Đánh giá đa dạng di truyền một số giống lạc địa phương phục vụ chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn

1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------

NGÔ THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG LẠC ĐỊA
PHƯƠNG PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG LẠC
KHÁNG BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------

NGÔ THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG LẠC ĐỊA
PHƯƠNG PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG LẠC
KHÁNG BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN

NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ NGÀNH: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Lê Thị Bích Thủy

Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Tác giả

Ngô Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thủy đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình
nghiên cứu này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt đến tập thể cán bộ Phòng Di truyền tế
bào thực vật đã giúp đỡ tôi về mặt tinh thần, cũng như tạo mọi điều kiện về vật
chất, các phương tiện kỹ thuật cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban đào tạo Viện sinh thái
Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn.
Tác giả

Ngô Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
DNA

: Deoxyribonucleic acid

RNA

: Axit ribonucleotide

AFLP

: Amplyfied Fragment Length Polymorphism

Bp

: Cặp base (base pair)

CTAB

: Cetyltrimethyl amoniumbromide

dNTP

: Deoxynucleosid triphosphat

EDTA

: Ethylene diamin tetra acetate

EtBr

: Ethidium bromide

Kb

: Kilo base

NST

: Nhiễm sắc thể

PCR

: Phản ứng chuỗi polymerase
(Polymerase chain reaction)

QTL

: Locut tính trạng số lượng (Quantitative Trait Loci)

Rnase

: Ribonuclease

RFLP

: Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế
(Restriction Fragment Length Polymorphism)

RAPD

: Rvàom Amplyfied Polymorphic DNA

SSR

: Các trình tự lặp lại đơn giản
(Simple Sequence Repeats)
Taq Polymerase: Thermus aquaticus Polymerase

TBE

: Tris base, Boric acid, EDTA.

TE

: Tris EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách 50 giống lạc nghiên cứu ..................................................... 20
Bảng 3.1. Hệ số PIC và số allen trên các chỉ thị nghiên cứu ............................... 30
Bảng 3.2. Các chỉ thị cho allen đặc trưng ............................................................ 32
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp giống lạc ............................ 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của 25 mẫu lạc ..................................... 29
Hình 3.2. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Ah041 với 30
giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 32
Hình 3.3. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi EM31 với 30
giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 33
Hình 3.4. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Ah408 với 30
giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 34
Hình 3.5. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Seq3F03 với
30 giống lạc trong tập đoàn .................................................................................. 34
Hình 3.6. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 giống lạc nghiên cứu .................... 37
Hình 3.7. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 7G2 với 30
giống lạc trong tập đoàn. ...................................................................................... 39
Hình 3.8. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 3A8 với 25
giống lạc trong tập đoàn. ...................................................................................... 40
Hình 3.9. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 14H6 với 25
giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 40
Hình 3.10. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi 16C6 với 25
giống lạc trong tập đoàn ....................................................................................... 41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1. Tổng quan về cây lạc ................................................................................. 4
1.2. Diện tích trồng lạc trên thế giới và Việt Nam ........................................... 4

1.2.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ..................................................... 4
1.2.2. Diện tích và năng suất trồng lạc ở Việt Nam ...................................... 5
1.3. Chỉ thị phân tử SSR .................................................................................... 6
1.3.1. Khái niệm............................................................................................. 6
1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống cây trồng ................... 6
1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền các
giống lạc ........................................................................................................... 9
1.4. Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ........................................... 10
1.4.1. Lịch sử phát hiện, phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn hại
lạc…………… ............................................................................................... 10
1.4.2. Thành tựu chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhờ chỉ thị
phân tử ……………………………………………………………………...12
1.5. Vai trò của việc chọn cặp lai trong chọn giống ....................................... 16
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20
2.1. Vật liệu ....................................................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 22
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ................................................. 22
2.2.2. Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR ........................................... 24
2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose .................................................. 24
2.2.4. Phương pháp điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide ............ 25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................. 27
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 29
3.1. Kết quả tách DNA tổng số....................................................................... 29
3.2. Đa dạng di truyền các giống lạc bằng chỉ thị phân tử SSR ..................... 30

