NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THư vú

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Tú Linh

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA MỘT SỐ GEN TY THỂ Ở
BỆNH UNG THƢ VÚ
Chuyên ngành:
Mã số:

Nhân chủng học
62310302

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2016


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. Trịnh Hồng Thái
PGS. TS. Tạ Văn Tờ

Phản biện:…………………………………………

Phản biện:…………………………………………

Phản biện:…………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc
gia chấm luận án tiến sĩ họp tại………………………………………
vào hồi:

giờ

ngày

tháng

năm 20..

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội


MỞ ĐẦU
Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây
tử vong hàng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới (Globocan 2012),
tuy nhiên, tỉ lệ sống sót có thể được cải thiện nếu bệnh nhân được
chẩn đoán ở giai đoạn sớm của bệnh (Anderson, 2008). Đối với sàng
lọc và chẩn đoán sớm ung thư vú, chụp nhũ ảnh và thăm khám vú
vẫn là phương pháp chuẩn trong lâm sàng (Vahabi, 2003), tuy nhiên
nguy cơ phát hiện dương tính giả cao (Elmore, 2010). Điều này cho
thấy cần phải có các chỉ thị sinh học đặc hiệu đối với sàng lọc và
phát hiện sớm bệnh.
ADN ty thể từ lâu đã được cho là có mối liên quan với quá trình

phát sinh ung thư vú (Carew, 2002), trong đó có sự thay đổi về số
lượng bản sao, biến đổi mức độ biểu hiện và hoạt động của các tiểu
đơn vị của chuỗi hô hấp và các đột biến điểm của ADN ty thể
(Tseng, 2006; Fan, 2009). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trên các
nhóm bệnh nhân khác nhau vẫn còn gây tranh cãi. Trên đối tượng
bệnh nhân người Việt Nam, nghiên cứu về về biến đổi của các gen ty
thể còn ít và chưa có tính hệ thống. Xuất phát từ thực tế trên, chúng
tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty
thể ở bệnh ung thư vú” nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp dữ liệu có
tính hệ thống ban đầu về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm
biến đổi số bản sao ADN ty thể, mức độ mất đoạn lớn, biến đổi của
gen ATP6, tARN, ND1 và ND3, trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú
người Việt Nam; (2) Xác định được mối liên quan giữa các biến đổi
này với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú. Kết quả thu được của
luận án là tiền đề có thể phát triển để sử dụng trong đánh giá nguy
cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh.
1


Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ VÚ
1.1.1.

Tình hình mắc ung thƣ vú trên thế giới và ở Việt Nam

Trong các loại ung thư ở nữ giới, ung thư vú là dạng ung thư
phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế
giới cũng như tại Việt Nam (Globocan, 2012; Duc, 2010).
1.1.2.

Các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ vú

Các yếu tố nguy cơ được cho là nguyên nhân gây ung thư vú
bao gồm phóng xạ ion hóa, virus, các hóa chất gây ung thư, chế độ
ăn uống, hoạt động thể chất, hormone ngoại sinh và một số yếu tố
sinh sản ở nữ giới. Các yếu tố này gây đột biến các gen tiền ung thư
hoặc gen ức chế ung thư, từ đó gây ra sự mất ổn định của tế bào
trong sửa chữa các lỗi di truyền và dẫn đến hoạt hóa các gen gây ung
thư.
1.1.3.

Các giai đoạn của ung thƣ vú

Đánh giá giai đoạn của ung thư vú dựa vào hệ thống phân loại
TNM, trong đó dựa vào kích thước và mức độ lan rộng của khối u
thể hiện qua 3 yếu tố: T (Tumor) – u nguyên phát, N (Node) – hạch
tại vùng và M (Metastase) – di căn xa (Edge, 2010).
1.1.4.

Các chỉ thị sinh học của ung thƣ vú

Các chỉ thị sinh học hiện nay của ung thư vú được áp dụng chủ
yếu cho chẩn đoán, lựa chọn phương pháp và theo dõi điều trị
(Ludwig, 2005). Thăm khám vú và chụp nhũ ảnh là phương pháp
chuẩn trong sàng lọc và chẩn đoán sớm, tuy nhiên lại có tỉ lệ phát
hiện dương tính giả cao (Vahabi, 2003; Elmore, 2010). Do đó, cần

2

phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc hiệu sử dụng trong sàng lọc và
phát hiện sớm bệnh.
1.2. TỔNG QUAN VỀ ADN TY THỂ NGƢỜI
ADN ty thể là phân tử mạch vòng, bao gồm 16.569 bp, chứa 37
gen mã hóa cho 13 protein của phức hệ phosphoryl hóa oxi hóa
(OXPHOS), 22 tARN và 2 rARN.
1.3. BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ
Biến đổi của các gen ty thể được cho là có liên quan với quá
trình tạo u bởi vì các tế bào ung thư sử dụng con đường OXPHOS ít
hơn so với tế bào bình thường (Warburg, 1956). Biến đổi này bao
gồm: thay đổi số bản sao ADN ty thể, giảm biểu hiện của các gen ty
thể hoặc biến đổi hoạt tính enzyme của ty thể và các đột biến soma
hoặc đột biến dòng mầm của ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon,
2006).
1.4. MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ
VÚ
1.4.1.

