Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây bảy lá một hoa paris polyphylla var chinensis franchet thu thập tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------------------

Nguyễn Thị Duyên

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA
VAR. CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội, 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------------------

Nguyễn Thị Duyên

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA - PARIS POLYPHYLLA

VAR. CHINENSIS FRANCHET THU THẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Đỗ Thị Hà
2. GS. TS. Phạm Quốc Long

Hà Nội, 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự
hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Đỗ Thị Hà và GS.TS. Phạm Quốc Long. Các kết
quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình khoa
học nào khác.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Duyên


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà và GS.TS. Phạm
Quốc Long - những người Thầy (cô) đã giao đề tài và hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các Thầy cô Trường Đại học Công nghiệp, Đại học

Bách Khoa và Đại học Khoa học Tự nhiên - Hà Nội và các nhà khoa học Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
đã giảng dậy các môn học chuyển đổi, các chuyên đề và cho tôi đính hướng nghiên
cứu hiệu quả. Tôi xin chân thành cảm ơn các chị em công tác tại khoa Hóa thực
vật - Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ tôi và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt
quá trình làm thực nghiệm tại khoa.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Thị Hiền tại Phòng Thực nghiệm Dược
học Đại học Lund - Thụy Điển đã nhiệt tình giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu
về hoạt tính sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Xuân Phương, TS.
Nguyễn Thế Cường, ThS. Bùi Hồng Quang - Viên Sinh thái Tài nguyên - Viện Hàn
Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Ths. Nguyễn Quỳnh Nga - Khoa Tài
Nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu đã giúp tôi giám định tên khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã
hỗ trợ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận án.
Luận án này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ đề tài cơ sở Viện
Dược liệu do Ths. Nguyễn Thị Duyên làm chủ nhiệm, Quỹ L'oreal National Fellowship2016 và đề tài cấp Bộ Y tế năm 2017 do PGS. TS. Đỗ Thị Hà làm chủ nhiệm.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Duyên


MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................

1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN..........................................................................................

3

1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật chi Paris............................................................ 3
1.2. Công dụng của một số loài thuộc chi Paris........................................................

4

1.3. Thành phần hóa học chi
Paris.............................................................................

5

1.3.1. Các hợp chất saponin.................................................................................

5

1.3.1.1. Các hợp chất saponin steroid..........................................................

5

1.3.1.2. Các hợp chất saponin triterpenoid.................................................. 16
1.3.2. Các flavonoid............................................................................................. 16

1.3.3. Các hợp chất khác...................................................................................... 17
1.4. Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Paris.................................................. 18
1.4.1. Tác dụng chống ung thư............................................................................ 18
1.4.2. Tác dụng điều hòa miễn dịch..................................................................... 21
1.4.3. Tác dụng cầm máu và tan máu.................................................................. 21
1.4.4. Tác dụng chống oxy hóa............................................................................ 22
1.4.5. Tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng....................... 23
1.4.6. Tác dụng trên thần kinh............................................................................. 24
1.4.7. Tác dụng trên dạ dày.................................................................................. 24
1.5. Những nghiên cứu về cây bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinenesis
Franchet).................................................................................................................... 24
1.5.1. Phân loại và đặc điểm hình thái bảy lá một hoa........................................ 24
1.5.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bảy lá
một hoa................................................................................................................. 25
1.5.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học................................................. 25


1.5.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học................................................... 26
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 28
2.2. Các phương pháp hóa học................................................................................... 28
2.2.1. Phương pháp phân lập các chất.................................................................. 28
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất............................................. 28
2.2.3. Phương pháp dấu vân tay hóa học............................................................. 29
2.3. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học............................................................ 30
2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào........................................ 30
2.3.2. Sử dụng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla để xác định hoạt độ của
hai yếu tố NF-κB và AP-1................................................................................... 31
2.3.3. Sử dụng kỹ thuật Western blot trong phát hiện biểu hiện của các protein
trong tế bào ung thư vú MCF-7........................................................................... 32

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM.................................................................................. 33
3.1. Chiết tách các phân đoạn và phân lập các chất................................................... 33
3.1.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ phần dưới mặt đất............................ 33
3.1.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ phần trên mặt đất............................. 34
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ
PPC...............

