Nghiên cứu sự tăng trưởng của cây IN VITRO định tính và khảo sát khả năng kháng khuẩn của hợp chất QUINON trong lá cây RIVINA HUMILIS l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU SỰ TĂNG TRƢỞNG CÂY IN
VITRO, ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT QUINON TRONG
LÁ CÂYRIVINA HUMILIS L.
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP

GVHD: TS. Đỗ Thƣờng Kiệt

Ths. Nguyễn Trần Đông Phƣơng
SVTH: Trần Đình Thiện
MSSV: 1153010785
Khóa: 2011-2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trƣờng, Ban chủ
nhiệm khoa Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo
điều kiện cho em đƣợc học tập và rèn luyện trong môi trƣờng tốt nhất.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả các quý thầy, cô giáo bộ môn của khoa Công
nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cần thiết
trong suốt thời gian học đại học.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Đỗ Thƣờng Kiệt và cô Nguyễn Trần

Đông Phƣơng đã trực tiếp hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Công nghệ
tế bào và phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt
thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình. Cảm ơn những tình
cảm mà ông bà, ba mẹ và anh chị đã dành cho con, sự ủng hộ và động viên của gia
đình đã giúp con vững bƣớc hơn trên con đƣờng học tập và đƣờng đời.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 5 năm 2015
Trần Đình Thiện

i


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MS

: Murashige & Skoog

BA

: 6-Benzinaminopurine

NB

: Nutrigent Broth

ND

: Nƣớc dừa

Cs

: Cộng sự

ii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng II.1: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ javel và
thời gian khử trùng đến khả năng khử trùng và nảy mầm của mẫu hạt Rivina humilis
L. ................................................................................................................................ 33
Bảng II.2: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của BA đến sự tăng
trƣởng của cây con Rivina humilis L. .......................................................................... 34
Bảng II.3: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hƣởng của kinetin đến sự
tăng trƣởng của cây con Rivina humilis L. .................................................................. 35
Bảng II.4: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hƣởng của ND đến sự tăng
trƣởng của cây con Rivina humilis L. .......................................................................... 36
Bảng III.1: Tỉ lệ mẫu vô trùng và thời gian nảy mầm của hạt khi đƣợc khử
trùng bởi javel ở các nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau.................................. 42
Bảng III.2: Chiều cao cây, số lá/cây và đặc điểm cây Rivina humilis L. trên
môi trƣờng có chứa BA với các nồng độ khác nhau. ................................................... 44
Bảng III.3: Chiều cao cây, số lá/cây và đặc điểm cây Rivina humilis L. trên
môi trƣờng có chứa kinetin với các nồng độ khác nhau. ............................................. 46
Bảng III.4: Chiều cao cây, số lá/cây và đặc điểm cây Rivina humilis L. trên
môi trƣờng có chứa ND với các nồng độ khác nhau. ................................................... 48
Bảng III.5: Kết quả phản ứng Borntraeger .......................................................... 51
Bảng III.6: Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Rivina humilis L. ......... 53

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình I.1: Cây Rivina humilis L. ............................................................................ 4
Hình I.2: Các con đƣờng tổng hợp nên hợp chất thứ cấp. ................................... 14
Hình I.3: Benzoquinon ....................................................................................... 19
Hình I.4: Naphthoquinon .................................................................................... 20
Hình I.5: Bình sắc ký lớp mỏng .......................................................................... 24
Hình II.1: Sơ đồ nhuộm hai màu......................................................................... 37
Hình II.2: Bản sắc ký .......................................................................................... 38
Hình III.1. Hạt cây Rivina humilis L. nảy mầm trên môi trƣờng MS (sau 30
ngày nuôi cấy) ............................................................................................................ 43
Hình III.2: Cây con in vitro (đã loại bỏ rễ) tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy trên
môi trƣờng có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau .................................................. 45
Hình III.3: Cây con in vitro (đã loại bỏ rễ) tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy trên
môi trƣờng có bổ sung kinetin ở các nồng độ khác nhau ............................................. 47
Hình III.4:Cây con in vitro (đã loại bỏ rễ) tại thời điểm 6 tuần nuôi cấy trên
môi trƣờng có bổ sung ND ở các nồng độ khác nhau .................................................. 49
Hình III.5: Cấu tạo giải phẫu thân cây Rivina humilis L. ................................... 50
Hình III.6: Cấu tạo giải phẫu lá cây Rivina humilis L........................................ 50
Hình III.7: Sắc ký bản mỏng dịch trích quinon trong lá Rivina humilis L............ 52
Hình III.10: Vòng kháng khuẩn đối với Pseudomonas aeruginosa ..................... 54
Hình III.9: Vòng kháng khuẩn đối với Escherichia coli ...................................... 54
Hình III.8: Vòng kháng khuẩn đối với Staphylococus aureus ............................. 54
Hình III.11: Vòng kháng khuẩn đối với Bacillus aureus ..................................... 55

iv

MỤC LỤC
I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3
I.1.