Biến đổi số bản sao của ADN ty thể

Các phân tử ADN ty thể dễ bị tổn thương hơn trong các tế bào
ung thư, và do đó ty thể thay đổi số lượng bản sao ADN của chúng
để phản ứng lại với hiện tượng này (Pelicano, 2004). Đối với ung thư
vú, số bản sao ADN ty thể được cho là giảm ở mô u so với mô không
ung thư (Tseng, 2006) và có liên quan với độ tuổi, độ mô học, tình
trạng của thụ thể estrogen và progesteron, kích thước khối u (Yu,
2007; Fan, 2009; Bai, 2011). Ngược lại, số bản sao ADN ty thể có xu
hướng tăng trong mẫu máu của các bệnh nhân ung thư vú so với đối
chứng và được cho là có liên quan với độ tuổi, giai đoạn bệnh (Shen,
3

2009; Lemnrau, 2015). Các kết quả này cho đến nay vẫn còn gây
tranh cãi và còn nhiều điều vẫn cần được làm sáng tỏ.
1.4.2.

Mất đoạn lớn của ADN ty thể

Hệ gen ty thể được đặc trưng bởi một số ít các trình tự lặp đóng
vai trò là các điểm cắt để tạo ra các mất đoạn lớn của ADN ty thể
(Dakubo, 2010). Mất đoạn 4977 bp (∆mtDNA4977), dạng biến đổi
thường gặp nhất, tạo ra phân tử ADN ty thể nhỏ hơn bình thường
nhưng vẫn có thể sao chép được và được tích lũy với tỉ lệ khác nhau
ở các mô sau nguyên phân. Trong nghiên cứu của Zhu (2004),
∆mtDNA4977 được cho là không đặc trưng ở ung thư vú. Ngược lại,
∆mtDNA4977 được tìm thấy trong 28/60 mẫu mô vú thường (47%)
trong khi đó chỉ có 3/60 mẫu u (5%) là có mất đoạn này (Tseng,
2006). Các kết quả thu được vẫn còn nhiều mâu thuẫn, do đó vẫn cần
phải tiếp tục nghiên cứu để đưa ra được kết luận chính xác hơn.
1.4.3.

Biến đổi của gen ATP6

Gen ATP6, nằm từ vị trí 8527 – 9207 trên ADN ty thể, mã hóa
cho dưới đơn vị a của tiểu phần F0 thuộc phức hệ tổng hợp ATP.
Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Sharp (1992) không phát hiện
thấy có biến đổi nào trên gen ATP6. Tuy nhiên, một số nghiên cứu
khác lại phát hiện thấy tỉ lệ biến đổi của gen ATP6 trong khoảng từ
72% – 82,14%, trong đó có một số biến đổi được cho là làm tăng
nguy cơ mắc ung thư vú (Grzybowska-Szatkowska, 2014a;

Ghaffarpour, 2014; Thapa, 2016).
1.4.4.

Biến đổi của gen tARN ty thể

Đột biến các gen tARN ty thể thường làm suy giảm hoạt tính
aminoacyl hóa của phân tử tARN, từ đó ảnh hưởng đến quá trình
tổng hợp và biểu hiện protein và chức năng của các enzyme
4


OXPHOS (Abbott, 2014). Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú,
Grzybowska-Szatkowska (2012) cho rằng 6 biến đổi A15924G,
A12308G, T7581C, A8348G, T10034C và T10463C đều có mối liên
quan với ung thư vú. Ngược lại, Meng (2015) cho rằng các biến đổi
T7581C và A12308G có vai trò tiềm năng trong biểu hiện lâm sàng
của ung thư vú, còn các biến đổi khác thì không. Có thể thấy hiểu
biết về vai trò của các biến đổi gen tARN ty thể trên bệnh ung thư vú
còn rất hạn chế, do đó gây khó khăn trong việc dự đoán tác động đến
biểu hiệu lâm sàng của bệnh.
1.4.5.

Biến đổi của gen ND3

Biến đổi A10398G làm thay đổi trình tự axít amin từ Threonine
thành Alanine trong sản phẩm của gen ND3 ty thể. Các nghiên cứu
trước đây đã phân tích mối liên quan giữa biến đổi A10398G và
nguy cơ mắc ung thư vú, tuy nhiên kết quả thu được cho đến nay còn
mâu thuẫn và gây nhiều tranh cãi (Canter, 2005; Bai, 2007)
1.4.6.

