Nghiên cứu nhân giống cây quýt bắc kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHÍ HỮU VIỆT

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHÍ HỮU VIỆT

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2017


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp làm các nghiên cứu trong luận văn này.
Mọi kết quả thu được là trung thực, không chỉnh sửa, không sao chép từ kết
quả nghiên cứu khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu của luận văn này chưa
từng được công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên!
Tác giả luận văn

Phí Hữu Việt

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp
đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, tôi
xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài này.
Các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của
Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình
giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Cán bộ kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật – Khoa Sinh họcTrường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình,
bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
thời gian học tập.
Thái Nguyên, tháng 3 năm 2017
Tác giả luận văn

Phí Hữu Việt

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
MỤC LỤC ......................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt ... 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ......................................... 3
1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ............................................... 4
1.2. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 5
1.2.1. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới ................................................ 5
1.2.2. Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam ................................................. 5
1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật ................. 6
1.3.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro ................................ 7
1.3.2. Quy trình nhân giống in vitro ............................................................ 9
1.4. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong
nuôi cấy mô thực vật ..................................................................................... 11
1.4.1. Auxin ............................................................................................... 12
1.4.2. Cytokinin ......................................................................................... 13
1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm 14

1.6. Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi cấy
in vitro............................................................................................................ 15

iii


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 19
2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ................................ 19
2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................. 19
2.1.2. Hoá chất, thiết bị.............................................................................. 19
2.1.3 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 20
2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro.............................................. 20
2.2.2. Phương pháp đưa cây ra vườn ươm ................................................ 22
2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................ 23
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 24
3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt
Bắc Kạn ......................................................................................................... 24
3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP hoặc kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt
Bắc Kạn ......................................................................................................... 27
3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ........ 27
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ..... 30
3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi
của quýt Bắc Kạn........................................................................................... 33
3.3.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi cây
quýt Bắc Kạn ............................................................................................ 33
3.3.2. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi quýt
Bắc Kạn ..................................................................................................... 35
3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ cây quýt Bắc Kạn .......... 38
3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra

ngoài tự nhiên ................................................................................................ 40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 43
1. Kết luận...................................................................................................... 43
2. Đề nghị....................................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 44
PHỤ LỤC ......................................................................................................... 47
iv


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid

BAP

: Benzylamino purine

cs

: Cộng sự

CT

: Công thức

DNA

: Deoxyribo nucleic acid

ĐC

: Đối chứng

IAA

: indol acetic acid

IAA

: indole acetic acid

IBA

: Indol butyric acid

Kinetin

: 6-furfurylamino purine

MS

: Murashige and Skoog (1962)

α-NAA

: α- naphthalene acetic acid

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1.

Thành phần cơ bản của môi trường MS ........................................ 19

Bảng 3.1.

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt
quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần nuôi cấy) .............................................. 25

Bảng 3.2.

Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn ... 28

Bảng 3.3.

Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn 31

Bảng 3.4.

Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của
cây quýt Bắc Kạn .......................................................................... 34

Bảng 3.5.

Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của
cây quýt Bắc Kạn .......................................................................... 36

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ của cây quýt Bắc Kạn... 39

Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc
Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần)................................................ 41

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1:

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt
quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần) ............................................................. 26

Hình 3.2.

Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn..... 30

Hình 3.3.

Ảnh của kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn (sau
8 tuần) ................................................................................... 32

Hình 3.4.

Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của
quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 35

Hình 3.5.

Ảnh hường của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của
quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 37

Hình 3.6.

Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành và phát triển rễ của cây
quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 40

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc
Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần) ................................................ 42

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là cây ăn quả được nhiều người biết
đến với vị ngọt mát, thơm đặc trưng, có chứa nhiều vitamin, chất khoáng và
các chất dinh dưỡng cần thiết khác cho con người. Các chuyên gia về dinh
dưỡng khuyên ta nên tích cực ăn quýt hàng ngày.
Cây quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai
trò tích cực trong việc phát triển kinh tế của nhiều địa phương. Do chất lượng
quả tốt nên nhu cầu tiêu thụ quýt trên thị trường ngày càng tăng với số lượng
lớn. Giá thành ổn định đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng quýt,
nhiều hộ gia đình đã thoát nghèo và vươn lên làm giàu từ cây quýt.

