Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn agrobacterium

Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Phạm Thị Lý Thu đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Lê Quang Hòa cùng các
thầy cô giáo phòng Sau Đại học, thầy cô giáo Viện CN Sinh học & CN Thực phẩm
– Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công
nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong
suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Cuối cùng tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người đã luôn
quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận này,
cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.

Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2013
Học viên

Nguyễn Thị Hòa

Nguyễn Thị Hòa

-i-

Hà Nội, 09/2013

Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ADN

: Deoxirionucleic Acid

Bt

: Bacillus thuringensis

CCC

: Chiều cao cây

CCĐB

: Chiều cao đóng bắp

Cry

: Crystal

CS

: Cộng sự

CTAB

: Cetyltrimethylammonium Bromide

ĐC

: Đối chứng

FAO

: Food and Agriculture Organization

GMC

: Genetically Modified Corn

GMO

: Genetically Modified Organism

OD

: Optical Density

PCR

: Polymerase Chain Reaction

T-DNA

: Transfer-DNA

TGST

: Thời gian sinh trưởng

Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid
Vir

: virulence

Nguyễn Thị Hòa

- ii -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1 Bản đồ Ti- plasmid dạng octopin .................................................................9
Hình 2.2 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật ...........................................12
Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp ...................................................................16
Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pADT2 ....................................................................35
Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra mẫu ADN tổng số trên gel agarose 0,8 % ..........46
Hình 3.2 Kết quả phân tích PCR gen Cry1A(c) ở các cây T2 của dòng VN106 ......48
Hình 3.3 Kết quả phân tích PCR gen Cry1A(c) ở các cây T2 của dòng CH9 ..........48
Hình 3.4 Kết quả đánh giá sự hiện diện protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang
gen kháng sâu thế hệ T2 ............................................................................................50

Hình 3.5 Đánh giá khả năng kháng sâu của dòng ngô CH9.13.159.1 chuyển gen
bằng phương pháp thử sâu in vitro ............................................................................53
Hình 3.6 So sánh một số chỉ tiêu nông sinh học chính của các dòng ngô chuyển gen
kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2 với các dòng ngô đối chứng (chưa chuyển gen) ......55
Hình 3.7 Các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2 trồng trong nhà
lưới cách ly côn trùng ................................................................................................55
Hình 3.8 Các cây T2 được trồng trong nhà lưới cách ly ...........................................56
Hình 3.9 Kết quả phân tích PCR gen Cry1A(c) ở các cây T3 của dòng VN106 ......58
Hình 3.10 Kết quả phân tích PCR gen Cry1A(c) ở các cây T3 của dòng CH9 ........58
Hình 3.11 Kết quả lai Southern blot các dòng ngô CH9 chuyển gen Cry1A(c) thế hệ
T3 ..............................................................................................................................59
Hình 3.12 Kết quả đánh giá sự hiện diện protein Cry1A(c) trong các dòng ngô CH9
chuyển gen kháng sâu thế hệ T3 ...............................................................................61
Hình 3.13 Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân trên lá và thân của các dòng mang
gen kháng sâu thế hệ T3 ...........................................................................................63
Hình 3.14 So sánh một số chỉ tiêu nông sinh học chính của các dòng ngô CH9
chuyển gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T3 với dòng ngô đối chứng (chưa chuyển
gen) ............................................................................................................................64
Hình 3.15 Các dòng ngô CH9 mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T3 trồng trong
nhà lưới cách ly côn trùng .........................................................................................65

Nguyễn Thị Hòa

- iii -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen ..............................................17
Bảng 1.2 Các gen chỉ thị sinh hóa .............................................................................18
Bảng 2.1 Danh sách các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T1 sử dụng
làm vật liệu nghiên cứu .............................................................................................34
Bảng 2.2 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu ......................................38
Bảng 3.1 Kết quả PCR phân tích các dòng ngô chuyển gen T2 ...............................47
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô
mang gen kháng sâu thế hệ T2 ..................................................................................49
Bảng 3.3 Đánh giá mức độ gây độc của các dòng ngô mang gen ............................51
Bảng3.4 Đánh giá một số đặc tính nông sinh học chính của các dòng ngô mang gen
kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2 ...................................................................................53
Bảng 3.5 Các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2 sử dụng làm vật
liệu nghiên cứu ..........................................................................................................56
Bảng 3.6 Kết quả PCR phân tích các dòng ngô chuyển gen T3 ...............................57
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô
mang gen kháng sâu thế hệ T3 ..................................................................................60
Bảng 3.9 Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) thế hệ T3 ............................................................................................62
Bảng3.9 Đánh giá đặc tính nông sinh học chính của các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) thế hệ T3 .............................................................................................63