Giới thiệu đặc tính sinh học cây Rivina humilis L. ................................ 3

I.1.1. Họ Thƣơng lục (Phytolaccaceae) ................................................... 3
I.1.2. Mô tả cây Rivina humilis L........................................................... 4
I.1.3. Phân bố và sinh thái ...................................................................... 5
I.1.4. Thành phần hóa học ...................................................................... 5
I.1.5. Tác dụng dƣợc lý........................................................................... 5
I.1.6. Các nghiên cứu đã thực hiện ......................................................... 6
I.2.

Nuôi cấy mô .......................................................................................... 6

I.2.1. Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật ......................... 6
I.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô .......................... 7
I.2.3. Sự phát sinh hình thái chồi bất định ............................................... 9
I.3.

Sự thu nhận hợp chất thứ cấp ............................................................... 10

I.3.1. Giới thiệu .................................................................................... 10
I.3.2. Phân loại ..................................................................................... 11
I.3.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp................ 14
I.3.4. Quinon và phƣơng pháp chiết tách .............................................. 18

I.3.5. Phƣơng pháp chiết tách ............................................................... 23
I.3.6. Định tính quinon ......................................................................... 23
I.3.7. Sắc ký lớp mỏng.......................................................................... 24
I.4.

Vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp ............................................................ 25

I.4.1. Staphylococus ............................................................................. 25
I.4.2. Escherichia coli........................................................................... 28
v


I.4.3. Pseudomonas aeruginosa ............................................................ 28
I.4.4. Bacillus cereus. ........................................................................... 29
II.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................................. 32

II.1.

Vật liệu ................................................................................................ 32

II.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 32

II.2.1. Nuôi cấy cây con in vitro từ hạt Rivina humilis L. ..................... 32
II.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của BA đến sự tăng trƣởng của cây con
Rivina humilis L. in vitro. .............................................................................. 34
II.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của kinetin đến sự tăng trƣởng của cây con

Rivina humilis L. in vitro. .............................................................................. 35
II.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của ND đến sự tăng trƣởng của cây con
Rivina humilis L. in vitro. .............................................................................. 36
II.2.5. Quan sát hình thái giải phẫu cây. ................................................ 37
II.2.6. Định tính quinon. ....................................................................... 37
II.2.7.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Rivina humilis
L. .................................................................................................................... 39
II.2.8. Xử lý thống kê ........................................................................... 40
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 42
III.1. Sự tạo cây con từ hạt Rivina humilis L. ............................................... 42
III.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tăng trƣởng của cây con in vitro ... 44
III.3.

Ảnh hƣởng của nồng độ kinetin đến sự tăng trƣởng của cây con in

vitro ........................................................................................................................ 46
III.4. Ảnh hƣởng của nồng độ ND đến sự tăng trƣởng của cây con in vitro .. 48
III.5. Nhuộm quinon trong lát mỏng tế bào .................................................. 50
III.6. Phản ứng Borntraeger .......................................................................... 51
vi


III.7. Sắc ký lớp mỏng .................................................................................. 52
III.8. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây Rivina humilis L. ........... 53
IV.

Kết luận và đề nghị ................................................................................. 58

IV.1. Kết luận ............................................................................................... 58
IV.2. Đề nghị ................................................................................................ 58

