nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------

T ị

NGHI N ỨU
I NĐ I Ủ
Ở

TS

G N T TH

NH UNG THƯ ĐẠI TRỰ TR NG
Chuyên ngành: S

ọ

ờ v

vật

Mã số: 62420104

Ự TH

T

TẮT UẬN ÁN TI N SĨ SINH HỌC

Hà N i - 2016


ô
r

g

trì

ng Đ i h

i h ớng dẫn khoa h c:

ợc hoàn thành t i:
ho h

nhi n ĐH GH

G

r nh H ng h i

TS. Tô Thanh h

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..............................
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..............................
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

..............................

Luận án sẽ đ ợc bảo vệ tr ớc Hội đ ng cấp ơ sở chấm luận án tiến sĩ
h pt i...................................................
vào h i

gi

phút, ngà

th ng

năm 201...

Có thể tìm hiểu luận án t i:
- h viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - h viện Đ i h c Quốc gia Hà Nội


MỞ ĐẦU
Ung th đ i tr tràng (U Đ ) là một trong những lo i ung th phổ biến, trên thế
giới U Đ
xếp thứ 3 s u ung th phổi và ung th tiền liệt tuyến ở nam giới đứng thứ
h i s u ung th v ở nữ giới trong tổng số các lo i ung th Ở Việt m U Đ
đứng
thứ năm s u ung th g n phổi, d dày, vú. Tỷ lệ mắ U Đ
hiếm khoảng 8,7% tổng
số bệnh nhân ung th (globo n 2012)
Có nhiều yếu tố nguy ảnh h ởng đến U Đ

nh

hế độ ăn uống, nối sống, nghề

nghiệp và hội chứng đ pol p theo gi đình Đặc biệt, các nghiên gần đâ đ ho thấ đột
biến ADN ty thể là một yếu tố góp phần làm tăng ngu ơ mắc bệnh. Kết quả nghiên cứu
về đột biến ADN ty thể cho thấ đâ là h ớng nghiên cứu tiềm năng để tìm các chỉ th
ho ung th ( umitr và s 2014; Ann và s 2010)
Ở Việt
m tr n đối t ợng bệnh U Đ
thì

nghi n ứu chủ yếu tập trung vào

các vấn đề li n qu n đến d ch tễ h
lâm sàng và
ph ơng ph p điều tr nh ng vẫn
h
ó ông trình nào nghiên cứu về đột biến ADN ty thể và mối liên quan giữ đột biến
ADN ty thể với bệnh U Đ
Xuất phát từ th c tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận
án: “
”
Mụ t u ủ uậ
:
1 X đ nh tỷ lệ mất đo n 4977 bp đ nh l ợng mứ độ mất đo n lớn số bản s o A
t thể t ơng đối ở mẫu mô mẫu m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ
ng i h e m nh bình th ng
2. Khảo sát các biến đổi trên một số gen: ND1, ND3, COX-1, COX-2 ở mẫu mô mẫu
m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ ng i h e m nh bình th ng

bằng các kỹ thuật sinh h c phân tử.
3 Đ nh gi mối liên quan giữa các d ng biến đổi của gen, tỷ lệ mất đo n lớn, mứ độ đột
biến mất đo n lớn s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ điểm bệnh
h c của bệnh nhân U Đ ở Việt Nam.
Đố t ợ
ứu ủ uậ
Nghiên cứu đ ợc th c hiện tr n 86 ặp mẫu mô và 9 mẫu máu của các bệnh nhân b
bệnh U Đ
ẫu ung th đ ợc cung cấp từ Bệnh viện và ệnh viện iệt Đức Hà Nội
từ năm 2012 - 2015. 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh bình th ng do Bệnh viện huyết
h c và truyền m u rung ơng ung ấp.
Ý

ĩ k o ọc và thực tiễn củ ề t uậ
- Với những kết quả mà đề tài luận n thu đ ợc sẽ góp phần cung cấp một ngu n dữ
liệu về các biến đổi trên một số gen ty thể (ND1, ND3, COX-1, COX-2), tỷ lệ và mứ độ
mất đo n lớn, s th đối số l ợng bản sao ADN ty thể ở bệnh nhân U Đ
tr n ơ sở


đó ó thể l a ch n đ ợ

đột biến, biến đổi có nhiều tiềm năng để nghiên cứu sâu hơn

giúp cho việc hỗ trợ chẩn đo n và điều tr bệnh U Đ
Đó
-Đ

óp ới củ ề tài
hảo s t và x đ nh đ ợ tỷ lệ

biến đổi nucleotide: A4164G, A10398G,

C6340T, G7853A trong hệ gen ty thể của bệnh nhân U Đ
- Đ x đ nh đ ợc tỷ lệ đ nh l ợng đ ợ mứ độ mất đo n lớn và s th

đổi số

l ợng bản sao ADN ty thể ở bệnh nhân U Đ
- Đ đ nh gi đ ợc mối liên quan giữ
biến đổi nucleotide, tỷ lệ, mứ độ mất đo n
lớn và s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ điểm bệnh h c ở bệnh
nhân U Đ
- Là ông trình đầu tiên phát hiện thấy một số đột biến mất đo n mới: 5094bp 5169
bp và 5104bp


HƯƠNG 1. T NG QUAN TÀI LI U
1.1. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.1.1. Thực tr ng mắ u t
i trực tràng
Ung th đ i tr tràng (U Đ ) là một trong những lo i ung th phổ biến nhất
chiếm tỉ lệ cao thứ b trong
tr ng hợp ung th ở nam giới, thứ hai ở n giới
(Globocan, 2012). T i Việt
lệ mắc mới và tử vong.

m U Đ

xếp thứ 4 ở nam giới, xếp thứ 5 ở nữ giới về tỷ

1.1.2. Các hệ thố
p â
o n bệ
ou t
i trực tràng
Có nhiều hệ thống phân gi i đo n ho ung th Đối với U Đ
th ng sử dụng phổ
biến hai hệ thống là: hân gi i đo n ung th theo d vào í h th ớc của khối u (T), mức
độ lâ l n đến các h ch b ch huyết (N) và s hiện diện củ di ăn ( ) ( umor- l mph
ode - et st ses ) và phân gi i đo n theo Dukes (Sobnin, 2009)
1.1.3. Các yếu tố uy
ây u t
trự tr
Có rất nhiều yếu tố đ ợc biết có thể làm tăng hoặc giảm ngu ơ U Đ
ụ thể:
Yếu tố tuổi tác, yếu tố di truyền và tiền sử gi đình tiền sử nhân Đặ biệt một số đột
biến tr n A
t thể ng đ đ ợ x đ nh làm tăng ngu ơ mắ bệnh
1.2. TY TH NGƯỜI
1.2.1. u tr v
ứ
ủ ty t ể
Ty thể là bào quan có mặt ở tế bào chất của hầu hết các tế bào nhân thật, có nhiều
hình d ng khác nhau xong hình d ng đặ tr ng là thon dài với đ ng kính 0,5-2 µm và
chiều dài 7-10 µm. Bao b c bên ngoài ty thể là hai lớp màng lipoprotein, giữa hai lớp
màng là khoang gian màng, bên trong hai màng là chất nền. Màng trong ty thể ăn sâu vào
chất nền t o thành các mào răng l ợ t thể là nhà m t o năng l ợng cho tế bào th m
gi vào qu trình l o hó qu trình t chết của tế bào và một số qu trình h