3.2.1. Hệ số PIC và số allen trên các chỉ thị nghiên cứu ............................ 30
3.2.2. Các allen hiếm trong tập đoàn giống lạc nghiên cứu ........................ 31
3.2.3. Quan hệ di truyền của các giống lạc nghiên cứu .............................. 35
3.3. Khuyến cáo một số cặp lai....................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 43
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ............................................ 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lạc (Arachis hypogage L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, cây thực phẩm
có giá trị kinh tế cao, đã được gieo trồng trên 100 nước trên thế giới. Năm 2009,
diện tích lạc thế giới là 23,95 triệu ha, trong đó lớn nhất là Ấn Độ với diện tích
5,47 triệu ha (chiếm 22,83%). Trung Quốc dẫn đầu về sản lượng lạc hàng năm
(14,76 triệu tấn/năm), chiếm tới 40,49% tổng sản lượng thế giới. Một số nước
như Hoa Kì, Trung Quốc, Achentina,... thuộc nhóm các quốc gia đạt năng suất
lạc cao nhất thế giới (38,24 tạ/ha; 33,56 tạ/ha; 23,52 tạ/ha tương ứng) (FAO,
2009) do tập trung đầu tư vào nghiên cứu và áp dụng các tiến bộ kỹ thuật trên

cây lạc.
Hiện nay diện tích trồng lạc tăng lên tuy nhiên năng suất và sản lượng lạc
tăng chưa tương xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các địa
phương trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nước trời như đất đồi gò, đất
cạn và đất bãi ven sông đều bị bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại làm giảm năng suất
và sản lượng. Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia Solanacerum Smith gây ra là
đối tượng gây hại nặng và chủ yếu trên cây lạc với khoảng 20 % diện tích trồng bị
nhiễm bệnh. Bệnh gây hại trên địa bàn các tỉnh có diện tích và sản lượng cao như
Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình,Tây Ninh. Bên cạnh đó
bệnh cũng làm suy giảm phẩm cấp, dinh dưỡng và hàm lượng dầu trong hạt lạc để
làm chế biến dầu thực vật.
Đã có một số nghiên cứu và áp dụng biện pháp canh tác để hạn chế bệnh héo
xanh hại lạc nhưng hiệu quả chưa cao. Dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra ở các
vùng và gây thiệt hại khá nặng cho người sản xuất. Kinh nghiệm ở các nước trồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2

lạc trên thế giới cho thấy sử dụng giống kháng bệnh là giải pháp hữu hiệu nhất để
hạn chế tác hại của bệnh. Trong thời gian qua Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp
Việt nam cũng đã chọn tạo thành công giống lạc kháng bệnh héo xanh MD7 và phát
triển ở một số vùng góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên giống này còn
một số hạn chế về đặc điểm nông học như vỏ dầy, hàm lượng dầu chưa cao. Cần
phải chọn tạo các giống vừa có khả năng kháng bệnh, lại có các đặc tính nông sinh
học tốt. Tuy nhiên kết quả chọn giống kháng bệnh theo phương pháp truyền thống
còn hạn chế do hiệu quả chuyển các gen kháng bệnh vào con lai bằng phương pháp

truyền thống còn khó khăn và thời gian còn dài.
Ngày nay việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh
là con đường ngắn nhất và hiệu quả. Chỉ thị phân tử là công cụ mạnh mẽ trong
việc đánh giá các biến dị di truyền, giải thích mối quan hệ di truyền trong và
giữa các loài, hỗ trợ việc quản lý các nguồn tài nguyên di truyền thực vật (Virk
và cs, 2000; Song và cs, 2003; Teixeira da Silva., 2005).
Trình tự lặp lại đơn giản (SSR) là công cụ quan trọng để xác định sự biến
đổi di truyền nguồn gen (Powell và cs, 1996; Ma và cs, 2011). Nhờ có ưu điểm
là đánh giá nhanh chóng, chính xác, cho đa hình cao và ổn định, do đó chỉ thị
SSR được sử dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, lập bản đồ phân tử
(Zhang và cs, 2007; Ma và cs, 2011), xây dựng dấu vân tay DNA (Xiao và cs,
2006; Ma và cs, 2011), kiểm tra độ tinh khiết di truyền (Peng và cs, 2003; Ma và
cs, 2011), phân tích sự đa dạng các nguồn gen (Zhou và cs, 2003; Jin và cs,
2010; Ma và cs, 2011).
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một
số giống lạc địa phương phục vụ chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3

khuẩn” nhờ chỉ thị phân tử SSR nhằm chọn lựa cặp lai phục vụ chọn tạo giống
lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, góp phần hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực
vật cũng như tác hại của bệnh, bảo vệ môi trường và tạo sự đa dạng sinh học đối
với cây lạc.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
 Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn giống lạc thu thập ở một số địa

