Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH
BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ
HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Hà Nội - 2016


1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH
BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ
HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn đƣợc hoàn thành bằng quá trình
nghiên cứu khoa học của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Bích Ngọc cùng
với cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật, viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu,
kết quả đƣợc trình bày trong luận văn này là trung thực. Phần văn bản trích dẫn đều
đƣợc ghi rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình
trƣớc hội đồng khoa học.
Hà nội, tháng 12 năm 2016
Học viên


ii

LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành dựa vào kinh phí của đề tài: ““Khai thác và phân
lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn
có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen”.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc đã hướng dẫn và tạo mọi
điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận
văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật –
Viện Công nghệ Sinh học, em Lý Khánh Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm
việc.
Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, ủng hộ và
giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt công việc và hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2016
Học viên


iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ I
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. II
MỤC LỤC .....................................................................................................................III
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... VI
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... VII
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... VIII
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Tinh bột.................................................................................................................3
1.1.1. Tinh bột ở thực vật ........................................................................................3

1.1.2. Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật...................................................................4
1.1.3. Dự trữ tinh bột ở lá cây..................................................................................6
1.2. Enzyme AGPase ...................................................................................................7
1.2.1. Enzyme AGPase ở thực vật ...........................................................................7
1.2.2. AGPase ở sắn............................................................................................... 10
1.3. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh
bột .............................................................................................................................. 11
1.3.1. Tăng khả năng tích lũy tinh bột ...................................................................11
1.3.2. Tăng khả năng phân hủy tinh bột ................................................................ 12
1.3.3. Thay đổi thành phần tinh bột .......................................................................12
1.4. Công nghệ chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ...................................13
1.5. Biểu hiện nhiều gene trên cùng một khung đọc mở với 2a peptide ...................15


iv

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................17
2.1. Vật liệu ...............................................................................................................17
2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................17
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................17
2.2. Phƣơng pháp .......................................................................................................18
2.2.1. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử ........................................................18
2.2.2. Phân lập gen AGPS và AGPL từ cây sắn .....................................................21
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL .............................................23
2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens ..............25
2.2.5. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR ...............27
2.2.6. Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng Western blot .............................. 28
2.2.7. Kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột của cây thuốc lá chuyển gen...............28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 31
3.1. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL ............................................................. 31

3.1.1. Nhân đoạn gen AGPS và AGPL bằng RT-PCR ..........................................31
3.1.2. Tách dòng gen AGPS và AGPL ...................................................................32
3.1.3. Kết quả giải trình tự với mồi M13F và M13R ............................................33
3.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen ....................................................................36
3.2.1. Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI..........37
3.2.2. Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121 .........39
3.2.3. Biến nạp pBI-35S-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................42
3.3. Kết quả chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá ....................................................42
3.3.1. Tạo cây thuốc lá chuyển gen AGPSL ..........................................................42
3.3.2. Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR ............................................44


v

3.3.3. Phân tích biểu hiện gen AGPSL bằng Western blot ....................................46
3.4. Kết quả định lƣợng tinh bột tích lũy ở lá............................................................ 48
3.4.1. Kiểm tra tinh bột bằng Iodine......................................................................48
3.4.2. Định lƣợng tinh bột bằng Anthrone ............................................................ 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................58
Kết luận......................................................................................................................58
Kiến nghị ...................................................................................................................58
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................59
Sách và bài báo ..........................................................................................................59
Website ......................................................................................................................62
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .....................................................................63
Bài báo .......................................................................................................................63
Trình tự gen ...............................................................................................................63
PHỤ LỤC ......................................................................................................................68

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
35S
3-PGA
A. tumefaciens
ADP
ADPG
AGPase
AGPL
AGPS
AGPSL
ATP
cDNA
CDS
cmyc
DBE
DNA
EDTA
GUS
isoform
kb
kDa
LB
NPTII
OD
P2a
PCR
Pi

RNA
SBE
T-DNA
Tris
WT

Viết đầy đủ
Cauliflower mosaic virus 35S promoter
3-Phosphoglyceric acid
Agrobacterium tumefaciens
Adenosine diphosphate
Adenosine diphophate glucose
ADP-glucose pyrophosphorylase
AGPase large subunit (Tiểu phần lớn AGPase)
AGPase small subunit (Tiểu phần nhỏ AGPase)
AGPS-P2a-AGPL-cmyc
Adenosine triphosphate
Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung)
Coding DNA sequence
Myc (human c-Myc oncogene) epitope tag
Debranching enzyme (Enzyme khử nhánh mạng tinh bột)
Deoxyribonucleic
Ethylenediaminetetraacetic acid
β-Glucuronidase gene
đồng phân (enzyme)
Kilo base (1000 bazơ)
Kilodalton (1000 dalton)
Lysogeny broth (Môi trƣờng nuôi cấy Lysogeny)
Neomycin phosphotransferase II gene
mật độ quang