Biến đổi của gen ND1

Gen ND1 của ty thể mã hóa cho một trong 7 tiểu đơn vị của
phức hệ hô hấp I và là bước đầu tiên trong chuỗi vận chuyển điện tử
của ty thể. Biến đổi gen ND1 được cho là làm thay đổi cấu trúc và
chức năng của protein NADH dehydrogenase subunit 1, từ đó thúc
đẩy quá trình phát sinh khối u. Một số biến đổi của gen ND1 được
báo cáo có liên quan với ung thư vú như T3398C, T4216C, A3796G
và được coi như là chỉ thị sinh học mới trong phát hiện sớm ung thư
vú (Tan, 2002; Grzybowska-Szatkowska, 2014b; Thapa, 2015).
Ngược lại, nghiên cứu khác lại cho rằng biến đổi của các gen thuộc
phức hệ V thường gặp hơn so với gen ND1 ở bệnh nhân ung thư vú.

5


Do đó cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu biến đổi của gen này trên
các nhóm đối tượng khác để cho kết quả chính xác hơn.
1.5. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về biến đổi của gen ty thể trên đối
tượng bệnh nhân ung thư vú còn ít và chưa có tính hệ thống. Do đó,
nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định các biến đổi
của một số gen ADN ty thể trên bệnh nhân ung thư vú người Việt
Nam và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng của bệnh,
góp phần làm sáng tỏ vai trò của ADN ty thể đối với bệnh ung thư vú
và cung cấp dữ liệu có tính hệ thống ban đầu cho các nghiên cứu tiếp
theo nhằm hỗ trợ cho đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như
tiên lượng bệnh hiệu quả hơn.

Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1.

Đối tƣợng

Mẫu mô u (được lấy tại vị trí khối u) và mô lân cận u (cách vị trí
có khối u từ 5 – 10 cm) của 102 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô u và
mô máu của 20 bệnh nhân mắc u xơ vú và mẫu máu của 65 người
cho máu khỏe mạnh.
2.1.2.

Hóa chất

Các hóa chất được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và
đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.

6


2.1.3.

Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Proteomics và sinh học
cấu trúc (KLEPT) và Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học và Sinh
học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN đều có độ chính xác
và tin cậy cao.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số

2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô
Mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit
(QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu
Mẫu máu được tách chiết bằng GeneJET Whole Blood Genomic
DNA Purification Mini Kit theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose và
polyacrylamide
2.2.3. Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phƣơng pháp PCR
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng ExoSAP-IT (Affymetrix) theo quy trình của nhà sản
xuất.
2.2.5. Phân tích PCR-RFLP
Các đột biến điểm trong ADN ty thể được phát hiện bằng kỹ
thuật PCR-RFLP sử dụng các enzyme giới hạn NlaIII, DdeI, Hin6I,
SatI, FspBI (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất.

7


2.2.6. Nhân dòng và tách chiết ADN plasmid
Nhân dòng bằng vector pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit
của Fermentas. Tách chiết ADN plasmid sử dụng QIAprepSpin
Miniprep Kit (Qiagen) và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.7. Định lƣợng ADN bằng realtime PCR
Định lượng số bản sao và mất đoạn lớn trong ADN ty thể bằng
phương pháp realtime PCR dựa trên gen HBB đại diện cho ADN
nhân), gen ND1 (nằm trong vùng ít mất đoạn) và gen ND4 (nằm
trong vùng hay xảy ra mất đoạn) đại diện cho ADN ty thể.
Hiệu suất khuếch đại của phản ứng realtime PCR được xác định

dựa vào đường chuẩn theo công thức:
% Hiệu suất = (10-1/slope – 1) x 100%
Trong đó: slope là hệ số góc của đường chuẩn định lượng.
Công thức xác định số bản sao tương đối của ADN ty thể là:
Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = 2(Ct HBB – Ct ND1)
Mức độ mất đoạn của ADN ty thể được xác định bằng công
thức:
Mức độ mất đoạn = (1 – 2(Ct ND1 – Ct ND4))*100%
2.2.8. Định lƣợng ADN bằng HPLC
Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng số bản sao
ADN ty thể dựa trên gen ACTB đại diện cho ADN nhân và gen ND1
đại diện cho ADN ty thể. Tỉ số bản sao của ADN ty thể so với ADN
nhân được tính toán dựa theo công thức:
Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = k x S1/S2
Trong đó: k = 1,235. S1: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm
gen ND1. S2: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm gen ACTB
8


2.2.9. Xử lý số liệu và tính toán thống kê
Sử dụng các công cụ tin sinh: BioEdit v7.0, BLAST, ClustalX,
chương trình RNAfold WebServer để phân tích số liệu. Xử lý các số
liệu thu được theo các phương pháp thống kê thường dùng: phép thử
χ², Shapiro-Wilk (Expanded) Test, Mann-Whitney U Test và Kruskal
– Wallis Test. Ước tính nguy cơ gây bệnh được biểu thị bằng tỉ số
odds (OR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI). Tất cả các kiểm định
thống kê được ghi nhận theo 2 chiều và giá trị p < 0,05 được coi là
có ý nghĩa thống kê.

