NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

----------

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Cán bộ hướng dẫn : TS. Lã Thị Huyền
PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội, 2016


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


MỞ ĐẦU
Nhiễm khuẩn huyết là một tình trạng bệnh lý rất thường gặp trong lâm sàng

và có nguy cơ gây tử vong cao. Chỉ riêng ở Hoa kỳ thì mỗi năm có khoảng 751.000
người mắc bệnh và 215.000 trường hợp tử vong chiếm 9,3% tổng số ca tử vong tại
đất nước này. Số lượng bệnh nhân tử vong do nhiễm khuẩn huyết tương đương với
số lượng bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp tính và cao hơn nhiều so với AIDS và ung
thư vú. Mặc dù có nhiều tiến bộ trong y học hiện đại như vaccine, kháng sinh hay
điều kiện chăm sóc đặc biệt nhưng tỷ lệ bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết vẫn chưa dấu
hiệu thuyên giảm.
Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết thường có tiến triển bệnh nhanh, đặc biệt
là ở các đối tượng trẻ em và người già. Vì vậy, việc phát hiện sớm tác nhân gây
bệnh có ý nghĩa quan trọng để điều trị kịp thời và góp phần hạn chế biến tính, giảm
tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết. Hiện nay, cấy máu kết hợp với
xét nghiệm sinh hóa là phương pháp phổ biến nhất để phát hiện mầm bệnh. Phương
pháp này tiến hành đơn giản, dễ thao tác với chi phí thấp nhưng có nhược điểm là
tốn nhiều thời gian, không loại trừ được trường hợp âm tính giả, có khoảng 60%
trường hợp nhiễm khuẩn huyết có kết quả cấy máu âm tính.
Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được cho là
một phương pháp có độ nhạy và chính xác cao. Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn
chưa có phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn nào được cho là chuẩn để ứng
dụng vào chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một phương
pháp chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đang là nhu cầu bức thiết
hiện nay. Multiplex PCR có thể coi là giải pháp cho những vấn đề trên. Phương
pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng cho phép phát hiện nhiều
loại tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết trong thời gian ngắn với độ chính xác cao.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm
khuẩn huyết” nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị cho các bệnh nhân

1

nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam. Nội dung chính của đề tài bao gồm:
Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các chủng vi khuẩn
gây nhiễm khuẩn huyết.
Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR.
Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm của bệnh
nhân nhiễm khuẩn huyết.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhiễm khuẩn huyết
1.1.1. Lịch sử, khái niệm và tình trạng nhiễm khuẩn huyết
Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định và
chẩn đoán. Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27 TCN) đã
mô tả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, không thể nhìn thấy
bằng mắt, có đầy trong không khí và qua hơi thở gây ra các bệnh nguy hiểm”. Tiếp
đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và tiêu biểu là một học giả thời kì
phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527) trong báo cáo của mình cũng đã lần
lượt mô tả đầy đủ về nhiễm khuẩn huyết [1].
Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩn huyết.
Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễm khuẩn huyết bởi
trong giai đoạn y học chưa phát triển, việc mô tả nhiễm khuẩn huyết rất khó để
được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên rõ ràng và khó khăn trong
điều trị cùng với tính sự nghiêm trọng của bệnh thì người ta bắt đầu quan tâm hơn
và nỗ lực tìm hiểu đưa ra khái niệm về nhiễm trùng huyết. Theo như sự mô tả của
bác sĩ người Mỹ William Osler (1849-1919) khi nghiên cứu bệnh nhân chết bởi
những phản ứng của cơ thể đáp ứng lại tác nhân xâm nhiễm hơn là do nhiễm trùng
đã đưa ra khái niệm đầu tiên về nhiễm khuẩn huyết là một hệ thống các đáp ứng của
cơ thể vật chủ với tác nhân xâm nhiễm [1]. Năm 1972, khái niệm này được khẳng

định lại trong một hội nghị quốc tế về y tế cho rằng: đó là sự đáp ứng của cơ thể với
bệnh tật [2]. Trong khái niệm chung lại cho rằng sự nhiễm độc là một hình thức của
nhiễm khuẩn huyết. Tuy nhiên trong thực tế sự hiện diện của nhiều vi sinh vật gây
bệnh hay độc tố của chúng trong máu hoặc mô dẫn tới sự phủ định của những khái
niệm chung này đồng thời kéo theo vô số nỗ lực phát triển về dịch tễ học, các công
cụ chẩn đoán và xét nghiệm để xác định nhiễm trùng huyết [3].
Vào năm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) và Socity
Critical Care Medicine (SCCM) cùng công bố các khái niệm của nhiễm trùng huyết

3


(Bảng 1, Hình 1). Đây là một trong những khái niệm phổ biến nhất về nhiễm khuẩn
huyết trong các đơn vị chăm sóc sức khỏe y tế đặc biệt, các trung tâm dịch vụ chăm
sóc sức khỏe chuyên sâu khác nhau trên khắp thế giới. Việc mô tả biểu hiện của các
phản ứng viêm toàn thân và đưa ra định nghĩa cụ thể cho nhiễm trùng huyết, nhiễm
trùng huyết nặng, sốc nhiễm trùng và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là
những vấn đề quan trọng trong lĩnh vực nhiễm trùng huyết.
Bảng 1: Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [4]

Tiêu chí đặt tên

Dấu hiệu, Triệu chứng

của ACCP / SCCM

Nhiệt độ cơ thể > 38°C hoặc <36°C, Nhịp tim ≥90 bpm,
Hội chứng

Khả năng hô hấp ≥ 20 / phút (hoặc PaCO2 <32 mmHg)

đáp ứng viêm

Tế bào bạch cầu ≥12,000 / µl hoặc ≤4000 / µl hoặc> 10% chưa
phát triển các triệu chứng.