phương Việt Nam.
 Chọn được một số cặp lai ưu tú phục vụ cho việc chọn tạo giống lạc kháng
bệnh héo xanh vi khuẩn.
3. Nội dung nghiên cứu
 Tách DNA tổng số của 50 giống lạc nghiên cứu
 Phân tích DNA tổng số với các mồi SSR xác định các mồi cho đa hình, số
lượng allen của mỗi mồi, hệ số PIC.
 Phân nhóm di truyền các giống lạc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây lạc
Lạc (danh pháp khoa học: Arachis hypogaea) là một cây thực phẩm họ
đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ ở các nước Bolivia, Brazil và Peru. Nó
là loài cây thân thảo, thân cao từ 3 - 50 cm. Lá mọc đối, kép hình lông chim với
bốn lá chét, kích thước lá chét dài 1 - 7 cm và rộng 1 - 3 cm. Hoa dạng hoa đậu
điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2 - 4 cm. Sau khi thụ phấn,
quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3 - 7 cm, chứa 1 - 4 hạt, và quả
thường giấu xuống đất để phát triển. Lạc thích hợp với những thành phần cơ giới
nhẹ và thoát nước tốt, như đất cát pha, đất thịt nhẹ… và thường được trồng phổ
biến ở Trung Quốc, Ấn Độ, Senagal, Nigieria, Myanmar, Sudan, Mỹ, Argentina
và Indonesia.
Ngoài việc tạo năng suất và hiệu quả kinh tế cao thì cây lạc cũng là một
loại cây trồng có khả năng cải tạo đất rất tốt (đó là nhờ sự cộng sinh của nhóm vi

khuẩn cộng sinh với lạc ở rễ, chúng có khả năng cố định đạm từ nguồn nitơ từ
không khí làm tăng lượng đạm trong đất đồng thời làm tăng độ phì của đất). Cây
lạc cũng là một cây phân xanh có thể sử dụng toàn bộ rễ thân lá của cây lạc làm
phân bón cho đất được luôn. Ngoài ra cây lạc còn có nhiều ứng dụng trong đời
sống (dùng để sản xuất dầu thực vật, thực phẩm…), trong y học (vỏ lạc và lụa
lạc được dùng làm thuốc…).
1.2.

Diện tích trồng lạc trên thế giới và Việt Nam

1.2.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
Theo số liệu FAOSTAT (2013), diện tích trồng lạc năm 2013 trên thế giới
đạt 25,45 triệu ha và có trên 112 nước trồng lạc. Trong đó diện tích trồng lạc ở
các nước châu Á chiếm 47,84%, châu Phi 47,83%, châu Mỹ 4,2%, châu Âu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




5

0,45% so với tổng diện tích. Các nước có diện tích lớn gồm 10 nước, trong đó
Ấn Độ có diện tích lớn nhất đạt 5.250.000 ha, Trung Quốc đạt 4.680.000 ha,
Nigieria đạt 2.360.000 ha. Diện tích trồng lạc trên thế giới trong 3 năm 2011,
2012 và 2013 biến động từ 24,59 triệu ha đến 25,45 triệu ha. Năng suất lạc bình
quân của thế giới là 1,640 - 1,777 tấn/ha. Năng suất lạc của các nước chênh lệch
khá lớn và không ổn định qua các năm. Sản lượng lạc bình quân của thế giới
trong 3 năm đạt từ 40,48 - 45,23 triệu tấn. Các nước có sản lượng đứng đầu là
Trung Quốc đạt từ 16,11 - 16,92 triệu tấn, thứ đến là Ấn Độ đạt từ 4,69 - 9,47

triệu tấn, Mỹ đạt từ 1,66 - 3,06 triệu tấn. Theo nhận định của các nhà khoa học,
tiềm năng nâng cao năng suất và sản lượng lạc ở các nước còn rất lớn cần phải
khai thác. Trong khi các loại cây như lúa mì và lúa nước đã gần đạt tới năng suất
trần và có xu hướng giảm dần ở nhiều nước trên thế giới thì năng suất lạc trong
sản xuất vẫn còn khác xa so với năng suất tiềm tàng. Thực tế này đã gợi mở khả
năng nâng cao năng suất và hiệu quả sản xuất lạc trên cơ sở áp dụng những tiến
bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất để khai thác tiềm năng. Chiến lược này đã
được áp dụng thành công ở nhiều nước và đã trở thành bài học kinh nghiệm
trong phát triển sản xuất lạc của các nước trên thế giới.
1.2.2. Diện tích và năng suất trồng lạc ở Việt Nam
Cây lạc được trồng ở Việt Nam từ lâu đời, và là cây lấy dầu đứng thứ nhất
về diện tích, sản lượng và xuất khẩu, hàng năm đóng góp khá lớn vào tổng giá trị
kim ngạch xuất khẩu của nước ta.
Giai đoạn từ 2009 - 2013, diện tích lạc trên cả nước biến động trong
khoảng 216.215 - 245.000 ha, cao nhất là vào năm 2009 sau đó có xu hướng
giảm dần (FAOSTAT ,2013). Tuy nhiên trong giai đoạn này, năng suất tiếp tục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




