Bước đầu ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự hỗ trợ định danh một số loài ong ký sinh dựa trên các gen đích 16s rRNA và COI
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.25 MB, 143 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR –
GIẢI TRÌNH TỰ HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT
SỐ LOÀI ONG KÝ SINH DỰA TRÊN CÁC GEN
ĐÍCH 16S rRNA VÀ COI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG
SVTH: NGUYỄN DUY HẠNH
MSSV: 1153010210
KHÓA: 2011-2015
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR –
GIẢI TRÌNH TỰ HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT
SỐ LOÀI ONG KÝ SINH DỰA TRÊN CÁC GEN
ĐÍCH 16S rRNA VÀ COI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
Chữ ký GVHD
GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG
SVTH: NGUYỄN DUY HẠNH
MSSV: 1153010210
KHÓA: 2011-2015
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05. Năm 2015
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào không gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong 4 năm học
vừa qua nếu không có sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè thì
em nghĩ em sẽ không có thành công như ngày hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn cô Lê Huyền Ái Thúy và cô Trương Kim Phượng,
Người đã tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài khóa luận.
Trong thời gian làm việc với cô, em không những tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích
mà còn học tập được tinh thần làm việc nghiêm túc, sáng tạo, hiệu quả từ cô. Nếu
không có sự động viên và giúp đỡ của cô thì em nghĩ sẽ không hoàn thành được bài
khóa luận tốt nghiệp này. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn cô.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu nhà trường Đại Học Mở Tp.HCM
cũng như quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học với tâm huyết và nền kiến thức của
mình đã tận tâm dạy bảo em trong suốt 4 năm học.
Bên cạnh đó em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh Đạo cơ sở 3 và Thầy Cô phụ
trách phòng thí nghiệm sinh học phân tử đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
quá trình làm đề tài tại phòng thí nghiệm và cơ sở.
Em cũng không quên gửi lời cảm ơn đến các anh chị khóa 2010 cũng như bạn bè
cùng khóa đã hỗ trợ em trong quá trình làm đề tài.
Cuối cùng con xin cảm ơn Ba Mẹ, Người đã luôn động viên, giúp đỡ con trong
suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường.
Trân trọng.
Tp. Hồ Chí Minh, ngà 27 tháng 05 năm 2015
Nguyễn Duy Hạnh
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang i
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
bp
Base Pair
DNA
Deoxyribonucleic Acid
NCBI
National Center Biotechnology Information
PCR
Polymerase Chain Reaction
rRNA
Ribosomal Ribonucleic acid
Tm
Nhiệt độ nóng chảy
COI
Cytochrome Oxidase I
HTPL
Hệ Thống Phân Loại
CboL
Consortium for Barcode of Life
dNTP
Deoxyribomucleoside triphotphate
IDT OligoAnalyzer
Integrated DNA technologies OligoAnalyzer
MEGA
Molecular Evolutionary Genetics Analysis
mtDNA
Mitochondrial deoxyribonucleic acid
Nucleotide
Nucleotide
PCR
Polymerase Chain Reaction
OTUs
Operational taxonomic units
NJ
Neighbour-Joining
ML
Maximum likelihood
MP
Maximum parsinomy
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang ii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC BẢNG
Bảng III.1: Bộ trình tự gen COI và gen 16S rRNA của các loài ong ký sinh thu thập từ
nguồn dữ liệu Genbank (NCBI) ..................................................................................... 31
Bảng III.2. Bộ trình tự kết hợp 2 gen COI và 16S rRNA của một số loài ong ký thu thập
từ nguồn dữ liệu GenBank (NCBI) ................................................................................ 37
Bảng III.3. Trình tự mồi khảo sát ................................................................................... 39
Bảng III.4. Thông số khảo sát cặp mồi CO1490F - CO2198R trên
IDT analyzer ................................................................................................................... 41
Bảng III.5. Thông số khảo sát cặp mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R trên IDT analyzer ... 49
Bảng III.6. Kết quả đo mật độ quang các huyền dịch DNA của mẫu
ong ký sinh ..................................................................................................................... 56
Bảng III.7. Kết quả thiết lập chu kỳ nhiệt PCR khuếch đại các vùng gen COI của các
mẫu ong ký sinh ............................................................................................................. 58
Bảng III.8. Kết quả thiết lập chu kỳ nhiệt PCR khuếch đại các vùng gen COI của các
mẫu ong ký sinh ............................................................................................................. 60
Bảng III.9. Mức độ tương đồng của trình tự IS1_COI_F với các trình tự gen COI trên
NCBI của các loài ong ký sinh thuộc họ Braconidae .................................................... 62
Bảng III.10: Mức độ tương đồng của IS2_COI_F với các trình tự gen COI trên NCBI
của các loài ong ký sinh thuộc họ Braconidae............................................................... 63
Bảng III.11. Mức độ tương đồng của IS1_16S_F với các trình tự gen 16S trên NCBI
của các loài ong ký sinh thuộc họ Braconidae............................................................... 64
Bảng III.12. Mức độ tương đồng của IS2_16S_F với các trình tự gen 16S trên NCBI
của các loài ong ký sinh thuộc họ Braconidae............................................................... 65
Bảng III.13. Giá trị Bootstrap của 9 cây phát sinh loài ................................................ 104
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang iii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC HÌNH
Hình I.1: Đặc điểm cấu tạo côn trùng .............................................................................. 5
Hình I.2. Loài Pimpla thuộc họ Ong Cự .......................................................................... 8
Hình I.3. Loài Cotesia thuộc nhóm Ong Kén Nhỏ .......................................................... 9
Hình I.4. Loài Brachymeria podagrica thuộc nhóm Ong Nhỏ ........................................ 9
Hình I.5. Loài Tricograma thuộc nhóm Ong Mắt Đỏ .................................................... 10
Hình I.6. Loài Encyrtus aurantii thuộc nhóm Ong Nhảy Nhỏ ...................................... 10
Hình I.7. Loài Cirrospilus thuộc nhóm Ong Nhỏ Râu Ngắn ......................................... 11
Hình I.8. Loài Miscogatrinae thuộc nhóm Ong Xanh Nhỏ ........................................... 11