2a peptide
Polymerase Chain Reaction
Inorganic phosphate (Photphate vô cơ (HPO42-))
Ribonucleic
Starch branching enzyme (Enzyme phân nhánh mạch tinh bột)
Transfer DNA
2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol
Wild type (Kiểu dại)


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách mồi PCR sử dụng ............................................................. 17
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green
Master Mix 2X...............................................................................................................18
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase..19
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn ........................20
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân
dòng đoạn AGPS và AGPL ............................................................................................ 22
Bảng 2.6. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp SmaI-P2aAGPL-Cmyc-SacI ..........................................................................................................24
Bảng 2.7. Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen .............26
Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen AGPS và AGPL mới phân lập với trình
tự tham chiếu .................................................................................................................34
Bảng 3.2. Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng ...........................53
Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng ..........................56


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo
Akula Nookaraju) [1] ......................................................................................................5
Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48] ........6
Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20] ...........................................8
Hình 1.4 Con đƣờng tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase
[37]...................................................................................................................................9
Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2010) [26] ....................12
Hình 1.6. Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47] ................................ 15
Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR ..............23
Hình 2.2. Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc ...................25
Hình 3.1. Kết quả RT-PCR nhân đoạn AGPS và AGPL từ RNA tổng số tách ở
lá sắn .............................................................................................................................. 32
Hình 3.2. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL .............................................33
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen AGPS và AGPL ..........................................34
Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS và AGPL mới phân lập ..........................35
Hình 3.5. Một số phƣơng án biểu hiện hai gen trên cùng một vector ................37
Hình 3.6. Kết quả tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-CmycSacI ................................................................................................................................ 38
Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI và SacI (A) và sơ
đồ vector pBI121 (B) .....................................................................................................39
Hình 3.8. Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL .............40
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra vector và A. tumefaciens mang vector pBI-35SAGPSL...........................................................................................................................41
Hình 3.10. Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá ....................43


ix

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR cây thuốc lá chuyển gen AGPase. ..............45
Hình 3.12 Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPSL........47
Hình 3.13 Các bƣớc kiểm tra hàm lƣợng tinh bột lá bằng iodine [49]. .............48

Hình 3.14. Ảnh nhuộm iodine lá thuốc lá chuyển gen .......................................50
Hình 3.15 Sơ đồ phản ứng Anthrone với Glucose .............................................51
Hình 3.16. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone (I) (α = 0.05)
.......................................................................................................................................52
Hình 3.17. Đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone (II) (α = 0.075) ........................55
Hình 3.18 Hàm lƣợng tinh bột trong lá cây chuyển gen và cây không chuyển
sau 2h và 14h chiếu sáng ............................................................................................... 56


1

MỞ ĐẦU
Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng nhƣ là nguồn lƣơng
thực và nguyên liệu công nghiệp. Phần lớn tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp
làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tinh bột cũng là nguồn nguyên liệu quan
trọng cho các lĩnh vƣc công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, nhiên
liệu, giấy và xây dựng… Nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng
lên và tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên,
do đặc tính dễ lên men. Năm 2015, lƣợng tinh bột đƣợc sản xuất trên thế giới lên đến
85 triệu tấn, gấp đôi so với năm 1995 (40 triệu tấn) [50]. Dự đoán, nhu cầu về tinh bột
sẽ còn tăng mạnh trong tƣơng lai.
Để đáp ứng nhu cầu tinh bột, ngoài việc tăng diện tích trồng trọt, tìm ra các cây
trồng mới thì việc cải tiến các giống cũ là chiến lƣợc quan trọng trong nông nghiệp.
Trong đó, cải tiến cây trồng theo hƣớng tăng năng suất tinh bột, giảm thời gian sản
xuất hay cải tiến chất lƣợng tinh bột là những hƣớng nghiên cứu quan trọng và luôn
đƣợc các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Các phƣơng pháp chọn giống, lai tạo
truyền thống đã đạt đƣợc nhiều thành quả lớn trong cải thiện năng suất cây trồng. Tuy
nhiên, năng suất tinh bột của các giống lai tạo đã gần đạt đến năng suất tối đa, trong
khi đó, diện tích đất canh tác đang ngày càng thu hẹp. Bởi vậy, chọn tạo giống bằng
công nghệ sinh học hiện đại (chuyển gen) đang là chiến lƣợc quan trọng trong sản xuất

tinh bột trên thế giới.
Năm 2000, 81% sản lƣợng tinh bột trên thế giới sản xuất từ ngô, tiếp đó là lúa
mì (5%), khoai tây (8,3%), sắn và các cây trồng khác (5%). Nhƣng đến năm 2010, sản
lƣợng tinh bột từ ngô còn 54%, trong khi đó sản lƣợng sắn tăng mạnh (33%) ) [50].
Thống kê này cho thấy ngô và sắn là hai cây trồng có tiềm năng lớn trong công nghiệp
tinh bột.
Trong gần một thập kỷ qua, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử
hiện đại, rất nhiều công cụ đƣợc phát triển sẵn sàng phục vụ cho việc phân tích chức
năng gen ở sắn, ví dụ nhƣ bản đồ di truyền, thƣ viện BAC (Bacterial artificial
chromosome), thƣ viện EST (expressed sequence tags). Đặc biệt gần đây toàn bộ hệ