6

có xu hướng tăng lên và cao hơn so với năng suất bình quân thế giới 0,5 tấn/ha
(năng suất lạc của thế giới năm 2013 đạt 1,777 tấn/ha).
1.3.

Chỉ thị phân tử SSR

1.3.1. Khái niệm
Simple sequence repeat (SSR) là một chỉ thị phân tử quan trọng trong
nghiên cứu đa dạng di truyền. Trong genome của Eukaryota tồn tại rất nhiều các
trình tự lặp lại rải rác như satellite, minisatellites, microsatellites. Các đoạn lặp
lại đơn giản (SSR) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites) là những đoạn DNA
ngắn gồm một số cặp nu liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài từ 4 đến 6 cặp base,
số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị. Kỹ thuật này được sử dụng
rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau. SSR
phát triển và được sử dụng rộng rãi do nó có khả năng phát hiện số lượng lớn các
đoạn trình tự lặp lại ở tất cả các cơ thể bậc cao, nó có tiềm năng cho đa hình cao
hơn và đơn giản hơn so với các chỉ thị phân tử khác. SSR là chỉ thị đồng trội vì
vậy nó chứa đựng thông tin cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là
quá trình thiết kế mồi rất tốn kém do phải thiết kế mồi đặc hiệu cho từng locus
SSR khác nhau, có bao nhiêu locus SSR thì cần bấy nhiêu mồi mà mỗi loại mồi
lại chỉ đặc trưng cho một loài. Việc đọc trình tự SSR cũng gặp nhiều khó khăn.
Vì vậy, chỉ có một số loài được quan tâm như người, lúa, ngô... được thiết kế
mồi SSR.
1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống cây trồng
Phân tích đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền giữa các
loài thực vật là những thông tin quan trọng cho chiến lược bảo tồn và phát triển
các giống cây trồng (Romero và cs, 2009). Hơn nữa, những thông tin này cũng
hữu ích cho việc mô tả nguồn gen và phân loại thực vật. Trong những năm gần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




7

đây, chỉ thị SSR đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác
định đa dạng di truyền (sự thay đổi trong trình tự nucleotide, cấu trúc gen, nhiễm
sắc thể và toàn bộ hệ genome) và các mối quan hệ phát sinh loài của loài dựa
trên trình tự bảo thủ cao của nó.
Một ứng dụng khác của chỉ thị SSR là xác định hiệu quả của cặp lai hữu
tính, trong đó đặc tính di truyền đồng trội của chỉ thị SSR đóng vai trò quyết
định và cho phép xác định mức đóng góp các allen của cá thể bố mẹ cho con lai
trong phép lai. Một số loại thực vật có hoa sinh sản lưỡng tính. Trong đó, chỉ
những cá thể cái mới có giá trị thương mại nhờ tạo ra các loại trái cây (đu đủ,
kiwi, seabuckthorn ...) và các loại hạt (quả hồ trăn, hạt tiêu đen, jojoba vv ...)
Tuy nhiên, các loại cây này không có sự khác biệt về mặt hình thái giữa cây đực
và cây cái nên không phân biệt được ở giai đoạn cây còn non và chỉ phân biệt
được vào thời kỳ ra hoa. Thời gian ra hoa của các loại cây này có thể mất vài
tháng đến vài năm. Việc này gây tốn kém và lãng phí rất nhiều. Sử dụng các chỉ
thị SSR liên kết với giới tính giúp chọn lọc ngay từ giai đoạn cây non, đem lại
lợi ích kinh tế cao hơn. Một số chỉ thị phân tử SSR liên kết với giới tính đã được
sử dụng ở một số loài như: gai dầu (Rode và cs, 2005), dâu tây hoang dã (Spigler
và cs, 2008), hop (Jakse và cs, 2008), đu đủ Carica (Parasnis và cs, 1999).
Chỉ thị phân tử SSR đã chứng minh có hiệu quả trong xác định các vùng
gen chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện của các tính trạng nông học và quá trình
sinh lý quan trọng. Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng trong phân tích các locus
tính trạng số lượng (quantitative trait loci - QLT), mà qua đó có thể xác định
được các gen quy định các tính trạng mong muốn. Một số tính trạng liên quan
đến các yếu tố cấu thành năng suất, chất lượng quả, hạt, khả năng kháng sâu
bệnh và các điều kiện bất lợi của môi trường (Neeraja và cs, 2007; Romero và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8