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Rivina humilis L. là một loài thực vật có hoa thuộc họ Phytolaccaceae, là một
cây thân thảo lâu năm, chiều cao có thể lên đến khoảng 1 m. Sự phân bố tự nhiên
ban đầu bị hạn chế ở châu Mỹ, kéo dài từ Argentina lên tới miền nam nƣớc Mỹ.
Rivina humilis L. chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới ẩm, nhƣng chỉ đòi hỏi một lƣợng ít
ánh sáng và có thể chịu đƣợc tất cả các ánh sáng màu. Rivina humilis L. có thể sống
trên loại đất có hàm lƣợng muối cao, có thể chịu đựng đƣợc nhiệt độ thấp [37].
Tất cả các bộ phận của cây đều độc, đặc biệt rễ và lá có chứa lƣợng chất độc
lớn hơn so với những phần còn lại của cây [25]. Tuy nhiên, các loài chim có thể ăn
quả mà không bị ngộ độc. Khan et al. (2011) đã thử nghiệm chất chiết xuất từ quả
không độc hại đối với chuột nhƣng phần nào lại độc hại đối với con ngƣời [28]. Quả
đƣợc sử dụng để nhuộm màu vải tại Cape Verde [16]. Khan et al. (2012) xác định
mƣời sắc tố betalain trong quả, bao gồm cả betaxanthins và betacyanins; xác nhận
các hoạt động chống oxy hóa quan trọng trong cả hai cũng nhƣ khả năng gây độc từ
betaxanthins.Rivina humilis L. đã đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc dân gian để điều
trị cảm lạnh, tiêu chảy, đi tiểu khó, đầy hơi, bệnh lậu, bệnh vàng da và đau buồng
trứng [25].
Trong dịch chiết lá của Rivina humilis L. có rất nhiều các hợp chất thứ cấp
nhƣ: flavonoids, alkaloids, terpenoids, coumarins, steroids, phytosteroids và đặc
biệt là quinon chiếm phần lớn [23]. Quinon có tác dụng trong sinh học và dƣợc,
chống khối u, ức chế sinh tổng hợp PGE2, phòng chống bệnh tim mạch, có thể đƣợc
sử dụng nhƣ một thuốc thử hóa học và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn [22]. Vì
vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự tăng trƣởng cây in vitro, định tính
và khảo sát khả năng kháng khuẩn của hợp chất quinon trong lá cây Rivina
humilis L.”nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình nhân giống, xác định hoạt tính của
hợp chất trong cây và tạo tiền đề phát huy lợi ích của quinon đặc biệt khả năng

kháng khuẩn.

1


2


I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1.

Giới thiệu đặc tính sinh học cây Rivina humilisL.

I.1.1.

Họ Thương lục (Phytolaccaceae)

Họ Thƣơng lục có danh pháp khoa học là phytolaccaeae, là một họ trong thực
vật có hoa, có hai lá mầm chứa khoảng 14 chi với tổng cộng 45 loài có nguồn gốc
từ châu Mỹ. Ở nƣớc ta có 4 loài đƣợc du nhập để trồng làm kiểng và bây giờ cũng
trở thành cây hoang dại.
Về phân loại, họ Thƣơng lục đƣợc chia làm 3 phân họ:
 Phân họ Phytolaccoideae bao gồm 4 chi với đặc trƣng rễ củ mập,
chùm hoa đối diện với lá song không gắn trƣớc lá, 5 lá đài. Có ít
nhất 5 lá noãn trong bầu noãn, hoa có năm cánh.
 Phân họ Rivinioideae bao gồm 9 chi, chỉ có một lá noãn trong bầu
noãn, thƣờng chỉ có 4 cánh hoa.

 Phân họ Agdestidoideae chỉ có một chi tập trung chủ yếu ở vùng
Trung Mỹ.
Họ Thƣơng lục bao gồm những cây thân thảo hoặc thân bụi sống nhiều năm
cao từ 1 tới 3m. Thân thƣờng hình trụ, màu xanh có thể có màu tím, ít phân nhánh.
Lá mọc so le hoặc đối xứng, gốc lá tù, đầu lá nhọn. Hoa thƣờng có màu trắng, mọc
thành chùm đối diện với lá nhƣng không gắn trƣớc lá. Quả mọng, thƣờng có hình
cầu, khi chín có màu sắc sặc sỡ, dễ thu hút sự chú ý của con ngƣời và các loài chim
ăn quả, hạt màu đen, hình thận hoặc hình tròn.
Hầu hết cây thuộc họ Thƣơng lục đều có công dụng trong y học trong đó nổi
bật nhƣ: Thƣơng lục, Rivina humilis L., Mohlana, Flueckigera, Villamillia....

3


I.1.2.

Mô tả cây Rivina humilis L.

Vị trí phân loại:
Giới: Plantae
Ngành: Angiospermae
Lớp: Eudicots
Bộ: Caryophyllales
Họ: Phytolaccaceae
Phân họ: Rivinioideae
Chi: Rivina
Loài: Rivina humilis L.

Hình I.1: Cây Rivina humilis L.