Trồng quýt còn có vai trò phủ xanh đất trống đồi trọc, giúp tạo cảnh quan
và bảo vệ môi trường sinh thái. Với chiều cao cây từ 2,0-3,5m, lá xanh che phủ
quanh năm, thích nghi với điều kiện sống khô hạn, nên cây quýt rất phù hợp
với vùng trung du và miền núi. Do đó, có thể trồng quýt trên các đồi dốc vừa
đem lại hiệu quả kinh tế vừa phủ xanh đồi trọc chống xói mòn, bảo vệ môi
trường sinh thái. Không những thế, quýt cũng có thể trồng trong vườn nhà, cây
cao vừa phải, lá thường xanh, hoa quả màu sắc đẹp, có tinh dầu tỏa ra mùi
thơm mát, do đó nó còn được trồng để làm cảnh.
Cây quýt Bắc Kạn được trồng chủ yếu ở huyện Chợ Đồn, có vị nọt mát,
hương thơm đặc trưng, là loại quả quý cần được bảo tồn. Đồng thời, cây quýt
đã được Ủy ban Nhân dân tỉnh Bắc Kạn xác định là cây trồng thế mạnh đóng
vai trò chiến lược trong phát triển kinh tế, do đó đã có nhiều chính sách và chế
độ phát triển cây quýt. Tính đến năm 2015, diện tích quýt của toàn tỉnh Bắc
Kạn lên tới 2200 ha, tăng gấp 5 lần so với năm 2005, tổng sản lượng khoảng
10000 tấn/năm đã mang lại giá trị sản xuất trên 100 tỷ đồng cho nông dân. Tuy
nhiên, giá trị đó vẫn chưa xứng tầm với tiềm năng sẵn có của địa phương. Một

1


trong những lí do làm năng suất của cây quýt còn thấp là nhiều vườn quýt khai
thác lâu năm đã bị thoái hóa không những làm năng suất thấp mà chất lượng
quả cũng bị giảm. Do đó, để tăng năng suất và nâng cao chất lượng thì cần có
biện pháp trồng cải tạo những diện tích quýt thoái hóa. Bên cạnh đó, chiến lược
trong những năm tới, tỉnh định hướng khoảng 1000 ha quýt chăm sóc theo tiêu
chuẩn VietGap nên nhu cầu cây giống tốt là rất lớn.
Phương pháp nhân giống in vitro giúp tạo ra một số lượng lớn giống cây
trồng trong khoảng thời gian ngắn, các cây con mang đặc điểm giống nhau và
giống với dòng mẹ nên có thể tạo quần thể đồng nhất. Đặc biệt, nhân giống in
vitro còn tạo ra giống cây sạch bệnh do được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng,

từ đó đáp ứng yêu cầu sản suất rau quả sạch ngày nay.
Từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu nhân giống cây
quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật".
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu được môi trường nhân giống quýt Bắc Kạn phù hợp trong
ống nghiệm.
Xác định được giá thể phù hợp cho việc chuyển cây từ môi trường nuôi
cấy ra vườn ươm.
3. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khử trùng hạt quýt Bắc Kạn nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban
đầu trong ống nghiệm.
Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin lên sự phát sinh chồi
trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn.
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát
sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn.
Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của αNAA tới sự phát sinh rễ từ chồi giống quýt Bắc Kạn.
Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt
1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học
Cây quýt thuộc bộ cam quýt: Rutales, họ cam quýt: Rutaceae, chi:
Citrus, loài quýt: Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus suhuiensis Hort. ex
Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [111].
Cây quýt có bộ lá xanh quanh năm, lá đơn, mọc cách và có eo lá. Lá thay
nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc nào cũng xanh lá. Trong lá có