Hình III.1. Kết quả Blast mồi CO1490F ........................................................................ 42
Hình III.2. Kết quả Blast mồi CO2198R ....................................................................... 42
Hình III.3: Kết quả kiểm tra vị ví bắt cặp của mồi CO1490F - CO2198R với trình tự
của Venturia Canescens ................................................................................................. 43
Hình III.4: Kết quả Blast mồi CO1490F - CO2198R với trình tự của Cotesia Vestalis 44
Hình III.5: Kết quả Blast mồi CO1490F - CO2198R với trình tự của
Diachasmimorpha Longicaudata ................................................................................... 45
Hình III.6: Kết quả Blast mồi CO1490F - CO2198R với trình tự của Macrocentrus
Camphoraphilus ............................................................................................................. 46
Hình III.7: Kết quả Blast mồi CO1490F - CO2198R với trình tự của Phanerotoma
Flava............................................................................................................................... 47
Hình III.8: Kết quả Blast mồi CO1490F - CO2198R với trình tự của Spathius Agrili . 48
Hình III.9. Kết quả Blast mồi 16S_outer_F ................................................................... 50
Hình III.10. Kết quả Blast mồi 16S_Wb_R ................................................................... 50
Hình III.11. Kết quả Blast mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R với trình tự của Aphidius
gifuensis .......................................................................................................................... 51
Hình III.12. Kết quả Blast mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R với trình tự của Cotesia
vestalis ............................................................................................................................ 52
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang iv
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Hình III.13. Kết quả Blast mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R với trình tự của
Diachasmimorpha longicaudata .................................................................................... 53
Hình III.14. Kết quả Blast mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R với trình tự của Macrocentrus
camphoraphilus .............................................................................................................. 54
Hình III.15. Kết quả Blast mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R với trình tự của Spathius
agrili ............................................................................................................................... 55
Hình III.16. Hình thái ong ký sinh được sử dụng tách chiết .......................................... 56
Hình III.17. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi CO1490F/CO2198R ở 3 nhiệt độ
........................................................................................................................................ 57
Hình III.18. Kết quả khuếch đại vùng gen COI của DNA mẫu ong ký sinh IS1 và IS258
Hình III.19. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi 16S_outer_F/16S_Wb_R ở 3
nhiệt độ ........................................................................................................................... 59
Hình III.20. Kết quả khuếch đại vùng gen 16S rRNA của DNA mẫu ong ký sinh IS1 và
IS2 .................................................................................................................................. 60
Hình III.21. Kết quả Blast trình tự gen COI của mẫu IS1 trên GenBank ...................... 62
Hình III.22. Kết quả Blast trình tự gen COI trên của IS2 trên GenBank ....................... 63
Hình III.23. Kết quả Blast trình tự gen 16S rRNA của mẫu IS1 trên GenBank ............. 64
Hình III.24. Kết quả Blast trình tự gen 16S rRNA của mẫu IS2 trên GenBank ............. 65
Hình III.25. Hiệu chỉnh vùng trình tự IS1_COI_FA của sản phẩm giải trình tự IS1 .... 67
Hình III.26. Hiệu chỉnh vùng trình tự IS1_COI_FB-1 của sản phẩm giải trình tự IS1 . 68
Hình III.27. Hiệu chỉnh vùng trình tự IS1_COI_FB-2 của sản phẩm giải trình tự IS1 . 69
Hình III.28. Hiệu chỉnh vùng trình tự IS1_COI_FB-3 của sản phẩm giải trình tự IS1 . 70
Hình III.29. Hiệu chỉnh vùng IS1_COI_FC trên mẫu IS1. ............................................ 71
Hình III.30. Kết quả Blast trình tự IS1_COI_F_P ......................................................... 72
Hình III.31. Hiệu chỉnh trình tự IS2_COI_FA trên mẫu IS2 ......................................... 73
Hình III.32. Hiệu chỉnh trình tự IS2_COI_FB-1 trên mẫu IS2 ...................................... 74
Hình III.33. Hiệu chỉnh trình tự IS2_COI_FB-2 trên mẫu IS2 ...................................... 75
Hình III.34. Hiệu chỉnh trình tự IS2_COI_FB-3 trên mẫu IS2 ...................................... 76
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang v
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Hình III.35: Hiệu chỉnh vùng IS2_COI_FC của mẫu IS 2............................................. 77
Hình III.36. Kết quả Blast trình tự IS2_COI_F_P trên NCBI ....................................... 78
Hình III.37. Hiệu chỉnh trình tự IS1_16S_FA (phần đầu trình tự) của sản phẩm IS1 ... 80
Hình III.38. Hiệu chỉnh trình tự IS1_16S_FB-1 (phần đầu trình tự) của sản phẩm IS1 82
Hình III.39. Hiệu chỉnh trình tự IS1_16S_FB-2 (phần đầu trình tự) của sản phẩm IS1 83
Hình III.40. Hiệu chỉnh trình tự IS1_16S_FC của sản phẩm IS1 .................................. 84
Hình III.41. Kết quả Blast trình tự IS1_16S_F sau khi hiệu chỉnh ................................ 85
Hình III.42. Hiệu chỉnh trình tự IS2_16S_FA của mẫu IS2 .......................................... 86
Hình III.43. Hiệu chỉnh trình tự IS2_16S_FB của sản phẩm IS2 .................................. 88
Hình III.44: Hiệu chỉnh trình tự IS2_16S_FC của sản phẩm IS2 .................................. 89
Hình III.45: Kết quả Blast trình tự IS2_16S_F sau khi hiệu chỉnh trên NCBI .............. 90
Hình III.46. Cây NJ được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên gen COI ............................ 92
Hình III.47. Cây ML được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên gen COI .......................... 93
Hình III.48. Cây MP được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên gen COI .......................... 94
Hình III.49.Cây NJ được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên gen 16S rRNA ................... 96