38

3.3. Xây dựng dấu vân tay hóa học............................................................................ 44
3.4. Hoạt tính sinh học............................................................................................... 46
3.4.1. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT........ 46
3.4.2. Xác định tác dụng của chất paris II lên hoạt tính của hai yếu tố NF-κB
và AP1.................................................................................................................. 47
3.4.3. Xác định tác dụng của chất paris II lên sự biểu hiện của các protein
trong tế bào ung thư vú MCF-7........................................................................... 48
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 49
4.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ thân rễ bảy lá một hoa PPC............ 49
4.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất bảy lá một hoa PPC..... 49
4.3. Biện giải cấu trúc của các hợp chất phân lập từ PPC......................................... 50


4.3.1. Biện giải cấu trúc chất mới AB17 (PE29)................................................. 50
4.3.2. Biện giải cấu trúc chất AE6 (PE27)........................................................... 56
4.3.3. Biện giải cấu trúc các chất diosgenin steroid ............................................ 59
4.3.4. Biện giải cấu trúc các chất pennogenin steroid ......................................... 81
4.3.5. Biện giải cấu trúc của một số sterol khác.................................................. 95
4.3.6. Biện giải cấu trúc các hợp chất flavonoid.................................................. 97
4.3.7. Biện giải cấu trúc chất AE11 (thymidin)................................................... 102
4.4. Xây dựng dấu vân tay hóa học các mẫu thuộc chi Paris.................................... 105

4.4.1. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp TLC......................................... 105
4.4.2. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp HPLC..................................... 109
4.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học............................................................................ 111
4.5.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư của cao chiết tổng, cao phân đoạn và
một số hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC......................................................... 111
4.5.2. Ảnh hưởng của hợp chất Paris II lên hoạt độ của hai yếu tố NF-κB và
AP-1 bằng kỹ thuật phân tích luciferase Renilla................................................. 115
4.5.3. Kết quả đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào ung
thư vú MCF-7 dưới tác dụng của hợp chất Paris II bằng kỹ thuật Western Blot......... 116
KẾT LUẬN..................................................................................................................... 120
KIẾN NGHỊ.................................................................................................................... 122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN................................................................................................................................123
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 124


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
NMR

Tiếng Anh
Nuclear Magnetic Resonance

Diễn giải
Phổ cộng hưởng từ hạt

Proton Nuclear Magnetic Resonance
spectroscopy
Carbon 13 Nuclear Magnetic

nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt

Resonance spectroscopy
Heteronuclear Multiple Bond
Correlation

nhân cacbon
Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết

HSQC

Heteronuclear Single Quantum
Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân
trực tiếp H→C

1

1

1

H-NMR

13

C-NMR

HMBC

H-1HCOSY
DEPT
DMSO

H-1H chemical Shift Correlation
Spectroscopy
Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Dimethyl sulfoxide

Mp

Hight Resolution Electron Spray
Ionization Mass Spectrometry
Electron Spray Ionization Mass
Spectra
Melting point

MeOH
EtOAc
DCM
EtOH

Methanol
Ethyl acetate

Diclo methane
Ethanol

IC50

Inhibitory Concentration at 50%

EGF
NF-κB

Epidermal growth factor
Nuclear factor kappa B

HR-ESI-MS
ESI-MS

Phổ tương tác proton
Phổ DEPT
(CH3)2SO
Phổ khối ion hóa phun mù
điện tử phân giải cao
Phổ khối lượng ion hóa
phu mù điện tử
Điểm chảy

Nồng độ ức chế 50% đối
tượng thực nghiệm
Yếu tố tăng trưởng biểu bì
Yếu tố phiên mã NF-κB

AP1

Activator protein 1

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide

LPS

Lipo polysaccharides

A549

Human lung cancer cells
Human promyelocytic leukemia
cells

HL-60

Yếu tố phiên mã AP1

Dòng tế bào ung thư phổi
Dòng tế bào ung thư bạch
cầu
Dòng tế bào ung thư cổ tử
cung

Hela

Cervical adenocarcinoma cells

Caco-2

Heterogeneus human epithelial
colorectal adenocarcinoma cells

MCF-7

Human breast cancer cells

PPC

Paris polyphylla var. chinensis

PPCW

Wild Paris polyphylla var. chinensis

PV

Paris vietnamensis

PPP

Paris polyphylla var. polyphylla

PC
PPY

Paris caobangensis
Paris polyphylla var. yunnanensis

δH

Proton chemical shift

δC

Carbon chemical shift

s: Singlet

d: Doublet
m: Multiplet

Dòng tế bào ung thư trực
tràng
Dòng tế bào ung biểu mô
vú
Loài bảy lá một hoa được
trồng tại Sapa - Lào Cai
Loài bảy lá một hoa thu
hái tự nhiên tại Sapa Lào Cai

Độ chuyển dịch hóa học
của proton

t: Triplet

Độ chuyển dịch hóa học
của cacbon
overlap: Overlapped
dd: doublet doublet


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các saponin sterol phân lập từ chi Paris............................................

10

Bảng 1.2: Cấu trúc của các flavonol phân lập từ chi Paris.............................. 17
Bảng 3.1: Mẫu thực vật chi Paris sử dụng trong nghiên cứu dấu vân tay
hóa học.............................................................................................................
Bảng 3.2: Chương trình chạy HPLC của phần trên và dưới mặt đất các loài
Paris.................................................................................................................

45
46

Bảng 4.1: Dữ liệu phổ của hợp chất AB17 (500MHz, DMSO-d6).................. 53
Bảng 4.2: Dữ liệu phổ hợp chất AE6 (500MHz, MeOD)................................ 58
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ của hợp chất RE1 (CDCl3, 500Hz)............................. 61
Bảng 4.4: Dữ liệu phổ của hợp chất AE16......................................................
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ của hợp chất AE15......................................................

64
67

Bảng 4.6: Dữ liệu phổ của hợp chất RE3 và gracillin.....................................
Bảng 4.7: Dữ liệu phổ của hợp chất AB18......................................................
Bảng 4.8: Bảng dữ phổ của hợp chất AB19 và paris saponin II......................

71
75
80

Bảng 4.9: Dữ liệu phổ của hợp chất RE4 (500MHz, DMSO-d6)....................
Bảng 4.10: Dữ liệu phổ của hợp chất RE5 và paris saponin H.......................

85
89

Bảng 4.11: Dữ liệu phổ của hợp chất AB20 (500MHz, DMSO-d6)................
Bảng 4.12: Dữ liệu phổ của hợp chất AE12 (500MHz, MeOD) và resveratrol..
Bảng 4.13: Dữ liệu phổ của hợp chất AE13 và viniferin.................................
Bảng 4.14: Dữ liệu phổ của hợp chất AE11 và thymidin................................
Bảng 4.15: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao tổng và cao phân đoạn.......

93
100
102
104
111

Bảng 4.16: Giá trị IC50 của 8 hợp chất phân lập được PPC trên 4 dòng
tế bào ung thư................................................................................................... 112

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sự chuyển hóa của các saponin steroid trong chi Paris....................... 6
Hình 1.2: Cấu trúc của các saponin spirostan phân lập từ chi Paris...................

7

Hình 1.3: Cấu trúc của các saponin furostan phân lập từ chi Paris.................... 8
Hình 1.4: Cấu trúc của các saponin pregna phân lập từ chi Paris...................... 8
Hình 1.5: Một số cấu trúc saponin khác được phân lập từ chi Paris.................. 9
Hình 1.6: Cấu trúc saponin polyhydroxyl hóa và kryptogenin........................... 10
Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen......................................... 16
Hình 1.8: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Paris........................................ 17
Hình 1.9: Cây bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet được
trồng tại Sapa - Lào Cai...................................................................................... 25
Hình 2.1: Mô phỏng hệ thống sắc ký HPLC....................................................... 30
Hình 3.1: Sơ đồ chiết cao phân đoạn thân rễ bảy lá một hoa.............................. 33
Hình 3.2: Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl axetat phần
thân rễ cây Bảy lá một hoa.................................................................................. 34
Hình 3.3: Sơ đồ chiết cao phân đoạn phần trên mặt đất bảy lá một hoa............. 35
Hình 3.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl axetat phần
trên mặt đất........................................................................................................... 36
Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn butanol phần
trên mặt đất.......................................................................................................... 37
Hình 4.1: Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ phần dưới mặt đất..... 49
Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ phần
trên mặt đất.......................................................................................................... 50
Hình 4.3: Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất AB17.........................................
Hình 4.4. Phổ NMR của hợp chất AE 17............................................................
Hình 4.5: Tương tác các anome trong phân tử đường của hợp chất AE 17........
Hình 4.6: Các tương tác HMBC (→) hợp chất AE 17........................................

51
52
53
55

Hình 4.7: Công thức cấu tạo của hợp chất AE 17............................................... 55
Hình 4.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất AE6......................................................... 56
Hình 4.9: Phổ 13C-NMR của hợp chất AE6........................................................ 57


Hình 4.10: Phân mảnh phổ ESI-MS hợp chất AE6............................................ 57
Hình 4.11: Tương tác HMBC trong cấu trúc phân tử hợp chất AE6.................. 58
Hình 4.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất AE6.................................................

59

Hình 4.13: Phổ 1H, DEPT và 13C-NMR của hợp chất RE1................................ 60
Hình 4.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất RE1.................................................. 61
Hình 4.15: Phổ 13C-NMR của hợp chất AE16.................................................... 62
Hình 4.16: Tương tác các anome trên phổ HMBC của hợp chất AE16............ 63
Hình 4.17: Phổ COSY của hợp chất AE16......................................................... 63
Hình 4.18: Cấu trúc của hợp chất AE16 và tương tác HMBC (→) và COSY
(−) phần đường ................................................................................................... 65
Hình 4.19: Phổ NMR hợp chất AE15................................................................. 66
Hình 4.20: Cấu trúc hóa học của hợp chất AE15................................................ 68
Hình 4.21: Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 3................................................. 69
Hình 4.22: Tương tác của anome phần đường của hợp chất 3............................ 70
Hình 4.23: Phổ COSY của hợp chất 3................................................................ 70
Hình 4.24: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 và tương tác HMBC và COSY..... 72

Hình 4.25: Phổ 1H-NMR và tương tác HMBC của nhóm metyl trong
hợp chất 18.......................................................................................................... 73
Hình 4.26: Phổ 13C-NMR của hợp chất 18......................................................... 74
Hình 4.27: Phổ giãn HMBC và HSQC của hợp chất 18..................................... 74
Hình 4.28: Phổ COSY của hợp chất 18.............................................................. 75
Hình 4.29: Cấu trúc hóa học của hợp chất 18 và tương tác HMBC và COSY
trong phần đường.................................................................................................. 77
Hình 4.30: Phổ 1H-NMR giãn và tương tác nhóm methy trên phổ HMBC của
hợp chất 19.......................................................................................................... 77
Hình 4.31: Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 19.......................................... 78
Hình 4.32: Phổ giãn HSQC và phổ giãn HMBC của hợp chất 19...................... 79
Hình 4.33. Công thức hóa học của hợp chất 19 và tương tác HMBC phần
đường................................................................................................................... 81


Hình 4.34: Phổ 1H-NMR của hợp chất 8............................................................. 82
Hình 4.35: Phổ 13C-NMR của hợp chất 8........................................................... 82
Hình 4.36: Công thức cấu tạo của hợp chất 8..................................................... 83
Hình 4.37: Phổ giãn 1H-NMR và tương tác của nhóm metyl trên phổ HMBC
của hợp chất 4..................................................................................................... 83
Hình 4.38: Phổ giãn DEPT của hợp chất 4......................................................... 84
Hình 4.39: Tương tác của các anome trên phổ HSQC và HMBC của hợp chất 4... 85
Hình 4.40: Tương tác HMBC trong phân tử của hợp chất 4............................... 85
Hình 4.41: Cấu trúc hóa học của hơp hợp chất 4............................................... 87
Hình 4.42: Phổ giãn NMR của hợp chất 5.......................................................... 88
Hình 4.43: Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 và tương tác HMBC trong
phần đường.......................................................................................................... 90
Hình 4.44: Phổ 1H-NMR và DEPT của hợp chất 20........................................... 91
Hình 4.45. Phổ giãn HMBC tương tác của anome.............................................. 92
Hình 4.46: Cấu trúc hóa học của hơp hợp chất 20 và tương tác HMBC trong

cấu trúc phần đường.............................................................................................. 94
Hình 4.47: Phổ 1H-NMR của hợp chất 7.............................................................
Hình 4.48: Phổ 1H-NMR của hợp chất 9..............................................................
Hình 4.49: Phổ DEPT của hợp chất 9.................................................................
Hình 4.50: Phổ 1H-NMR của hợp chất 14...........................................................

96
97
98
98

Hình 4.51: Phổ DEPT của hợp chất 14............................................................... 99
Hình 4.52: Cấu trúc hóa học của hợp chất 14..................................................... 99
Hình 4.53: Phổ 1H-NMR của hợp chất 13........................................................... 101
Hình 4.54: Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất 13......................................... 101
Hình 4.55: Công thức cấu tạo của hợp chất 13................................................... 102
Hình 4.56: Phổ DEPT của hợp chất 11...............................................................
Hình 4.57: Phổ COSY, HMBC của hợp chất 11.................................................
Hình 4.58: Cấu trúc hóa học của hợp chất 11.....................................................
Hình 4.59: Sắc ký đồ bản mỏng các mẫu phần trên mặt đất chi Paris...............
Hình 4.60: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) các mẫu phần

103
103
104
105

dưới mặt đất chi Paris (Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01) )............. 106

Hình 4.61: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) các mẫu phần
dưới mặt đất chi Paris (Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1)) ................ 107
Hình 4.62: Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 20x10 cm) các
mẫu phần dưới mặt chi Paris (Hệ dung môi: MeOH/H2O (20/3)) .................... 107
Hình 4.63: Sắc ký đồ HPLC các mẫu phần trên mặt đất thuộc chi Paris........... 109
Hình 4.64: Sắc ký đồ HPLC các mẫu phần dưới mặt đất thuộc chi Paris.......... 110
Hình 4.65: Ảnh hưởng của cao tổng, các cao phân đoạn, và các hợp chất
spirostan steroid đến mức độ tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7..................... 114
Hình 4.66: Ảnh hưởng của paris II đến mức độ tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7.... 115
Hình 4.67: Ảnh hưởng của hợp chất paris II đến mức độ hoạt độ của NF-B
và Ap-1 gây bởi LPS trong đại thực bào RAW264.7......................................... 115
Hình 4.68: Tác dụng của paris II lên mức độ biểu hiện nhóm protein tham gia
vào chu trình tế bào............................................................................................. 117
Hình 4.69: Tác dụng của paris II lên mức độ biểu hiện nhóm protein tham gia
vào quá trình apotosis ......................................................................................... 118