Nhiễm khuẩn huyết

Nhiễm khuẩn huyết
nặng

Sốc nhiễm trùng

Hội chứng rối loạn
chức năng nội tạng

Ít nhất có hai tiêu chí của hội chứng đáp ứng viêm hoặc
nghi ngờ nhiễm trùng
Nhiễm khuẩn huyết với rối loạn chức năng cơ quan cấp tính (bao
gồm cả tăng truyền dịch và hạ huyết áp) gây ra bởi
nhiễm trùng huyết
Nhiễm khuẩn huyết với hạ huyết áp kéo dài hoặc hoặc tràn dịch
mô mặc dù chất lỏng hồi sức thích hợp
Xuất hiện rối loạn chức năng nội tạng tại một bệnh cấp tính
bệnh nhân không thể duy trì cân bằng nội mô
khi không có tác động hỗ trợ.

4

Hình 1: Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng
giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [4].
Nhiễm khuẩn huyết là một trong những nguyên nhân gây bệnh tật và tử vong
hàng đầu ở các bệnh nhân phải nhập viện trên toàn thế giới. Đây là một tình trạng
bệnh lý do đáp ứng của cơ thể với sự có mặt của vi khuẩn hay các vi sinh vật gây
bệnh khác hoặc độc tố được tạo ra bởi sinh vật gây bệnh lưu hành trong máu và đi
tới khắp các cơ quan trong cơ thể. Nhiễm khuẩn huyết gây ra các triệu chứng lâm
sàng đa dạng, suy đa tạng, sốc nhiễm khuẩn với tỉ lệ tử vong rất cao (từ 20 – 50%),
trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng của nhiễm khuẩn huyết [5].
Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 30 triệu người mắc nhiễm khuẩn huyết,
nhiều người trong số đó đã chết hoặc bị các vấn đề sức khỏe lâu dài vì không được
phát hiện và điều trị hợp lí. Trong hầu hết các các nước phát triển, tỉ lệ nhiễm khuẩn
huyết đã được phát hiện khoảng 50 -100 trường hợp trên 100.000 dân số [6]. Trong
nghiên cứu của Martin đã cho thấy tỉ lệ nhiễm trùng huyết tăng từ 0,83 trường hợp
trên 1000 dân số vào năm 1979 tới 2.40 trường hợp trên 1000 dân số vào năm 2000.
Trong giai đoạn 1995-2000, 33,6% bệnh nhân nhiễm trùng huyết trong nghiên cứu
5


bị suy tạng, cho thấy tỉ lệ nhiễm trùng nghiêm trọng trong năm 2000 chỉ có 0,81
trên 1000 dân số. Nhìn chung, tỉ lệ nhiễm trùng cao hơn 3-4 lần, phản ánh tỷ lệ
tương đối của các bệnh nhân rối loạn chức năng nội tạng và do đó có những đáp
ứng nặng hơn (nhiễm trùng huyết nặng hoặc sốc nhiễm trùng) [7].
Tỷ lệ nhiễm khuẩn huyết có sự thay đổi rõ ràng nhất tại Hoa Kỳ, có khoảng
751.000 trường hợp nhiễm khuẩn nặng xảy ra hàng năm và ước tính có khoảng
450.000 trường hợp nhiễm trùng huyết mỗi năm tại Hoa Kỳ với hơn 100.000
trường hợp tử vong [8]. Ở châu Âu, một nghiên cứu dựa vào những quan sát trên
quy mô lớn đã ghi nhận có khoảng 30% bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết tại các
đơn vị chăm sóc sức khỏe đặc biệt. Theo như nghiên cứu này, nguy cơ tử vong của
các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết là 27%, tăng lên 32% và 54% với các bệnh

nhân bị nhiễm khuẩn huyết nặng và sốc nhiễm trùng . Theo một nghiên cứu ở Anh
tỷ lệ dân số nhiễm khuẩn nặng là 0,51 trường hợp trên 1000 dân số [9]
Gần đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết đang có xu hướng gia tăng
với khoảng 8,7% mỗi năm. Nhiều trong số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết, khoảng
0,003% tiến triển thành nhiễm khuẩn huyết nặng [8].
1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết
Các dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết bao gồm các triệu chứng:
Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thở
nhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phù nề.
Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: tăng hoặc giảm số lượng tế bào
bạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin, interleukin-6).
Thay đổi huyết áp động mạch: hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanh
không rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượng nước tiểu
giảm.
Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổn thương
phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, không giải thích được thay đổi
chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầu hoặc đông máu nội mạch rải rác,
không rõ nguyên nhân thay đổi trong các thử nghiệm chức năng gan (bilirubin),
không dung nạp thức ăn (thay đổi nhu động ruột) [10].