cs, 2009). Tuy nhiên, trái ngược với các chỉ thị phát triển từ phát triển từ thư viện
genome, Các chỉ thị EST-SSRs có thể đóng góp trực tiếp allen chọn lọc bởi vì đã
biết được chức năng của chúng và chúng có thể liên kết với tính trạng mong
muốn (Varshney và cs, 2005). Bản đồ liên kết cũng đề cập đến mối liên kết chặt
chẽ giữa chỉ thị phân tử với các tính trạng kiểu hình. Điều này đặc biệt có ích
trong quá trình chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử với các tính trạng số
lượng trong các chương trình chọn tạo giống (Breseghello và cs, 2006).
Đối với cây lạc, SSR là một công cụ về di truyền được ưa thích trong việc
lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chương trình chọn
giống. Bản đồ liên kết di truyền với các chỉ thị SSR đã được xây dựng cho bộ đôi
lặp lại AA trong genome, bộ bốn AABB (Hong và cs, 2010). Gần đây, có nhiều
nghiên cứu về cơ sở di truyền có tính chuyên sâu để phát triển chỉ thị SSR cung
cấp các công cụ di truyền phục vụ cho nghiên cứu tổng thể giống lạc (Guo và cs,
2009). Trong trường hợp chọn tạo giống lạc ở mức độ phân tử: Dữ liệu cho phân
tích phân tử của thực vật thì khá dễ dàng để chọn lọc, nhưng việc quan sát những
quần thể có ý nghĩa để giải quyết những vấn đề lai tạo thì thường phức tạp và
khó khăn. Nhiều vấn đề đang thu được kết quả tốt nhờ sự phân tích số liệu cho
những tính trạng mong muốn. Nhiều nghiên cứu đã công bố về các chỉ thị phân
tử liên kết với tính kháng bệnh đốm lá ở lạc gây ra bởi Cercospora arachidicola
Hori và đã mô tả những khó khăn trong việc chọn lọc bố mẹ dưới những điều
kiện đồng ruộng, nơi chọn lọc có ý nghĩa có thể xảy ra (Staker và cs, 2001).
Ngoài ra, gần đây những thông tin thu được về sự liên kết các chỉ thị phân tử với
tính trạng kháng bệnh và hình thái ở lạc đã được giới thiệu như bệnh héo xanh vi
khuẩn (Jiang và cs, 2007), rỉ sắt (Mace và cs, 2006; Mondal và cs, 2005), bệnh
nấm (Chenault và cs, 2008)...

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9

1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền các
giống lạc
Để khai thác nguồn tài nguyên di truyền cây lạc có hiệu quả, trước hết
phải nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của các dòng
giống trong tập đoàn. Trên cơ sở đó có thể xác định được nguồn thực hiện làm
bố mẹ phục vụ tốt cho chương trình lai tạo giống.
Ngoài việc đánh giá phân loại tập đoàn dựa trên đặc tính hình thái gần đây
người ta sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền của tập đoàn lạc và cho kết quả tốt, có nhiều hứa hẹn: SSR, AFLP, đa
hình nucleotide đơn (SNP- single nucleotide polymorphisms), nhân bản đa hình
vùng quan tâm (TRAP- target region amplification polymorphism), trình tự gen
mục tiêu (EST- expressed sequence tags).
Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích đa dạng ở lạc đã có những nghiên cứu ở
Trung Quốc (Tang và cs, 2007), Nhật Bản (Naito và cs, 2008), Krishna và cs,
2004) và một số nơi (Barkley và cs, 2007; Guo và cs, 2009, Luu và cs, 2008,
Ferguson và cs, 2004; Fonceska và cs, 2009). Nhìn chung nhiều chỉ thị SSR
được phát triển từ các chuỗi EST cho thấy tỷ lệ AG/TC lặp lại chiếm ưu thế
(Guo và cs, 2009).
Sử dụng nguồn gen của các giống lạc hoang dại là con đường làm tăng đa
dạng di truyền của các giống lạc đang trồng. Nghiên cứu của Song (2010) đã tìm
được 600 EST chứa ít nhất 1 chỉ thị SSR trong số 12000 EST. Kết quả nghiên
cứu cho thấy sự đa hình thấp ở các giống lạc trồng và cao ở các giống hoang dại
(Song và cs, 2010).
Chen (2008) đã tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh đối với 79 dòng

của 18 loài Arachis từ năm 2004 đến 2006. Qua đó, chọn lọc được kiểu gen có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