2

gen của sắn đã đƣợc giải trình tự [52]. Phân tích sự biểu hiện của toàn bộ hệ gen cũng
là một công cụ hữu hiệu nhằm nâng cao khả năng tiếp cận của các nhà khoa học để
nghiên cứu sâu các quá trình sinh học của sắn. Trong đó, nhiều gen liên quan đến sinh
tổng hợp tinh bột đã đƣợc nghiên cứu. Có thể kể đến các gen nhƣ: AGPase, nhóm gen
GBSS, SS, SBE, DBE, ISA ….
Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi
glucose-1-P và ATP thành ADP-glucose và pyrophosphate. AGPase là enzyme quan
trọng trong việc nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen tăng khả năng tích lũy tinh bột
[45]. Các nghiên cứu biểu hiện vƣợt mức AGPase phân lập từ thực vật hoặc từ vi
khuẩn trên cây chuyển gen đều làm tăng hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong các mô
chuyển gen. Gen AGPase ở sắn cũng đã đƣợc phân lập và chứng minh khả năng làm
tăng khả năng tích lũy tinh bột ở thực vật [45], [46].
Nghiên cứu này xuất phát từ ý tƣởng xây dựng một vector chuyển gen ở thực
vật phục vụ việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng sinh tổng hợp và tích lũy tinh
bột. Gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme AGPase ở sắn đƣợc phân lập và thiết kế
vector biểu hiện trên cây mô hình (thuốc lá), để đánh giá khả năng hoạt động của

vector chuyển gen và tích lũy tinh bột của gen chuyển. Kết quả thu đƣợc có ý nghĩa
trong việc nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng khả năng tích lũy tinh bột. Công
trình này đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TINH BỘT
1.1.1. Tinh bột ở thực vật
Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu tạo bởi hai loại polyme của glucose
là amylose và amylopectin. Amylose là polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo nên
từ các phân tử α-D-glucose nhờ các liên kết α-1,4-glucoside. Amylose đƣợc tạo ra từ
500-1000 phân tử α-D-glucose hoặc có khi chỉ khoảng 250-300 phân tử. Chuỗi phân
tử glucose xoắn lại với nhau theo hình xoắn lò xo. Sự hình thành dạng xoắn lò xo là do
sự hình thành các liên kết hydro giữa các phân tử glucose. Mỗi vòng xoắn có 6 đơn vị
glucose và đƣợc duy trì bởi liên kết hydro với các dòng xoắn kề bên. Khoảng không
gian giữa các vòng xoắn có kích thƣớc phù hợp cho một số phân tử khác có thể liên
kết vào, ví dụ nhƣ iodine. Khi phân tử iodine liên kết vào vòng xoắn sẽ làm cho các
phân tử glucose thay đổi vị trí và tạo nên phức màu xanh thẫm đặc trƣng. Ái lực của
amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài mạch polymer. Amylopectin có
cấu tạo phức tạp hơn amylose. Tham gia cấu tạo của amylopectin có khoảng 500,000
đến 1 triệu phân tử α-D-gluco liên kết với nhau, đƣợc nối với nhau bởi liên kết α-1,4glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Cứ khoảng 24-30 đơn vị
glucose trên mạch sẽ có 1 liên kết α-1,6 glucoside để tạo mạch nhánh. Trên mạch
nhánh cấp 1 lại hình thành mạch nhánh cấp 2, cứ nhƣ vậy phân tử amylopectin phân
nhánh nhiều cấp rất phức tạp.
Ngƣời ta có thể phân biệt đƣợc amylose và amylopectin dựa trên sự khác nhau
về khối lƣợng phân tử; cũng nhƣ về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iodine.
Amylopectin có phân tử lƣợng trong khoảng 107 đến 108; trong khi phân tử lƣợng của

amylose chỉ khoảng 5x105 đến 106. Ở nhiệt độ 200C, khả năng gắn của amylopectin
với iodine chỉ khoảng 0,2 % khối lƣợng trong khi amylose là 20% khối lƣợng. Ngoài
ra, amylose tƣơng tác với iodine tạo phức có màu xanh dƣơng, trong khi amylopectin
tạo phức màu đỏ nâu.
Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào
quang hợp và không quang hợp. Tinh bột đƣợc coi là nguồn carbohydrate dự trữ chủ