6


1.1.3. Tác động lâm sàng của nhiễm khuẩn huyết và các yêu cầu y tế chưa được
đáp ứng
Nhiễm khuẩn huyết được coi là một cuộc chạy đua giữa các tác nhân gây
bệnh và hệ thống miễn dịch vật chủ và là vấn đề y tế cộng đồng tiêu biểu và là một
trong những nguyên nhân phổ biến nhất lựa chọn vào các đơn vị chăm sóc đặc biệt
(ICU) [11]. Tỷ lệ tử vong liên quan đến nhiễm trùng huyết khá cao dù đã được cải
thiện kết quả trong chăm sóc sức khỏe đồng thời nhiễm trùng huyết là nguyên nhân

thứ hai gây tử vong ở ICU. Bệnh nhân bị nhiễm trùng huyết mang nguy cơ tử vong
tăng gấp đôi sau 5 năm so với nhóm đối chứng nhập viện [12, 13].
Việc điều trị kháng sinh không phù hợp là một vấn đề nghiêm trọng dẫn đến
sự gia tăng tỷ lệ tử vong trong nhiễm trùng huyết [14, 15]. Nguyên nhân của việc
điều trị không phù hợp bao gồm: việc thiếu kiểm soát các mầm bệnh tiềm ẩn, sự
kháng thuốc của các mầm bệnh gây bệnh trong nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm
khuẩn Gram âm thế hệ mới [16]. Việc điều trị nấm không phù hợp cũng có thể dẫn
tới gia tăng tỷ lệ tử vong bởi những biện pháp điều trị nấm theo kinh nghiệm chỉ
được điều trị cho những bệnh nhân có nguy cơ nhiễm trùng huyết cao như giảm
bạch cầu, nhiễm trùng ổ bụng [17, 18, 19]. Từ những thực trạng trên đã dẫn đến một
yêu cầu cấp thiết trong việc phát triển các xét nghiệm chẩn đoán nhanh các tác nhân
gây nhiễm khuẩn huyết nhằm kiểm soát và đưa ra các biện pháp điều trị kháng sinh
thích hợp ở những bệnh nhân nhiễm khuẩn nặng.
Cấy máu (BC) vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán và phát hiện
nhiều mầm bệnh từ máu [20, 21]. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là độ
nhạy không cao và mầm bệnh dễ bị suy yếu trong thời gian chờ kết quả. Để tăng tốc
độ của chẩn đoán và cải thiện độ nhạy của phương pháp phát hiện mầm bệnh trong
máu, các phương pháp mới về sinh học phân tử đã được sử dụng nhằm phát hiện
DNA vi khuẩn và nấm, tuy nhiên những phương pháp này lại không được sử dụng
rộng rãi trong lâm sàng [22]. Bằng cách rút ngắn thời gian để phát hiện mầm bệnh
và cho phép phát hiện các sinh vật bỏ qua bởi cấy máu, các phương pháp sinh học
phân tử có thể đóng góp vào việc giảm tỷ lệ nhập viện và nhập ICU cũng như giảm

7


tỷ lệ tử vong [23, 24]. Ngoài các kỹ thuật vi sinh có sẵn cho chẩn đoán nhiễm trùng
huyết đã được quan tâm. Các kĩ thuật mới được phát triển gồm có khối phổ và kỹ
thuật microarray. Tuy nhiên dựa trên số lượng lớn các nghiên cứu đã báo cáo, hiện
nay, những kỹ thuật có thể thương mại hóa cùng các nghiên cứu lâm sàng đang

được tập trung thực hiện và công bố.
1.1.4 Dịch tễ học nhiễm khuẩn huyết
Trong một nghiên cứu gần đây của Angus và Van der Poll về tỷ lệ tỉ lệ nhiễm
khuẩn huyết [12]. Tại Hoa Kỳ 2% bệnh nhân và 10% bệnh nhân của IUC ( đơn vị
chăm sóc y tế đặc biệt- intensive care unit ) là những bệnh nhân bị nhiễm trùng
huyết nặng [25]. Nhiễm trùng huyết nặng xảy ra do đồng thời nhiễm trùng cộng
đồng và nhiễm trùng y tế liên quan. Viêm phổi, nhiễm trùng ổ bụng, nhiễm trùng
đường tiết niệu là nguyên nhân phổ biến nhất của nhiễm trùng huyết [8, 9].
Staphylococcus aureus và Streptococcus gây viêm phổi là những chủng Gram
dương phổ biến nhất, trong khi những chủng vi khuẩn Gram âm phổ biến là
Escherichia coli, Klebsiella và Pseudomonas aeruginosa đã được phát hiện [9].
Trong giai đoạn 1979-2000, Vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết được báo
cáo với tần suất cao hơn so với Gram âm [7]. Tuy nhiên, gần đây hơn, vi khuẩn
Gram âm được phân lập ở 62% bệnh nhân bị nhiễm trùng huyết nặng, trong khi vi
khuẩn Gram dương chiếm 47% và nấm chiếm 19% các trường hợp [9].
Yếu tố nguy cơ quan trọng đối với nhiễm trùng huyết nặng là cách thức bệnh
nhân bị nhiễm trùng và khả năng của các cơ quan bị rối loạn chức năng nếu nhiễm
trùng phát triển. Các bệnh mãn tính như hội chứng suy giảm miễn dịch, tắc nghẽn
phổi mãn tính, nhiều bệnh ung thư khác và việc sử dụng các tác nhân ức chế miễn
dịch là một trong những nguy cơ quan trọng đối với những bệnh nhiễm trùng dẫn
đến nhiễm trùng huyết nặng và sốc nhiễm trùng [8]. Tuổi tác, giới tính, chủng tộc
hoặc dân tộc tất cả đều ảnh hưởng tới tỉ lệ nhiễm trùng. Tỷ lệ nhiễm trùng huyết cao
hơn ở trẻ sơ sinh và người lớn tuổi so với các nhóm tuổi khác, cao hơn ở nam nhiều
hơn ở nữ, và cao hơn ở người da đen so với người da trắng [8, 27]. Các yếu tố di
truyền như đa hình trong gen mã hóa cytokine và các chất trung gian khác tham gia