Nguyễn Thị Hòa

- iv -

Hà Nội, 09/2013

Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
KÝ HIỆU VIẾT TẮT............................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH VẼ .......................................................................................... iii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1 Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây ngô trong hệ thống cây trồng .......................4
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại...................................................................................4
1.1.2. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế ..........................................................4
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam....................................5
1.1.4. Khái quát tình hình sâu hại ngô ở Việt Nam................................................6
1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật .........8
1.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens .........................................8
1.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid.........................................................8
1.2.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-ADN .............................................9
1.2.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
...............................................................................................................................10
1.2.5 Tương tác giữa T-ADN và genome tế bào thực vật....................................12
1.3 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
vào tế bào thực vật ....................................................................................................13
1.3.1 Hệ vector hai nguồn ....................................................................................14
1.3.2 Hệ vector liên hợp .......................................................................................15
1.3.3 Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vector biến
nạp .........................................................................................................................16
1.4 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và Cry ..........................................19
1.4.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis ...................................19
1.4.2 Những nghiên cứu về gen Cry ..................................................................19

1.4.3 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể độc .........................................20
Nguyễn Thị Hòa

-v-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

1.4.4 Một số nghiên cứu về gen Cry1A(c) ...........................................................22
1.5 Thực trạng nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Sinh học trong chọn tạo giống
ngô .............................................................................................................................23
1.5.1 Hệ thống tái sinh ở cây ngô.........................................................................23
1.5.2 Hệ thống chuyển gen ở ngô ........................................................................26
1.5.3 Một số đặc tính đã được cải thiện ở cây ngô bằng kĩ thuật di truyền .........30
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................34
2.1 Vật liệu ................................................................................................................34
2.1.1 Vật liệu thực vật ..........................................................................................34
2.1.2 Vật liệu di truyền.........................................................................................34
2.3 Phương pháp thí nghiệm .....................................................................................35
2.3.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng ..........................................................35
2.3.2 Phương pháp phân tích các dòng ngô chuyển gen .....................................37
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................45
3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá của các dòng ngô mang gen kháng sâu
Cry1A(c) thế hệ T2 ....................................................................................................45
3.2 Kết quả phân tích PCR sự có mặt của gen Cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển
gen thế hệ T2 .............................................................................................................46
3.3 Đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen

kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2 ...................................................................................48
3.4 Đánh giá khả năng kháng sâu của các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c)
thế hệ T2 bằng phương pháp thử sâu in vitro ...........................................................50
3.5 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và các đặc tính nông học quan trọng
của các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2 .....................................53
3.6 Kết quả phân tích PCR sự có mặt của gen Cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển
gen thế hệ T3 .............................................................................................................56
3.7 Phân tích Southern blot gen Cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T3
...................................................................................................................................58

Nguyễn Thị Hòa

- vi -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

3.8 Đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen
kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T3 ...................................................................................59
3.9 Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T3
trong điều kiện thử sâu nhân tạo trong nhà lưới cách ly ...........................................61
3.10 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và các đặc tính nông học quan trọng
của các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T3 .....................................63
CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................66
4.1 Kết luận ...............................................................................................................66
4.2 Đề nghị ................................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................67