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ VÀ MẪU MÁU
ADN tổng số được tách chiết từ 102 cặp mẫu mô u và lân cận u
của bệnh nhân mắc ung thư vú, 20 cặp mẫu mô u và mẫu máu của
bệnh nhân mắc u xơ vú và 65 mẫu máu của người khỏe mạnh.
3.2. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI SỐ BẢN SAO CỦA ADN TY THỂ
Trong nghiên cứu này, biến đổi số bản sao của ADN ty thể được
tiến hành phân tích định lượng đồng thời bằng HPLC và realtime
PCR nhằm so sánh kết quả thu được khi thực hiện bằng cả hai
phương pháp.
3.2.1. Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng HPLC
Sử dụng kỹ thuật PCR, đã khuếch đại thành công đoạn đoạn
ADN của gen ND1 có kích thước 433 bp đại diện cho ADN ty thể và
đoạn ADN của gen ACTB có kích thước 107 bp đại diện cho ADN
nhân. Sản phẩm được nhân dòng bằng vector pJET1.2 và biến nạp
vào E. Coli DH5 và giải trình tự để khẳng định chính xác. Sau đó,
9


tiến hành xây dựng đường chuẩn giữa tỉ số hàm lượng ADN của gen
ND1/ACTB và tỉ số băng HPLC thu được. Kết quả thu được đường
chuẩn với hệ số tương quan cao (R2 = 0,9961).
Tiến hành định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu
nghiên cứu sử dụng sản phẩm PCR đa mồi của gen ACTB và ND1.
Kết quả thu được cho thấy giảm số bản sao ADN ty thể ở mô u (2,9
± 3,9) so với mô lân cận u (4,1 ± 4,8) và giảm số bản sao ở mô u xơ
(2,7 ± 3,1) so với mô lân cận u của bệnh nhân ung thư vú. Sự khác
biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả định lượng số bản
sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong
Hình 3.9.

Hình 3.1. Biến đổi số bản sao mtDNA xác định bằng phƣơng pháp
HPLC (*: p < 0.05)
Giảm số bản sao ADN ty thể được cho là liên quan đến sự hình
thành khối u ở bệnh nhân ung thư vú do ảnh hưởng đến chức năng
điều hòa quá trình chết theo chương trình của tế bào, từ đó làm cho
các tế bào đột biến gây ung thư thoát khỏi chết theo chương trình để
trở thành tế bào bất tử.

10


3.2.2. Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng
realtime PCR
Các plasmid mang đoạn gen HBB và ND1 đã tách dòng và tinh
sạch được pha loãng với hệ số 10, từ 109 đến 101 bản sao/µl, để xây
dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện của phản ứng. Kết
quả cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp là khoảng 20 bản
sao ADN trong một phản ứng với đường chuẩn có hệ số tương quan
R2 = 0.999 và 0.9934 đối với gen ND1 và HBB tương ứng. Hiệu suất
khuếch đại tương ứng của gen ND1 và HBB là 96.69% và 93.08%.
Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên
cứu được thể hiện trong Hình 3.15.

Hình 3.2. Biến đổi số bản sao ADN ty thể trong các loại mô nghiên
cứu (*: p < 0.05)
Kết quả cho thấy số bản sao của ADN ty thể trong mô u thấp
hơn có ý nghĩa thống kê so với mô lân cận u (p = 0,0173). Kết quả
này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng số bản sao ADN
ty thể giảm ở mô u so với mô lân cận u ở bệnh nhân ung thư vú (Fan,
2009; Bai, 2011; Hu, 2016). Số bản sao ADN ty thể trong mô của

bệnh nhân mắc u xơ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mô u (p =
11


0,0143) và mô lân cận u (p = 0,0001) của bệnh nhân mắc ung thư vú.
Bên cạnh đó, số bản sao của ADN ty thể trong máu của bệnh nhân u
xơ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với số bản sao trong máu của
người khỏe mạnh bình thường với mức ý nghĩa 0,05 (p = 0,0003).
Trong các nghiên cứu trước đây, số bản sao của ADN ty thể trong
máu cao hơn được cho là làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Shen,
2009; Lemnrau, 2015).
So sánh sự thay đổi số bản sao ADN ty thể theo các đặc điểm
lâm sàng cho thấy không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa
số bản sao của ADN ty thể theo độ tuổi (< 50 hoặc ≥ 50), kích thước
khối u (< 5 hoặc ≥ 5 cm3), số hạch (< 10 hoặc ≥ 10), kích thước hạch
(< 0,5 hoặc ≥ 0,5 cm), giai đoạn hạch N, mức độ biệt hóa và giai
đoạn bệnh. Tuy nhiên, số bản sao ADN ty thể thấp hơn có ý nghĩa
thống kê ở giai đoạn T3-4 so với giai đoạn T1-2 (p = 0,0058) ở nhóm
bệnh nhân ung thư vú. Tương tự với nghiên cứu của Mambo và cs
(2005), kết quả không thấy có mối liên quan giữa biến đổi số bản sao
với độ mô học của khối u và di căn, do đó biến đổi này được cho là
xảy ra ở giai đoạn sớm của quá trình phát sinh khối u và có thể được
sử dụng như là một công cụ chẩn đoán phân tử để xác định các bất
thường di truyền của khối u. 3.3. PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ MẤT
ĐOẠN LỚN CỦA ADN TY THỂ
3.3.1. Xác định mất đoạn 4977 bp
Xác định ∆mtDNA4977 được dựa trên phản ứng nhân bản các
đoạn gen ND1 đại diện cho vùng không mất đoạn của ADN ty thể,
gen ND3 thuộc vùng mất đoạn 4977 bp và đoạn ADN nằm ngoài các
trình tự lặp 13 bp (ngoài vùng mất đoạn 4977 bp) bằng phương pháp

PCR lồng.
12


Thực hiện phân tích trên các mẫu xác định được tỉ lệ của
∆mtDNA4977 là 61.76% (63/102 mẫu) ở mô u, 77.45% (79/102 mẫu)
ở mô lân cận u và 15.38% (10/65 mẫu) trong máu của người bình
thường. Bên cạnh đó, tỉ lệ mất đoạn 4977 bp được xác định thấp hơn
có ý nghĩa thống kê ở mô u so với mô lân cận u, và giữa máu của
người bình thường so với mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân ung
thư vú (OR = 8,88, 95% CI = 1,2 – 5,7, p < 0,05). Kết quả này cũng
thống nhất với một số kết quả nghiên cứu trước đây (Dani, 2004;
Tseng, 2006; Ye, 2008), từ đó ủng hộ quan điểm ∆mtDNA4977 đóng
vai trò vào sự phát sinh khối u và tiến triển của ung thư vú. Nguyên
nhân của hiện tượng giảm số bản sao ở mô u có thể do sự mở rộng
của dòng tế bào ung thư trong quá trình phát triển hoặc các tế bào có
đột biến ∆mtDNA4977 bị loại bỏ đi bởi quá trình apoptosis (Wu,
2005).
Phân tích mối liên quan giữa tỉ lệ mất đoạn 4977 bp với các đặc
điểm bệnh học của bệnh ung thư vú cho thấy mất đoạn 4977 bp có
mối liên quan có ý nghĩa thống kê với di căn hạch (thấp hơn ở giai
đoạn N0 so với giai đoạn N1-2) (p = 0,0416). Bên cạnh đó, không có
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần số của mất đoạn 4977 bp
và các đặc điểm bệnh học khác.
3.3.2. Xác định các mất đoạn lớn khác ở bệnh nhân ung thƣ vú
Kết quả của phản ứng PCR lồng cũng phát hiện thấy các băng
có kích thước khác với băng 381 bp đại diện cho mất đoạn 4977 bp.
Một số trường hợp thể hiện đồng thời nhiều mất đoạn với kích thước
khác nhau. Các băng lạ có kích thước lớn hơn và nhỏ hơn 381 bp
được tinh sạch, giải trình tự và so sánh với trình tự chuẩn của ADN

ty thể. Hình 3.18 minh họa một số mất đoạn lớn khác của ADN ty
thể xác định được thông qua giải trình tự trực tiếp.
13


Hình 3.3. Mất đoạn lớn khác 4977 bp của ADN ty thể đƣợc xác định
thông qua giải trình tự trực tiếp
(A): vị trí nối sau khi mất đoạn 4977 bp. (B): mất đoạn 5156 bp.
(C): mất đoạn 5266 bp. (D): mất đoạn 5012 bp. Mũi tên chỉ vị trí nối
sau khi mất đoạn, trình tự lặp màu xanh: 13 bp (A), 3 bp (B)
Kết quả thu được ngoài mất đoạn 4977 bp, đã phát hiện thấy 18
mất đoạn lớn trên mô u, 11 mất đoạn lớn trên mô lân cận u của bệnh
nhân ung thư vú chưa được công bố trước đây trên cơ sở dữ liệu của
MITOMAP. Các mất đoạn lớn khác được tìm thấy với tỷ lệ 52,94%
(54/102 mẫu) ở mô u, 45,1% (45/102 mẫu) ở mô lân cận u và
27,69% (18/65 mẫu) ở mẫu máu đối chứng. Sự tăng dần của các mất
đoạn lớn ở máu bình thường, mô lân cận u và mô u khác biệt có ý
nghĩa thống kê với p < 0,05.
Tuy nhiên, kết quả này chưa đủ cơ sở để trả lời câu hỏi rằng liệu
các biến đổi của ADN ty thể có phải là các yếu tố góp phần vào quá
trình phát sinh ung thư hay các đột biến này chỉ đơn giản phát sinh
như một phần của hiệu ứng phụ trong quá trình tiến triển của ung thư
bởi vì nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong số đó có mức độ của
14


các mất đoạn này trong mô. Do đó, để trả lời câu hỏi vai trò của các
mất đoạn lớn này đến ung thư vú như thế nào thì cần phải tiến hành
các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3. Xác định mức độ mất đoạn lớn bằng realtime PCR

Mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể được xác định bằng
phương pháp realtime PCR dựa trên sự có mặt của gen ND1 (nằm
trong vùng ít xảy ra mất đoạn) và gen ND4 (nằm trong vùng hay xảy
ra mất đoạn). Mức độ mất đoạn trong các loại mẫu khác nhau được
thể hiện trong Hình 3.20.

Hình 3.20. Mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể trong các loại mô
nghiên cứu (*: p < 0.05)
Kết quả cho thấy mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể cao nhất
ở mô u (54,6 ± 6,69) rồi giảm dần ở mô lân cận u (53,7 ± 7,00), máu
của người bình thường (51,7 ± 5,77), máu của bệnh nhân u xơ (51,5
± 3,94) và thấp nhất trong mô của bệnh nhân mắc u xơ (45,3 ± 7,24).
Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mức độ mất đoạn
lớn của mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú, cũng như giữa
máu của bệnh nhân mắc u xơ và máu của người bình thường. Ngược
15


lại, mức độ mất đoạn ít hơn ở mẫu mô u xơ (45,3 ± 7,24) so với mẫu
máu của bệnh nhân u xơ (51,5 ± 3,94) và ít hơn ở mô u xơ so với mô
u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú (54,6 ± 6,69 và 53,7 ± 7,00)
là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này trái ngược với nghiên
cứu của Ye và cs (2008) khi không tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê về mức độ mất đoạn 4977 bp giữa mô u và lân cận u ở bệnh
nhân mắc ung thư vú và u xơ. Nie và cs (2015) lại thấy tỉ lệ mất đoạn
lớn trong máu của bệnh nhân ung thư vú cao hơn có ý nghĩa thống kê
so với trong máu của bệnh nhân mắc u vú lành tính (p < 0,001). Như
vậy có thể thấy mức độ mất đoạn của ADN ty thể giảm có thể là kết
quả của quá trình tiến triển ung thư thông qua phân chia tế bào một
cách nhanh chóng hoặc là kết quả của tác động chọn lọc thông qua

một cơ chế nào đó (ví dụ như chết theo chương trình) dẫn đến các tế
bào có mức độ mất đoạn lớn bị loại bỏ đi trong các mô ung thư (Wu,
2005).
Trong nghiên cứu này, khi so sánh mức độ mất đoạn lớn của
ADN ty thể trong mô u với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú,
kết quả cho thấy mức độ mất đoạn cao hơn ở những bệnh nhân có
kích thước hạch lớn (≥ 0,5 cm) so với các bệnh nhân có kích thước
hạch nhỏ hơn 0,5 cm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p =
0,024.
Trong các nghiên cứu trước đây, mức độ mất đoạn lớn của ADN
ty thể, cụ thể là ∆mtDNA4977, được thấy giảm cùng với giai đoạn tiến
triển của ung thư đại trực tràng (p = 0,031) tuy nhiên số bản sao của
ADN ty thể lại thấy tăng lên (Chen, 2011b). Ngược lại, trong nghiên
cứu của Ye (2008), mức độ mất đoạn 4977 bp lại được thấy không
có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với các đặc điểm lâm sàng của
ung thư vú như độ tuổi, độ mô học, giai đoạn của khối u và tình trạng
16


của ER/PR ở cả bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân mắc u lành tính.
Sự mâu thuẫn này có thể liên quan đến các kỹ thuật sử dụng trong
phân tích và đặc điểm của nhóm mẫu khác nhau (ví dụ mẫu mô đông
lạnh so với mẫu đã được cố định bằng formalin, độ tuổi và nhóm
bệnh nhân khác nhau, loại mẫu mô hay máu) (Ye, 2008).
3.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ATP6
Đoạn ADN chứa gen ATP6 được tiến hành nhân bản và giải
trình tự trực tiếp. Kết quả giải trình tự đã xác định được 20 biến đổi
trên mẫu mô u, trong đó có 13 biến đổi làm thay đổi trình tự axít
amin, và 13 biến đổi trên mẫu máu của người bình thường, trong đó
có 12 biến đổi đã được công bố và 1 biến đổi mới (9183insC). Trong