nhiều túi tiết tinh dầu nên khi vò lá có mùi thơm [3].
Quýt là cây thân gỗ, thiết diện tròn, mầu nâu thẫm, cao 2-3m, hình dạng
ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong vỏ cây có chứa
nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc lớn, trồng
cây bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc.
Quýt có rễ cọc khỏe, lan rộng, rễ phát triển ở nhiệt độ 10-37oC, khi nhiệt
độ cao hay thấp hơn, độ ẩm của đất 1% thì sự phát triển của rễ sẽ ngừng lại. Tỉ
lệ ôxi trong đất từ 1,2 - 1,5% thì rễ cũng ngừng phát triển. Cây trồng bằng chiết
cành thì không có rễ chính rõ ràng mà có nhiều rễ cạnh có thể phát triển to
nhưng không đâm sâu xuống đất như trồng bằng hạt.
Hoa thường được hình thành ở nách lá, hoa mọc thành cụm, lưỡng tính,
cánh hoa rời nhau và mẫu bốn. Trong hoa thường có đĩa mật thích nghi với việc
thụ phấn nhờ sâu bọ. Nhị hoa thường có số lượng nhiều gấp ba đến bốn lần số
cánh hoa. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hàng
năm, phần lớn sinh ra cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 sinh ra hoa,
đợt 3 tháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt.
Trong các lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất [3].
3


Quả quýt thuộc dạng quả mọng gồm vỏ, thịt và hạt. Vỏ có túi tinh dầu,
thịt quả có nhiều múi, trong múi có các tép mọng nước, mỗi quả có 9- 13 múi.
Quả quýt hình dẹp, vỏ màu vàng và mỏng, vỏ dễ bóc, múi dễ chia, trọng lượng
trung bình đạt từ 35 đến 145 gam tùy giống. Quả có vị ngọt, chua nhẹ và có
hương thơm đậm đặc trưng rất dễ để phân biệt vơi bất kì loại quả nào trong
nhóm cây ăn quả có múi. Trong mỗi quả có từ 18 đến 20 hạt tùy giống. Hạt
quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có 2 lớp màng vỏ, màng ngoài
cứng do thấm nhiều linhin, màng trong mỏng. Hạt thường chín cùng quả, nảy
mầm ở nhiệt độ từ 10oC đến 30oC, tốt nhất là 25- 30oC [3].
1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt

Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, chất khoáng cần thiết
cho sức khỏe con người, đặc biệt có chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh
tật, tăng cường sức đề kháng. Trong 100 gam múi quýt (phần ăn được) có thành
phần dinh dưỡng gồm: nước 66,5%, protein 0,6%, lipit 0,7%, gluxit 6,4%
xelulozo 0,4%, năng lượng 32kcalo, canxi 25,9mg, photpho 12,6mg, sắt 0,3mg,
caroten 0,44mg, vitamin B1 0,06mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,2mg,
vitamin C 41mg và một số axit hữu cơ [3], [277].
Trong quả quýt ngoài vitamin, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ.
Các chất xơ khi vào ống tiêu hóa bị trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn
bã của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp
với đường và axit tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số
chất dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức
cần thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dự
trữ ở các mô gây béo phì [266].
Qủa quýt được nhiều người ưa chuộng, là loại quả sử dụng để ăn tráng
miệng, làm nước giải khát, làm mứt. Quả quýt có vị chua tính ấm, có tác dụng
làm mát tim, khai uất, trừ đàm, tan khí kết, giải rượu. Người bị cao huyết áp,
bệnh mạch vành, đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm, ăn

4


quýt rất tốt. Vỏ quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ
dày, long đờm, trị ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vị. Y học đã
chứng minh, tinh dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế
vận động của cơ dạ dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao
huyết áp, nhồi máu cơ tim, có tác dụng tốt với các chứng bệnh đầy bụng, rối
loạn tiêu hóa, kém ăn, buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt vị đắng tính bình, vào
hai kinh can và thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị
đắng, tính bình vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng,