4

yếu và đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của tế bào thực vật. Trong lá,
một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở
dạng tinh bột chứ không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ
phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ
chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của
cây.
Trong các cơ quan không diễn ra quá trình quang hợp nhƣ thân, rễ, củ và hạt,
sucrose có thể đƣợc chuyển đổi thành tinh bột dự trữ trong một loại plastid chuyên biệt
gọi là amyloplasts. Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển
khác của cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là
cơ quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (lúa, ngô, lúa mì,
lúa mạch, lúa miến… ) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ thân (khoai
tây, khoai mỡ New Zealand) và rễ củ (khoai lang, sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu.
Tinh bột là nguồn carbonhydrate chủ yếu cho con ngƣời và đồng thời cho
nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp. Hiện nay nguồn nguyên liệu tinh bột cho
công nghiệp chủ yếu tách chiết từ ngô, tuy nhiên một lƣợng đáng kể khác từ lúa, lúa
mì, sắn, khoai tây, arrowroot (Maranta arundinacea), và sago palm (Metroxylon
sagu). Tinh bột từ các nguồn khác nhau có thành phần polymer, cấu trúc và thành phần
hóa lý khác nhau. Thành phần hóa lý chính là chức năng của tinh bột quyết định khả
năng ứng dụng của tinh bột.

1.1.2. Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật
Tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan là một quá trình phức tạp, có liên quan đến
quang hợp và sucrose (Hình 1.1) Quá trình này bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy ra
trong lục lạp và bột lạp [35] [45].
i)

Cung cấp glucose-1-phosphate (Glc-1-P) vào trong các thể lạp. Glc-1-P
có thể đƣợc cung cấp từ quá trình quang hợp ở lục lạp (đối với tế bào
quang hơp) hoặc từ quá trình chuyển hóa sucrose, sucrose nhận đƣợc từ
mạch dẫn (đối với tế bào không quang hợp).


5

ii)

Tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P và ATP nhờ enzyme
AGPase. Đây là phản ứng quan trọng, có ảnh hƣởng đến tốc độ tổng hợp
tinh bột.

iii)

Tổng hợp tinh bột (amylose và amylopectin) từ ADPG.

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo Akula
Nookaraju) [1]
Ghi chú: Sản phẩm của chu trình Calvin (DHAP và GA3P) được biến đổi thành Glucose-1-P
và Fructose-6-P (hoặc 1-6PP). Glucose-1-P được chuyển đổi thành ADP-Glucose dưới sự
xúc tác của AGPase, ADP-Glucose được xúc tác trùng hợp thành mạch tinh bột, quá trình
này diễn ra trong lục lạp hoặc bột lạp. Glucose và Fructose cũng được chuyển hóa thành

sucrose được dự trữ trong không bào hoặc chuyển tới các tế bào khác của cây. AI: acid
invertase; CeSy: cellulose synthase; HK: hexokinase; FRK: fructokinase; FBPase: fructose1,6-biphosphatase; N/AI: neutral or alkaline invertase; PFP: pyrophosphate d -frucrose-6phospahte 1-phosphotransferase; PGM: phosphoglucomutase; SoSUT1: spinach sucrose


6

transporter 1; SPP: sucrose phosphate phosphatase; SPS: sucrose phosphate synthase;
SSy: starch synthase; SuP: sucrose phosphorylase; SuSy: sucrose synthase; SXD1: sucrose
export defective 1; UDPase: uridine diphosphate- glucose pyrophosphorylase

Nói một cách ngắn gọn, bƣớc đầu tiên không thể thiếu đƣợc là sự tổng hợp
ADPG từ Glc-1-P và ATP đƣợc xúc tác bởi AGPase. Một khi đƣợc hoạt hóa, enzyme
starch synthase chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi
α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc dùng nhƣ là các cơ chất cho các
enzyme phân nhánh của tinh bột (SBEs hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là
amylopectin (Hình 1.2). Cuối cùng amylopectin đƣợc tinh thể hóa tạo thành tinh bột
dƣới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) và
glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase
hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng đƣợc dự đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên
trong quá trình tổng hợp tinh bột [45].

Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48]

1.1.3. Dự trữ tinh bột ở lá cây
Lá cây là cơ quan dự trữ sản phẩm quang hợp tạm thời của cây xanh. Tinh bột
trong lá cây thƣờng đƣợc lƣu trữ ngay trong lục lạp. Tuy nhiên, có sự khác nhau về dự
trữ tinh bột ở lá của một số thực vật. Các loài nhƣ thuốc lá, đậu tƣơng (Glycine max)
[22], củ cải đƣờng (Beta vulgaris) [13] và Arabidopsis [46] … thì một lƣợng lớn tinh

7

bột đƣợc dự trữ ở lá. Trong khi đó, các loài khác nhƣ đậu Pháp (Phaseolus vulgaris)
[13], rau bina (Pisum sativum) [41] thì lƣu trữ nhiều sucrose thay cho tinh bột. Ngoài
ra, carbohydrate còn đƣợc lƣu trữ ở lá dƣới dạng raffinose và fructan [3], [32]. Ở một
số loài nhƣ Pisum sativum và rau chân vịt, tinh bột chỉ đƣợc tổng hợp khi mà lƣợng
sucrose đƣợc tạo ra vƣợt ngƣỡng dự trữ của lá, khi đó lƣợng tinh bột đƣợc tăng dần và
sucrose giảm dần trong quá trình quang hợp [41]. Tuy nhiên, ở Arabidopsis, thuốc lá
và các loài khác, luôn có một phần glucose từ quang hợp đƣợc tổng hợp thành tinh bột
[46]. Khi đó, quá trình tổng hợp tinh bột và sucrose diễn ra song song, tốc độ tổng hợp
của hai quá trình này đƣợc kiểm soát và phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng (đặc biệt
là thời gian chiếu sáng). Cây trồng trong điều kiện ngày ngắn tích lũy nhiều tinh bột ở
lá hơn so với trồng trong điều kiện ngày dài, khi đó, tinh bột đƣợc dự trữ nhiều hơn để
cung cấp năng lƣợng cho trao đổi chất vào ban đêm [7], [17].
1.2. ENZYME AGPASE
1.2.1. Enzyme AGPase ở thực vật
Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho các bƣớc đầu tiên
trong quá trình tổng hợp tinh bột. AGPase đƣợc phát hiện ở hầu hết các nhóm thực vật
bao gồm thực vật bậc thấp, thực vật một lá mầm và hai lá mầm. Nó xúc tác cho phản
ứng biến đổi glucose-1-P và ATP thành ADPG và pyrophosphate. AGPase đƣợc xác
định là enzyme dị lập thể (240 kDa), đƣợc cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL hoặc
β, 51-60 kDa) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS hoặc α, 50 – 55 kDa) do hai gen tƣơng tứng
mã hóa (Hình 1.3). Các tiểu phần nhỏ ở các loài khác nhau có độ tƣơng đồng cao (85–
95%) trong khi tiểu phần lớn thì đa dạng hơn (độ tƣơng đồng 50 – 60%) [29].


8

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20].
Ghi chú: Mã số 1YP2 được đăng ký trên RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org), các tiểu

phần được thể hiện với các màu khác nhau).

Trong các tế bào quang hợp, sự hoạt động của AGPase trong lục lạp chủ yếu
đƣợc điều khiển bởi 3-Phosphoglyceric acid (3-PGA), thế ôxy hóa khử (redox) và
phosphate (Pi) [40] (Hình 1.4). Hợp chất 3-PGA là sản phẩm tham gia vào chu trình
Calvin, xuất hiện khi xảy ra quá trình cố cacbon từ CO2. Sự xuất hiện của 3-PGA đồng
nghĩa với việc bộ máy quang hợp đang hoạt động trong lục lạp, cơ chất glucose 1phosphate đƣợc tạo ra. Lúc này, AGPase đƣợc kích hoạt bởi 3-PGA biến đổi glucose
1-phosphate và ATP thành ADP glucose và pyrophosphate. Pyrophosphate đƣợc thủy
phân thành Pi. Sự tích lũy nhiều Pi (đồng nghĩa với việc sản phẩm ADP glucose đƣợc
tạo ra nhiều) trong lục lạp làm ức chế hoạt tính của AGPase. Nhƣ vậy, tỉ lệ 3-GPA/Pi
quyết định khả năng hoạt động của AGPase. Cơ chế điều hòa bằng thế ôxi hóa khử
xảy ra ở tế bào quang hợp và không quang hợp, có ý nghĩa quan trọng trong vào ban
đêm. AGPase bị bất hoạt khi các gốc sulfur cysteine của tiểu phần nhỏ bị ôxi hóa, cầu
disulfide đƣợc hình thành giữa hai tiểu phần. AGPase đƣợc hoạt hóa trở lại nếu các
cầu disulfide này đƣợc cắt bỏ. Tuy nhiên, cơ chế điều hòa gen AGPase các tế bào dự
trữ tinh bột vẫn chƣa đƣợc rõ ràng.