ủ

ơ thể

1.2.2. Hệ gen ty thể
Bào quan ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen nhân. ADN ty thể
ng i t n t i ở d ng m ch vòng, sợi đôi ó í h th ớc 16.569bp, bao g m 37 gen, mã
hóa cho 2 phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA và 13 phân tử protein thuộc các
phức hợp của chuỗi hô hấp.
1.2.3. Sự di truyền theo dòng mẹ của ADN ty thể
S di truyền các gen trên ADN ty thể là di truyền qua tế bào chất (di truyền theo dòng
mẹ) g i mẹ truyền hệ gen ty thể ho
mới truyền hệ gen đó ho thế hệ tiếp theo.
1.2.4. Hiệ t ợng dị tế bào ch t v

ng

i con và chỉ có những ng

ỡng biểu hiện củ

i con gái

t biến ADN ty thể


Do hệ gen ty thể có nhiều bản sao: vài bản sao trong một ty thể, hàng nghìn bản sao
trong một tế bào.Vì vậy, ADN ty thể có một hiện t ợng rất đặc thù - hiện t ợng d tế bào
hất (heteropl sm )
tế bào hất là hiện t ợng t n t i đ ng th i cả bản sao ADN ty thể

b đột biến và bản sao ADN ty thể ở d ng d i trong cùng một mô, một tế bào. Nếu tất cả
các bản sao của ADN ty thể giống nhau thì g i là tính đ ng nhất (homopl sm ) Ở tr ng
th i bình th ng phần lớn A
t thể t n t i ở d ng đ ng tế bào hất h i niệm ng ỡng
biểu hiện củ đột biến đ ợ dùng để chỉ khả năng h u đ ng của tế bào tr ớc một tỷ lệ số
bản sao ADN ty thể m ng đột biến trong tổng số
bản s o ỷ lệ ty thể đột biến phải
đ t đến ng ỡng thì mới gây ra kiểu hình lâm sàng của bệnh ( l
và s 1996) g ỡng
biểu hiện củ đột biến th đổi phụ thuộc từng lo i đột biến và từng lo i mô ( ll e và
cs, 2013).
1.3. Đ T I N
N T TH V
NH UNG THƯ
hiều d ng biến đổi tr n A
t thể đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến

bệnh ung

th . Các biến đổi có thể ở d ng đ hình ng ó thể là
đột biến làm th đổi axit
amin có thể dẫn đến th đổi cấu trúc của các enzyme thuộc chuỗi hô hấp, dẫn đến việc
hông đảm bảo chứ năng ó thể làm ảnh h ởng tới dòng vận chuyển điện tử bình
th ng. Các biến đổi thuộ vùng ghi m đặc biệt là các biến đổi trên các gen ND1, ND3,
COX-1, COX-2 đ đ ợ x đ nh trên nhiều lo i ung th trong đó ó ung th đ i tr c
tràng.
ất đo n lớn tr n A
t thể trong đó ó mất đo n phổ biến 4977bp đ ợ oi là
ngu n nhân hính ủ một số bệnh t thể và ó thể đóng v i tr trung tâm đối với qu
trình l o hó

goài r mất đo n 4977bp ng đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến nhiều
lo i bệnh ung th h nh u nh ung th v niêm m c tử cung, th c quản, d dà đ i
tr c tràng, gan, phổi, thận, da và tuyến giáp ( hen và s 2011; e và s 2008; i và s
2006; Demberg, 2015) u nhi n mứ độ ảnh h ởng ủ mất đo n đến biểu hiện bệnh
n li n qu n đến mứ độ ủ mất đo n
o trong mỗi tế bào ó từ hàng tr m đến hảng nghìn bản s o A
t thể s th đổi
số l ợng bản sao ADN ty thể đ ợc coi là một dấu hiệu quan tr ng của bệnh ung th
u
nhiên, vai trò của s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể xảy ra trong gi i đo n đầu,
gi i đo n tiến triển của bệnh ung th nói hung và U Đ
nói ri ng vẫn n h thống
nhất.
1.4. Á
HƯƠNG HÁ HÁT HI N Đ T BI N GEN TY TH
Để x đ nh và đ nh l ợng
biến đổi tr n A
t thể th ng p dụng một số
ph ơng ph p s u: PCR-RFLP giải trình t gen e ltime
H L và một số ph ơng
ph p h
ph ơng ph p ó thể dùng ết hợp với nh u để tăng độ hính x
ủ ết
quả phân tí h


HƯƠNG 2. NGU

N I UV

HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU

2.1. NGUYÊN LI U
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
86 mẫu mô ung th g m mô u và lân cận u của bệnh nhân U Đ

ng

i Việt Nam, 9

bệnh nhân có mẫu máu kèm theo. Các mẫu mô và máu của bệnh nhân ung th đ ợc thu
thập từ bệnh viện K và bệnh viện Việt Đức Hà Nội từ năm 2012 đến năm 2015
67 mẫu máu củ ng i kh e m nh đến cho máu đ ợc thu thập từ Viện huyết h c và
truyền m u rung ơng
mẫu m u đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2015. Các mẫu
nghiên cứu đều đ ợc bảo quản ở tủ - 800C.
2.1.2.
ó
t
ợ s ụ
Các cặp m i dùng ho phân tí h

tro
- FL

x

ứu
đ nh mất đo n, HPLC, Realtime

PCR (IDT, Invitrogen (Mỹ), Maxima Hot Start PCR Master Mix 2x (Thermo Scientific,
Mỹ, qPCR BIO SyGreen Mix LO-ROX 2X (Biosystem), Các enzyme cắt giới h n
Ferment s (Đứ ) và một số hó hất h đều đ t độ tinh hiết ho
phân tí h sinh h
phân tử
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao g m: máy NanoDropTM 2000c
(Thermo Scientific), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy nhân gen
PCR Biorad (Mỹ), máy Realtime PCR Mygopro (IT-IS Life Science (Anh), máy ly tâm
5417 (l tâm 1 5mlendorf Đức), thiết b điện di ng ng điện di đứng (Biorad) và hệ
thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad), tủ l nh -20OC và -80OC (Nuaire, Mỹ) và
m mó thiết b h thuộ ph ng roteomi s và inh h
ấu tr thuộ ph ng thí
nghiệm tr ng điểm ông nghệ en me và rotein- r

ng ĐH H

hi n.