10

tính kháng cao với bệnh héo xanh vi khuẩn. Mối quan hệ và mức độ đa dạng di
truyền của 15 kiểu gen kháng bệnh đã được ghi nhận dựa trên các chỉ thị phân tử
SSR. Kết quả cho thấy, loài tứ bộ A. monticola có mối quan hệ gần nhất với loài
lạc được trồng A. hypogaea so với các loài được nghiên cứu trong này. Loài
lưỡng bội A.duranensis và A.chacoense của phân chi Arachis có mối quan hệ rất
gần với loài lạc trồng (Chen và cs, 2008).
Naito (2008) đã phân tích đa dạng và quan hệ di truyền các giống lạc ở
Nhật bằng cách so sánh sự khác nhau của các allen khi sử dung 13 chỉ thị SSR.
Qua đó cho thấy hai loài A. lypogaea và A. monticola được phân thành 2 nhóm
riêng biệt.
1.4.

Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc

1.4.1. Lịch sử phát hiện, phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn hại
lạc
Năm 1896 nhà bác học người Mỹ E.F. Smith là người đã phát hiện vi
khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh
héo xanh vi khuẩn đặc biệt gây hại nặng ở vùng Nhiệt đới, Á nhiệt đới và các
vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây hại trên 400 loài cây
trồng thuộc 80 họ khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong hạt giống, trong

đất và cỏ dại (Seal và Elphinstone, 1994). Chính vì vậy việc phòng trừ bệnh gặp
nhiều khó khăn.
Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra là một
trong những yếu tố quan trọng hạn chế năng suất, diện tích và sản lượng lạc trên
thế giới. Bệnh có thể làm giảm năng suất lạc từ 30 – 65% (Hayward 1994, CAB
2004).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




11

Theo Y.Z.Tan và cs (1994) ở Trung Quốc bệnh héo xanh hại lạc phân bố ở
16 tỉnh nhưng gây hại chủ yếu ở các vùng thuộc miền Trung và miền Nam, nặng
nhất là ở Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, An Huy với tỷ lệ bệnh 10 -20%,
diện tích bị nhiễm 300.000 ha. Bệnh gây hại nặng ở phía Nam với 70% diện tích
bị nhiễm, làm giảm hàng năm trên 35.000 tấn lạc.
Tại Indonesia bệnh thường gây hại nặng ở vùng đất cao và khô hạn và làm
giảm hàng năm 50.000 - 150.000 tấn lạc trị giá 50 - 150 triệu USD. Tại Thái Lan
bệnh gây hại chủ yếu ở vùng chuyên canh trồng lạc liên tục nhiều năm. Theo
M.P. Natural (1994) ở Philippin tại Isabela thiệt hại do bệnh héo xanh lạc gây ra
ước tính 30%.
Hayward (1990) cho biết các Biovar 3, 4 gây bệnh cho lạc ở các nước
châu Á và châu Phi, Biovar 1 gây bệnh cho lạc ở Mỹ. Biovar 3 chiếm ưu thế hơn
Biovar 4 về độc tính ở các nước Trung Quốc, Indonesia, Malayxia (Machmud,
1993; Mehan và Liao, 1994).
Cho đến nay, sử dụng thuốc hoá học để phòng trừ bệnh không có hiệu
quả, sử dụng giống kháng được coi là phương pháp thích hợp để phòng trừ bệnh

héo xanh vi khuẩn. Theo Duan và cs (1993), Tang và Zhou (2000), Zhou và cs
(2003), nhiều nguồn gen kháng bệnh đã được xác định. Tuy nhiên, hầu hết chúng
đều gắn với kiểu gen có tiềm năng năng suất thấp. Do đó xác định các dòng
giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn có năng suất chấp nhận được là hết sức
cần thiết.
Theo Singh (1990) để đánh giá tính kháng bệnh của cây trồng đối với các
loại bệnh phát sinh từ đất người ta thường đánh giá ở vườn lây nhiễm (sick-plot).
Để đánh giá tính chống chịu của các giống lạc đối với bệnh héo xanh vi khuẩn,
nhiều tác giả (Kelman, Li và Tan, 1984, Tan và cs, 1994) đã đưa ra phương pháp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