Hình III.50. Cây ML được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên gen 16S rRNA ................. 97
Hình III.51. Cây MP được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên gen 16S rRNA ................. 98
Hình III.52. Cây NJ được xây dựng từ bộ trình tự dựa trên 2 gen COI và
gen 16S rRNA ............................................................................................................... 100
Hình III.53:. Cây ML được xây dựng bộ trình tự dựa trên 2 gen COI và gen
16S rRNA ...................................................................................................................... 101
Hình III 54. Cây MP được xây dựng bộ trình tự dựa trên 2 gen COI và gen
16S rRNA ...................................................................................................................... 102
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang vi
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................iv
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 4
I.1. SƠ LƯỢC VỀ CÔN TRÙNG ................................................................................ 4
I.1.1. Khái niệm côn trùng ......................................................................................... 4
I.1.2. Cấu tạo côn trùng ............................................................................................. 4
I.1.3. Đặc điểm sinh lý .............................................................................................. 5
I.2. PHÂN LOẠI CÔN TRÙNG ................................................................................. 7
I.3. BỘ CÁNH MÀNG (HYMENOPTERA) ................................................................. 7
I.3.1. Một số họ thuộc bộ Cánh Màng: ...................................................................... 8
I.3.1.1. Họ Ong Cự (Icheneumonidae) ...................................................................... 8
I.3.1.2. Họ Ong Kén Nhỏ (Braconidae) .................................................................... 8
I.3.1.3. Họ Ong Nhỏ (Chalcididae) ........................................................................... 9
I.3.1.4. Họ Ong Mắt Đỏ (Trichogrammatidae) ....................................................... 10
I.3.1.5. Họ Ong Nhảy Nhỏ (Encyrtidae) ................................................................. 10
I.3.1.6. Họ Ong Nhỏ Râu Ngắn (Eulophidae) ......................................................... 11
I.3.1.7. Ong Xanh Nhỏ (Pteromalidae) ................................................................... 11
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang vii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
I.4. HỌ BRACONIDAE ............................................................................................... 12
I.5. ĐỊNH DANH CÔN TRÙNG ............................................................................... 12
I.6. TỔNG QUAN VỀ GEN COI VÀ GEN 16S rRNA .............................................. 13
I.6.1. Gen COI ......................................................................................................... 13
I.6.2. Gen 16S rRNA ................................................................................................ 13
I.7. NGHIÊN CỨU PHÁT SINH LOÀI ..................................................................... 14
I.7.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài ............................................. 14
I.7.2. Các bước xây dựng cây phát sinh loài ........................................................... 16
I.7.3. Một số phương pháp dựng cây phát sinh loài ................................................ 20
I.7.4. Giá trị Bootstrap ............................................................................................. 21
I.8. Các phương pháp sinh học phân tử ...................................................................... 21
I.8.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) [3] .......................................................... 21
I.8.2. Điện di ............................................................................................................ 22
I.8.3. Giải trình tự .................................................................................................... 22
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 24
II.1. Vật liệu ................................................................................................................ 24
II.1.1. Mẫu Ong ký sinh .......................................................................................... 24
II.1.2. Dụng Cụ - Thiết Bị - Hóa Chất..................................................................... 24
II.1.2.1. Dụng cụ ...................................................................................................... 24
II.1.2.2. Thiết bị ....................................................................................................... 24
II.1.2.3. Hóa Chất .................................................................................................... 24
II.1.2.4. Các phần mềm và trang web trực tuyến: ................................................... 25
II.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 25
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang viii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
II.2.1. Thu nhận trình tự gen ................................................................................... 26
II.2.2. Đánh giá mồi................................................................................................. 26
II.2.3. Tách chiết DNA từ mẫu ong ký sinh ............................................................ 27
II.2.3.1. Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách chiết ...................................................... 27
II.2.4. PCR (polymerase chain reaction) ................................................................. 28
II.2.4.1. Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng PCR .................................................. 28
II.2.4.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................................ 28
II.2.4.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ................................................................ 28
II.2.5. Điện Di .......................................................................................................... 29
II.2.6. Giải trình tự ................................................................................................... 29