đó, biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin có tần suất cao hơn ở mô
u so với mô máu là G9053A (22,86%, 8/35 mẫu) được lựa chọn để
sàng lọc trong các mấu nghiên cứu. Kết quả xác định thấy tỉ lệ dạng
biến đổi 9053A là 21,57% (22/102 trường hợp) ở mô của bệnh nhân
ung thư vú và 11,76% (12/65 trường hợp) ở mẫu máu của người
khỏe mạnh bình thường. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý
nghĩa thống kê với p > 0,05. Kết quả phân tích cũng cho thấy không
có mối liên quan giữa biến đổi G9053A với các đặc điểm bệnh học
của ung thư vú như độ tuổi, kích thước u, số hạch, kích thước hạch,
mức độ xâm lấn, di căn hạch, mức độ biệt hóa và giai đoạn bệnh.
3.5. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN tARN TY THỂ
3.5.1. Xác định tần suất biến đổi của gen tARN ty thể
Đoạn ADN chứa 8 gen: MT-TI (tARNLeu), MT-TQ (tARNGln),
MT-TM (tARNMet), MT-TW (tARNTrp), MT-TA (tARNAla), MT-TN
(tARNAsn), MT-TC (tARNCys) và MT-TY (tARNTyr) được nhân bản và
giải trình tự trực tiếp. Kết quả đã xác định được tổng số 12 biến đổi
17


trong 20,4% bệnh nhân (10/49 trường hợp) thuộc 7 gen tARN nghiên
cứu, trừ gen MT-TM (mã hóa cho tARNMet). Hầu hết các biến đổi tập
trung trên gen MT-TA (mã hóa cho tARNAla) (41,67%, 5/12 biến
đổi). Đáng chú ý là có 3 biến đổi thuộc gen MT-TW (A5536T), MTTA (G5645T) và MT-TN (A5724G) chưa được công bố trên cơ sở dữ
liệu Mitomap trước đây. Đây có thể là các biến đổi mới của gen
tARN ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam.
Mặt khác, các biến đổi này được phát hiện với tần suất thấp do đó
các biến đổi này có thể là các biến đổi hiếm trong nhóm bệnh nhân
này. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần
suất của các biến đổi này với đặc điểm bệnh học của ung thư vú.
3.5.2. Dự đoán sự thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN có

biến đổi
Để nghiên cứu sâu hơn tác động của các biến đổi mới chưa được
công bố (A5536T, G5645T và A5724G) lên cấu trúc bậc 2 của phân
tử tARN, chúng tôi sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc bậc 2
RNAfold WebServer. Sự tác động của các biến đổi này lên cấu trúc
bậc 2 của các phân tử tARN tương ứng được thể hiện trong Hình
3.27. Theo đó, chỉ có 2 biến đổi A5536T và G5645T làm thay đổi
cấu trúc bậc 2 của phân tử tARNTrp và tARNAla, trong khi đó biến đổi
A5724G không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử tARNAsn.
Tuy nhiên, trong số đó chỉ có biến đổi A5536T làm giảm năng lượng
tự do tối thiểu (MFE) đối với phân tử tARNTrp, điều này cho thấy
rằng biến đổi A5536T có thể đóng một vai trò quan trọng trong bệnh
ung thư vú.
A. MFE: -9,60 kcal/mol

MFE: -10,00 kcal/mol

18


B. MFE: -4,90 kcal/mol

MFE: -4,70 kcal/mol

C. MFE: -9,60 kcal/mol

MFE: -9,60 kcal/mol

Hình 3.4. Dự đoán sự thay đổi cấu trúc của các phân tử tARN khi
có biến đổi A5536T, G5645T và A5724G

3.5.3. Sàng lọc biến đổi A5536T trên các mẫu nghiên cứu
Đoạn ADN của gen MT-TW chứa vị trí 5536 được nhân bản và
sàng lọc trên các mẫu nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR-RFLP.
19


Kết quả sàng lọc trên 91 bệnh nhân chỉ phát hiện được 1 trường hợp
duy nhất có biến đổi A5536T ở bệnh nhân # 26137. Biến đổi này của
gen tARN ty thể tác động đến cấu trúc bậc 2 của phân tử và do đó có
thể ảnh hưởng đến quá trình dịch mã và tổng hợp protein của ty thể
cũng như có thể cải biến các quá trình sinh học liên quan đến tiến
triển của ung thư vú.
3.6. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ND3
Đoạn gen ND3 chứa vị trí 10398 được nhân bản và sử dụng
enzyme DdeI để sàng lọc biến đổi A10398G trên các mẫu nghiên
cứu. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về tỉ lệ biến đổi A10398G
trong các loại mô, trong đó tỉ lệ dạng biến đổi G là 59,8% (61/102
trường hợp) ở mô lân cận u, 57,8% (59/102 trường hợp) ở mô u và
47,7% (31/65 trường hợp) ở mẫu máu đối chứng. Theo Hình 3.33, có
thể thấy dạng biến đổi 10398G nhiều hơn dạng 10398A trong mẫu
mô nhưng lại ít hơn dạng 10398A trong mẫu máu của nhóm đối
chứng. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 (Hình
3.33).