12

lây nhiễm qua thân, rễ và hạt cho các thí nghiệm trong chậu vại và nhà kính và
để so sánh độc tính của các nguồn vi khuẩn.
Đã có một số nghiên cứu và áp dụng biện pháp canh tác để hạn chế bệnh héo
xanh hại lạc nhưng hiệu quả chưa cao. Dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra ở các
vùng và gây thiệt hại khá nặng cho người sản xuất. Kinh nghiệm ở các nước trồng
lạc trên thế giới cho thấy sử dụng giống kháng bệnh là giải pháp hữu hiệu nhất để
hạn chế tác hại của bệnh. Trong thời gian qua Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp
Việt Nam cũng đã chọn tạo thành công giống lạc kháng bệnh héo xanh MD7 và
phát triển ở một số vùng góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên giống này
còn một số hạn chế về đặc điểm nông học như vỏ dầy, hàm lượng dầu chưa cao.
Cần phải chọn tạo các giống vừa có khả năng kháng bệnh, lại có các đặc tính nông
sinh học tốt. Tuy nhiên kết quả chọn giống kháng bệnh theo phương pháp truyền
thống còn hạn chế do hiệu quả chuyển các gen kháng bệnh vào con lai bằng phương

pháp truyền thống còn khó khăn và thời gian còn dài.
Để phát triển cây lạc bền vững và tăng thu nhập cho người trồng lạc, việc
ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh chỉ thị phân tử là con
đường ngắn nhất và hiệu quả, không những góp phần hạn chế tác hại của bệnh mà
còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật phòng trừ bệnh, bảo vệ môi trường và
tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc.
1.4.2. Thành tựu chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhờ chỉ thị
phân tử
Công nghệ sinh học phát triển, việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn
giống cũng như trong việc sàng lọc giống kháng bệnh và tính chống chịu được
đặc biệt quan tâm. Xác định được chỉ thị DNA liên kết chặt với tính trạng nào đó
thì có thể sử dụng cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS). Nhiều chỉ thị cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




13

lượng đa hình lớn, các allen thay thế ít có ảnh hưởng xấu ở mức độ phân tử cũng
như mức độ toàn thể thực vật, chúng thường đồng trội, có thể phân biệt được tất
cả các kiểu gen trong mỗi thế hệ và ít bị tách biệt trong tần số át chế gen. Ở lạc
đã có nhiều công bố về các chỉ thị như RFLP, RAPD, AFLP, SCAR, SNP và đặc
biệt khá nhiều ở SSR vì nó đồng trội, nhiều allen và phong phú hơn các chỉ thị
khác.
Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự khác nhau về độc tính các nguồn vi
khuẩn ở các vùng khác nhau và trên các cây ký chủ khác nhau. Theo Cheng và
cs (1981) các isolate từ cây lạc có độc tính cao đối với cây họ cà nhưng không
gây bệnh trên cây vừng, hướng dương, đậu tương. Hiện nay đã có rất nhiều chỉ

thị phân tử liên quan đến bệnh héo xanh vi khuẩn trên nhiều loại cây trồng
(nhiều nhất là ở khoai tây) đã được thông báo như RAPD (Sun và cs, 2008;
Balatero và cs, 2002), SCAR (Bi-hao và cs, 2009) hoặc một số gen liên quan đến
bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc cũng đã được công bố (Peng và cs, 2011)… Để
nghiên cứu đặc tính di truyền của tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở khoai
tây, Carlos và cs (1998) đã tiến hành lập bản đồ di truyền của các cá thể con lai
từ hai giống bố mẹ L285 (Lycopersicon esculentum var cerasiforme) x CLN 286
(L. esculentum). Bản đồ di truyền hai giống bố mẹ R570-R576 được thiết lập
trên cơ sở phân tích 112 con lai bằng 242 cặp mổi AFLP. Kết quả thu được 220
cặp mổi đa hình và có sự khác biệt rất lớn. Cũng tiến hành phân tích các QTL
của tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở khoai tây, đối với Ralstonia
solanacearum race 3-phylotype II strain JT516. Kết quả so sánh cho thấy có thể
có trường hợp có một vài QTL kháng đặc biệt với typ ở Hawaii 7996 (Carmeille
và cs, 2006).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