8


vào quá trình miễn dịch bẩm sinh, đông máu và phân hủy fibrin cũng khả năng góp

phần vào tỷ lệ và kết quả của nhiễm trùng huyết [12]
1.2. Tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết
1.2.1. Các tác nhân không phải do vi sinh vật
Có rất nhiều yếu tố là nguyên nhân dẫn đến nhiễm khuẩn huyết như:
Các yếu tố nội sinh (do chính bản thân người bệnh): là yếu tố các bệnh mãn
tính, mắc các bệnh tật làm suy giảm khả năng phòng vệ của cơ thể, trẻ sơ sinh non
tháng và người già. Đặc biệt các vi sinh vật cư trú trên da, các hốc tự nhiên của cơ
thể người bệnh có thể gây nhiễm trùng cơ hội, những người bệnh dùng thuốc kháng
sinh kéo dài.
Các yếu tố ngoại sinh như: Vệ sinh môi trường, nước, không khí, chất thải,
quá tải bệnh viện, nằm ghép, dụng cụ y tế, các phẫu thuật, các can thiệp thủ thuật
xâm lấn, vật nuôi.
1.2.2. Nhiễm khuẩn huyết do vi sinh vật
Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ các ổ
nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: da, mô mềm, cơ, xương khớp, hô hấp, tiêu
hóa... Ban đầu, bệnh được mô tả gắn liền với các vi khuẩn Gram âm. Nguyên nhân
là do nhiễm khuẩn huyết được coi là một phản ứng của cơ thể với nội độc tố
(endotoxin) một phân tử tương đối đặc hiệu cho các vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên
trong giai đoạn 1979-2000, nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram
dương lại chiếm ưu thế [7].
Trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết, Staphylococcus aureus
là chủng Gram dương phổ biến nhất, còn Acintobacter baumannii, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, và Pseudomonas aeruginosa chiếm ưu thế trong các chủng
Gram âm [29].

9


a. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều bệnh

khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đời sống bệnh
nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội chứng sốc độc tố.
S. aureus (MRSA) kháng Methicillin và S. aureus (MSSA) mẫn cảm với Methicillin
là nguyên nhân gây tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn.
Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA
gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm
nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực
phẩm, và nhọt độc [30]. MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a,
một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa). Protein này có ái
lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam. Gen femA mã hóa cho protein PBP2a kháng
methicillin, do đó gen này được sử dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA
[31, 32].
Staphylococcus aureus kháng Methicillin được phát hiện trong một nghiên
cứu của Hassanain và tập thể (2009). Trong nghiên cứu này các tác giả sử dụng
phương pháp nhân bản gen đa mồi. 5 gen được nhân bản bao gồm: 16S rRNA của
chi Staphylococcus, MecA của S. aureus, gen MecA mã hóa cho kháng methicillin,
gen Luks mã hóa sản xuất của Panton-Valentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử
và một gen nội chuẩn để tránh hiện tượng âm tính giả. Thử nghiệm trên 230 chủng
phân lập lâm sàng, cho thấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới
99,3% [33].
b. Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii là trực cầu khuẩn, gram âm, hiếu khí, không lên
men glucose. Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các điều kiện
môi trường rất cao do vậy A. baumannii xuất hiện phổ biến trong môi trường và là
một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [34]. Trong thập kỷ qua, chúng ngày
càng được chỉ ra là một vi sinh vật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau
ở bệnh viện bao gồm nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng

10

đường tiết niệu, nhiễm trùng vết thương và viêm màng não [35]. A. baumannii có
khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt cùng với khả năng tiếp nhận và tích
lũy các gen kháng kháng sinh cao cấp dẫn tới sự kháng thuốc hàng loạt [36].
c. Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae là vi khuẩn gram âm và là mầm bệnh cơ hội chiếm
tới 10% tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến của bệnh nhiễm trùng
đường tiết niệu, nhiễm trùng huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch,
đồng thời là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với bệnh nhiễm trùng cộng đồng
[37]. Tầm quan trọng của Klebsiella pneumoniae trong cơ sở y tế đang gia tăng do
khả năng kháng kháng sinh phổ rộng β-lactamase của chúng. Các nghiên cứu chỉ ra
rằng sinh vật kháng kháng sinh phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn tới khả
năng thất bại trong điều trị. Do vậy mà chúng ngày càng đóng vai trò quan trọng
trong nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng cộng đồng [38].
Một số phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng cho việc phát hiện K.
pneumoniae như phân tích đa hình nhân bản ngẫu nhiên DNA (RAP-PCR), điện di
trường xung đẩy hoặc đa hình khuếch đại các đoạn dài (AFLP) [39]. Tuy nhiên, các
phương pháp này dựa trên các băng điện di vì vậy kết quả có thể không rõ ràng,
nhưng nhìn chung các phương pháp này rất thích hợp để điều tra khú trú dịch tễ
học. Tuy nhiên, rất khó để so sánh kết quả do phòng thí nghiệm khác nhau công bố
cho thực hiện một phân tích dịch tễ học trên toàn thế giới. Để khắc phục những hạn
chế của các phương pháp trên, phương pháp xác định trình tự nhiều gen đặc trưng
(MLST) đã được phát triển, đó là một phương pháp giải trình tự nucleotide các đoạn
trình tự điển hình của vi khuẩn hoặc nấm [40]. Phương pháp này dễ dàng được
chuẩn hóa, lưu trữ và trao đổi thông tin điện tử. Nó được áp dụng thành công cho
việc khu trú dịch tễ học của một loạt các vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở mức lâm
sàng như Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecium, Neisseria meningitidis, và Campylobacter jejuni. Rất gần đây, một phương
pháp MLST nhằm phát hiện K. pneumoniae sử dụng 7 gen quản gia bao gồm rpoB,
GAPA, MDH, PGI, phoE, infB, và tonB đã được phát triển [41].

11


d. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn hình que, gram âm được tìm thấy phổ
biến trong môi trường tự nhiên, con người và động vật. Chúng sinh trưởng mạnh
trong điều kiện ẩm ướt và có thể sử dụng một loạt các hợp chất hữu cơ. P.
aeruginosa gây nhiễm trùng nghiêm trọng dẫn tới tỷ lệ tử vong cao ở bệnh nhân suy
giảm miễn dịch và là một trong các nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện [42,
43].
P. aeruginosa là sinh vật phổ biến nhất được phân lập từ phổi của 80% bệnh
nhân trưởng thành với chứng xơ nang phổi. Sự có mặt của chủng vi sinh vật này
tương quan với sự suy giảm chức năng phổi và các triệu chứng lâm sàng của bệnh
nhân. Tại bệnh viện, các loại thiết bị y tế hoặc dụng cụ có liên quan đóng vai trò
như một nguồn cung cấp P. aeruginosa và những nguồn này trở thành tiêu điểm cho
việc bùng phát lây lan vi sinh vật [44].
Kích thước hệ gen của P. aeruginosa khoảng từ 5,2-7,1 Mbp. Mức độ dao
động kích thước có ý nghĩa quan trọng đối với các phương pháp được sử dụng để
nghiên cứu sự tiến hóa và dịch tễ học của vi sinh vật này. Nghiên cứu gần đây cho
thấy rằng hơn 80% trình tự hệ gen của các chủng (chủng PAO1) được công bố (chỉ
với 0,5% nucleotide bị phân tán). Trong khi đó, hiện nay hàng loạt các phương pháp
di truyền phân tử được sử dụng để nghiên cứu dịch tễ học và phân tích di truyền
quần thể. Lomholt và cộng sự (2001), Pirnay và cộng sự (2002) sử dụng kỹ thuật
giải trình tự của gen mã lipoprotein màng ngoài, kết hợp với huyết thanh đặc trưng
và pyoverdine để nghiên cứu di truyền khảm nhiễm thể mở rộng, đặc biệt là ở gen
oprD [45, 46].
e. E.coli
E. coli là nguyên nhân vi khuẩn phổ biến nhất của nhiễm trùng bệnh viện và
chúng cũng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm trùng đường hô hấp và nhiễm

trùng đường tiết niệu. Cả hai chủng E. coli và P. Aeruginosa đều là các tác nhân gây
nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở các đơn vị chăm sóc y tế đặc biệt và gây ra
nhiễm khuẩn y tế và nhiễm khuẩn cộng đồng [47].

12


Vi khuẩn Gram âm, trong đó có E. coli thường có liên quan nhiều đến nhiễm
khuẩn bệnh viện và phổ biến trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi. Họ vi khuẩn đường
ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hoá của người và động vật,
đang là mối quan tâm lớn trong nhiễm khuẩn bệnh viện do có khả năng kháng cao
với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactamase và có khả năng truyền tính
kháng qua plasmid. Nhiều nghiên cứu trong nước và quốc tế đã khẳng định, vi
khuẩn Escherichia coli gây nhiễm trùng chủ yếu trên đường tiết niệu, sinh dục của
phụ nữ và nhiễm trùng vết mổ [48].
1.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết
Mặc dù được điều trị chuẩn hóa và tốn kém nhưng tỷ lệ tử vong ở các bệnh
nhân nhiễm khuẩn huyết vẫn rất cao. Với những nỗ lực để ngăn chặn sự gia tăng về
tỷ lệ bệnh nhân tử vong do nhiễm khuẩn huyết, nhiều nghiên cứu đã tập trung theo
hướng phát triển các phương pháp chẩn đoán bằng cách cải thiện độ nhạy và giảm
thời gian xác định nguyên nhân của bệnh nhiễm khuẩn huyết. Chẩn đoán sớm cung
cấp những điều trị thích hợp, do đó có liên quan mật thiết với kết quả về mặt lâm
sàng. Mỗi giờ của sự chậm trễ trong điều trị sẽ làm giảm 7,6% cơ hội sống sót của
người bệnh mắc nhiễm khuẩn huyết. Ngoài ra, việc xác định tác nhân gây bệnh từ
đầu cũng góp phần tránh tình trạng lạm dụng kháng sinh [15]. Các phương pháp xác
định nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết (Hình 2).