II.2.7. Hiệu chỉnh trình tự ........................................................................................ 29
II.2.8. Phân tích phả hệ phân tử ............................................................................... 30
II.2.8.1. Xây dựng bộ dữ liệu DNA......................................................................... 30
II.2.8.2. Phân tích phả hệ phân tử ............................................................................ 30
PHẦN III. KẾT QUẢ .................................................................................................... 31
III.1. Khảo sát in silico ............................................................................................... 31
III.1.1. Thu thập trình tự .......................................................................................... 31
III.2. Thu thập bộ mồi ................................................................................................. 38
III.3. Khảo sát và đánh giá mồi................................................................................... 40
III.3.1. Kết quả khảo sát bộ mồi CO1490F - CO2198R......................................... 40
III.3.1.1. Khảo sát thông số vật lý cặp mồi CO1490F - CO2198R ........................ 40
III.3.1.2. Kết quả kiểm tra vị trí cặp mồi CO1490F - CO2198R với một số trình tự
của họ Braconidae ................................................................................................... 42
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang ix
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
III.3.2. Kết quả khảo sát bộ mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R ................................... 49
III.3.3. Khảo sát thông số vật lý cặp mồi 16S_outer_F/ 16S_Wb_R ...................... 49
III.3.3.1. Kết quả kiểm tra cặp mồi 16S wb/ 16S outer với một số trình tự của họ
Braconidae ............................................................................................................... 51
III.4. KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM .......................................................................... 56
III.4.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ........................................................................... 56
III.4.2. Kết quả khuếch đại vùng gen COI của cặp mồi CO1490F - CO2198R ... 57
III.4.3. Kết quả khuếch đại vùng gen 16S rRNA của cặp mồi 16S_outer_F/
16S_Wb_R .............................................................................................................. 59
III.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ............................................................................. 61
III.6. KẾT QUẢ HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ .............................................................. 66
III.6.1. Kết quả hiệu chỉnh trình tự gen COI ........................................................... 66
III.6.1.1. Kết quả hiệu chỉnh trình tự IS1_COI_F ................................................... 66
-
Vùng IS1_COI_FA ........................................................................................... 66
-
Vùng IS1_COI_FB ........................................................................................... 68
-
Vùng IS1_COI_FC ........................................................................................... 70
III.6.1.2. Hiệu chỉnh trình tự IS2_COI_F ................................................................ 72
-
Vùng IS2_COI_FA ........................................................................................... 72
-
Vùng IS2_COI_FB ........................................................................................... 74
-
Vùng IS2_COI_FC ........................................................................................... 77
III.6.2. Kết quả hiệu chỉnh trình tự gen 16S rRNA ................................................. 78
III.6.2.1. Hiệu chỉnh trình tự IS1_16S rRNA_F...................................................... 78
III.6.2.2. Hiệu chỉnh trình tự IS2_16S_F ................................................................ 85
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang x
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
III.7. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI.......................................... 90
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................ 105
IV.1. Kết luận............................................................................................................ 105
IV.2. Đề nghị ............................................................................................................ 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 107
PHẦN V. PHỤ LỤC .................................................................................................... 114
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang xi
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, sử dụng thiên địch trên đồng ruộng nhằm kiểm soát sâu hại đặc
biệt là những loài sâu hại có khả năng kháng thuốc trừ sâu là một trong những mục
tiêu phát triển nền nông nghiệp bền vững [1]. Việc ứng dụng các loài thiên địch, đặc
biệt là các loài ong ký sinh nhằm tiêu diệt côn trùng, sâu hại đã và đang góp phần
quan trọng vào việc đáp ứng mục tiêu sản xuất rau an toàn theo tiêu chuẩn VietGap
ở Việt Nam [1].
Ong ký sinh thuộc họ Braconidae là một trong những nhóm có số lượng loài
phong phú nhất trong bộ cánh màng (Hymenoptera) [4]. Họ ong ký sinh Braconidae
có khoảng 17532 loài [59, 4]. Một số công trình nghiên cứu sự phân loại côn trùng,
cụ thể là phân loại ong ký sinh thường dựa vào đặc điểm hình thái (morphology)
[41]. Hiện nay, có rất nhiều các hệ thống phân loại côn trùng dựa vào đặc điểm hình
thái với các phương pháp thực hiện khác nhau. Tuy nhiên, công tác phân loại
thường gặp khó khăn (không phân tích được các mối quan hệ ở mức dưới họ), kết
quả định danh không đồng thuận với nhau giữa các công trình nghiên cứu [42, 58,
41].
Một số kỹ thuật phân tử (PCR, giải trình tự ...) dựa trên các vùng gen (16S
rRNA, 28S rRNA, COI) được áp dụng trong việc phân tích phát sinh loài, xác định
đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hóa hoặc định danh côn trùng (ong ký sinh)
[41].
Gen COI (cytochrome oxidase I) là gen thường trực trong bộ gen DNA ty
thể, là một “Barcode” phổ biến dùng để phân loại các loài động vật nói chung, côn
trùng nói riêng [41]. Gen COI (cytochrome oxidase I) có chức năng mã hóa cho tiểu
đơn vị I của cytochrome oxidase, được ứng dụng trong những nghiên cứu về phân
tích mức độ tiến hóa ở ong ký sinh [40].