Nguyễn Thị Hòa

- vii -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

MỞ ĐẦU
Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây lương thực quan trọng nhất trên thế
giới. So với lúa mì và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về năng suất
nhưng thứ nhất về sản lượng. Với giá trị kinh tế cao và khả năng thích ứng rộng,
cây ngô đã được trồng ở hầu hết các vùng trên trái đất. Năm 2012, diện tích trồng
ngô trên thế giới đạt 174,64 triệu ha với tổng sản lượng đạt 838 triệu tấn. Trong đó
Mỹ là nước có diện tích lớn nhất với 35,5 triệu ha, sản lượng đạt 274 triệu tấn
(James, 2012). Nhu cầu ngô của thế giới được dự báo sẽ tăng lên 50% với 852 triệu
tấn vào năm 2020 và có thể vượt qua cả gạo và lúa mì (Pingali & Padney, 2010).
Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, là đối tượng
chủ lực trong công cuộc xóa đói giảm nghèo, đặc biệt ở các tỉnh vùng núi. Năm
2012, diện tích gieo trồng ngô của cả nước đạt gần 1,2 triệu ha với sản lượng 4,6
triệu tấn, năng suất đạt 40,09 tạ/ha (Tổng cục thống kê, 2012). Tuy nhiên hàng năm
nước ta vẫn phải nhập khẩu ngô với lượng khá lớn, 1,614 triệu tấn năm 2012 với trị
giá hơn 500 triệu USD (Bộ Công thương, 2012). Theo chiến lược của Bộ Nông
nghiệp & PTNT đến năm 2020, sản lượng ngô của Việt Nam cần đạt 8 – 9 triệu
tấn/năm để đảm bảo cung cấp đủ nhu cầu trong nước và từng bước tham gia xuất
khẩu. Tuy nhiên sản xuất ngô đang phải đối mặt với tình hình sâu bệnh dịch hại
ngày càng tăng. Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng

để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại
cho sức khỏe con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, những kỹ thuật tiên
tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững đã
và đang được nghiên cứu.
Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops,
GMCs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật
đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng
suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp.

Nguyễn Thị Hòa

-1-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Cây ngô chuyển gen đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996, đến năm
2012 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 55,1 triệu ha chiếm 31,6% tổng diện tích
trồng ngô trên toàn thế giới. Trong số đó, ngô chuyển gen kháng sâu biểu hiện
protein Cry có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) chiếm khoảng 7,5
triệu ha (4%) (James, 2012). Tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen trên đối
tượng cây ngô đã được thực hiện tại iện Di truyền Nông nghiệp từ năm 2002. Cho
đến nay, các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) đã được tạo ra bằng phương
pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
các giống ngô chuyển gen kháng sâu ở

ới mục đích chọn tạo được

iệt Nam, các nghiên cứu đánh giá sự có

mặt và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng ngô mang gen kháng sâu
Cry1A(c) là rất cần thiết.
Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các
dòng ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium”.
Mục tiêu nghiên cứu:
Đánh giá được sự có mặt, tính ổn định của gen chuyển Cry1A(c) trong các
dòng ngô chuyển gen kháng sâu (thế hệ T2, T3) thông qua các chỉ tiêu:
-

Phân tích PCR đối với gen Cry1A(c)

-

Phân tích Southern blot đối với gen Cry1A(c)

-

ác định sự hiện diện của protein Cry1A(c)

-

Đánh giá khả năng kháng sâu bằng phương pháp thử sâu invitro và trong
điều kiện lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới cách ly côn trùng.

-

Đánh giá một số đặc tính nông học quan trọng của các dòng ngô chuyển gen.
Nội dung nghiên cứu:
- Phân tích sinh học phân tử (PCR) gen kháng sâu Cry1A(c) trong các dòng

ngô mang gen thế hệ T2, T3.
- Phân tích sinh học phân tử (lai Southern blot) gen kháng sâu Cry1A(c)

Nguyễn Thị Hòa

-2-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

trong các dòng ngô mang gen thế hệ T2, T3.
- Đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen
kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2, T3.
- Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) thế hệ T2, T3 bằng phương pháp thử sâu invitro.
- Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) thế hệ T2, T3 trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới cách
ly côn trùng.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, các đặc tính nông học quan
trọng của các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2, T3.