13

Hình 2 : Các phương pháp xác định nhiễm khuẩn huyết [49]
1.3.1. Chẩn đoán nhiễm trùng huyết bằng phương pháp cấy máu
Phương pháp được dựa trên cơ sở một mẫu máu được nuôi cấy trong môi
trường giàu dinh dưỡng sau đó được nhận diện và kiểm tra các tác nhân gây bệnh
bằng cách sử dụng xét nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn. Phương pháp cấy máu được thực
hiện với các thiết bị tự động phát hiện sự tăng trưởng của vi sinh vật bằng cách phân
tích sự giải phóng CO2 bởi huỳnh quang hoặc cảm biến hoặc cách khác là thay đổi
áp suất trong bình nuôi cấy do sự tiêu thụ và sản xuất khí này dùng để chỉ thị sự
phát triển của vi sinh vật [22]. Mặc dù có những ưu điểm nhất định nhưng thời gian
thực hiện của phương pháp là quá dài dẫn tới khó khăn để đưa ra quyết định điều trị
nhanh chóng trong những trường hợp cần thiết [50]. Trong khi đó độ nhạy của
phương pháp còn bị ảnh hưởng bởi khoảng thời gian từ lấy máu đến nạp vào bình
nuôi cấy [22, 51]. Hơn nữa để có kết quả, cần thêm một thời gian phát triển của sinh
vật gây bệnh khoảng 24 đến 72 giờ và việc nhuộm Gram cần thêm thời gian ủ qua
đêm để thu được khuẩn lạc riêng rẽ cho xét nghiệm. Hơn nữa, kết quả âm tính chỉ

14


có thể được kết luận sau 5-7 ngày. Ngoài ra, hiệu ứng ức chế của các loại thuốc
kháng sinh hoặc mầm bệnh khó nuôi cấy cũng làm hạn chế độ nhạy của phương
pháp [52].
1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ
Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp được
nghiên cứu nhiều nhất trong các kỹ thuật thương mại. Phương pháp này phù hợp
cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy máu dương tính. Trong khoảng
2,5-3 giờ, FISH có thể xác định hơn 95% vi khuẩn và nấm men thường được tìm
thấy trong máu [53, 54]. Kết quả cấy máu dương tính được chuẩn bị, lai với mẫu dò
oligonucleotide gắn huỳnh quang hướng tới đích là rRNA, và quan sát bằng kính
hiển vi [55]. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là một số vi khuẩn chỉ có

thể được phát hiện ở cấp độ chi bởi vì không sẵn có mẫu dò cho đặc hiệu cấp độ
loài. Một phương pháp lai huỳnh quang mới dựa trên phương pháp lai sử dụng đầu
dò peptide axit nucleic nhắm tới đích là 16SrRNA cho phép phát hiện trực tiếp S.
aureus từ các môi trường cấy máu dương tính trong vòng 3 giờ [56] được phát triển.
Kỹ thuật này đã được mở rộng để cho phép phát hiện vi khuẩn và nấm khác từ cấy
máu dương tính [57]. Độ nhạy và độ đặc hiệu cho các bộ kit khác nhau đã được báo
cáo tương ứng là 99% và 100% [22].
1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA
a. PCR
PCR là kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát hiện của mầm bệnh
từ cấy máu dương tính. Sử dụng xét nghiệm thương mại có sẵn hoặc broad-range
PCR hoặc multiplex PCR.
Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của các đoạn DNA có
trình tự bổ sung với gen đích cùng khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để
nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu. Do DNA
polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn-mồi, trong môi trường
thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy
để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu.
Kỹ thuật PCR rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn (ở mức nanogam) là phản
15


ứng đã có thể cho kết quả dương tính. Phương pháp này có độ nhạy cao, chính xác,
phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn.
b. Mutiplex PCR
Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng tác nhân gây
bệnh trực tiếp từ máu. Mutiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùng một
mẫu trong cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi. Kỹ thuật này thường được
dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của vi sinh vật. Đây là vùng
không mã hóa của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt

giữa các loài vi khuẩn, nấm và các loài sinh vật khác. Phương pháp có mức độ nhạy
cao hơn khi sử dụng mồi thoái hóa [22].
Mặc dầu kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh, nhạy các tác nhân gây
bệnh so với cấy máu thông thường và có thể hỗ trợ rất lớn trong chẩn đoán nhưng
không thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu. Trong nhiều nghiên cứu, tỷ lệ
phát hiện bệnh do kết hợp của cả hai phương pháp cao hơn hẳn so với chỉ thực hiện
PCR hoặc nuôi cấy máu riêng lẻ. Toàn bộ quá trình xét nghiệm bằng PCR đến khi
cho kết quả có thể được hoàn thành trong khoảng 5 giờ. Phương pháp này rút ngắn
thời gian cần thiết cho xác định kiểu hình và kháng sinh đồ đồng thời có ưu điểm là
độ nhạy độ, đặc hiệu rất cao. Một trong những hệ thống xét nghiệm điển hình là
StaphPlex demonstrated có độ nhạy và độ đặc hiệu lên tới xấp xỉ 100% và có độ
dao động từ 95,5% đến 100,0% khi dùng để xác định tụ cầu khuẩn [61].
c. Broad-range PCR
Broad-range PCR cho phép phát hiện vi khuẩn hoặc nấm trong máu dựa trên
gen mã cho gen 16S rRNA hoặc gen 23S rRNA của vi khuẩn và gen 18S rRNA của
nấm. Sau phản ứng, các sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện bằng các
phương pháp khác nhau như phân tích giải trình tự, pyrosequencing, hoặc lai với
mẫu dò đặc hiệu [89].