Công trình nghiên cứu của Hebert và cộng sự (2004) dựa trên vùng gen COI
đã định danh được các loài bướm (Fulgerator Astraptes) [26, 54]. Công bố khoa
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
học của Kruse và Sperling (2002) phân tích đặc điểm di truyền phân tử dựa trên
những phân đoạn trình tự gen COI, đã xác định được cấu trúc phân loại hệ chi
thuộc Tortricidae [34, 33, 54]. Công trình nghiên cứu điển hình của Schroeder &
Degen (2008) xác định được cấu trúc quần thể Tortricid dựa trên vùng gen COI
[55, 54]. Công trình nghiên cứu của Raowski và Tarcz (2012) xác định mối quan hệ
của bộ Bactrini và Endotheniini dựa trên sự phân tích trình tự gen COI [54, 11].
Gen 16S rRNA được ghi nhận là một marker phân tử hữu ích nhằm phân tích
mối quan hệ ở mức phân họ và chi của ong ký sinh [59, 41, 44]. Gen 16S rRNA đã
được sử dụng rộng rãi ở các cấp độ khác nhau để xác định phát sinh loài ở côn
trùng, đặc biệt là trong bộ Hymenoptera [59, 11, 58, 44].
Kết quả nghiên cứu của Whitfield (1997) đã xác định sự tiến hóa của phân
họ Microgastrinae dựa vào sự phân tích đặc điểm phân tử trên vùng gen 16S RNA
[59, 11, 6]. Công trình nghiên cứu của Dowton và Austin (1998) dựa trên trình tự
vùng gen 16S rRNA và 28S rDNA cho thấy nguồn gốc tiến hóa của khu hệ phân họ
Microgastroids [11, 6]. Công bố điển hình của Min và cộng sự (2005) dựa trên
vùng trình tự 16S rRNA, 18S rRNA, 28S rRNA đã xác định mối quan hệ gần gũi của
các phân họ: Adelinae, Cheloninae, Miracinae, Microgastrinae và Cardiochilinae
[6].
Xuất phát từ những cơ sở khoa học nêu trên, chúng tôi thực hiện chuyên đề
khóa luận tốt nghiệp: “BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR – GIẢI
TRÌNH TỰ HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI ONG KÝ SINH DỰA
TRÊN CÁC GEN ĐÍCH 16S rRNA VÀ COI”
Mục tiêu :
-
Xác định đặc điểm di truyền phân tử trên gen COI và 16S rRNA của các loài
ong ký sinh bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự nhằm hỗ trợ
định danh một số loài ong ký sinh tập trung trên hai gen đích COI và 16S
rRNA.
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 2
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Nội dung nghiên cứu :
-
Khảo sát dữ liệu:
Thu thập các công bố khoa học về đặc điểm di truyền của các loài ong ký
sinh dựa trên vùng gen COI, 16S rRNA ứng dụng.
Kỹ thuật PCR, giải trình tự trong các hướng nghiên cứu về phát sinh loài
côn trùng, đặt biệt là các loài ong ký sinh trên công cụ Google và NCBI (các công
bố đến năm 2015).
-
Khảo sát in silico
Thu thập trình tự gen COI, 16S RNA trên Genbank của NCBI.
Thu thập, khảo sát, đánh giá bộ mồi đặc hiệu, chuyên biệt trên vùng gen
COI, 16S rRNA nhằm xác định đặc tính di truyền ong ký sinh.
-
Khảo sát thực nghiệm
Thực hiện quy trình PCR giải trình tự, phân tích phả hệ phân tử dựa trên
gen COI và gen 16S rRNA của mẫu ong ký sinh.
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 3
PHẦN I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.1. SƠ LƯỢC VỀ CÔN TRÙNG
I.1.1. Khái niệm côn trùng
Côn trùng là động vật không xương sống có tên khoa học là Insecta hay
Hexapoda, thuộc ngành Tiết túc (Arthropoda) [2].
I.1.2. Cấu tạo côn trùng
Cơ thể côn trùng gồm 3 phần rõ rệt: đầu, ngực và bụng. (Hình I.1)
Phần đầu có 1 đôi râu đầu, miệng, 1 đôi mắt kép và 2-3 mắt đơn (một số loài
không có mắt đơn). Râu đầu, mắt kép, mắt đơn là cơ quan cảm giác. Miệng là cơ
quan thu nhận thức ăn. Vì vậy, đầu là trung tâm cảm giác và thu nhận thức ăn.
Trên bề mặt vỏ đầu có các ngấn là đường lõm xuống của da tạo nên. Phần lõm vào
trong đó được gọi là sống nổi trong. Các sống nổi này để cơ bám và tăng thêm độ
cứng của vỏ đầu. Các ngấn phân chia vỏ đầu thành các khu và các mảnh, như khu
trán - chân môi, khu cạnh - đỉnh đầu, khu ót, khu ót sau, khu dưới má, và đặc biệt
môi trên và lưỡi cũng là một mảnh của vỏ đầu tạo thành. Trên đỉnh đầu ở giai
đoạn ấu trùng thấy rất rõ ngấn lột xác hình chữ Y ngược [2].