tan u cục, chữa đau mạng sườn, sa nang, đau vú, u cục ở vú [266], [277].
1.2. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới
Cam quýt là loại quả quan trọng, đứng trên cả nho, chuối, táo. Quýt được
trồng tập trung chủ yếu ở các nước có khí hậu cận nhiệt đới như Mêhico,
Brazin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và các nước ven Địa Trung Hải, các nước ở vĩ
tuyến 30- 350. Ngày nay, sản xuất cam quýt từ vùng nhiệt đới đã tăng lên gần
bằng các nước cận nhiệt đới. Nguyên nhân là do điều kiện tự nhiên, kĩ thuật
canh tác tiến bộ, nhiệt độ vùng ôn đới hạ thấp hơn ảnh hưởng đến sản lượng
quýt. Nguyên nhân quan trọng hơn là dân số các nước vùng nhiệt đới tăng
nhanh, điều kiện kinh tế phát triển hơn, nhu cầu tiêu thụ cam quýt tăng, kéo
theo sản xuất cũng tăng. Theo FAO (năm 2013) tổng sản lượng cam quýt trên
thế giới đạt 135,169 triệu tấn. Trong đó, năm quốc gia có sản lượng cao nhất là
Trung Quốc 32,1 triệu tấn, Brazin 19,9 triệu tấn, Mỹ 10,3 triệu tấn, Ấn Độ 9
triệu tấn, Mehico 7,18 triệu tấn [29].
1.2.2. Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp với nhiều loại cây. Do
vậy, cây quýt ở nước ta được trồng trải dọc từ Bắc xuống miền Nam. Ở miền
Bắc, quýt được trồng nhiều ở một số tỉnh Hà Tây, Hưng Yên, Bắc Giang, Bắc
Kạn, Tuyên Quang, Hà Giang...Do nhu cầu tiêu thụ cao nên diện tích trồng

5


quýt ở các địa phương ngày càng được mở rộng, nhiều vườn quýt được trồng
lại bằng các giống cho năng suất và chất lượng cao. Theo FAO, năm 2012 tổng
sản lượng cam quýt nước ta đạt 958000 tấn, sang năm 2013 sản lượng đã tăng
lên và đạt 971000 tấn. Về năng suất trung bình trong năm 2012 đạt 119,53/ha,
sang năm 2013 chỉ số này đã tăng lên 119,77/ha. Tuy nhiên, việc sản xuất quýt
trong nước vẫn chưa đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước nên mỗi năm nước ta

vẫn phải nhập khẩu quýt từ các nước, trong đó chủ yếu là từ Trung Quốc [29].
1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính
của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm
sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu
thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp
đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch
bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1].
Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau:
(1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công
tác chọn giống.
(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống
các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây
cảnh, cây dược liệu…
(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc
làm sạch bệnh virus.
(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm
tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai.
(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong
ngân hàng gen [1],[15].

6


1.3.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro
Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong
những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng và số lượng cây giống tăng lên
nhanh chóng trên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản
xuất lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường
toàn cầu. Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình

nhân giống nào có được.
Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản
xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ
nhân nhanh. Đồng thời, tạo cây con giống cây mẹ, đáp ứng yêu cầu của việc
bảo tồn nguồn gen quý hiếm.
Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong
1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây.
Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh
vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh.
Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000
cây dâu tây cũng chỉ nặng 15kg); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ 40C
trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%.
Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hành
trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm.
Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô
phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác
của cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống
cây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp
thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm
đồng nhất về mặt di truyền. Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩm hoàn
toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mất trong
tự nhiên [122].

7


Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy
được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của
đỉnh sinh trưởng [1]. Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy

rất khó thành công. Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy là
làm sạch virus cho cây trồng. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnh
sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10mm.
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương
quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi
vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồi
cũng giảm. Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng,
hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng.
Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một
đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều
chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ [122].
Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh
trưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ
chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh. Tuy nhiên, trong thực
tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh.
Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là:
+ Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như
khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm như
dứa sợi, mía…
+ Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm)
Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phong lan, dứa,
huệ. Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có
thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn

8


chỉnh. Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được
hàng triệu cá thể. Do đó, đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn, như ở phong lan vì có

phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành (protocorm) nên nhân giống vô tính hoa lan
đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi.
Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các
cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông,
bồ đề, cam, quýt…
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh
sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ
thể thực vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được. Các bộ
phận đó là: Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh…; mảnh lá
ở thuốc lá, cà chua, bắp cải… ; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…và
nhánh củ ở tỏi, hành…
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực
tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cây cũng
khá đồng đều về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy
không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển
nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do đó nhất thiết phải sử dụng các mô
sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông
qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [8], [10], [144].
1.3.2. Quy trình nhân giống in vitro
Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai
đoạn sau:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng
của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ

9

thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy
mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn
để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy
sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị.
Tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng.
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn
này được tiến hành theo các bước:
(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy
(2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn
môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro).
Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi
trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời
gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các
cơ quan hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ít nhất
4 lần cấy các mảnh.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá
trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi
mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô
tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người
ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần
và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân
nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 - 2
tháng tùy loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển.
Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh
chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu. Ví dụ, từ một đỉnh
sinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên 2000

10

- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma. Đối với các cây
khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi từ
cây mẹ ban đầu.
Giai đoạn 4: Tạo rễ
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh,
nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác
để kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực
tiếp ra đất. Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần.
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng
thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng
ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro. Đối với một số loài có thể chuyển
cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau
khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm.
Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc
đặc biệt. Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm
với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che
cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm
mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không
chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [144].
1.4. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật
Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một
hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất
cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Tuy vậy,
yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm
lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hòa sinh
trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và

nhóm cytokinin [6], [7].

11


1.4.1. Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là indol acetic
acid (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả
các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở
dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol,
IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt
tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol
ethanol.
Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và
chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực
vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng
hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [2], [7].
Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới
hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích
thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các
ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín
của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sự sinh trưởng thông
qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá
trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác.
Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác
nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin
là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở
của vách tế bào [2], [7].
Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất
đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp. Chỉ một thời gian ngắn sau khi

IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp
chất có giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ
dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh

12


sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự
hình thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có
vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính
auxin yếu nhưng có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt
tính của auxin [7].
Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích
sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo
rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric
acid), IAA (3-indol acetic acid), NAA (naphthalen acetic acid), 2,4-D (2,4dichlorophenoxy acetic acid). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử
dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra
chồi. Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [7].
Auxin thường được sử dụng từ 0,1-2,0mg/l, riêng IAA, do kém bền với
nhiệt độ và ánh sáng nên nồng độ sử dụng cao hơn (1,0-3,0mg/l). Chúng có
hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối
tương nuôi cấy...mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của
mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào
dẫn đến hình thành mô sẹo [16].
1.4.2. Cytokinin
Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin. Loại cytokinin đầu tiên phát
hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô. Ngoài ra
còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin,
chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người ta
thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [7].

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là
một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm
1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA
được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng
độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [7].

13


Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi
và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng
tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần
của các glycoside [7].
Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,
đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein. Cytokinin điều
chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi
phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái ngủ
của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gây
nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá do
kích thích sự lớn lên của tế bào [144].
Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,
tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi
vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi
đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ. Các loại cytokinin thường được dùng là:
kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [144].
Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin trong nuôi cấy mô dao động từ
0,1-2,0mg/l. Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt
đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi
cấy. Trong nuôi cấy, có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần
cả hai, còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin

với những tổ hợp tỷ lệ khác nhau [16].
1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm
Ánh sáng và nhiệt độ: Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những
phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các nuôi cấy đều cần ánh
sáng, trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình tái sinh và
nhân giống của chúng cũng yêu cầu có ánh sáng, tỉ lệ chiếu sáng và pha tối là
16/8. Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25-280C nhờ các máy điều
hòa nhiệt độ [16].