2.3. HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU
2.3.1. T

ết

N tổng số từ mẫu

ôu

t

i trự tr

v

ẫu

u

Tiến hành tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u bằng it t h hiết QIAamp
A ini it IA mp lood mini it ( IAGE Đứ )
b ớ t h hiết theo h ớng
dẫn ủa nhà sản xuất .
2.3.2. Tách chiết ADN plasmid
A

pl smid đ ợc tách và tinh s ch bằng kit QIAprep-miniprep củ

b ớ tiến hành theo theo h ớng dẫn ủ nhà sản xuất
2.3.3. Đ ện di kiể

tr v

ị

ợng ADN tổng số

i gen


sản phẩm

S có mặt của ADN tổng số
điện di trên gel agarose pol
2.3.4. Nhân bả

đ ợc kiểm tra bằng ph ơng ph p

r l mide nhuộm ethidiumbromie

o n gen ty thể chứ

t biến bằng kỹ thuật PCR

đo n ADN thuộc các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, mất đo n 4977bp thuộc
ADN ty thể đ ợc sàng l đột biến/đ hình đ ợc khuế h đ i bằng phản ứng PCR với các
cặp m i đặc hiệu (bảng 2). Khuôn cho phản ứng PCR là ADN tổng số đ ợc tách chiết từ
mẫu mô, máu của bệnh nhân U Đ

và mẫu máu củ ng
ì

2.3.5. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật

i kh e m nh.
ều

o n cắt giới h n

(PCR-RFLP)
Trong nghiên cứu này, các biến đổi (đột biến điểm/đ hình) tr n A

phát hiện bằng kỹ thuật PCR- FL (và đ ợc khẳng đ nh bằng kỹ thuật x

t thể đ ợc
đ nh trình t

nu leotide)
en me đ ợ sử dụng g m: NlaIII, DdeI, HincII, HincII (bảng 2. 1).
Phản ứng cắt đ ợc th c hiện với các thành phần theo h ớng dẫn của nhà sản xuất

Tên

Trì

ả

2. 1.

tự

â

zy
ết

enzyme

ớ

tro

Vị tr

ứu
Sả

(gen)

ế

p

ắt

ổ

ô

ế
ổ

NlaIII

DdeI

5'- A G↓-3'

5’-C↓TNAG-3’

A4164G,
T4216C



202bp; 133bp (T4216C)



335bp



185bp; 150bp (A4164G)

(ND1)



203 185 150 133bp
( 4216 và A4164G)

A10398G



38 bp 50bp và 158 bp



50 bp và
196 bp



113 bp 144 bp và 215bp



257 bp và
215 bp



161bp



128bp và
33bp

(ND3)
HincII

BccI

5’-GTY↓RAC-3’

G7853A

R=G, A; Y=T, C

(COX-2)

5’CCATC(N4) ↓3'

C6340T
(COX-1)


ả

2.2. C

T

p

tro

G

t

vị
tr qu
tâm
p
ND1.1

COX-1.1

op ả ứ

COX-1/
C6340T

COX-2.1
p
mtDNA

ớ

Trì

bp)
(v trí)

ND1/
T4216C,
A4164G
ND3/
A10398G

ND3

ứu

335
(4015-4349)

CGA CCC TAC TTC

TAA CC

CGA CCC TAC TTC
TAA CC

246
(1030710552)
161

CTG CCA CTA ATA
GTT ATG TC

GAT ATG AGG TGT
GAG CGA TA

472

GAA GAA GGT GGT
GTT GAG GTT G

TCC CTC TCT CCT ACT CTA AGA TAG AGG
CCT GTT C
AGA CAC CTG CTA

Rx

433
(3457-3889)
496
(8167-13639)

381
(8196 -13553)

4977-1
4977-2
p

o

ợ
5’-3’)

R-RFLP

op ả ứ
ND1

tự
xuô
(5’-3’)

R ể

ị

t o

GAC GCC ATA AAA
CTC TTC AC
TCA ATG CTC TGA

AAT CTG TGG
ACA GTT TCA TGC
CCA TCG TC

ả trì

CCC TCT CTC CTA
CTC CTG CTC
GGT TGG TCT CTG
CTA GTG TG
GTT GAC CTG GGG
TGA GAA G
GCG TTT GTG TAT
GAT TTT GC

tự trự t ếp

COX1.2

COX-1

1745
(5851-7595)

CTT TAG ATT TAC GT
CCA ATG CTT

CATGTGCCATTA
AGATATATA GGAT

COX2.2

COX-2

1050
(7375-84340

ACC TGG AGT GAC
TAT ATG GAT

GAT GAG GAA TAG
TGT AAG GAG

2.3.6. Nhân dòng trực tiếp o n gen chứ
Nhân dòng phân tử g m một nhóm
 Phân lập một đo n gen (A

t biến vào vector pJet1.2
ph ơng ph p nhằm:

) đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử A

b n đầu

đ ợc tách chiết từ các mẫu sinh h c có thành phần phức t p.
 Nhân bản đo n trình t A
đ ợc quan tâm lên một l ợng đủ lớn để có thể tiến
hành phân tích về cấu trúc và chứ năng gen t ơng ứng.
2.3.7. G ả trì

tự

o

ứ

t biến


ết quả

- FL đ ợ

hẳng đ nh bằng ph ơng ph p giải trình t gen

2.3.8. Đ ện di ADN trên gel polyacrylamide
- ùng để x đ nh s
dụng trong ph ơng ph p

ó mặt ủ
- FL và

băng A
đ ợ nhân l n từ
băng ủ sản phẩm ắt en me

ặp m i sử

2.3.9. Tinh s ch sản ph m PCR
inh s h sản phẩm

rodu t le nup
2.3.10. Đị

bằng ít

IAqui

gel extr tion và Exo A -I

ùng để thu sản phẩm tinh s h ho gi it rình t A

ợ

ứ

t

o

tr

tiếp

v số bản sao ADN ty thể bằng kỹ thuật

Realtime PCR
D a trên giá tr Ct, số bản sao ADN ty thể so với số bản sao ADN nhân (giá tr t ơng
đối) tính toán theo công thức:
-∆C

Trong đó: ∆Ctc= CtND1.3 - CtHBB

Mứ độ mất đo n đ ợc tính theo công thức
m t o n (%) = (1-1 2Δ t ) *100%

Mứ

Trong đó: Δ td =

tND4.2 −

CtND1.3

ặp m i dùng ho phân tí h đ nh l ợng mứ độ mất đo n và số bản s o A
t ơng đối bằng ph ơng ph p e ltime
đ ợ trình bà rong bảng 2 3
ả

2.3. Trì

tự

p

s

ụ

op ả ứ

R

â

o

t thể
N ể

â
T

G

t

ớ

xuô
(5’-3’)

( bp)
p

o

â

ND1.2

ND1

293

HBB.1

HBB

272

p
ND1.3

or
ND1

t
115

ể ự

ờ

ợ
5’-3’)
u

CCT AGC CAT CAT
TCT ACT ATC AACA
GAA AAT AGA CCA

ATA GGC AGA GAG A

ACC CTC ACC ACT
ACA ATC TTC C
GTC AGA AGC AAA
TGT AAG CAA TAGA

AGT GGC TCC TTT

GGT TGG TCT CTG

R


HBB.2

HBB

104

ND4.2

ND4

128

AAG GAG TG
GGA GAA GTC TGC
CGT CAA C
CCT ATT TAG CTG

TCT CCC AA

hu trình nhiệt và thành phần ho phản ng re ltime
hiện riêng biệt cho từng cặp m i. Hỗn hợp phản ứng
tí h 10μl b o g m: 2X