Rivina humilis L. là một cây thân thảo lâu năm chiều cao có thể lên đến
khoảng 1 m. Thân thẳng, có phân nhánh, cành có góc cạnh, nhẵn hoặc có lông tại
các nhánh. Lá hình trứng đến elip, có thể dài đến 12 cm, cuống dài, chóp lá nhọn, có
phủ lông mịn ở cả hai mặt, đặc biệt là dọc theo gân lá. Lá có mùi khó chịu khi bị
nghiền nát. Cụm hoa có thể mọc ở ngọn hoặc nách lá, dài đến 15 cm, mọc thẳng
hoặc cong, mảnh mai. Hoa nhỏ, lƣỡng tính, cuống hoa dài lên đến 5 mm, phía dƣới
có lá bắc rất nhỏ, dài khoảng 2-3 mm, màu xanh lá cây, màu trắng hoặc màu hồng,
liên tục; nhị 4 túi phấn, hình trứng, 1 ô. Vòi nhụy hơi cong, nƣớm nhụy tròn. Quả có
màu đỏ hoặc màu da cam, 3-4 mm, quả có một hạt, đƣờng kính 3 mm. Bộ lƣợng
nhiễm sắc thể của cây 2n=126 [39] [40].
Rivina humilis L. chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới ẩm, nhƣng chỉ đòi hỏi một
lƣợng ít ánh sáng và có thể chịu đƣợc tất cả các ánh sáng màu. Rivina humilis L. có
thể sống trên loại đất có hàm lƣợng muối cao, có thể chịu đựng đƣợc nhiệt độ thấp
[37]. Hạt có thể nảy mầm mà không cần thông qua các giai đoạn tiền xử lý, hoa có
thể trổ tất cả các mùa trong năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc lƣu trữ giống [34].
4


I.1.3.

Phân bố và sinh thái

Sự phân bố tự nhiên ban đầu bị hạn chế trong châu Mỹ, kéo dài từ Argentina
lên tới miền nam nƣớc Mỹ. Hiện nay, nó đã phân bố rộng rãi đến các nƣớc khác và
đã trở thành cây xâm hại ở nhiều nơi trên Thái Bình Dƣơng và một số ít các nƣớc ở
châu Phi và châu Á.
Rivina humilis L. chủ yếu sống ở vùng nhiệt đới ẩm, nhƣng nó đòi hỏi một
lƣợng ít ánh sáng và có thể chịu đƣợc tất cả các ánh sáng màu. Nó có thể sống trên
loại đất có hàm lƣợng muối cao, có thể chịu đựng đƣợc nhiệt độ thấp [37]. Hạt có
thể nảy mầm mà không cần thông qua các giai đoạn tiền xử lý, hoa có thể trổ tất cả

các mùa trong năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc lƣu trữ giống [34].
I.1.4.

Thành phần hóa học

Thành phần chính trong lá Rivina humilis L. là carbohydrate và quinon. Ngoài
ra còn có các hợp chất khác nhƣ tannin, saponin, flavonoid, alkaloid, cardiac
glycoside, terpenoid, coumarin, steroid nhƣng chỉ có hàm lƣợng thấp [23].
Trong lá Rivina humilis L. có hàm lƣợng quinon rất lớn, quinon có tác dụng
trong sinh học và dƣợc học, chống khối u, ức chế sinh tổng hợp PGE2, phòng chống
bệnh tim mạch, có thể đƣợc sử dụng nhƣ một thuốc thử hóa học và đặc biệt là khả
năng kháng khuẩn [22].
I.1.5.

Tác dụng dược lý

Rivina humilis L. đã đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc dân gian để điều trị cảm
lạnh, tiêu chảy, đi tiểu khó, đầy hơi, bệnh lậu, bệnh vàng da và đau buồng trứng
[25].
Mặc dù các loài chim có thể ăn trái mà không bị ngộ độc. Khan et al. (2011)
đã thử nghiệm chất chiết xuất từ trái không độc hại đối với chuột. Tuy nhiên, khi
ngƣời ăn phải trái cây Rivina humilis L. sẽ bị tê miệng, trong vòng 2 giờ đầu sẽ cảm
thấy cảm giác ấm áp trong cổ họng và dạ dày. Tiếp theo là ho, khát nƣớc, mệt mỏi,
ngáp kèm theo nôn mửa và tiêu chảy (đôi khi có máu). Rễ và lá có chứa lƣợng chất
độc lớn hơn so với những phần còn lại của cây [25].
5


Quả mọng có chứa một sắc tố gọi là rivianin hoặc rivinianin, rất giống với
betanin, sắc tố đƣợc tìm thấy trong củ cải đƣờng (Beta vulgaris) [24]. Ngoài ra

trong trái cây còn chứa betaxanthin humilixanthin [14]. Rivina humilis L. cũng đã
đƣợc chứng minh là có hoạt động tƣơng tự hormone chống lại loài muỗi vằn (Culex
quinquefasciatus) [26].
I.1.6.