Hình 3.5. Phân bố biến đổi A10398G trong các nhóm nghiên cứu

20


Kết quả này khác so với các nghiên cứu đã công bố trước đây.

Trong nghiên cứu của Czarnecka (2010a) trên đối tượng phụ nữ Ba
Lan, tỉ lệ 10398G là 23% và 10398A là 77%. Nghiên cứu của Nadiah
và cs (2012) trên phụ nữ Mã Lai thấy tần suất của dạng 10398A là
27% và 10398G là 73% trong nhóm bệnh nhân. Jiang và cs (2014)
nghiên cứu trên máu ngoại vi của các bệnh nhân ung thư vú người
Hán Trung Quốc thấy rằng không có sự khác biệt về đa hình
A10398G trong máu ngoại vi của nhóm bệnh nhân (10398A =
48,6%, 10398G = 51,4%) so với nhóm đối chứng. Tỉ lệ này ở nhóm
bệnh nhân người Bangladesh là 75% 10398A và 25% 10398G
(Ismaeel, 2013). Như vậy, có thể thấy rằng tần suất dạng 10398A và
10398G thay đổi phụ thuộc vào các nhóm tộc người khác nhau.

Hình 3.6. Phân bố biến đổi A10398G theo mức độ biệt hóa của mô
Kết quả phân tích cho thấy không có mối liên quan giữa biến
đổi A10398G với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú như độ tuổi,
kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai
đoạn T), di căn hạch (giai đoạn N) và giai đoạn bệnh. Tuy nhiên, khi
phân tích biến đổi A10398G theo mức độ biệt hóa của u cho thấy sự
khác biệt của dạng 10398A và 10398G ở các mức độ biệt hóa khác
21


nhau là khác nhau (Hình 3.34). Ở mức độ biệt hóa rõ và kém, tần
suất dạng biến đổi 10398G thấp hơn so với 10398A. Trong khi đó ở
mức độ biệt hóa vừa, tần suất xuất hiện 10398G (63,64%) cao hơn rõ
rệt so với 10398A (36,36%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê
với mức ý nghĩa α = 0,05 (p = 0,004). Mức độ biệt hóa dùng để chỉ
mức độ giống các tế bào bình thường cùng một loại mô của các tế
bào u. Mức độ ác tính của ung thư có liên quan trực tiếp đến sự phát
triển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư. Thông thường, những

khối u có tính biệt hóa rõ, tế bào ung thư thường phát triển chậm,
mức độ ác tính thấp, di căn chậm. Mặt khác những khối u có tính biệt
hóa kém thì độ ác tính lại cao, di căn nhanh. Do đó, biến đổi
A10398G có thể có mối liên quan với tiến triển của bệnh ung thư vú.
3.7. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI A4164G CỦA GEN ND1
Đoạn gen ND1 chứa vị trí 4164 được nhân bản và sử dụng
enzyme NlaIII để sàng lọc biến đổi A4164G trên các mẫu nghiên
cứu. Kết quả cho thấy tần suất của biến đổi A4164G là 15,69%
(16/102 trường hợp) ở mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú và 10,77%
(7/65 trường hợp) ở mẫu máu của người khỏe mạnh bình thường (đối
chứng). Mặc dù biến đổi A4164G cũng thấy xuất hiện ở người bình
thường, tuy nhiên, tỷ lệ biến đổi thành G tại vị trí 4164 ở nhóm bệnh
nhân ung thư vú cao hơn nhóm đối chứng. Tuy nhiên sự khác biệt
này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (Hình 3.38).

22


Hình 3.7. Tỉ lệ biến đổi A4164G trong các nhóm nghiên cứu
Phân tích mối liên quan với một số đặc điểm bệnh học của ung
thư vú cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa biến
đổi A4164G của gen ND1 với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú
như độ tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ
xâm lấn (giai đoạn T), mức độ hạch (giai đoạn N), mức độ biệt hóa
và giai đoạn bệnh. Trong các nghiên cứu trước đây, A4164G được
tìm thấy với tần suất thấp ở các bệnh nhân mắc bệnh Liệt thần kinh
thị giác di truyền Leber (LHON) (< 4%) và bệnh nhân mắc ung thư
phổi (3/30 mẫu bệnh nhân) (Fujitake, 2002; Fang, 2015). Trong
nghiên cứu này, tần suất của biến đổi A4164G trên đối tượng bệnh
nhân ung thư vú cũng rất thấp và không thấy có mối liên quan với

đặc điểm bệnh học của bệnh. Do đó, chúng tôi cho rằng không có
mối liên quan giữa biến đổi này với bệnh ung thư vú.
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
(1) Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam cung cấp dữ liệu có
tính hệ thống về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm: biến
đổi số bản sao của mtDNA, mất đoạn lớn của mtDNA, biến đổi

23