CTA CAC GA
CCT TAA ACC TGT
CTT GTA CGG AA
GTG ATA GTG GTT
CCA TGG ATA AGT

: hản ứng
đ ợc th c
đ ợc th c hiện trong tổng thể

Green I: 5μl 0 2µ

mỗi m i, 0,1~0,2 (ng/ µl) khuôn ADN

tổng số. Chu trình nhiệt cho phản ứng e ltime

: 95° trong 2 ph t s u đó 40 hu

kỳ g m 95°C trong 10 giây, 60°C trong 30giây. Ch
èm theo h ơng trình phân tích
đỉnh chả ( elting urve) để x đ nh độ đặ hiệu ủ m i: tr ớc tiên bu ng ủ nhiệt sẽ
đ nhiệt độ lên 950C trong 60 giây biến tính hoàn toàn tất cả các sản phẩm khuế h đ i.
u đó h nhiệt độ xuống 600

trong 60 giâ để tất cả các sản phẩm khuế h đ i này

thành sợi đôi
u đó th c hiện h ơng trình phân tí h nhiệt độ chảy (melt- urve) đ
nhiệt độ bu ng ủ từ 600C lên 970C với tố độ ra nhiệt 0,10 /1 giâ gi p phân tí h độ đặc
hiệu của m i.
HƯƠNG 3.
3.1. T ố
ẫu

k

ệ

ọ â

s

v kết quả t

ết

N tổ

số từ

ứu

đặ điểm bệnh h
bệnh viện ung ấp

800

T QU VÀ TH O LUẬN

lâm sàng ủ bệnh nhân đ ợ tổng hợp từ h sơ bệnh n do
mẫu mô đ ợ bảo quản trong ni tơ l ng hoặ trong tủ l nh sâu -

ho tới hi phân tí h

trung bình 58 71 13

hóm bệnh nhân nghi n ứu g m 41 n m 45 nữ độ tuổi

heo v trí ung th g m ó 41 bệnh nhân ung th tr

bệnh nhân ung th đ i tràng và đ i tr

tràng

tràng 45

ệnh nhân đ ợ phân gi i đo n bệnh theo

g m ó: gi i đo n 1 (n=30) gi i đo n 2 (n=21) gi i đo n 3 và 4 (n=33)

heo mứ

đô biệt hó g m mứ độ biệt hó r (n=10) mứ độ biệt hó vừ (n=39) mứ độ biệt hó
thấp (n=6)
ADN tổng số của mẫu máu và mẫu mô U Đ

đ ợ t h hiết bằng kit tách chiết
th ơng phẩm củ h ng i gen ết quả t h hiết đ ợ minh h trong hình 3 1
Hình 3.1 cho thấy sản phẩm ADN tổng số thu đ ợ từ các mẫu nghiên cứu đều có
một băng A
r nét hứng t ADN tổng số t h đ ợ đều nguyên vẹn Hàm l ợng
ADN trung bình (ng/µl) trên mô u, mô lân ận u và tr n mẫu m u t ơng ứng lần l ợt là
50,69 và 41,67 và 17,78 ng/µl.


Hì

3.1:

ện di ADN tổng số ợc tách chiết từ
ẫu
ứu
(điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide)
Giếng 1-4; 5-8: ADN tổng số từ mô u, lân cận u của 4 bệnh nhân UTĐTT,
giếng 9-12; 13-15: ADN tổng số t h từ
ủa người khỏe mạnh,
máu của bệnh nhân UTĐTT, Giếng M: thang ADN chuẩn 1kb

3.2. T ệ
t o 4977 p tr
N ty t ể ở ệ
â u t
trự tr
ằng ph ơng ph p
với 4 cặp m i: mtDNA, 4977-1; 4977-2 và
3 trong đó

cặp m i mt A bắt ặp đặ hiệu với đo n A
thuộ gen ND1 t thể (gen thuộ vùng
rất hiếm xả r đột biến mất đo n) dùng để khẳng đ nh s ó mặt ủ A
t thể trong
mẫu ADN tổng số. Hai cặp m i 4977-1, 4977-2 dùng trong phản ứng PCR l ng để xác
đ nh mất đo n 4977 bp trong mẫu nghiên cứu ặp m i
3 nhân đo n A
thuộ vùng
mất đo n 4977 bp dùng để l i trừ d ơng tính giả (nếu ặp m i 4977-2 hông l n băng
381 bp ùng bệnh nhân đó m i
3 l n băng 246 bp thì hẳng đ nh bệnh nhân đó hông
ó mất đo n ết quả PCR với 3 cặp m i ở một số mẫu nghiên cứu đ ợc minh h a theo
hình 3.2.

Hì

3.2:
ện di sản ph m PCR m i mtDNA, 4977-2, ND3 trên
t số mẫu nghiên cứu ( ệ
tr
ros 1 7 %
u
t r)


Hình A: Giếng 1: Đối chứng âm của cặp mồi mtDNA, giếng 2: Sản phẩm PCR mồi mtDNA,
giếng M: Thang ADN chuẩn 100bp, giếng 3: Đối chứng âm của cặp mồi 4977-2, giếng 4,5: sản
phẩm PCR của cặp mồi 4977-2 của 2 mẫ
ô UTĐTT, giếng: 6,7: sản phẩm PCR của cặp mồi
4977-2 của 2 mẫ

đối chứng. Hình B: Giếng M: Thang chuẩn ADN 100bp, giếng 1-4:

bệnh nhân 1 #16675: (giếng 1,2: sản phẩm PCR với kí h thước 433 bp và 381 bp của mô u;
giếng 3,4: sản phẩ PCR tương ứng của mẫu máu). Giếng từ 5-8: bệnh nhân 2 #16678 (giếng
5,6: sản phẩm PCR 433 bp và 381 bp của mô u; giếng 7,8 sản phẩ PCR tương ứng của mẫu
máu).
: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi
3
ệnh nhân không ó
t hiện ng
381 bp

rong nghi n ứu nà h ng tôi x đ nh thấ mất đo n 4977bp là lo i mất đo n phổ
biến, tỷ lệ cao (95,35%) ở mô ủ bệnh nhân U Đ ng i Việt Nam và thuộc d ng đột
biến sôm (hình 3 2) goài mất đo n 4977 bp, chúng tôi còn phát hiện đ ợc một số mất
đo n lớn khác trên ADN ty thể ở mô U Đ
với tỷ lệ 38 37 trong đó x đ nh chính
xác 3 mất đo n mới (5169bp 5094bp 5104bp) (hình 3 3 và hình 3 4)

Hì
có m t o

3.3: Sản ph m PCR m 4977-2 tr
ẫu mô
k
t o 4977 p
k
t ớ k
381 p)

ệ
tr
ros 1 5%
u
t r)
M: Thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: Sản phẩm PCR mồi t
, giếng : Đối hứng ương
ủa ệnh nhân hứa t đoạn
p đ đư kh ng đ nh ng giải tr nh t Giếng 3 -16: Sản
phẩ PCR ủa ặp ồi
nh ng ệnh nhân hứa t đoạn kh
t đoạn
p