Các nghiên cứu đã thực hiện

Năm 2012, Mujeera Fathima và Florida Tilton đã nghiên cứu phân tích thành
phần các hợp chất có trong lá cây Rivina humilis L.
Năm 1997, Nellis, David W đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây Rivina
humilis L. từ đoạn thân mang chồi bên và chồi ngọn từ cây ngoài tự nhiên.

I.2.

Nuôi cấy mô

I.2.1.

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

I.2.1.1. Auxin
Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trƣởng của tế bào nên có vai trò
quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin đƣợc tổng hợp trong ngọn
thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào
nhanh). Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ [11] [31].
Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trƣởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào,
cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và
kích thích sự phân hóa mô dẫn [11].
Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhƣng cản sự tăng trƣởng
của các sơ khởi rễ này [9]. Auxin đƣợc vận chuyển hƣớng gốc, tích lũy ở phần gốc

của khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định [21].
Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (nhƣ thianin mà rễ không tổng
hợp đƣợc), acid amin (nhƣ arginin), nhất là các hợp chất orthor-diphenolic (nhƣ
acid cafeic, acid chlorogenic) [11].
Trong số các loại auxin đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D đƣợc xem
là một auxin mạnh, có tác động hình thành mô sẹo. Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng
6


độ quá cao, auxin này sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền. Trong
sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thƣờng đạt hiệu quả
cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh
cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng nhƣ hàm lƣợng chất điều hòa nội
sinh trong nuôi cấy. Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lƣợng IAA nội sinh
tích lũy tăng cao. Điều này đƣợc giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động
của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng
làm tăng nhanh lƣợng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định.
I.2.1.2. Cytokinin
Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokynin tự do cho cả cơ
thể thực vật. Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhƣng kích thích tăng rộng tế bào (sự
tăng trƣởng củ). Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trƣởng thành của diệp
lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi [31].
Trong sự hình thành chồi, cytokinin có thể đƣợc xử lý riêng rẽ hay phối hợp các loại
để làm tăng khả năng hình thành và chất lƣợng chồi.
Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đƣa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi. Số
lƣợng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên, cũng có những
bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi.
Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ
cảm ứng hình thành chồi bất định nhƣng chồi rất khó ra rễ.
Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi đƣợc cảm ứng bởi cytokinin

nhƣng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt đƣợc chuyển sang môi trƣờng
giảm hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi
nhƣng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách
giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi đƣợc phát
triển tốt nhất.
I.2.2.


Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
Ánh sáng
7


Ánh sáng có tác động đến sự tăng trƣởng và khả năng phát sinh hình thái của
tế bào trong nuôi cấy in vitro. Mỗi loài thực vật khác nhau có những đáp ứng khác
nhau với từng loại ánh sáng, cƣờng độ và thời gian chiếu sáng khác nhau.
Cƣờng độ chiếu sáng cao làm tăng sự thoát hơi nƣớc, môi trƣờng nuôi cấy bị
khô và nƣớc trong tế bào sẽ giảm xuống gây ảnh hƣởng đến sự phân chia và tăng
trƣởng của chúng.
Cƣờng độ chiếu sáng yếu làm ảnh hƣởng đến sự dự trữ chất dinh dƣỡng của
cây vì sự quang hợp kém hơn sự hô hấp.


Nhiệt đô

Nhiệt độ trong khoảng 17-250C thƣờng đƣợc áp dụng để cảm ứng sự tạo mô
sẹo và tăng trƣởng của tế bào nuôi cấy. Nhƣng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với
một nhiệt độ khác nhau. Toivonen et al. (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ trong
quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lƣợng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo
trọng lƣợng khô) [3].



pH

Độ pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết
cho cây. Ngƣời ta thƣờng chỉnh pH khoảng 5.7-5.8, đây là mức tốt để cây có thể
hấp thụ muối khoáng.


Sự thoáng khí

Quá trình quang tự dƣỡng diễn ra một cách tự nhiên nhờ sự hiện diện của khí
CO2 trong không khí nhƣ một nguồn cung cấp carbon. Trong nuôi cấy in vitro
truyền thống, nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm trong quá trình quang hợp làm
giảm khả năng quang tự dƣỡng.Thông thoáng khí giúp cây trong nuôi cấy mô hô
hấp và quang hợp tốt. [5].