MỞ ĐẦU
Đất nước Việt Nam có dạng hình chữ S gồm phần đất liền trải dài theo vĩ độ
Bắc từ 8030’ đến 23022’, có 4/5 diện tích là đồi núi, khí hậu nhiệt đới gió mùa. Những
yếu tố địa lý và khí hậu như trên là điều kiện thuận lợi để các sinh vật phát triển đa
dạng về số lượng, phong phú về chủng loại. Theo ước tính, Việt Nam có khoảng
11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo.
Trong đó, có nhiều loài được dùng làm thuốc. Đặc biệt, năm 2016 Viện Dược liệu đã
công bố 5117 loài cây thuốc trong Danh mục Cây thuốc Việt Nam.
Căn cứ theo hệ thống phân loại mới nhất APG năm 2011 (dựa trên những dẫn
liệu về sinh học phân tử) chi Paris thuộc họ Hắc dược hoa - Melanthiaceae gồm 26
loài với 13 thứ, phân bố ở vùng cận nhiệt ôn đới hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu. Kết quả
nghiên cứu tài liệu cho thấy các loài thuộc chi Paris có hoạt tính đáng quý như: tác
dụng chống ung thư, tác dụng điều hòa miễn dịch, tác dụng cầm máu và tan máu, tác

dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng, tác
dụng trên dạ dày, tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần.
Về thành phần hóa học, các hợp chất đã được phân lập từ một số loài Paris bao
gồm saponin, flavonol, sphingolipid và các glycosid khác. Trong đó, nhóm cấu trúc
saponin được nghiên cứu nhiều nhất là saponin steroid (có trên 120 hợp chất) từ 22
loài thuộc chi Paris đã được công bố.
Ở Việt Nam, chi Paris là chi hiếm gặp và phân bố chủ yếu ở một số tỉnh miền
núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên - nơi có khí hậu mát, độ ẩm cao. Hiện nay, ở
nước ta có 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris gồm: Paris dunniana H.Lév., Paris fargesii
Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis Y.H.Ji, H.Li &
Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li &
Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var.
yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., và Paris polyphylla var. chinensis (Franch.)
H.Hara.). Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của một số loài thuộc chi Paris với
tên thường gọi bảy lá một hoa (hay thất diệp nhất chi hoa) được dùng để chữa sốt, sốt
rét cơn, giải độc nhất là khi bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao,
ho lâu ngày, hen suyễn. Dùng ngoài với tác dụng sát trùng những nơi bị sưng đau, vết
rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt [1].

1


Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nước ngoài, nhưng chủ yếu tập trung
trên đối tượng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối tượng Paris
polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây bảy lá một hoa Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam” góp phần xây dựng
cơ sở dữ liệu khoa học về loài này ở Việt Nam. Đề tài thực hiện với 2 mục tiêu chính
như sau:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis Franchet trồng tại
Lào Cai:

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.
- Bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học để phân biệt một số loài thuộc chi Paris.
2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư và sơ bộ cơ chế tác dụng của hợp chất
paris saponin II trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7.

2


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật chi Paris
Về phân loại thực vật:
Hiện nay, hệ thống phân loại thực vật chi Paris chưa có sự thống nhất. Theo hệ
thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris thuộc phân giới
thực vật bậc cao; ngành Ngọc lan (Magnoliophyta); phân lớp Hành (Liliopsida); phân
lớp Loa kèn (Lilidae); bộ Củ nâu (Dioscoreales); họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu)
(Trilliaceae) [2].
Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III dựa trên những dẫn liệu về sinh học
phân tử, chi Paris được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) [116] với tổng số
26 loài và 13 thứ. Chi Paris L. là một chi nhỏ, phân bố ở vùng cận nhiệt đới hoặc ôn
đới ẩm Bắc bán cầu trong đó Trung Quốc được coi là trung tâm đa dạng của các loài
Paris.
Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa kèn
(Liliaceae) với 22 loài và 17 thứ (var.) trong đó có 12 loài đặc hữu. Đồng thời các nhà
thực vật Trung Quốc cũng phân loại loài Paris polyphylla thành 10 thứ bao gồm Paris
polyhylla var. polyphylla, P. polyphylla var. yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis,
P. polyphylla var. nana, P. polyphylla var. alba, P. polyphylla var. stenophylla, P.
polyphylla var. minor, P. polyphylla var. latifolia, P. polyphylla var. pseudothibetica
và P. polyphylla var. kwantungensis [67].
Ở Việt Nam chi Paris hiếm gặp, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc
và vùng núi cao Tây Nguyên là những nơi có khí hậu mát, độ ẩm cao từ 800-1600m,