16


d. Real-time PCR
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch
đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong
đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh
quang. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch
đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống
phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc
điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên

mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đích ban đầu.
Real-time PCR là phương pháp nhanh hơn so với PCR truyền thống và
không cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn. Áp dụng các phương
pháp phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài vi khuẩn cụ
thể từ các mô hoặc nhiễm trùng, như viêm màng não do vi khuẩn. Đối với các vi
khuẩn nhiễm trùng bệnh viện, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác
định các đối tượng này [59, 60].
1.3.4. Giải trình tự
Một số phương pháp giải trình tự DNA được nghiên cứu nhằm xác định vi
khuẩn, nấm gây bệnh được lấy trực tiếp từ mẫu máu dương tính trong môi trường
cấy máu. Qian và tập thể (2001) đã sử dụng MicroSeq 500 kit (Perkin-Elmer
Applied Biosystems,CA), một phương pháp về trình tự đầu tiên để xác định 527
base của gene 16S rRNA nhằm xác định các chủng sinh vật gây bệnh [61]. Turenne
và tập thể (2000) sử dụng phân tích đa hình sợi đơn PCR để phân biệt giữa các sinh
vật [62]. Một số nghiên cứu đã sử dụng pyrosequencing để nhận dạng nhiều vi
khuẩn, nấm men và nấm [63, 64]. Ưu điểm chính của pyrosequencing là nhanh
chóng và giá cả thấp hơn so với giải trình tự thông thường đồng thời cung cấp
nhanh chóng trình tự các đoạn ngắn khoảng 30 bp trong khoảng 30 phút. Phương
pháp này đã được sử dụng để phân loại, xác định nhiều loại vi khuẩn [65]. Tuy
nhiên giải trình tự và giải trình tự thế hệ mới đòi hỏi thiết bị phức tạp, tốn kém do
đó không phải dễ dàng chuyển sang thực hành lâm sàng.

17


Ngoài ra, còn nhiều phương pháp phân tử khác chẳng hạn như, khối phổ hay
DNA chip (microarray)… được ứng dụng để phát hiện và chẩn đoán tác nhân gây
nhiễm khuẩn huyết. Ưu điểm của các phương pháp này là có độ nhạy, chính xác cao
và tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, do đòi hỏi về chi phí vận hành và yêu cầu trình độ
kỹ thuật nên các phương pháp này không được sử dụng phổ biến.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Minh Hiền và cộng sự (2015) về bệnh nhân
nhiễm khuẩn huyết nặng điều trị tại Bệnh Viện Thanh Nhàn có 42,5% tử vong dù đã
được điều trị tích cực như lọc máu liên tục, thở máy. Trong đó có 22,5% phát hiện
vi sinh vật. Điều trị chậm 1giờ, thang điểm SOFA tăng 1 điểm thì nguy cơ tử vong
tăng 1,25 lần. Do đó phương pháp xác định nhanh đối tượng nhiễm khuẩn là hết sức
quan trọng. Phương pháp multiplex PCR hiện nay là phương pháp có khả năng đáp
ứng được yêu cầu của thực tế. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5
chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus,
Acintobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Pseudomonas
aeruginosa) sử dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần vào
việc phát hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần vào điều trị hiệu quả.

18


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
Các mẫu DNA tổng số của các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus,
Acintobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Pseudomonas
aeruginosa được bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp.
Các chủng nhiễm khuẩn huyết (nuôi cấy thuần).
Mẫu bệnh phẩm được lấy từ bình cấy máu của 50 bệnh nhân người Việt
Nam nghi ngờ bị nhiễm khuẩn huyết được lấy từ Bệnh viện Thanh Nhàn.
Mẫu máu được lấy từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết do bệnh viện
Thanh Nhàn cung cấp.
Các cặp mồi được tổng hợp bởi Proligo (Sigma-Aldrich, Corporation, USA)
(Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi
Cặp mồi

AbF/AbR
EcF/EcR
PaF/PaR
KpF/KpR
SaF/SaR

Trình tự
AbF: 5’-ATTTACAGTGGCACATTAGGT-3’
AbR: 5’-GCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’
EcF: 5’-AAGCCCGGACACCATAAATGC-3’
EcR: 5’-TCATTACGTTGCGGATTTGGC-3’
PaF: 5’-ATGGAATAGCTGAAATTCGG-3’
PaR: 5’-CTTCTTCAGCTCGACGCGA-3’
KpF: 5’-GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCA-3’
KpR: 5’-TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA-3’
SaF: 5’-CTCTTGCTGGTTTCTTCTTTATC-3’
SaR: 5’-GTGCGGTATATGCTGCGTAA-3’

Hóa chất: Mastermix, Tris-base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr, Agarose và
các hóa chất khác do hãng Merck cung cấp.
2.1.2. Thiết bị
Máy PCR, máy chạy điện di, máy li tâm lạnh, máy lắc ổn nhiệt, bể ổn nhiệt,
lò vi sóng, tủ lạnh sâu(-80oC), máy vortex, máy đo pH, tủ cấy vô trùng, Pipetman
các loại (Gilson, Pháp), máy soi chụp gel, kính hiển vi điện tử và các trang thiết bị
khác của phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công Nghệ Sinh Học
trực thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
19


2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương
pháp đun sôi
Bổ sung lysozyme nồng độ 1 mg/ml vào 1 ml mẫu bệnh phẩm cấy máu, ủ ở
37o trong 30 phút. Sau đó đun sôi mẫu ở 100 oC trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh
trong nước đá 5 phút. Ly tâm mẫu với tốc độ 12 000 vòng/phút trong 5 phút để lấy
dịch nổi (chứa DNA).
2.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm
khuẩn huyết
DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được tách theo chỉ dẫn của kit
Qiagen theo thứ tự các bước như sau:
Hút 1 ml máu của bệnh nhân vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 7000 v/ph
để thu tế bào.
Hòa tan tế bào trong 180 µl đệm lysis chứa enzyme lysozyme 1 mg/ml và ủ
ở 37oC trong 30 phút.
Bổ sung 4 µl enzyme RNase 10 mg/ml, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5
phút.
Bổ sung 200 µl EtOH (96-100%), đảo đều.
Hút dịch lên cột, ly tâm cột 8000 v/ph, 1 phút, bỏ dịch qua cột.
Bổ dung 500 µl dung dịch AW1 lên cột, ly tâm 8000 v/ph trong 1 phút, bỏ
dịch qua cột.
Bổ sung 500 µl dung dịch AW2 lên cột, ly tâm 12 000 v/ph trong 5 phút, bỏ
dịch qua cột.
Bổ sung 100 µl nước khử ion vô trùng lên cột, để khoảng 1 phút, sau đó ly
tâm 8000 v/ph để thu DNA.
2.2.3. Xác định nồng độ DNA
Nồng độ DNA mạch kép được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước
sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280).
Nồng độ DNA được tính theo công thức:
CDNA = OD260 × 50 × d
Trong đó: d: độ pha loãng mẫu khi đo

CDNA: nồng độ DNA
Nếu 1,8 ˂ OD260/OD280 ˂ 2 thì mẫu DNA được đánh giá là đạt yêu cầu về
mức độ tinh sạch cho các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
2.2.4. Cắt DNA bằng enzyme lamda exonuclease

20


Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt DNA sợi đôi bằng enzyme lamda
exonuclease bao gồm 16µl DNA, 2µl enzyme và 2 µl buffer. Ủ hỗn hợp phản ứng ở
37oC trong 30 phút.
2.2.5. PCR
Phản ứng PCR đơn mồi
Các gen đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
Thể tích 1 phản ứng PCR là 25 µl bao gồm 12,5 µl master mix, 1 µl mồi xuôi 10
pmol/ml, 1 µl mồi ngược 10 pmol/ml, và 8,5 µl H 2O. Chương trình phản ứng PCR:
bước 1: biến tính 95oC trong 3 phút; bước 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (94oC trong
45 giây, 57oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút); bước 3: hoàn thiện sản phẩm ở
72oC trong 8 phút; bước 4: làm mát sản phẩm PCR ở 10oC trong 30 phút.
Phản ứng PCR đa mồi
Thể tích phản ứng PCR đa mồi là 25 µl với thành phần bao gồm: 12,5 µl
master mix; 0,5 µl SaF 10 pM; 0,5 µl SaR 10 pM; 0,3 µl AbF 10 pM; 0,3 µl AbR 10
pM; 0,3 µl EcF 10 pM; 0,3 µl EcR 10 pM; 0,3µl PaF 10 pM; 0,3 µl PaR 10 pM; 0,3
µl KpF 10 pM; 0,3 µl KpR 10 pM; 3 µl khuôn DNA và 6,1 µl H 2O. Chương trình
phản ứng PCR: bước 1: biến tính 95oC trong 3 phút; bước 2: chu trình lặp lại 30 chu
kỳ (94oC trong 45 giây, 57oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút); bước 3: hoàn thiện
sản phẩm ở 72oC trong 8 phút; bước 4: làm mát sản phẩm PCR ở 10 oC trong 30
phút.
Phản ứng PCR với mồi random haxamer
Thể tích phản ứng PCR với mồi random hexamer (làm giàu DNA vi khuẩn)

với các thành phần: 12,5 µl Mastermiex, 1 µl random hexamer, 8 µl khuôn DNA và
3,5 µl H2O. Chương trình phản ứng: bước 1: biến tính 95 oC trong 3 phút; bước 2:
chu trình lặp lại 20 chu kỳ (94oC trong 45 giây, 50oC trong 45 giây, 72oC trong 1
phút 30 giây); bước 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72 oC trong 8 phút; bước 4: làm mát
sản phẩm PCR ở 10oC trong 30 phút.
2.2.6. Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1% : cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE
1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 50 oC rồi rót
dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút, khi
gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Rót đệm TAE 1X vào bể để

21