Muối khoáng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu
cầu của cây ngoài tự nhiên. Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lƣợng và vi
lƣợng là điều cần thiết.
8




Nguồn Carbon

Chủ yếu cho mô nuôi cấy là đƣờng. Mô tế bào nuôi cấy có sự quang hợp giới
hạn, vì vậy ngƣời ta cần thêm glucid cần thiết cho sự tăng trƣởng của mô vào môi
trƣờng nuôi cấy.


Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dƣỡng khác nhau, các
vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin HCl
(vitamin B1), pyridoxin HCl (vitamin B6), acid nicotinic, myo-inositol [5].


Agar

Agar là một polyosid có trọng lƣợng phân tử cao, đƣợc chiết ra từ rong biển
loại gelidium. Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi
trƣờng gây chết mô do thiếu oxi.
I.2.3.

Sự phát sinh hình thái chồi bất định

Sự phát sinh hình thái ở thực vật là sự phát triển của tế bào, mô hay cơ quan ở
thực vật. Sự phát sinh hình thái ở thực vật phụ thuộc vào hai quá trình căn bản: sự
điều hòa hƣớng kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí và hƣớng phân chia của tế bào.
Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với mô chóp mà còn xuất hiện gần
vết thƣơng, gần chỗ vết cắt, gần cùng phát sinh libe-mộc hoặc ngoài biểu bì, vì vậy
chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân hóa các tế
bào trƣởng thành. Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế
bào giống nhƣ sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân [9].
Chồi phân sinh ngọn có thể từ các tế bào biều bì, mô hàng rào, mô khuyết hay

mô bao quanh mạch của mô cấy. Trƣớc khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh
của chồi đƣợc tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động. Sự
tái hoạt động này có thể đƣợc cảm ứng trên cây nguyên bằng cách đàn áp các hiệu
ứng cản tƣơng quan (gỡ ƣu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy
nhờ các môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa thích hợp. Theo Buvat, có

9


hai giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hóa và giai
đoạn tái phân hóa [11].
Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ
quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ
cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lạp thể phân chia thành các bóng nhỏ).
Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trƣớc khi bắt đầu giai đoạn khử phân hóa: mất
dần tinh bột dự trữ trong các lạp hoặc tích lũy tinh bột dự trữ và một số chất khác,
nhƣng sự tích lũy nhƣ vậy có thể làm chậm sự tạo mô phân sinh.
Sau đó là bƣớc chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang
trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Có sự phân chia không
bào thành những không bào nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất
đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to [15].
Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại
trạng thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng trải qua hai bƣớc: bƣớc một,
tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trƣơng nƣớc và hợp
thành không bào trung tâm, kích thƣớc tế bào gia tăng, ti thể dần trở về hình dạng
đặc trƣng; bƣớc hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào
chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tannin, tinh dầu…) đƣợc tổng hợp. Sau đó, các tế
bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà
không qua sự phân chia tế bào [11].

I.3.

Sự thu nhận hợp chất thứ cấp

I.3.1.

Giới thiệu

Ở thực vật có những chất đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc nên cơ
thể, những chất đó đƣợc gọi là những hợp chất sơ cấp. Gồm các polysaccharide,
đƣờng, protein và chất béo. Ngoài những chất đó ra, còn có những hợp chất khác có
nồng độ ít hơn (M≤ 1500 amu) đƣợc gọi là các hợp chất thứ cấp, gồm có alkaloid,
terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid. Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và
kích thƣớc và đƣợc tìm thấy trong nhiều loài thực vật khác nhau, mỗi loài có một

10


dẫn xuất khác nhau. Các hợp chất thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần
thiết cho sự sống của sinh vật [6].
Cho đến nay, ngƣời ta đã tìm thấy hơn 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực
vật khác nhau và hàng năm có một lƣợng lớn các chất mới đƣợc phát hiện thêm.
Nguồn gốc của các chất thứ cấp là các điểm cuối cùng của quá trình biến dƣỡng, với
chức năng ít chuyên biệt [18].
Các hợp chất thứ cấp có thể đƣợc sản xuất trong những tế bào đặc biệt nhƣ tế
bào tuyến tiết, lông tơ biểu mô... nơi mà chúng đƣợc tiết ra có chức năng nhƣ các
chất xua đuổi hay dẫn dụ. Một trong các chức năng dể nhận thấy nhất ở các chất thứ
cấp đó là có vai trò sinh vật hóa học trong cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại các tác
nhân gây bệnh và xâm hại.
I.3.2.