Phần ngực là trung tâm vận động của cơ thể côn trùng gồm có 3 đốt, mỗi đốt
có 1 đôi chân ngực và thời kỳ trưởng thành có thể có 2 đôi cánh: đôi cánh trước ở
đốt ngực giữa, đôi cánh sau ở đốt ngực sau. Nếu chỉ có một đôi cánh như ruồi,
muỗi thì đôi cánh sau thoái hoá và biến đổi thành một cấu tạo hình chùy làm
nhiệm vụ giữ thăng bằng khi bay. Côn trùng có ba đốt ngực được gọi là đốt ngực
trước, đốt ngực giữa và đốt ngực sau, gắn chặt với nhau. Mỗi đốt ngực do 4 mảnh
là mảnh lưng, mảnh bụng và 2 mảnh bên gắn chặt với nhau tạo nên. Mỗi đốt ngực
có một đôi chân có tên tương ứng là chân trước, chân giữa và chân sau [2].
Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn nằm ở cuối bụng.
Da côn trùng chia ra 3 lớp: lớp biểu bì, lớp tế bào nội bì và lớp màng đáy.
Da côn trùng là bộ xương ngoài giữ cho cơ thể có hình dạng nhất định, là chỗ cho
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 4
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
cơ bám vào, ngăn ngừa sự bốc hơi nước trong cơ thể côn trùng, bảo vệ cho các cơ
quan bên trong tránh được những tổn thương cơ giới, sự xâm nhập của vi sinh vật
và các chất có hại. Trên da có nhiều cơ quan cảm giác nên cũng là nơi thu nhận
các kích thích bên ngoài vào cơ thể côn trùng. Da côn trùng có màu sắc rất đa
dạng, tạo nên do 3 loại màu sắc cơ bản là: màu sắc hoá học, màu sắc vật lý và màu
sắc hỗn hợp. Màu sắc hoá học trên cơ thể côn trùng do các sắc tố tạo nên, có
nguồn gốc từ nguồn dinh dưỡng : clorofin, caroten, antoxin, flavones và dẫn xuất
của clorofin (hemoglobin). Màu sắc vật lý tạo nên do bề mặt da có các cấu tạo đặc
biệt (như có tầng sáp mỏng, các ngấn lồi lõm, các lông, vảy …), khi ánh sáng mặt
trời chiếu vào thì có hiện tượng khúc xạ, rồi phản xạ tạo nên màu sắc khác nhau.
Hình I.1: Đặc điểm cấu tạo côn trùng [2]
Chú thích: (1) Đầu; (2) Ngực; (3) Bụng; (4) Râu đầu; (5) Mắt kép; (6) Mắt
đơn; (7) Miệng; (8) Ngực trước; (9) Ngực giữa; (10) Ngực sau; (11) Chân trước;
(12) Chân giữa; (13) Cánh trước; (14) Cánh sau; (15) Chân sau; (16) Lỗ thính
giác; (17) Lỗ thở; (18) Lông đuôi; (19) Bộ phận sinh dục ngoài.
I.1.3. Đặc điểm sinh lý
Bộ máy tiêu hóa côn trùng bắt đầu từ miệng và kết thúc ở hậu môn. Ống tiêu
hoá chia làm 3 phần: ruột trước, ruột giữa và ruột sau. Ranh giới ruột trước và ruột
giữa là van Cacdia. Ranh giới ruột giữa và ruột sau là van Pilo. Các van Cacdia và
Pilo ngăn không cho thức ăn đi ngược chiều và điều hoà sự vận chuyển thức ăn
trong ruột [2].
Côn trùng hô hấp bằng hệ thống khí quản. hệ thống khí quản bắt đầu từ lổ thở
ở hai bên cơ thể được nối với nhau bằng các khí quản dọc và ngang, phân nhánh
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 5
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
đến các vi khí quản ở các tế bào của cơ thể. Ở khí quản hô hấp theo 2 cơ chế:
khuếch tán và thông khí qua lỗ thở [2].
Bộ máy tuần hoàn có chức năng làm cho máu lưu thông trong cơ thể. Chức
năng đó của côn trùng được thực hiện nhờ mạch máu lưng. Do cơ thể côn trùng nhỏ
bé, nên nhiệt sinh ra do hoạt động của các cơ quan, của các phản ứng oxi hoá luôn
bị tiêu hao rất lớn bởi sự toả nhiệt và truyền nhiệt. Tương quan giữa sản nhiệt và
tiêu nhiệt luôn thay đổi, nên thân nhiệt của côn trùng không ổn định. Nhiệt độ cơ
thể côn trùng phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường. Khi côn trùng hoạt động mạnh
như vẫy cánh khi bay nhiệt độ cơ thể có thể được nâng lên cao hơn nhiệt độ môi
trường 30 - 400C, nhưng khi dừng bay nhiệt độ cơ thể hạ xuống ngang nhiệt độ môi
trường [2].
Bộ máy bài tiết của côn trùng chủ yếu là các ống Malpighi, thể mỡ và các tế
bào đa nhân gọi là tế bào thận nằm xung quanh mạch máu lưng. Bộ máy bài tiết
của côn trùng có chức năng thải ra ngoài hoặc vào trong cơ thể những chất sản
sinh ra trong quá trình trao đổi chất. Những chất bài tiết ra ngoài chủ yếu là các
hợp chất có chứa nitơ sản sinh ra do oxy hóa protein, đồng thời thải ra ngoài
những chất thừa trong cơ thể như axit oxalic, axit photphoric, các ion Ca++ và Na+
[2].