9

Hình 1.4 Con đường tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37]
Ghi chú: Fructose-6-P tạo ra từ chu trình Calvin được chuyển hóa thành Glucose -1-P.
Glucose-1-P được hoạt hóa bởi ATP thành ADP-Glucose nhờ sự xúc tác của enzyme
AGPase. AGPase được hoạt hóa bởi thế ôxi hóa khử và/hoặc 3-Phosphoglyceric acid được
tạo ra từ chu trình Calvin và bị bất hoạt bởi nồng độ cao của Pi. (Viết tắt trên hình: Fru6P,
fructose 6-phosphate; Glc1P, glucose 1-phosphate; Glc6P, glucose 6-phosphate; TPT,
triose-phosphate/phosphate translocator. 3PGA: 3-Phosphoglyceric acid)

Mặc dù đƣợc mã hóa bởi hai gen, tuy nhiên, trong cùng một loài có thể có nhiều
isoform khác nhau. Ở lúa có 3 isoform đƣợc mã hóa bởi AGPS và 4 isoform mã hóa

bởi AGPL [31]. Các isoform khác nhau có các tính chất khác nhau về khả năng xúc
tác, mức nhạy cảm với các cơ chế điều hòa… Các isoform ở lá thƣờng nhạy cảm với
3-PGA/Pi trong khi ở các mô dự trữ thì có thể khác nhau. Ở tế bào nội nhũ lúa mì,
phôi đậu Hà Lan, phôi đậu răng ngựa (Vicia faba) chứa những isoforms của AGPase
có độ nhạy thấp hoặc không nhạy cảm với cơ chế điều hòa 3-PGA/Pi [12]. Đặc biệt,
AGPase ở tế bào nội nhũ lúa mạch (Barley) có thể hoạt động mà không cần hoạt hóa
bởi 3-PGA và ít nhạy cảm với sự ức chế của Pi [21]. Những isoform này mang lại
nhiều ứng dụng trong việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả năng tích lũy
tinh bột.


10

AGPase là một trong những enzyme quan trọng trong con đƣờng tổng hợp tinh
bột. Nghiên cứu trên cây A.thaliana bị đột biến ở cả hai gen mã hóa cho hai tiểu phần
lớn nhỏ cho thấy lƣợng tinh bột giảm còn 2% so với cây bình thƣờng [27]. Khi biểu
hiện các đoạn đối mã của 2 gen AGPS và AGPL trong cây khoai tây cũng cho kết quả
sự tích lũy tinh bột ở các dòng cây chuyển gen ít đi từ 1,5 - 3 lần trong khi đó hàm
lƣợng các loại đƣờng tan nhƣ glucose, sucrose và fructose tăng khoảng 5 lần. Các
nghiên cứu tăng cƣờng khả năng biểu hiện của một trong hai hoặc cả hai gen đều thu
đƣợc các dòng chuyển gen có hàm lƣơng tinh bột tích lũy cao hơn so với cây đối
chứng.
1.2.2. AGPase ở sắn
Gen AGPase ở sắn đã đƣợc phân lập và giải trình tự thành công [19]. Nghiên
cứu trên các giống sắn TMS 30572 và CM 2177-2, vùng mã hóa (CDS) cho AGPS dài
1572 bp và AGPL dài 1593 bp. Trình tự AGPS và AGPL có độ tƣơng đồng thấp
(40%). Kết quả phân sàng lọc thƣ viện cDNA ở hai giống sắn này chỉ thu đƣợc một
isoform của AGPS và AGPL. Chuỗi AGPS dài 524 amino acid, 57,3 kDa và AGPL
dài 531 amino acid, 58,7 kDa. Cả hai chuỗi AGPS và AGPL đều chứa đoạn Transit
peptide (dài khoảng 69 – 74 amino acid) ở đầu N giúp vận chuyển vào lạp thể. Ở sắn,

tiểu phần AGPS chỉ biểu hiện mạnh ở các mô tổng hợp tinh bột (lá, củ) trong khi
AGPL biểu hiện đồng đều ở tất cả các mô. Điều này dẫn tới AGPase biểu hiện mạnh
nhất trong lá khi quang hợp, tiếp đó là mức biểu hiện ở củ sắn (thấp hơn 4 lần so với
lá), mức độ biểu hiện ở các mô khác là rất ít hoặc không biểu hiện. Cơ chế điều hòa
AGPase có sự khác nhau ở lá và củ sắn. AGPase ở lá chịu tác động mạnh của 3-PGA
và bị bất hoạt tới 90% khi có mặt Pi (2 mM). Trong khi đó, AGPase ở củ không bị ảnh
hƣởng bởi 3-PGA nhƣng bị bất hoạt mạnh bởi Pi [19].
Phân

tích

dữ

liệu

genome

sắn

(V6.1)

trên

Phytozome

11

() [51] cho thấy gen AGPS nằm trên nhiễm sắc thể số 12
(nucleotide số 6583306 đến 6588233) và AGPL nằm trên nhiễm sắc thể số 11
(nucleotide số 11864610 đến 11871278). Vùng mã hóa AGPS có độ tƣơng đồng cao

(89%) với gen mã hóa tiểu phần lớn của glucose-1-phosphate adenylyltransferase
(glgC).