Phân loại

Các hợp chất thứ cấp bao gồm nhiều loại và đƣợc sắp xếp thành những nhóm
khác nhau. Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thƣờng không phải bởi một
định nghĩa duy nhất, cũng nhƣ ranh giới của một nhóm thƣờng không rõ ràng.
I.3.2.1. Alkaloid
Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ.
Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế
R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ.
I.3.2.2. Flavonoid
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật. Hơn một nữa
rau quả thƣờng dùng chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong
dƣợc liệu có nguồn gốc thực vật. Cho đến nay có khoảng 4000 chất đã đƣợc xác
định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol với nhóm thế là –OH hoặc –
OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38627 chất. Phần lớn các flavonoid có màu vàng
(flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím,
đỏ, một số khác không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có

11


một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhƣng lại có màu vàng nhƣ
carotenoid, antharanoid, xanthon.
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ
oxy hoa của mạch 3C. Ngƣời ta chia flavonoid thành: euflavonoid là các flavonoid
có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, neoflavonoid có gốc
aryl ở vị trí C-4. Ngƣời ta còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer,
triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà
phân tử có một phần cấu trúc ligan.

I.3.2.3. Saponin
Saponin còn gọi là saponoid do chữ latinh sapo có nghĩa là xà phòng, là một
nhóm glycoside lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Ngƣời ta cũng phân lập đƣợc
saponin trong động vật nhƣ hải sâm, cá sao.
Saponin có một số tính chất đặc biệt nhƣ: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt
nhiều khi lắc với nƣớc, có tác dụng nhũ tƣơng hóa và làm sạch; làm vỡ hồng cầu
ngay ở nồng độ rất loãng; độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô
đƣờng hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra còn có tác dụng diệt
các loài thân mềm nhƣ giun sán, ốc sên; kích thích niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.
Có tác dụng long đờm, lợi tiểu, có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid khác.
I.3.2.4. Hợp chất glycoside
Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và tất cả các bộ phận cây:
lá, vỏ, hạt…Các glycoside thƣờng là chất kết tinh và có vị đắng.
Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đƣờng và
phần không đƣờng thƣờng đƣợc gọi là aglycon. Dƣới tác dụng của enzyme thực vật
hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycoside bị thủy phân thành aglycon và phần mang
đƣờng:
 Phần đƣờng của glycoside: phần đƣờng phổ biến là D-glucose, Dgalactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuromic,
acid galacturonic và một số đƣờng khác.
12


 Phần aglycon của glycoside: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả
các hợp chất tự nhiên nhƣ: monoterpen, diterpen. Triterpen, steroid,
iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol…
I.3.2.5. Hợp chất phenol
Các hợp chất phenol dùng chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có vòng
benzene mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl – OH. Trong thiên nhiên, các
hợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng,
các polyphenol (ligin, tannin…).

Các hợp chất phenol dễ tan trong nƣớc vì chúng thƣờng hiện diện trong cây ở
dạng glycoside. Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể dựa vào đặc
điểm này để theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây. Các
hợp chất phenol thƣờng bị phân hủy do tác dụng của enzyme phenolase vốn luôn có
trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng để chiết tách do alcol nóng giúp hạn chế tác
dụng của enzyme này trong cây.
Sinh tổng hợp các hợp chất đã đƣợc biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid là
phenylalanin, tyrosin, tryptophan. Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản
ứng phức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp
chất pheno L.
I.3.2.6. Tinh dầu
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, đƣợc sử dụng nhƣ chất mùi, chất thơm
và dung môi. Giống nhƣ những lipid khác, các terpenoid không tan trong nƣớc.
Terpenoid đƣợc xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và đƣợc thiết lập từ nhiều đơn
vị isoprene, ví dụ monoterpen chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpen chứa 3 đơn vị
isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene .
Các con đƣờng tổng hợp nên hợp chất thứ cấp đƣợc trình bày trong sơ đồ sau:

13


Hình I.2: Các con đƣờng tổng hợp nên hợp chất thứ cấp.

