Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích thực phẩm Báo cáo khoa học

HCM UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING

BÁO CÁO KHOA HỌC
ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

Đề tài:
Ứng dụng của sắc ký hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích thực phẩm
Thực hiện: Nguyễn Văn Tú

- PhD Student (51305919)

TPHCM, 2017


NỘI DUNG

I. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ

II. CẤU TẠO CỦA HỆ THỐNG HPLC

III. ỨNG DỤNG HPLC TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM


I. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ
• Nguyên lý: Quá trình tách của các cấu tử (chất cần
phân tích ra khỏi chất nền) dựa trên ái lực khác nhau
của mỗi cấu tử đối với pha tĩnh và pha động.

• Hệ thống: Pha tĩnh (stationary phase) và pha động
(mobile phase)

• Các loại sắc ký phổ biến: Sắc ký khí (Gas
chromatography) và sắc ký lỏng (liquid
chromatography)


Nguyên tắc của quá trình tách

Tạp phẩm

Trang sức

Điện tử


Nguyên tắc của quá trình tách

Tạp phẩm

Trang sức

Điện tử


Nguyên tắc của quá trình tách

Tạp phẩm

Trang sức

Điện tử

Nguyên tắc của quá trình tách

Tạp phẩm

Trang sức

Điện tử


Nguyên tắc của quá trình tách

sắc ký đồ


Nguyên tắc của quá trình tách
• Nguyên lý: Quá trình tách của các cấu tử
(chất cần phân tích ra khỏi chất nền) dựa

trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối
với pha tĩnh và pha động.

• Hệ thống: Pha tĩnh (stationary phase) và
pha động (mobile phase)


Nguyên tắc của quá trình tách
• Dựa vào mức độ tương tác (ái lực) hoặc kích

thước khác nhau của các chất cần phân tích với
các nhóm chức (phân cực hoặc không phân cực,

ion dương hoặc âm...) hoặc với kích thước các
khoảng trống (rây phân tử) trong cột nhồi mà các
chất có thời gian lưu lại trong cột khác nhau dẫn
đến quá trình tách giữa các chất.


II. CẤU TẠO HỆ THỐNG HPLC
• Hệ thống bơm (Pump)
• Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
• Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ
cột)
• Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)
• Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)
• Đầu dò (Detector)
• Hệ thống xử lý dữ liệu


HPLC System


Cột sắc ký
• Chứa pha tĩnh
• Được nhồi đầy bằng các hạt nhồi


Cột sắc ký
• Kích thước cột

– Dài (L): 5 – 30 cm
– Đường kính trong (I.D.): 2 – 5 mm
– Kích cỡ hạt: 3, 5, 10 µm


Cột sắc ký
• Các loại cột thường dùng trong phân tích:
– Cột pha đảo (Reverse phase)
– Cột pha thuận (Normal Phase)
– Cột trao đổi ion âm (Anion Exchange)

– Cột trao đổi Ion dương (Cation Exchange)
– Cột sắc ký rây phân tử (Size Exclusion)
– Cột sắc ký ái lực (Affinity)
– Cột sắc ký đẳng điện (Mono P)
– Cột Ceramic Hydroapatite (CHT)


Pha tĩnh
• Sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid
Chromatography - RPLC)
– Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các
nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol
C8

Silica

C18

Silica

Silica

Silanol


Pha tĩnh
• Sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography

- NPLC)
– Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các
nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3
bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino...
R
Silica

O

(CH2) 3CN

Si
R
R

Silica

O

Si
R

(CH2) 3NH2

Amino, NH2


Pha động
• Yêu cầu:
– Độ tinh khiết cao (ví dụ: nước/đệm với
MeOH/ACN)
– Không phản ứng với chất phân tích và pha
tĩnh
– Không có bọt khí
– Không có bụi


Pha động
• Độ phân cực của dung môi
ảnh hưởng mạnh đến quá
trình sắc ký
MeOH/H2O 85:15

ACN/H2O 85:15


Pha động

• Một số dung môi sử dụng trong HPLC
Độ phân cực
Không phân cực

Phân cực

Dung môi
Hexan
Isooctan
Petroleum ether
Cyclohexan
Carbon tetrahydrochloride
Chloroform
Dichlorometan
Tetrahydrofuran
Diethyl ether
Ethyl acetate
Aceton
Acetonitril
Isopropanol
Methanol
Nước
Acid acetic

Khả năng tan trong nước

Không
Không
Không
Không
Không
Không
Không

Có
Không
ít
Có
Có
Có
Có
Có
Có


pH: Pha động
• pH cũng ảnh hưởng
đến hiệu quả tách giữa

các chất. Tuy nhiên tùy
thuộc vào bản chất của
các chất phân tích mà
ảnh hưởng của pH có
thể làm tăng hoặc giảm
khả năng tách của cột.


ỨNG DỤNG CỦA HPLC TRONG PTTP
• Florfenicol là 1 loại thuốc kháng khuẩn phổ rộng thay thế cho

kháng sinh Chloramphenicol – là loại kháng sinh chủ yếu dùng
để trị bệnh nhiễm trùng huyết đường ruột trên cá tra, ba sa ….
• Florfenicol

(2,2-dichloro-N-((1R,2S)-3-fluoro-1-

hydroxy-1-(4-

(methylsulfonyl) phenyl) propan-2-yl) tan tốt trong các dung môi
phân cực như: Nước, Chlorofrom, Methanol, Ethyl acetate,
Acetone,... Tan ít trong các dung môi không phân cực như: nhexane, Diether ethyl, Benzene, Petroleum ether,....
• Công thức phân tử: C12H14Cl2FNO4S


ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI
CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN

• Phương pháp này mô tả qui trình phân tích xác
định hàm lượng Florphenicol trong các mẫu có

nguồn gốc động vật bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao gọi tắt là HPLC. Giới hạn

phát hiện của phương pháp 50 µg/kg.


ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI
CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN

• Dư lượng Florphenicol trong mẫu được ly trích
bằng ethyl acetate. Dung môi được làm khô bằng

dòng khí nitơ, sau đó hoà tan lại bằng pha động
và làm sạch mẫu bằng n – hexan. Hàm lượng chất

phân tích được xác định trên hệ thống HPLC, cột
pha đảo C18 và đầu dò UV ở bước sóng 220nm.


ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI
CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN

CHUẨN BỊ MẪU
• Lấy các phần ăn được từ những vị trí khác nhau của
mẫu. Cắt phần mẫu vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ
3-5 cm. Cho phần mẫu vừa cắt (khoảng 100 gam) vào
máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất. Giữ mẫu ở 18C hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích. Khi tiến
hành phân tích mẫu phải đưa về nhiệt độ phòng.