11

1.3. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHẰM CẢI BIẾN
QUÁ TRÌNH TRAO ĐỔI TINH BỘT
Việc biến đổi quá trình trao đổi tinh bột trong cây trồng có thể góp phần tăng
khả năng tích lũy tinh bột trong các cơ quan dự trữ, tăng tốc quá trình tích lũy tinh bột,
ngăn chặn hoặc tăng việc phân hủy tinh bột (tùy thuộc vào loại cây trồng hay nhu cầu
sử dụng), biến đổi cấu trúc tinh bột để tăng hoặc đa dạng chức năng của tinh bột trong
thực phẩm và nguyên liệu của công nghiệp.
Với số lƣợng lớn các enzyme tham gia vào việc xác định cấu trúc của tinh bột
trong một bộ phận nhất định của cây, có thể thấy rằng số tinh bột khác nhau có thể
đƣợc biến đổi qua việc điều khiển của các gen liên quan là rất lớn. Trong các loài
lƣỡng bội mà sinh sản hữu tính thì phƣơng pháp tốt nhất là kết hợp các đột biến ảnh
hƣởng đến các gen mã hóa cho các enzyme trao đổi tinh bột. Các phƣơng pháp công
nghệ sinh học có thể có nhiều ƣu thế và cần thiết nếu cây trồng quan tâm là đa bội và
sinh sản vô tính, các gen quan tâm cần biểu hiện mạnh hơn hoặc giảm một phần hoạt
tính, tính trạng mong muốn là kết quả của việc biểu hiện gen từ loài khác.
1.3.1. Tăng khả năng tích lũy tinh bột
Cho đến nay những cố gắng nhằm tăng khả năng tích lũy tinh bột tập trung vào
việc tăng hoạt tính AGPase trong cây. Đây là enyme cung cấp cơ chất cho SS. Một loạt
đột biến của gene AGPase Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho các dạng điều khiển
khác nhau của enzyme này đã đƣợc dùng để biểu hiện mạnh trong cây. Khi glgC16
đƣợc biểu hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng
tích luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60%. Tuy nhiên với các cây khác
nhƣ sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt đƣợc mức nhƣ vậy. Vì thế
việc biến đổi một mình AGPase có thể có hoặc không đạt đƣợc kết quả mong muốn

tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ. Ngoài ra, có một số bằng chứng về việc tăng
nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể kích thích việc tạo ra ADPG và dẫn đến
việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tinh bột. Biểu hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở
vỏ plastid của Arabidopsis trong khoai tây làm tăng ADPG lên 2 lần và hàm lƣợng
tinh bột tăng lên từ 16-36% so với đối chứng. Khi kìm hãm adenylate kinase của


12

plastic (enzyme chuyển hóa hai chiều 2 phân từ ADP thành ATP và AMP) làm ADPG
tăng lên 10 lần và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây cả ở trong nhà kính và
ngoài đồng ruộng [35].
Nghiên cứu của Li N và cộng sự (2011) [26] chuyển gen mã hóa cho tiểu phần
lớn (Sh2) và tiểu phần nhỏ (Bt2) đƣợc phân lập từ sắn dƣới sự điều khiển bởi promoter
CaMV 35S vào cây ngô cho làm tăng cƣờng hàm lƣợng tinh bột và khối lƣợng hạt.
Kết quả biểu hiện vƣợt ngƣỡng Sh2 hoặc Bt2 đều làm tăng hàm lƣợng tinh bột và khối
lƣợng hạt. Tuy nhiên, biểu hiện đồng thời Sh2 và Bt2 (Hình 1.5) cho kết quả cao nhất,
khối lƣợng hạt tăng 15%, hàm lƣợng tinh bột tăng 13,8% so với cây chƣa chuyển gen.

Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2011) [26]
Ghi chú: Gen mã hóa cho tiểu phần lớn của AGPase (Sh2) và tiểu phần nhỏ (Bt2) được điều
khiển bởi promoter P27kD, hai gen được biểu hiện trên hai khung đọc mở khác nhau.

1.3.2. Tăng khả năng phân hủy tinh bột
Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung cấp
nguyên liệu sản xuất ethanol. Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô đã đƣợc
ứng dụng để tạo ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột sang ethanol.
Amylase đƣợc biểu hiện trong gian bào nên không tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột
hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó không ảnh hƣởng đến việc tích tụ tinh bột trong
quá trình phát triển của cây. Khi hạt xay ra đƣợc làm nóng trong nƣớc để hồ hóa tinh

bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men
[45].
1.3.3. Thay đổi thành phần tinh bột
Mục đích chính để thay đổi cấu trúc của tinh bột trong cây là biến đổi tỷ lệ
amylopectin và amylose, thay đổi phân bố chiều dài chuỗi trong amylopectin hoặc để
tăng hàm lƣợng phosphate của tinh bột. Do thành phần hóa lý của amylose và
amylopectin nên tính chất có lợi cho công nghiệp là chủ yếu là các tinh bột chỉ có một


13

trong hai thành phần trên. Nhiều đột biến đã đƣợc mô tả trong nhiều loài ngũ cốc và họ
đậu có chứa tinh bột chỉ có amylopectin hoặc có phần lớn là amylose. Những gen liên
quan đến quá trình tổng hợp tinh bột này mở ra khả năng ứng dụng trong việc tạo ra
các loại củ hoặc hạt có chất lƣợng tinh bột và đƣờng khác nhau với tỷ lệ
amylose/amylopectin khác nhau.
Gen Puroindoline từ lúa mì PINA và PINB đã đƣợc chuyển vào lúa để thay đổi
thành phần tinh bột. Hạt chuyển gen rất mềm và đƣợc gọi là "Soft Rice". Viêc thay đổi
này có rất nhiều lợi thế trong ngành công nghiệp thực phẩm cho phép tạo ra loại gạo
mới có chất lƣợng tốt hơn [23].
Các enzyme SBE (starch branching enzyme) và DBE (debranching enzyme) có
vai trò quan trọng trong việc quyết định thành phần amylose và amylopectin. Quá trình
phân nhánh đƣợc xúc tác bởi SBE. Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và
chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở
chuỗi glucan khác. SBE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận
chuyển các chuỗi dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc
biệt trong tổng hợp amylopectin. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, tăng cƣờng biểu
hiện SBE trong cây chuyển gen làm tăng hàm lƣợng amylopectin [9].
1.4. CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN NHỜ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Việc sử dụng Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) bắt đầu từ 1970, khi

ngƣời ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị
thƣơng, đƣợc gọi là khối u cổ rễ. Agrobacterium là một loài vi khẩn đất thuộc vi khuẩn
gram âm. Cả chủng A. tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes đều đƣợc sử dụng
phổ biến trong chuyển gen vào thực vật. Theo cơ chế tự nhiên, hai loài này có khả
năng xâm nhiễm qua vết thƣơng của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra
những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy roots) [42]. Những tế bào của
khối u hay lông rễ có thể phát triển in vitro khi vắng mặt bất cứ hormone thực vật nào.
Khả năng này có đƣợc do tế bào của các dạng hoang dại A. tumefaciens hay A.
rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid).
Ti-Plasmid có kích thƣớc khoảng >200 kb đã đƣợc xác định trình tự, chứa một đoạn


14

DNA có chiều dài khoảng 25 Kb gọi là T-DNA có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ
chế tự nhiên [16]. Do đó Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên. Bằng
cách cải biên (cắt bỏ các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những
gen thích hợp, gen này sẽ đƣợc chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng.
Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phƣơng pháp chuyển
gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.
A. tumefaciens nhận biết acetosyringone nhờ một chất nhận, đƣợc mã hóa bằng
một gen ở vùng vir (virulence), vùng vir bao gồm nhiều gen. Sự nhận biết bằng chất
nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir. Một sản phẩm gen vir khác là một
endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T-DNA ở những vị trí này.
Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này đƣợc chuyển vào
thực vật cũng nhờ tác dụng của các sản phẩm gen vir.
Ti-plasmid tự nhiên khó đƣợc dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen
vì có kích thƣớc lớn (>200kb) và mang các gen gây khối u bất lợi cho thực vật. Hơn
nữa, trên trình tự DNA của Ti-plasmid có rất nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn, điều
đó gây ra những trở ngại trong quá trình tạo vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu để

chuyển vào tế bào thực vật. Mặt khác, khi chuyển Ti-plasmid vào vi khuẩn E. coli
chúng không có khả năng tự tái bản. Tuy nhiên, bên cạnh đó Ti-plasmid có thể cung
cấp những yếu tố cần thiết quan trọng cho kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Do đó, cần thiết kế lại để có thể sử dụng Ti-plasmid trong kĩ thuật
chuyển nạp gen vào thực vật.
Ngày nay, hầu hết quy trình chuyển gen sử dụng vector nhị thể (binary vector)
vì những ƣu điểm vƣợt trội trong thiết kế vector và hiệu suất biến nạp. Hệ thống vector
nhị thể thiết kế gồm hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong
Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E. coli, trong đó có thiết kế vùng
bờ trái và bờ phải, nằm giữa hai bờ là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển.
Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái, bờ phải
bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng gen vir hỗ trợ chuyển gen vào tế bào thực vật, plasmid này
đƣợc gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector nhị thể luôn đƣợc cải tiến để nâng cao