Bộ máy thần kinh của côn trùng có cấu tạo phức tạp và chia thành: thần kinh
trung ương, thần kinh ngoại vi và thần kinh giao cảm. Bộ máy thần kinh của côn
trùng có chức năng điều hoà hoạt động của mọi cơ quan trong cơ thể để các hoạt
động đó hướng theo một mục đích thống nhất, làm cho cơ thể là một khối thống
nhất hoàn chỉnh, phản ứng hợp lý mọi tín hiệu của môi trường bên ngoài, đảm bảo
cho sự tồn tại của cá thể. Như vậy, vai trò của bộ máy thần kinh là chỉ huy mọi
hoạt động sống trong cơ thể côn trùng [2].
Trong quá trình sinh trưởng phát dục, côn trùng có các dạng biến thái bên
trong và bên ngoài [2].
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 6
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
I.2. PHÂN LOẠI CÔN TRÙNG [2]
Số lượng các bộ của lớp côn trùng khác nhau tuỳ theo hệ thống phân loại
của từng tác giả. Điển hình như hệ thống phân loại (HTPL) của Carl von Linne
(1758) chia thành 7 bộ; HTPL của J. C. Fabricius (1775) chia thành 13 bộ; HTPL
của Brauer (1885) chia thành 17 bộ; HTPL của Sharp (1895) chia thành 21bộ;
HTPL của Shipley và Borner (1904) chia thành 22 bộ; HTPL của Tillyard (1926)
và Imms (1944) chia thành 24 bộ; HTPL của Comstock (1925) và Svanvich
(1949) chia thành 25 bộ; HTPL của Crampton (1935) và Ross (1948) chia thành
28 bộ; HTPL của Plavonsikop (1950) chia thành 29 bộ; HTPL của Weber (1949)
và Chu Nghiêu (1950) chia thành 31 bộ; HTPL của Handlirsch (1925) và Essig
(1947) chia thành 33 bộ; HTPL của Brues & Melander (1932) và Thái Bang Hoa
(1955) chia thành 34 bộ; HTPL của Wardle (1936) và Mactưnop (1949) chia
thành 40 bộ.
Hiện nay, các nhà côn trùng học thường áp dụng hệ thống phân loại của
Weber (1949) và Chu Nghêu (1950), chia lớp côn trùng làm 31 bộ [2].
I.3. BỘ CÁNH MÀNG (HYMENOPTERA)
Bộ Cánh Màng là một trong những nhóm loài côn trùng lớn nhất, bao gồm
hơn 100.000 loài đã được mô tả [36, 12]. Chúng được xem là một trong những
nhóm côn trùng ký sinh lớn nhất kể cả về số lượng loài và sự đa dạng về ký chủ
[35, 10].
Bộ Cánh Màng là một trong những loài có sự đa dạng sinh học cao nhất, bao
gồm các loài ăn thức ăn là cây cỏ, và một loạt các loài ký sinh trùng [35, 12]. Các
loài ký sinh trùng có sự đa dạng đặc biệt, bao gồm các loài ngoại ký sinh và nội ký
sinh. Sinh sống bằng nhiều hình thức khác nhau như sống đơn độc hay sống theo
bày đàn hoặc một số loài ký sinh sống nhờ vào cá thể khác [12].
Trong số các loài côn trùng có ích, các loài ong ký sinh thuộc bộ Cánh
Màng (Hymenoptera) có số lượng rất lớn, nhiều loài có vai trò quan trọng trong
việc kiềm hãm số lượng côn trùng gây hại cho cây trồng [12].
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 7
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Trong số nhóm loài ong ký sinh thuộc bộ Cánh Màng, Ichneumonoidea và
Chalcidoide là hai nhóm loài đặc biệt phong phú [43]. Ở pha sâu non của các côn
trùng gây hại, ong ký sinh thuộc họ Braconidae chiếm tới 15.000 loài, trong đó,
riêng các loài ong ký sinh kén trắng giống Apanteles Foerter (Braconidae :
Microgastrinae) có gần 1.300 loài [4].
I.3.1. Một số họ thuộc bộ Cánh Màng [2]
I.3.1.1.Họ Ong Cự (Icheneumonidae)
Họ Ong Cự là một trong những họ lớn nhất của các lớp côn trùng, hiện diện
hầu như ở khắp nơi, riêng ở Bắc Mỹ đã ghi nhận có trên 3.100 loài.
Ong Cự có thể tấn công nhiều loại ký chủ, phần lớn các loài thuộc nhóm nội
sinh trên ấu trùng hoặc sâu non của côn trùng thuộc cách vẩy và cánh cứng. Các
loài thường gặp như: Cremastus, Metopius, Pimpla, Campolex, Xanthopimpla.
Đặc điểm hình thái: cơ thể dài, mảnh khảnh, có râu dài (thường có từ 6 đốt
trở lên), có 2 đốt chuyển và thiếu 1 buồng Costal ở cánh trước. Cánh trước có hai
mạch quay tạo thành 3 buồng giữa nhỏ (buồng M1 và M2 cách nhau bởi 1 mạch
quay). Bụng có 7 - 8 đốt dài và hẹp, phía trước đốt bụng phía trước thon nhỏ như
một cái cuống. ống đẻ trứng khá dài, thường dài hơn chiều dài cơ thể.
Hình I.2. Loài Pimpla thuộc họ Ong Cự [61]
I.3.1.2.Họ Ong Kén Nhỏ (Braconidae)
Ong Kén Nhỏ là họ lớn của bộ cánh màng. Tập quán ký sinh giống với Ong
Cự nhưng khác với ong cự là nhóm này thường kéo kén hóa nhộng bên ngoài cơ
thể ký chủ.