14


Nguồn Cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang
hợp, nếu có quang hợp thì cường độ cũng rất yếu do thiếu chlorophil, cường độ
CO2 và nhiều điều kiện khác...Vì vậy, phải đưa thêm những hợp chất
hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy kể cả mẫu cấy là chồi xanh
có khả năng quang hợp. Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường
sucrose với hàm lượng từ 2%-6% [166].
Than hoạt tính: được dùng để hấp thụ các chất mầu, các hợp chất phenol
các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp...trong trường hợp các chất đó có tác dụng
gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính cũng hút các chất
hữu cơ như phytohoocmon, vitamin, sắt chelat, kẽm...Hàm lượng sử dụng than
hoạt tính 0,2%-0,3%. Ngoài ra, than hoạt tính còn làm giảm hiệu quả của chất
điều hòa sinh trưởng, làm thay đổi môi trường ánh sáng, có thể kích thích sự
hình thành và phát triển của rễ. một số trường hợp than hoạt tính thúc đẩy phát
sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng, phát sinh cơ quan của các loài cây
thân gỗ [16].
Nước dừa: Nước dừa được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích
phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được sử dụng

ở nồng độ từ 5% đến 20% [4].
1.6. Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro
Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
được ứng dụng khá rộng rãi, không những trong nghiên cứu mà còn được ứng
dụng trong thực tiễn. Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu được thực hiện trên
cây thân thảo, còn trên cây thân gỗ, đặc biệt là cây ăn quả còn hạn chế.
Nghiên cứu tạo chồi in vitro ở cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.),
Lê Văn Trường Huân (2007) đã chỉ ra, môi trường tạo đa chồi từ đoạn thân
mang mắt chồi bên của cây chanh dây trồng ngoài tự nhiên là môi trường MS
cơ bản có bổ sung đường sucrose 20g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l đã cho hệ
số nhân chồi là 6,57± 0,74 [5].

15


Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro trụ trên lá mầm
hoàn chỉnh của cây cam Vinh và quýt Đường Canh phục vụ công tác chuyển
gen, Phan Hữu Tôn và cs (2014) đã xác định, môi trường cho tái sinh chồi tốt
nhất đối với giống cam Vinh là MS cơ bản bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l +
vitamin B5 1,0mg/l + BAP 1,5mg/l, quýt Đường Canh là MS + sucrose 30g/l +
agar 8g/l + vitamin B5 1,0mg/l + BAP 1,0mg/l, đạt số chồi/mẫu của giống cam
Vinh là 4,7 và quýt Đường Canh là 5,5. Môi trường tốt nhất cho tạo rễ của chồi
đối với giống cam Vinh là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l +
vitamin B5 5,0mg/l + α-NAA 0,4mg/l + IAA 0,4mg/l cho tỉ lệ chồi phát sinh rễ
là 82,3%, số rễ /chồi là 3,5 và chiều dài rễ là 3,5cm, với quýt Đường Canh là
MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l + vitamin B5 5,0mg/l + α-NAA
0,3mg/l + 0,4mg/l tỉ lệ chồi phát sinh rễ là 86,3%, đạt 3,5 rễ/chồi, chiều dài
chồi là 3,2cm. Giá thể tốt nhất cho ra cây in vitro ra ngoài tự nhiên là cát vàng
+ trấu hun với tỉ lệ 1:1, tỉ lệ sống sót sau 6 tuần của cam Vinh là 96,5% và của

quýt Đường Canh là 95% [13].
Nghiên cứu môi trường nhân nhanh giống quýt Cleo-Patra, Suneel
Sharma và cs (2009) đã chỉ ra, môi nhân nhanh chồi từ đoạn trên trụ lá mầm
của quýt Cleo- Patra là môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30g/l
+ agar 9g/l + BAP 1,0mg/l đã cho hệ số nhân chồi đạt 2,4 lần; số rễ tối đa được
ghi nhận khi nuôi cấy đoạn chồi trong môi trường 1/2MS cơ bản có bổ sung
IBA 10mg/l [25].
Adhikarimayum H. và cs (2011) nghiên cứu về nhân giống in vitro cây
quýt Megaloxycarpa Lush của Manipur, Ấn Độ. Tác giả đã chỉ ra, môi trường
MS cơ bản có bổ sung BAP 0,25mg/l + α-NAA 0,5mg/l là thuận lợi nhất cho
sự tạo chồi của đoạn thân mang mắt chồi bên với hệ số nhân chồi là 4,7. Tiếp
đến là môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/l cho
hệ số nhân chồi là 4,4. Chồi non ra rễ tốt nhất là ở môi trường MS cơ bản
có bổ sung α-NAA 2,0mg/l đạt 4,4 rễ/chồi [188].

16