Hì

3.4:

o n trình tự ADN ty thể của bệnh nhân UTĐTT

t o

A: m t đoạn 4977bp (bệnh nhân #4169B), B: m t đoạn 5169bp (bệnh nhân #36924),
C: m t đoạn 5094bp (bệnh nhân #42308), D: m t đoạn 5104bp (bệnh nhân # 10731
( ũi tên hỉ v trí nối sau khi m t đoạn

T

ệ

t o 4977 p t o
ể
ệ
ọ â s
heo độ tuổi: ỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân ít hơn 50 tuổi là 100
o hơn so với
nhóm bệnh nhân tr n 50 tuổi (93 9 ) ỷ lệ mất đo n ở n m giới là 97 6
o hơn so
với nữ giới (93 3 ) ở nhóm ung th đ i tràng và đ i tr tràng ó tỷ lệ mất đo n t ơng
đ ơng với nhóm ung th tr tràng heo mứ độ biệt hó ở nhóm bệnh nhân ó mứ độ
biệt hó r và biệt hó ém ó tỷ lệ mất đo n 100
o hơn so với nhóm bệnh nhân ở
mứ độ biệt hó vừ (94 9 ) heo í h th ớ hối u ở nhóm bệnh nhân ó í h th ớ u
nh hơn 3 m ó tỷ lệ mất đo n o nhất (100 ) s u đó đến nhóm bệnh nhân ó í h
th ớ hối u lớn hơn 3 5 m thấp nhất ở nhóm bệnh nhân ó í h th ớ hối u từ 33,5cm. heo gi i đo n tỷ lệ mất đo n giảm dần theo thứ t lần l ợt là 98 ở gi i đo n
No, 96 4 ở gi i đo n 1 và 75 ở gi i đo n 2 heo gi i đo n : tỷ lệ mất đo n ở
nhóm bệnh nhân ở gi i đo n 1 o nhất (100 ) tiếp đó đến nhóm bệnh nhân ở gi i
đo n 3 và 4 (97 5 ) thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n 2 (94 3 ) heo
gi i đo n bệnh: tỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n II o nhất (100 )
tiếp đến là ở nhóm bệnh nhân gi i đo n I (96 7 ) thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ
gi i đo n III và I


Sử dụng test chính xác củ Fisher và iểm đ nh hi bình ph ơng ( HI E

) để đ nh

giá mối liên quan giữa mất đo n 4977 bp với
đặ điểm bệnh h c lâm sàng của bệnh
U Đ

ết quả iểm đ nh bằng ả h i ph ơng ph p đều ho thấy mất đo n 4977 bp
hông li n qu n đến
đặ điểm bệnh h c bao g m: độ tuổi, giới tính í h th ớc khối
u, v trí ung th

mứ độ biệt hó gi i đo n

3.3. Mứ
m t o
ớ tr
ứ độ mất đo n lớn tr n A

gi i đo n bệnh ủ bệnh nhân (p>0 05).

N ty t ể ở ệ
â u t
trự tr
t thể đ ợ đ nh l ợng bằng ph ơng ph p re ltime

Để x đ nh độ hính x ổn đ nh ủ ph ơng ph p h i đ ng huẩn đ ợ
hiệu
là đ ng
1 và đ ng H
đ ợ h ng tôi xâ d ng trong nghi n ứu nà
vào
hệ số t ơng qu n giữ số bản s o b n đầu và hu ỳ ng ỡng ủ re time
hiệu quả
huế h đ i hệ số biến thi n theo hu ỳ ng ỡng giữ
đ nh gi độ hính x và ổn đ nh ủ ph ơng ph p

lần lặp l i ủ đ ng huẩn để
h ng tôi đ d ng đ ợ đ ng

chuẩn ND1 với ph ơng trình: = -3,40x + 33,27, giá tr của hệ số t ơng qu n 2 giữa số
bản sao ADN ty thể và số chu kỳ ng ỡng là 0,999, hiệu quả
là 96 8 độ dố là 3 40 (hình 3 5)
ơng t đ ng huẩn H
ng đ ợ d ng ó ph ơng trình: = -3,5x + 36,2, giá
tr của hệ số t ơng qu n 2 giữa số bản sao ADN ty thể và số chu kỳ ng ỡng là 0,993,
hiệu quả
là 91 độ dố là -3 56 (hình 3 5 )

Hì

3.5:

ểu
khuế
v p
trì
củ o n gen ND1 (A), HBB (B)

ờng chu n


Đị
ợng mứ
m t o n trên các mẫu nghiên cứu
D a vào chu kỳ ng ỡng, công thức tính mứ độ mất đo n đ n u ở phần ph ơng ph p
h ng tôi đ x đ nh đ ợ 52/86 ( hiếm 60 46 ) bệnh nhân U Đ

ó mứ độ mất
đo n ở mô u o hơn so với mô lân cận, có 34/86 (39,54%) bệnh nhân có mất đo n ở mô
u thấp hơn mô lân ận u. Mứ độ mất đo n trung bình ở mô u (55,93%±6,55) t ơng
đ ơng với mô lân cận u (55,69±8,01). Giá tr trung v mứ độ mất đo n ở mô u là 56,02
(52,70 – 58,81) mô lân cận u là 55,05(51,15-59,51). Trên mẫu mô U Đ
phần lớn
bệnh nhân có mứ độ mất đo n thuộc khoảng 45%-70%. Trên mô u mứ độ mất đo n lớn
nhất là 78,15%, nh nhất là 26 t ơng ứng trên mô lân cận u là 81,86 % và 31,65%.
Sử dụng test Wilcoxon Signed-Rank để so sánh s khác biệt về mứ độ mất đo n giữa
mô u và lân cận u chúng tôi không nhận thấy có s khác biệt m ng
(p=0,163)

nghĩ thống kê

Mứ độ mất đo n trên mẫu máu của 9 bệnh nhân U Đ đ ợc cung cấp kèm theo mẫu
mô và 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh làm đối chứng t ơng ứng là 64 63
8 67 và
(52,08% ±6,25). Sử dụng test thống kê Mann-Whitney, nhận thấy có s khác biệt mang ý
nghĩ thống kê về mứ độ mất đo n giữa mẫu máu của bệnh nhân U Đ
với mẫu máu
đối chứng (P<0,001)
Mối liên quan gi a mứ
m t o n ADN ty thể t
ối vớ
ểm
bệnh học lâm sàng
Sử dụng
ph ơng ph p thống kê g m: Man-Whitney, Kruskal-Wallis Test với k=3
để phân tích mối liên quan giữa mứ độ mất đo n ADN ty thể với
đặ điểm nh tuổi,

giới tính
đặ điểm bệnh h lâm sàng nh v trí u í h th ớc u, mứ độ biệt hóa,
gi i đo n gi i đo n gi i đo n bệnh trên 86 bệnh nhân U Đ
ả

3.1:

ố

qu

ứ
ệ

Đ

ểm

t o vớ
UTĐTT

Số bệnh
nhân

ứ
Mô LCU

18
66

57,67 ±7,90
55,19 ± 8,13

t số
t o
U

Tuổi
< 50
>= 50
Giới tính
Nam
Nữ
í h th ớc u (cm)
<3
>=3, <=3,5
>3,5
V trí khối u

ể

ệ

ọ

ủ

P theo d/theo
mô u
0,095/0,163

55,35±3,88
56,02±7,19
0,232/0,315

41
45

55,82± 8,51
55,58 ± 7,62

56,3±7,81
55,59±5,2
0,704/0,172

21
16
42

54,41 ± 8,07
57,23± 6,64
55,70 ± 8,89

56,15±5,48
59,22±6,49
55,10±6,78
0,06/0,173


Tr c tràng

41
Đ i tràng + Đ i
tr c tràng
45
Mứ độ biệt hóa
Cao
10
Vừa
39
Thấp
6
Mứ độ xâm lấn của khối u (T)
T1
9
T2
35
T3+T4
40
H h di ăn ( )
N0
51
N1+N2
32
Gi i đo n bệnh (TNM)
I
30
II
21
III+IV
33

t

t

op

p

p

55,59 ± 5,80

56,92±6,22

55,79 ± 9,66

54,84±6,79
0,687/0,559

57,03 ±10,33
56,22 ± 7,86
58,03 ±12,03

54,82±3,58
56,9±5,03
55,77±8,16
0,019/0,447

52,61± 5,32
56,88 ± 6,45

55,47 ± 9,69

58,64±6,76
56,05±4,91
55,85±6,15

55,80 ± 8,36
55,73 ± 7,84

55,41±4,78
55,72±6,80

0,0968/0,0261

0,532/0,198
55,93 ± 6,89
55,38 ±10,26
55,84 ± 7,74

55,97±5,29
54,67±3,86
57,47±6,85

pháp Man-Whitney, *: p tính theo p
d= s bản sao mô U-s bản sao mô lân cận u

p

p krusk

waliss.

ảng 3 1 ho thấ mứ độ mất đo n hông li n qu n đến
đặ điểm bệnh h lâm
sàng g m: độ tuổi giới tính í h th ớ hối u mứ độ biệt hó gi i đo n
gi i đo n
bệnh ( >0 05) nh ng li n qu n với gi i đo n
ủ bệnh (p<0 05)
3.3.4. Sự t y ổ số bản sao ADN ty thể t o
ể
ệ
ọ â s
ủ
ệ UTĐTT
ố bản s o A
t thể t ơng đối đ ợ x đ nh bằng ph ơng ph p re ltime PCR. Số
bản s o t ơng đối ủ A
t thể đ đ ợ x đ nh tr n 86 ặp mẫu mô U Đ
67
mẫu m u đối chứng ết quả đ nh l ợng iểm tr độ đặc hiệu của m i đ ợc minh h a
qua biểu đ khuế h đ i và biểu đ phân tí h đỉnh chảy (hình 3.6).


Hì

3.6: Biểu
khuế
i, biểu
ỉnh chảy của phản ứng realtime PCR
với cặp mồi ND1 (A), cặp mồi HBB (hình B) của một số bệnh nhân UTĐTT

(đường hiển th đậm, nổi là của bệnh nhân #3035)

vào ông thứ tính số bản s o n u ở phần ph ơng ph p ch ng tôi đ x đ nh
đ ợc 49/86 bệnh nhân U Đ
hiếm 56,97% số bệnh nhân có số bản s o t ơng đối ở
mô u thấp hơn so với mô lận u 37/86 bệnh nhân hiếm 43,03% có số bản s o t ơng đối ở
mô u o hơn so với mô lận cận u. Giá tr trung bình số bản sao ADN ty thể t ơng đối
trên mô lân cận u (1237 46 1051 12) o hơn so với mô u (1038 50 743 36) (bảng 3 2)
Giá tr trung v trên mô lân cận u là 906,43 (604,30-1544,88), trên mô u là 858,37
(516,77-1333,04). Giá tr số bản s o t ơng đối lớn nhất trên mô lân cận u mô u t ơng
ứng là 7455,04 và 3999,20 giá tr số bản s o t ơng đối nh nhất trên mô lân cận u, mô u
t ơng ứng là 63,32 và 65,64. Số bản s o t ơng đối trên mô u (1038,51±743,36) o hơn
so với m u đối chứng (189,27±112,30) và máu của bệnh nhân U Đ
(149,49±80,85).
S khác biệt về số bản s o t ơng đối giữa mẫu mô và mẫu máu trên cùng một bệnh nhân,
giữa mẫu mô ung th và m u ủ ng i kh e m nh ó nghĩ thống kê (P<,0.001), tuy
nhiên, l i không có s khác biệt m ng nghĩ thống kê khi so sánh giữa máu U Đ và
m u đối chứng (P>0,05)
th đổi số bản sao ADN ty thể t ơng đối theo
đặ điểm bệnh h lâm sàng
ó xu h ớng giảm dần theo s biểu hiện tăng dần của bệnh U Đ
ố bản sao ADN ty
thể không phụ thuộc vào một số đặ điểm nh tuổi, giới tính nh ng phụ thuộc và giai
đo n và gi i đo n N của bệnh U Đ
(bảng 3 2)


ả

3.2: Số ả s o

N ty t ể t
ủ

Đ

ệ

u

t

ì

)t

o

ể

ọ

Mô LCU

P tính theo d/theo
mô u

ối
U

0,135/ 0,209

Tuổi
< 50
>= 50

18
66

1393,96 ± 1678,52
1193,61± 835,28

889,36± 689,59
1092,72±763,05

Nam
41
Nữ
45
t ớc u (cm)
<3
21
>=3, <=3,5
16
>3,5
42
Vị trí khối u
Tr c tràng
45
Đ i tràng +Đ i

tr c tràng
41
Mứ
biệt hóa
Cao
10
Vừa
39
Thấp
6
Mứ
xâm l n của khối u (T)
T1
9
T2
35
T3+T4
40
H
N)
N0
51
N1+N2
32
G
o n bệnh (TNM)
I
30
II
21

III+IV
33

1128,04 ±862,49
1337,17 ± 1198,67

1011,03±738,73
1063,55±755,00

0,176 /0,2709

Giới tính

Ghi chú:

ệ

trự tr

Số bản sao ADN ty thể t

Số bệnh
nhân

ểm

ố tru

t

t

p

p

p

0,239/ 0,759 *
934,70 ± 576,38
1375,04 ± 1170,37
1361,71 ± 1248,03

938,48± 479,52
1043,14± 928,22
1054,02± 832,25
0,050/ 0,050

1357,19 ± 1291,09

959,83± 772,90

1128,38 ± 770,39

1110,19± 716,52
0,524/ 0,425*

1141,60 ± 858,09
935,75 ± 581,73
1175,65 ± 662,21

1058,58± 719,17
834,94± 654,13
716,63± 370,13
<0,0001/ 0,489 *

1287,33± 948,09
1377,56± 1436,38
1082,76± 623,29

1208,56± 577,00
1068,83± 807,71
1010,58± 727,74

1394,81±1245,58
991,22 ± 624,51

1130,74±841,79
923,53± 548,71

0,173/ 0,192

0,565/ 0,398 *
1594,64 ±1501,33
1132,49 ± 669,20
977,12 ± 619,99
p

p

-W t

1215,00± 848,70
1055,34± 836,48
912,04± 544,08
y *: p t

t

op

p

p krusk

w

ss. =

số bản sao mô U-số bản sao mô lân cận u

3.5. M T S
3.5.1. Các biế
tràng

BI N Đ I THU C CÁC GEN ND1, ND3, COX-1, COX-2 TY TH
ổ T4216

4164G ủ

ND1 ở bệ

â u

t

i trực


ử dụng ặp m i

1 1và en me NlaIII để x

đ nh biến đổi t i v trí 4216 và

4164. Kết quả PCR- RFLP của một số mẫu đ i diện trong nghiên cứu đ ợc minh h a
trong hình 3.7.

Hì

3.7:

ện di sản ph m PCR và sản ph m cắt bằng enzyme giới h n NlaIII
ện di gel agarose 1.5%, nhu m ethidium bromide)
Giếng M: Thang ADN chuẩn 100bp. Hình A: Giếng (1; 2), (3; 4): sản phẩm PCR; cắt n
ô , ân ận tương ứng ủa
3
1
Giếng (5;6): sản phẩm PCR, cắt
enzyme mẫ

đối chứng. Hình B: Giếng (1; 2), (3; 4), (5;6): sản phẩm PCR, cắt n
ô
, ân ận , ẫ
tương ứng ủa ng ột ệnh nhân
1 1

Kết quả

- FL x

đ nh ó 11/86 mẫu ( hiếm 12 79 ) hi điện di sản phẩm cắt

thu đ ợ 2 băng ó í h th ớ t ơng t nh giếng 4 hình 3.7A. Từ kết quả đó h ng tôi
b ớ đầu kết luận rằng, có thể có biến đổi 4216 hoặc biến đổi A4164G trong những
mẫu nghiên cứu nà
goài r h ng tôi ng thu đ ợc 1 mẫu mà sản phẩm PCR sau khi
cắt bằng en me ho 3 băng ó í h th ớc lần l ợt khoảng 335bp (đ i diện cho những
bản sao không mang biến đổi t i v trí 4216 và 4164), 220,133bp hoặ 185 150bp (đ i
diện cho bản sao có biến đổi t i v trí 4216 hoặc 4164) - giếng số 4 hình 3 7
Đâ là
mẫu có hiện t ợng d tế bào chất.
ơng t
ó 8/67 (11 94 ) mẫu m u ủ ng

i h e m nh và 2/9 (22 22 ) mẫu

m u bệnh nhân U Đ m ng biến đổi t i v trí 4216 hoặ 4164 tr n gen ND1.
Để khẳng đ nh kết quả PCR-RFLP, 11 mẫu có biến đổi và một mẫu không chứa biến
đổi đ ợc tiến hành nhân dòng và giả trình t .
Kết quả giải trình t A

đ hỉ ra rằng tất cả 11 mẫu phân tí h nà đều không có
biến đổi t i v trí 4216 mà có biến đổi t i v trí 4164 (hình 3 8).


Hì

3.8: Trì

tự o n ADN không bị biế

tại v trí 4216; 4164 (h nh )

ổi

không đột biến tại v trí 4216,

biến đổi tại v trí 4164 (hình B) thuộc gen ND1 ty thể tương ứng
hai bệnh nhân BN#3089 và BN #17180.

Ngoài ra, kết quả giải trình t còn chỉ ra một số biến đổi khác thuộc gen ND1 g m:
G4048A 4071
4254
4108
4137 và A4263G (hình 3 9) iến đổi G4048A
là biến đổi làm th đổi axit amin từ Aspatate thành Asparagine t i v trí 248 (D248N)
của phân tử protein NADH dehydrogenase subunit 1 thuộc vùng xuyên màng trong ty thể
(www.mitomap.org).

Hì

3.9: Trì tự o n ADN có biế ổi t i các vị trí
4048 (A), 4108(B), 4071(C), 4137 (D), 4263 (E)

Sửa dụng test chính xác củ Fisher để kiểm đ nh mối liên quan giữa biến đổi A4164G
với
đặ điểm bệnh h c của bệnh ung th đ i tr c tràng, kết quả đ ợ trình bà trong
bảng 3 3


ả

3.3:

â

ố 4164G tr
â u

N ty t ể t o
t

ể

ểm

ủ

Số

ợng

su t 4164G )
(%)
4164A
4164G

uổi

ệ

P
0,43

<50
>=50

18
66

(15) 83,3
(58) 87,9

(3) 16,7
(8) 12,1

Giới tính

0,003
Nam
ữ

41

(31) 75,6

(10) 24,4

45

(44) 97,8

(1)2,2

trí ung th

0,433
Đ i tràng+Đ
r

tràng

45

(40) 88,9

(5) 11,1

41

(35) 85,4

(6) 14,6

Độ biệt hó

0,585
Rõ
ừ
Kém

10
39
6

(8) 80,0
(33) 84,6
(6) 100,0

(2) 20,0
(6) 15,4
(0) 0,0

í h th ớ u( m)

0,256
<3
>=3; <=3,5
>3,5

21

16
42

(18) 85,7
(12)75,0
(38) 90,5

(3) 14,3
(4) 25,0
(4) 9,5

Gi i đo n

0,058
No
N1
N2

53
28
4

(49) 92,5
(21) 75,0
(4) 100,0

(4) 7,5
(7) 25,0
(0) 0,0

Gi i đo n

0,011
T1
T2
T3+T4

9
35
40

(5) 55,6
(30) 85,7
(38) 95,0

(4) 44,4
(5) 14,3
(2) 5,0

Gi i đo n bệnh

0,080
I
II
III + IV

Ghi chú. n

ọ

trự tr
T

Đ

ệ

n I: T1-2 0M0;

30
20
33

(26) 86,7
(20) 100,0
(26) 78,8

n II: T3-4 0M0;

(4) 13,3
(0) 0,0
(7) 21,2
n III: Tbất kỳ N1-2M0;

n

IV: Tbất kỳ N bất kỳ M1

Từ bảng 3.3 cho thấ biến đổi A4164G li n qu n với giới tính và gi i đo n T giới
tính ( <0 05) hông li n qu n với

đặ điểm bệnh h c khác g m độ tuổi í h th ớc


khối u, mứ độ biệt hó

gi i đo n

và gi i đo n bệnh (p>0 05) ủa bệnh U Đ

Không có s khác biệt về tỷ lệ ủa biến đổi A4164G giữa mô u và mô lân cận u, giữa
mẫu mô và mẫu m u đối chứng, giữ m u đối chứng và máu bệnh (p>0,05). Tuy nhiên,
tỷ lệ d ng biến đổi 4164G trên máu bệnh (22 2 ) ó xu h ớng o hơn so với m u đối
chứng (11,9%) (p>0,05)
3.5.2. Biế ổi A10398G trên gen ND3 ở bệ
â t
i trực tràng
Bằng ph ơng ph p
- FL với ặp m i
3 và en me ắt DdeI để sang l c biến
đổi A10398G, giải trình t A
để khẳng đ nh kết quả PCR-RFLP. Kết quả
- FL
giải trình t ở một số mẫu đ ợc minh h a trong hình 3.10.

Hì

3.10:
ện di sản ph m PCR-RF
trình tự o n ADN chứa vị tr 10398

o n ADN chứa vị trí 10398 (A) và
t biến và k ô
t biến (B)

(Điện di trên ge polyacrylamide 8%, nhuộm ethidium bromide)
Giếng M: Thang chuẩn
p, giếng : Đối chứng âm, giếng 1, 3, 5: sản phẩm cắt b ng
enzymecủa các BN#9802 mô u,LCU, BN# 8619 mô u, giếng 2, 4, 6 sản phẩ PCR tương ứng.

Từ hình 3.10 cho thấy, có những mẫu sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme DdeI
ho 2 băng ó í h th ớ t ơng ứng 196, 50bp (mẫu ở d ng 10398A)- giếng 5 hình
3.10A, có những mẫu sau khi cắt bằng en me ho 3 băng ó í h th ớ t ơng ứng 158,
50, 38bp (d ng 10398G) - giếng 1, 3 hình 3.10A. Để khẳng đ nh kết quả PCR-RFLP, 02
mẫu có d ng 10398A 10398G đ ợ nhân d ng và giải trình t . Kết quả giải trình t cho
thấy hoàn toàn phù hợp với kết quả PCR-RFLP (hình 3.10B).
Kết quả phân tích PCR-RFLP cho thấy: tần suất d ng 10398G ở nhóm bệnh nhân trên
50 tuổi (78 8 ) o hơn so với nhóm d ới 50 tuổi (53,1%), nhóm nam giới (61%) cao
hơn so với nữ giới (53,5%), nhóm bệnh nhân đ i tràng và đ i tr tràng (65 1 ) o hơn
so với nhóm tr c tràng (48,8%), nhóm biệt hóa rõ và vừ
o hơn nhóm biệt hóa kém,
gi i đo n 1 và 2
o hơn so với gi i đo n N0, ở gi i đo n III và I
o hơn so với
gi i đo n I và II. Tuy nhiên, s khác biệt về tần suất d ng 10398G theo
đặ điểm
bệnh h c kể tr n hông ó nghĩ thống kê (P>0,05). Theo
đặ điểm gi i đo n T và
í h th ớc khối u cho thấy: Ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n 1 và í h th ớc u <3cm

có tần suất d ng 10398G cao nhất, tiếp theo là đến nhóm bệnh nhân ở gi i đo n T3+T4,
í h th ớc khối u >3,5cm; thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n 2 và í h th ớc
u >=3; <=3 5
h biệt về tỷ lệ phân bố A10398G theo gi i đo n và í h th ớc
khối u là ó nghĩ thống (p<0,05) (bảng 3.4)
Bả
ủ

3.4:
ệ

â ố 10398G tr
â u t
trự tr
Đ

N ty t ể t
Số
ợ

ể

o

ể
T

ệ

ọ â

su t 10398G ) %
10398A
10398G

uổi

P
0,051

<50
>=50

18
64

(4) 22,2
(30) 46,9

(14) 77,8
(34) 53,1

Giới tính

0,318
Nam
ữ

41
43

(16)39,0
(20)46,5

(25) 61,0
(23) 53,5

trí ung th

0,09
Đ i tràng+Đ
r

tràng

43

(15) 34,9

(28) 65,1

41

(21) 51,2

(20) 48,8

Độ biệt hó

1,0

Rõ
ừ
Kém

9
38
6

(4) 44,4
(17) 44,7
(3) 50,0

(5) 55,6
(21) 55,3
(3) 50,0

í h th ớ u( m)

0,011
<3
>=3; <=3,5
>3,5

20
16
41

(5) 25,0
(9) 56,3
(3) 7,3

(15) 75,0
(7) 43,8
(22) 53,7

Gi i đo n

0,119
No
N1
N2

50
27
4

(25) 50,0
(10) 37,0
(0) 0,0

(25) 50,0
(17) 63,0
(4) 100,0

Gi i đo n

0,016
T1
T2
T3+T4

9
33
40

(0) 0,0
(16) 48,5
(19) 47,5

(9) 100,0
(17) 51,5
(21) 52,5

Gi i đo n bệnh

Lo i mô

s

0,401
I
II
III + IV
U
Mô LCU

29
21
32

(13) 44,8
(11) 52,4
(11) 34,4

(16) 55,2
(10) 47,6
(21) 65,6
0,439

86

(39) 45,3

(47) 54,7


3.5.3.
t số ế ổ ủ
COX-2 ty thể
Để sàng l c các biến đổi trên gen COX-2 ty thể h ng tôi đ tiến hành giải trình t
A
toàn bộ hiều dài ủ gen COX-2 tr n mô u ủ 31 bệnh nhân U Đ
ết quả giải
trình t đ x đ nh đ ợc 13 biến đổi trong đó ó 5 biến đổi làm th đổi xit min thuộ
gen COX-2 t thể (hình 3 11).

Hì

3.11:

t số vị tr

ế

ổ tr

COX-2 ty t ể

A, B, C, D, E: Các v trí biến đổi nucleotide dẫn đến tha đổi a it a in: T
C, T
C,
G
3 , G
, C 13 T tương ứng các mẫu #4120, #3089, #19561, # 37158, #11777,
tương ứng. F: Biến đổi n
oti G
không
tha đổi axit amin mẫu #42440

Biến đổi G7853A là biến đổi làm th đổi axitamin từ Valine thành Isoleucine và là
d ng biến đổi có tần suất xuất hiện cao nhất trong 31 mẫu đ ợc giải trình t (4/31 tr ng
hợp). Vì vậy, biến đổi t i v trí nà đ ợ l
h n để sàng l c trên các bệnh nhân còn l i
bằng ph ơng ph p
-RFLP. Kết quả PCR- FL đ ợc minh h a trong hình 3.12.

Hì

3.12:

ệ

sả p
R-RF
o
N ủ
COX-2 tr
ôu â ậ u
ẫu
u ủ ệ
ậ UTĐTT
ros 2 5%)
U: mô u, LCU: mô lân cận u, M: mẫu máu, Giếng M: Thang ADN chuẩn 50bp. Giếng 1: Đối
chứng ương - sản phẩm cắt enzyme (mẫu có biến đổi G
3 đư c kh ng đ nh b ng giải trình
t ); giếng: 2,4,6,8,10,12: Sản phẩm PCR; giếng: 3,5,7,9,11,13: Sản phẩm cắt b ng enzyme
HincII; giếng (-): đối chứng âm

Tổng hợp kết quả giải trình t và kết quả phân tích PCR- RFLP cho thấy: tần suất
biến đổi G7853A trên mô u (15,1%) thấp hơn so với mô lân ận u (21,2%). Tuy nhiên, s
khác biệt về tần suất biến đổi G7853A giữa mô u và lân cận u hông ó nghĩ thống kê