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 8
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đặc điểm hình thái: có kích thước nhỏ ít khi vượt quá 15 mm chiều dài,
phần lớn cơ thể trong mạnh và chắc hơn ong cự. Cánh trước thiếu một buồng
costal, chỉ có một mạch quay.
Hình I.3. Loài Cotesia thuộc nhóm Ong Kén Nhỏ [61]
I.3.1.3. Họ Ong Nhỏ (Chalcididae)
Họ Ong Nhỏ là họ lớn của bộ cánh màng. Phần lớn ký sinh trên những loại
côn trùng khác, tấn công chủ yếu trứng hay ấu trùng của bộ cánh vẩy, bộ hai cánh,
bộ cánh cứng và bộ cánh đều. Loài thường gặp: Ong Đùi To (Brachymeria
latusWalker).
Đặc điểm hình thái: có kích thước rất nhỏ, môt vài loài thuộc họ Mymaridae
có kích thước nhỏ hơn 0,5 mm. Phần lớn dài từ 2 - 3 mm, một số lài dài từ
10 - 15 mm (Leucospiridae). Có màu nâu hay đen pha trộn với những đốm vân
màu trắng hay vàng hoặc màu xanh kim loại. Phần lưng ngực hơi vồng lên, đốt
đùi chân sau thường phình to và có những răng lồi nhỏ. Đốt chày chân sau hơi
cong vào. Râu đầu có dưới 13 đốt.
Hình I.4. Loài Brachymeria podagrica thuộc nhóm Ong Nhỏ [61]
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 9
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
I.3.1.4. Họ Ong Mắt Đỏ (Trichogrammatidae)
Họ Ong Mắt Đỏ thường ký sinh trên bộ cánh vẩy [2].
Đặc điểm hình thái: có kích thước rất nhỏ (0,3 – 1 mm), bàn chân có 3 đốt
nên còn gọi là họ ong 3 đốt bàn. Cánh trước rộng, mặt cánh phủ nhiều lông rất
nhỏ, mịn, xếp thành hàng. Hệ thống mạch cánh rất thoái hóa, chỉ còn 1 - 2 mạch.
Cơ thể thường có màu vàng hay đỏ gụ. Râu đầu gấp dạng đầu gối, có 12 đốt.
Hình I.5. Loài Tricograma thuộc nhóm Ong Mắt Đỏ [61]
I.3.1.5.Họ Ong Nhảy Nhỏ (Encyrtidae)
Họ Ong Nhảy Nhỏ gồm khá nhiều loài, phân bố rộng, điển hình là Aphycus
chuyên ký sinh trên giống rệp sáp Cocus, ong Blastothrix chuyên ký sinh trên
Cocus và Pulvinaria.
Một số loài thuộc họ Ong Nhảy Nhỏ có vai trò phòng trừ rệp sáp hiệu quả:
Pseudophycus utilus Timb, Blastothrix sericae Dalm.
Đặc điểm hình thái: kích thước nhỏ 1 - 2 mm. Râu đầu có từ 8 - 12 đốt. Bàn
chân 5 đốt. Chân giữa phát triển, nhảy giỏi. Phần cuối đốt chày chân giữa có một
cựa lớn. Cánh trước thường có vân màu nâu hoặc màu đen [2].
Hình I.6. Loài Encyrtus aurantii thuộc nhóm Ong Nhảy Nhỏ [61]
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 10
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
I.3.1.6.Họ Ong Nhỏ Râu Ngắn (Eulophidae)
Họ Ong Nhỏ Râu Ngắn khá phổ biến, chỉ riêng tại Bắc Mỹ đã phát hiện trên
600 loài. Thuộc nhóm ký sinh cấp 2.
Đặc điểm hình thái: kích thước nhỏ (1 - 3 mm), râu đầu ngắn ít đốt. Bàn
chân có 4 đốt. Lông mịn trên mặt cánh không xếp thành hàng. Bụng thắt nhỏ phía
trước. Nhiều loài có màu sắc kim loại sáng. Rây đầu con đực có dạng răng lược.
Hình I.7. Loài Cirrospilus thuộc nhóm Ong Nhỏ Râu Ngắn [61]
I.3.1.7.Ong Xanh Nhỏ (Pteromalidae)
Đa số các loài thuộc họ Ong Xanh Nhỏ chủ yếu ký sinh trên sâu non và
nhộng của bộ cánh cứng và bộ cánh vẩy. Một số loài ký sinh trên sâu non của bộ
cánh màng và nhộng của bộ hai cánh. Cũng có loài ký sinh trên bộ cánh đều, bộ
cánh thẳng, bộ cánh mạch. Có thể ăn hoặc ký sinh trên trứng.
Thường gặp: ong Pteromalus puparum Linn ký sinh trên sâu xanh bướm
trắng, ong Lariophagus distingendus Forster ký sinh trên sâu non mọt gạo, ong
Dibrachys cavusWalker ký sinh trên sâu hồng hại bông.
Đặc điểm hình thái: kích thước nhỏ, màu đen hoặc màu xanh kim loại. Râu
đầu 13 đốt, bàn chân 5 đốt. Cuối hàm trên có 3 - 4 răng [2].
Hình I.8. Loài Miscogatrinae thuộc nhóm Ong Xanh Nhỏ [61]
SVTH: Nguyễn Duy Hạnh
Trang 11