I.3.3.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp

I.3.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp
chất có giá trị trong y dƣợc, gia vị, hƣơng liệu và màu nhuộm mà không thể sản

xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đƣờng hóa học. Những
14


năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thƣơng mại là
kết quả đƣợc mong đợi trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ƣu thế về mặt nguyên lý kỹ
thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách
chiết một tỉ lệ lƣợng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy.
Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất
thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái.Nhiều hợp chất thứ cấp đƣợc sản
xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng đƣợc tìm thấy trong các mô
có khả năng phân hóa cao nhƣ rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trƣởng
thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các hợp chất thứ cấp có khuynh
hƣớng ngƣng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân
hóa trong nuôi cấy huyền phù thƣờng tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào
ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trƣờng khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự
phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối tế bào để tạo thành các chất
thứ cấp .
I.3.3.2. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật
Sự tiến bộ vƣợt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hợp chất quý hiếm
mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thƣơng mại. Phƣơng pháp này sẽ mở rộng và tăng
khả năng thu hồi các chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô
nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ
cấp [12]. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đƣợc khởi xƣớng từ cuối những năm 60 của thế
kỷ 20 nhƣ là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực
vật. Kỹ thuật này đƣợc phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có
hoạt tính sinh học. Ƣu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên
tục và đáng tin cậy dựa trên những lí do sau:
 Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dƣới sự điều khiển

các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện thổ
nhƣỡng.

15


 Phủ định sự ảnh hƣởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ
cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng).
 Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp
khác nhau.
 Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trƣởng của tế bào và điều
hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lƣợng sản phẩm
tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy
nuôi cấy tế bào trong dung dịch huyền phù của thực vật cũng đƣợc
sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp.
Trong nuôi cấy tế bào, việc lựa chọn cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển
và điều kiện nuôi cấy tối ƣu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức
cao hơn. Để thu đƣợc hiệu suất cao cho khai thác thƣơng mại, ngƣời ta đã sử dụng
nhiều phƣơng pháp khác nhau trong nổ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động
sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy. Tế bào nuôi cấy tích lũy một lƣợng lớn hợp
chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt nhƣ:
 Chọn lựa thành phần môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp:
các thông số hóa học và vật lý nhƣ thành phần và pH môi trƣờng,
chất điều hòa sinh trƣởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc
hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hƣởng đến hàm lƣợng các hợp chất thứ
cấp đã đƣợc nghiên cứu nhiều [17]. Một vài sản phẩm tích lũy trong
tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi đƣợc
nuôi cấy ở điều kiện tối ƣu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh
dƣỡng trong một mẻ có thể gần nhƣ là yếu tố cơ bản cho việc tối ƣu
hóa hiệu suất nuôi cấy.

 Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao: các tế bào thực vật trong
nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế
bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong
nuôi cấy đã đƣợc Berlin và Susse công bố năm 1985, và sau đó
phƣơng thức này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng
16


tế bào của cây Bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích
lũy gấp khoảng 7 lần lƣợng anthocyanin đƣợc sản xuất từ nuôi cấy
tế bào mẹ [36]. Yamada và Sato (1982) đã chọn lọc đƣợc một dòng
tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trƣởng gấp 6 lần sau 3
tuần nuôi cấy và hàm lƣợng biberin đạt tới 1,2g/ L.
 Bổ sung tiền chất nuôi cấy: cung cấp tiền chất của quá trình sinh
tổng hợp nội bào vào môi trƣờng nuôi cấy cũng có thể tăng lƣợng
sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng
bắt đầu sinh tổng hợp nên hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng cƣờng
sản phẩm cuối cùng. Phƣơng pháp này hữu ích khi dùng các tiền
chất có giá thành rẻ. Tăng cƣờng kích thích hoặc bổ sung tiền chất
hoặc các hợp chất tƣơng tự mang lại hiệu quả trong nhiều trƣờng
hợp [29]. Chẳng hạn, bổ sung phenylalaninkhi nuôi cấy tế bào trong
dung dịch huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra
rosmarinic acid, cung cấp feluric acid trong môi trƣờng nuôi cấy cây
Vanilla planifolia đã tăng tích lũy vanilin, hoặc bổ sung leucine dẫn
đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla
frutiscens.
 Cảm ứng sự phân hóa mô: dịch treo tế bào thƣờng đƣợc sử dụng
đểthu nhận các sản phẩm thứ cấp. Tuy nhiên, gần đây nhiều nghiên
cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô đã phân hóa nhƣ
nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ… nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp.

Các nghiên cứu chứng minh rằng có mối quan hệ mật thiết giữa sản
xuất hợp chất thứ cấp với sự phân hóa tế bào và sự phát sinh hình
thái của thực vật.
 Cố định tế bào: trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận
các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử
dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng sinh học. Mặt khác,
những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trƣờng hơn so
với tế bào tự do. Tế bào cố định thƣờng là những tế bào có khả năng
17