14

Ren và cs (2008) đã tiến hành lai 2 giống Zhonghua 5 (giống nhiễm) với
giống Yuanza 9102 (giống kháng bệnh) để nghiên cứu đặc tính di truyền của tính
kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Theo dõi sự di truyền của tính kháng bệnh héo
xanh từ quẩn thể F1 đến F6 của phép lai. Kết quả cho thấy, tính kháng bệnh héo
xanh ở lạc được điều khiển bởi 2 gen chủ yếu với sự di truyền cao (84%). Hai
chỉ thị phân tử DNA, ký hiệu là P3M59 và P1M5 liên kết với 2 gen kháng bệnh
lần lượt ở tỷ lệ là 8,12 cM và 11,46 cM được ghi nhận khi sử dụng kỹ thuật
AFLP kết hợp với sự phân tích các biến dị với số lượng lớn. Mười kiểu gen lạc

kháng bệnh héo xanh và ba kiểu gen nhiễm bệnh được sử dụng để kiểm tra mức
độ tin cậy của các chỉ thị kháng bệnh. Kết quả mối tương quan cao đã được ghi
nhận với 2 chỉ thị trên lần lượt là 70% và 50%. Với các kết quả thu được, 2 chỉ
thị phân tử trên hoàn toàn có thể sử dụng trong chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối
với lạc.
29 chỉ thị trong số 78 chỉ thị SSR và 32 trong số 126 chỉ thị AFLP phát
hiện đa hình đã được xác định dựa trên một tập đoàn 31 giống lạc có mức độ
kháng bệnh héo xanh vi khuẩn khác nhau (Jiang và cs, 2007). Trong một nghiên
cứu khác 32 chỉ thị SSR được xây dựng từ 45 giống lạc cũng được phát hiện
99,4% đa hình (Mace và cs, 2007). Huang đã dựa trên quần thể F6 của cặp lai
giữa hai giống Yuanza 9102 và Chico phân tích trên 354 chỉ thị SSR đã nhận
được 8 nhóm liên kết, trong đó nhận được 2 chỉ thị SSR 7G02 và PM137 liên kết
với bệnh héo rũ vi khuẩn (Huang và cs, 2008). Một số chỉ thị như SSR (Bo-Shou
và cs, 2010), SCAR (Bi-Hao và cs, 2009) liên kết chặt với tính kháng bệnh héo
xanh vi khuẩn ở lạc cũng đã được phát hiện.
Các chỉ thị phân tử đối với bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc đã được một
nhóm các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu bằng các chỉ thị SSR, AFLP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




15

cũng như về biểu hiện gen liên quan đến bệnh héo xanh vi khuẩn. Việc nhận biết
các giống/dòng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn thuyết phục nhất là đánh giá phản
ứng của các dòng khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh. Theo dõi vật liệu lây
nhiễm qua một số vụ. Các đặc trưng phân tử DNA và những chỉ thị của 15 dòng
lạc kháng bệnh đã được ghi nhận dựa trên sản phẩm PCR với các mồi SSR đặc

hiệu (Chen và cs, 2008).
Một nghiên cứu ở Viện Hàn lâm Khoa học nông nghiệp Trung Quốc qua
đánh giá hình thái và sử dụng phản ứng PCR với 18 giống lạc đã tìm thấy sự liên
kết của một số chỉ thị SSR với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn (Chen và cs,
2008).
Để tìm ra các kiểu gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn phục vụ việc lai tạo
các giống lạc, Chuang và cs (2009) tiến hành trồng 106 kiểu gen có nguồn gốc
khác nhau, trên 2 địa điểm của tỉnh Sơn Đông, Trung Quốc sau đó cho lây nhiễm
với vi khuẩn gây bệnh héo xanh để đánh giá khả năng kháng bệnh của từng kiểu
gen dựa trên tỷ lệ sống sót của các dòng. Kết quả cho thấy, trong số 106
dòng/giống được đánh giá, chỉ có 5 kiểu gen (4,72%) kháng bệnh cao với tỷ lệ
sống sót của cây sau khi lây nhiễm đạt 83,33 - 93,33%, 9 kiểu gen (8,49%)
kháng bệnh trung bình với tỉ lệ sống của cây sau lây nhiễm là 66,67 - 73,33%, 19
kiểu gen (17,92%) và 73 kiểu gen (68,87%) được xác định là nhạy cảm trung
bình và cao đối với bệnh héo xanh vi khuẩn.
Để khảo sát cơ chế phân tử của tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc,
một giống lạc kháng bệnh Yuanza 9102 và một giống mẫn cảm Zhonghua 12 đã
được lây nhiễm với vi khuẩn Ranstonia solanacearum. Những biểu hiện khác
nhau của gen liên quan đến tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đã được
phân tích bằng kỹ thuật AFLP sử dụng cDNA. Cây con có ba lá được lây nhiễm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN