các chất có trong mẫu phân tích
thành từng chất riêng biệt, qua đó định tính và định lượng được từng chất có trong
mẫu. Quá trình tách các chất dựa trên ái lực giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha
động. Trong sắc kí lỏng, pha tĩnh và pha động đóng vai trò rất quan trọng trong việc
tách các chất phân tích.
1.3.1- Một vài thông số quan trọng được sử dụng trong định tính và định
lượng các chất phân tích.
- Thời gian lưu TR: là thời gian từ lúc bắt đầu cho mẫu vào cột đến lúc mũi
xuất hiện trong một điều kiện phân tích nhất định ( pha tĩnh, pha động, tốc độ dòng
… ). Một chất có thời gian lưu cố định và không phụ thuộc vào các thành phần khác
có trong mẫu. Do vậy, thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho mỗi chất và được

dùng để định danh trong kỹ thuật sắc kí.
- Hệ số phân bố K : là tỷ số giữa nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh và
nồng độ chất đó trong pha động.
K = CS/CM
CS: Nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh.
CM: Nồng độ chất phân tích trong pha động.
K càng lớn, chất phân tích càng có ái lực với pha tĩnh.
- Hệ số dung lượng K’:
K’ = K x VS/VM
VS: Thể tích chiếm trong pha tĩnh.
VM: Thể tích chiếm trong pha động.
Nếu K’ > 20, thời gian rửa giải lâu, mũi bị bành rộng.
Nếu K’ < 1, thời gian rửa giải nhanh, các mũi bị chập.
- Số đĩa lý thuyết N: là tỷ số giữa chiều dài cột sắc kí với chiều cao đĩa lý
thuyết.
N=L/H
L: Chiều dài cột sắc kí.
H: Chiều cao đĩa lý thuyết.

19


Số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao. Ngoài ra, số đĩa lý thuyết
còn được tính dựa trên sắc lí đồ
N = 16 x ( TR/WB )2
TR: Thời gian lưu của mũi sắc kí.
WB: Bề rộng đáy của mũi sắc kí.

R

s

=

T R ,B − T R ,A
W B − W A
2

- Độ phân giải RS: biểu thị khả năng tách của hai mũi trên sắc kí đồ.
Với
TR,A , TR,B : Thời gian lưu của chất A và chất B ( phút ).
WA, WB: Bề rộng đáy của mũi A và mũi B ( phút ).
:

TR , B − TR , B >

WA + WB
2

: 2 mũi tách được.

TR , B − TR , B <

WA + WB
2

: 2 mũi không tách được.

Hai mũi tách hoàn toàn khi Rs > 1.5.
Khi WA = WB và K’A - K’B

Rs =

1 ⎛ ∝ −1 ⎞⎛ K ' ⎞
⎜
⎟⎜
⎟ N
4 ⎝ ∝ ⎠⎝ 1 + K ' ⎠

Với:
N: Số đĩa lý thuyết trung bình của 2 mũi A và B kế cận nhau.
K’: Hệ số chứa trung bình của 2 mũi A và B kế cận nhau.
Để tăng hệ số phân giải, cần phải thay đổi lần lượt 3 yếu tố:
Tăng hệ số chọn lọc " bằng cách chọn pha tĩnh thích hợp hoặc thay đổi
thành phần pha động.
Giảm hệ số chứa K’ bằng cách thay đổi khả năng rửa giải của dung môi.

20


Tăng số đĩa lý thuyết N bằng cách tăng chiều dài cột ( chủ yếu dùng trong
sắc kí khí ) hoặc giảm chiều cao đĩa lý thuyết.
1.3.2- Các thiết bị trong hệ thống sắc kí lỏng được sử dụng để xác định
Phenol và dẫn xuất.
1.3.2.1- Hệ thống pha động
Dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi khác nhau để rửa giải
chất phân tích ra khỏi cột. Có thể sử dụng chế độ đẳng dòng để rửa giải các chất
trong quá trình phân tích. Tuy nhiên, đối với hỗn hợp có nhiều chất phân tích bị
chập và nhiều chất có thời gian lưu dài khi dùng chế độ đẳng dòng, ta có thể dùng
chế độ gradient dòng để tách các chất phân tích bị chập và rút ngắn thời gian lưu

của các mũi ra sau.
Yêu cầu đối với pha động được dùng:
Dung môi chuyên dùng cho HPLC và được đuổi khí thật kĩ trước khi sử
dụng.
Không tương tác hoá học với pha tĩnh và làm thay đổi đặc tính của pha
tĩnh.
Không gây ảnh hưởng trong quá trình thu tín hiệu các chất phân tích.
1.3.2.2- Hệ thống bơm
Bơm được dùng để cung cấp áp lực cần thiết giúp pha động di chuyển trong
hệ thống. Bơm được sử dụng cho hệ thống HPLC để xác định các hợp chất Phenol
là bơm vừa hút vừa đẩy hai piston vì bơm này đạt một số yêu cầu sau:
Dòng chảy được loại bỏ xung.
Tốc độ dòng chảy linh hoạt, thông thường từ 0.1 đến 10 ml/phút.
Điều khiển tốc độ dòng chảy đúng.
Có thể tạo ra áp suất cao (6000 psi )
Được làm từ chất liệu chống ăn mòn và chống dung môi
1.3.2.3- Bộ phận tiêm mẫu
Bộ phận tiêm mẫu bằng tay gồm 6 cổng và hai vị trí van bao gồm vòng
Loop mẫu từ 20 đến 100 :l.

21


Hình 1.1: Hệ thống vòng Loop tiêm mẫu.
Có hai vị trí tiêm mẫu là vị trí A và vị trí B. Vị trí A là vị trí trước khi tiêm
mẫu. Sau khi tiêm mẫu, van được chuyển sang vị trí B và pha động sẽ đưa mẫu vào
cột. Hệ thống tiêm mẫu này được dùng phổ biến hiện nay trong hệ thống sắc kí lỏng
vì thể tích mẫu tiêm vào có độ lặp lại cao.
1.3.2.4- Cột sắc kí pha đảo
Trong HPLC, việc tách hỗn hợp các chất có trong mẫu phân tích thành từng

chất riêng biệt được thực hiện bởi ái lực tương đối khác nhau giữa các hợp chất có
trong mẫu phân tích với pha tĩnh của cột và pha động rửa giải.
Hiện nay, cột sắc kí phân bố pha đảo thường được dùng trong hệ thống sắc kí
lỏng để tách các chất phân tích. Cột pha đảo có pha tĩnh là chất lỏng được gắn lên
chất mang rắn. Pha tĩnh được cấu tạo gồm một mạch alkyl ( -CH2-CH2-CH2-CH3 )
gắn lên một chất mang rắn, thường là silica.

Hình 1.2: Cấu tạo của pha tĩnh dùng trong cột pha đảo.

22