nhiệt độ trung bình năm 15-21OC, lượng mưa 1500 mm/năm. Năm 1999, Phạm Hoàng
Hộ được xem là người đầu tiên có những thống kê và mô tả đơn giản 5 loài thuộc chi
Paris nhưng chưa có khóa phân loại. Tác giả Nguyễn Thị Đỏ nghiên cứu về chi Paris
đầy đủ hơn với mô tả chi tiết và có khóa phân loại kèm hình vẽ của 6 loài là Paris
delavayi, P. polyphylla, P. dunniana, P. yunnanensis, P. chinensis, P. fargisii [2].
Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu phân loại một số loài thuộc chi Paris (họ
Trilliaceae) ở Việt Nam sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị PCR -RFLP” 2013-2015
[6], Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự (2015) đã bổ sung thêm 2 loài cho hệ thực vật Việt
Nam là Paris cronquistii (Takht.) H.Li và Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li &
Z.K.Zhou, đồng thời tách Paris vietnamensis (Takht.) H.Li thành loài riêng theo quan
điểm của H. Li (1984) vốn được Nguyễn Thị Đỏ (2007) coi là synonym của loài Paris
polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. – Mazz. Như vậy, theo kết quả nghiên
cứu Nguyễn Quỳnh Nga và cs tại Việt Nam có 8 loài và 2 thứ là: Paris dunniana
3


H.Lév., Paris fargesii Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis
Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li)
Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris
polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., Paris polyphylla var. chinensis
(Franch.) H.Hara. [5], [86], [87].
Ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Paris là những cây thuốc quý hiếm, có nguy cơ
tuyệt chủng. Nạn phá rừng làm thu hẹp môi trường sống và tình trạng thu gom bán qua
biên giới trong thời gian dài là nguyên nhân gây suy giảm mạnh nguồn cung cấp dược
liệu này. Hiện nay, loài Paris polyphylla var. yunnanensis Smith đã được đưa vào
Sách đỏ Việt Nam (2007) và danh mục cây thuốc Việt Nam (2006).
Đặc điểm thực vật của chi Paris L.
Cây thảo nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần thân trên
mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh hoặc hiếm khi phân nhánh, nảy mầm
vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá mọc vòng trên thân, 4-10 lá; phiến lá màu lục,

có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngược, mềm, gân bên rõ,
không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn. Hoa thường đơn độc hoặc hiếm khi có
một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lưỡng tính, mẫu 3-5-7, cuống dài, thẳng
đứng. Đài (2)3-5(10), rời nhau, hình mũi giáo, màu xanh lục, thường to hơn cánh hoa
xếp lợp hoặc hơi vặn. Cánh hoa (2)3-5(10), dạng dải hoặc hình trứng, màu sắc khác
nhau, bằng nhau. Nhị 3-22 chiếc; chỉ nhị dẹp, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao
phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, trung đới kéo dài tạo thành hình cầu
hoặc hình sợi hoặc rất ngắn. Bầu trên, tròn hoặc có cạnh, 1 ô, nhiều noãn, đính noãn
bên; vòi nhụy rời hoặc dính nhau phần gốc; đầu nhụy xẻ 3-5-7 thùy. Quả mọng hoặc
quả nang, mở ở lưng ô. Hạt hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc
không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc [2, 6].
Năm 2015, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm thực vật
một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam và đã khẳng định các loài thuộc chi Paris đã
ghi nhận ở Việt Nam đều thuộc nhóm bầu 1 ô, noãn đính bên thuộc dưới chi Daiswa
theo quan điểm của Li Heng [5], [6], [86], [87].
1.2.

Công dụng của một số loài thuộc chi Paris [1]
Bộ phận dùng: Thân rễ, thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa thu đông, rửa

sạch phơi khô [1].
Tính vị và công năng: vị đắng, hơi cay, tính hơi hàn, hơi độc, vào kinh can, có
tác dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt giải độc [1].

4


Tác dụng chủ yếu là thanh nhiệt giải độc, bình suyễn, chỉ khái, tức phong, định
kinh, tiêu viêm chỉ thống, hoạt huyết tán ứ, tiêu thũng [1].
Công dụng: Thân rễ bảy lá một hoa chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc,

nhất là khi bị rắn độc cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày,
hen suyễn [1].
Liều dùng: ngày uống 4-12 g thân rễ dưới dạng thuốc sắc. Dùng ngoài với tác
dụng sát trùng, tiêu sưng, giã thân rễ đắp lên những nơi sưng đau, vết rắn cắn, tràng
nhạc, mụn lở, nhọt [1].
Ở Trung Quốc, các loài thuộc chi Paris được sử dụng chữa gẫy xương, chứng co
giật, cầm máu, điều tiết miễn dịch và sử dụng như là thuốc giảm đau, thuốc chống
viêm, thuốc hạ sốt, thuốc ho, thuốc kháng sinh, thuốc động kinh, thuốc thanh lọc cơ
thể [46, 110, 129, 135].
Ở Ấn Độ thân rễ loài P. polyphylla sử dụng trị giun sán và làm thuốc bổ [39].
Tại Nê Pan, các loài thuộc chi Paris được thu hái tự nhiên dùng làm thuốc trị
giun sán, bệnh dạ dày, làm long đờm [11].
1.3. Thành phần hóa học chi Paris
Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938 bởi Dutt và
cs [33] đã phân lập được 2 hợp chất parid và paristyphnin từ loài P. quadrifolia. Sau
đó năm 1983 [85] Nakano và Chen (1995) [20] công bố các hợp chất saponin,
flavonoid glycosid, sterol [14], [19] β-phytoecdyson và polysaccharid được công bố
lần lượt bởi Singh [104] và Zhou [135]. Cho đến nay có trên 100 saponin (xem hình
1.1) được phân lập từ các loài thuộc chi Paris gồm P. axialis, P. polyphylla var.
yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. delavayi Franch., P. vietnamensis, P.
dunniana, P. luquanensis, Paris polyphylla var. pseudothibetica, P. quadrifolia. Cấu
trúc của phần aglycon của các saponin phân lập được có khung steroid được mô tả như
hình 1.1. Hầu hết các aglycon liên kết với phần đường tại vị trí C-3, một số ít liên kết
với C-1.
1.3.1. Các hợp chất saponin
1.3.1.1. Các hợp chất saponin steroid
a. Các hợp chất saponin spirostan
Các saponin nhóm này thường có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin
hoặc là các dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C-24 hoặc C-27. Các
saponin này có từ 1 đến 4 đường và thường liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số

saponin pennogenin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 được phân lập bởi
Chen và cs [14-19], [22] từ loài P. axialis và PPY. Theo thống kê đến thời điểm này có
trên 60 hợp chất nhóm này được phân lập từ chi Paris ký hiệu từ 1-63 (xem hình 1.2).
5


Hình 1.1: Sự chuyển hóa của các saponin steroid trong chi Paris
b. Các saponin furostan
Các saponin furostan (xem hình 1.3) có cấu trúc tương tự như các saponin
spirostan nhưng bị phản ứng bởi enzym mở vòng ở vòng F và bị đường hóa tại C-26.
Cấu trúc dạng này lần đầu tiên phân lập từ Paris bởi Matsuda và cs năm 2003 [77] là
protogracillin. Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại
khung E.

6


Hình 1.2: Cấu trúc của các saponin spirostan (1 – 63) phân lập từ chi Paris
c. Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan
Chen và cs lần đầu tiên được phân lập hai nhóm saponin pseudo-spirostanol
và pregnan từ chi Paris trong đó nhóm saponin pseudo-spirostanol (1995) [20]
gồm nuatigenin và isonuatigenin, năm 1990 công bố nhóm saponin pregna[14,
19]. Có 21 hợp chất saponin pregnan được phân lập từ Paris được ký hiệu từ 87107 (xem hình 1.4).
7


Hình 1.3: Cấu trúc của các saponin furostan (64 – 86) phân lập từ chi Paris

Hình 1.4: Cấu trúc của các saponin pregna (87 – 107) phân lập từ các loài thuộc chi Paris
8

d. Các saponin steroid khác
Năm 2009, Xiao và cs phân lập được parispseudosid A và parispseudosid B
[121]. Hợp chất 18-norspirostanol được phân lập từ loài P. quadrifolia bởi
Nohara năm 1982 [88]. Năm 2016 Qin và cộng sự [96] đã phân lập được hai
sterol là 7α-hydroxy stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (117) và 7β-hydroxy
sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (118).

Hình 1.5: Một số saponin steroid khác (109 – 118) được phân lập
từ chi Paris

9


e. Các saponin polyhydroxyl hóa
O

R3H2C

OR 2
O OH
119.R=Xyl

OR1

O

HO
6

Glc

3

Glc

2

R2=Gal

OR2
O OH

OR1

R3=OH

121.R1= Xyl

Rha

120.R1= Xyl
HO

R3H2C

3

Glc
2

Rha

R2=D-Fuc R3=O-Gal

122.R1= Xyl

HO

3

Glc R2=L-Fuc
2
Rha
Glc R2=D-Fuc
2
Rha

O
OR 2
O OH

OR 1

3

123 .R= Xyl
124 .R= Xyl

HO

3

3

O
O

OH

Glc R2=D-Fuc R3=OH
2
Rha
Glc R2=D-Fuc R3=O-Gal
2
Rha

125.R=Rha

RO

4

Rha

4

Glc

Hình 1.6: Cấu trúc saponin polyhydroxyl hóa và kryptogenin (119 – 125) phân
lập từ chi Paris

Tóm lại: Theo tổng hợp từ các tài liệu tham khảo, cho đến thời điểm hiện tại 125
hợp chất saponin sterol phân lập từ các loài thuộc chi Paris (xem bảng 1.1).
Bảng 1: Các saponin sterol phân lập từ chi Paris

Diosgenin

(1)

Trillin

(2)

Diosgenin-3-O-α-L-rha-(1→4)-βD-glc

(3)

Paris V

(4)

Polyphyllin C
Diosgenin-3-O-α-L-ara-(1→4)-βD-glc

(5)

Bộ phận phân lập,
loài
Thân lá PPY
Thân rễ PP,

thân lá PPY
Thân rễ PP,
thân lá PPY
Thân rễ PPC,
thân lá PPY
Thân rễ PP

(6)

Thân rễ PP

Polyphyllin D/ Paris I

(7)

Dioscin/ParisIII

(8)

Tên hợp chất

Diosgenin-3-O-α-L-ara-(1→4)[α-L-rha-(1→3)]-β-D-glc
Diosgenin-3-O-α-L-ara-(1→2)[α-L-ara-(1→3)]-β-D-glc
Gracillin
Diosgenin-3-O-α-L-rha-(1→4)-

stt

Thân rễ PPC,
thân rễ PPY

Thân rễ Paris axialis,
thân lá PPY

Tài liệu
[95]
[95], [100],
[101]
[95], [100],
[101]
[80], [95]
[105]
[82]
[120]
[17]

(9)

Thân rễ PP

[105]

(10)

PPC

[124]

(11)
(12)

PP, thân rễ PPY
Thân rễ PP
10

[56],[120]
[100], [101]


[α-L-ara-(1→3)]-β-D-glc
Paris II

(13)

Polyphyllin F
Polyphyllin E
Diosgenin-3-O-β-D-glc-(1→3)α-L-rha-(1→4)-[α-L-rha-(1→3)β-D-glc
Reclinatosid

(14)
(15)

Thân rễ PP,
thân lá PPY
Thân rễ PP
Thân rễ PP

(16)

Thân rễ PP

(17)

Thân rễ PP và P Y

Loureirosid

(18)

Thân rễ PP và PPY

(19)

Thân rễ PPC

[80]

(20)

Thân rễ PPY

[134]

(21)

Thân rễ PPY

[120]

Diosgenin-3-O-α-L-rha(1→4)-αL-rha(1→4)-β-D-glc
Diosgenin-3-O-β-D-glc-(1→5)α-L-Ara-(1→4)-[rha(1→2)]-β-Dglc

Diosgenin-3-O-β-D-api-(1→3)[α-L-rha-(1→2)]-β-D-glc
Pennogein-3-O-β-D-glc
Paris IV
Pennogenin-3-O-α-L-ara-(1→4)β-D-glc
Paris saponin H
Paris saponin D
Pennogenin-3-O-α-L-rha-(1→4)[α-L-rha(1→2)]-β-D-glc
Pennogenin-3-O-α-L-rha(1→4)α-L-rha(1→4)- β-D-glc

[104]
[104]
[50]
[134], [133]
[134],
[133]

[80]

(22)
Thân rễ và thân lá
PPY

(23)
(24)

[82], [102]

Thân rễ PP và PP

[15], [102]

[82], [120]

(25)
(26)

Thân rễ PPC
Thân rễ PPC

[80]
[80]

(27)

Hạt PPY

[14]

Paris VII

(29)

Polyphyllosid
Pennogenin-3-O-β-D-xyl-(1→5)α-L-Ara-(1→4)-[rha(1→2)]-β-Dglc
Pennogenin-3-O-β-D-api-(1→3)[α-L-rha-(1→2)]-β-D-glc
Pennogenin-3-O-β-D-Glc(1→5)-α-L-Ara-(1→4)[rha(1→2)]-β-D-glc
Pennogenin-3-O-β-D-xl-(1→4)α-L-ara-(1→4)-[rha(1→2)]-β-Dglc
24α-hydroxyl-pennogenin-3-O-αL-rha-(1→3)-[α-L-rha-(1→2)]-βD-glc

(30)

Thân rễ PPC, thân lá
và thân rễ PPY
Phần trên mặt đất
PPY, thân lá và thân
rễ PPC
Thân rễ PP

(31)

Thân rễ PP

[28]

(32)

Thân rễ PPY

[114]

(33)

Thân rễ PPY

[119]

(34)

Thân rễ PPY

[119]

(35)

PP

[56]

(28)

11

[80]
[19]
[77]