Nguyễn Thị Hòa

-3-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây ngô trong hệ thống cây trồng
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L, thuộc chi Maydeae, họ Hòa thảo
Gramineae, có bộ nhiễm sắc thể 2n = 20. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng
cây ngô có nguồn gốc ở Trung Mỹ, trung tâm phát sinh là Mehico (Galinat, 1995).
Trải qua hàng triệu năm phát triển, dưới tác động của chọn lọc tự nhiên và nhân tạo
đã hình thành 8 loài phụ, phân bố ở 4 vùng sinh thái: ôn đới, nhiệt đới thấp, nhiệt
đới cao và cận nhiệt đới.
Cây ngô quang hợp theo chu trình C4, có cường độ quang hợp cao gấp 3 lần
cây quang hợp theo chu trình C3, có khả năng quang hợp cao ở nồng độ oxy thấp.
Các yếu tố này có tiềm năng năng suất cao hơn các cây trồng khác ( ũ

ăn

ụ,

1997).
1.1.2. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế
Cây ngô luôn thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học vì có nhiều đặc
tính quý như sinh trưởng và phát triển nhanh, năng suất cao và khả năng thích ứng
rộng. Sản phẩm từ ngô đã và đang góp phần nuôi sống 1/3 dân số thế giới. Toàn thế

giới đã sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực. Đặc biệt là nhiều nước Châu
Phi, Châu Mỹ, v.v... ngô làm lương thực chính (khoảng 85% sản lượng ngô). Hạt
ngô chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, hàm lượng tinh bột trung bình khoảng 69,2%
(trong khi đó hàm lượng tinh bột trong gạo 62,4%; lúa mì 63,8%); protein 10,6%;
lipit 4,3%; chất xơ 2% và nhiều loại vitamin quan trọng cho sự sống. Chính vì thành
phần dinh dưỡng phong phú và đầy đủ này mà ngô đã được dùng rất nhiều trong
thành phần thức ăn bổ sung, giúp tái tạo và tăng cường năng lượng (Ngô Hữu Tình
và CS., 1997).
Cùng với những tác dụng trên, có đến 70% ngô được sử dụng để chế biến thức
ăn chăn nuôi, nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Nguyễn Thị Hòa

-4-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

(đường, rượu, bia, đồ uống giải khát); sản xuất xăng sinh học; công nghệ y dược,
ngô dùng để sản xuất glucose, peniciline, ngô non còn được dùng để tinh chế
vitamin v.v...
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam
Ngô được trồng ở hơn 100 quốc gia trên thế giới tập trung ở các nước Mỹ,
Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và ấn Độ, chúng chiếm 75% (FAO, 2008).
Trên thế giới, so với lúa mỳ và lúa gạo thì ngô đứng thứ ba về diện tích, thứ
hai về năng suất nhưng thứ nhất về sản lượng. Vào những năm cuối thế kỷ 20, nghề
trồng ngô đã có những bước phát triển kỳ diệu nhờ có những ứng dụng rộng rãi
công nghệ giống ngô lai và những thành tựu khoa học khác về di truyền tạo chọn

giống và kỹ thuật nông học. Châu Á đóng góp 1/3 sản lượng ngô trên thế giới.
Trung Quốc dẫn đầu với 197,5 triệu tấn trên diện tích trồng trọt là 34,95 triệu ha.
Tại Đông Nam Á, những nước có diện tích trồng ngô lớn nhất là Indonesia (41%),
Philippins (29%), Thái Lan (13%) và Việt Nam (12%).
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng nhất thứ hai sau lúa. Ngô được
trồng trong những điều kiện sinh thái khác nhau trên nhiều vùng. Các thời vụ trồng
ngô chủ yếu được căn cứ vào tác động của chế độ nhiệt, lượng mưa (Bùi Mạnh
Cường, 2007).
Năng suất ngô Việt Nam đến đầu những năm 1980 chỉ đạt khoảng 1 tấn/ha
do trồng các giống ngô địa phương với kỹ thuật canh tác lạc hậu. Từ giữa những
năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm Cải tạo Ngô và Lúa mỳ Quốc tế (CIMMYT),
nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng ở nước ta, góp phần nâng năng suất
lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những năm 1990.
Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô nước ta thực sự có những bước tiến nhảy vọt
là từ đầu những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng giống
ngô lai ra sản xuất, đồng thời cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác theo đòi hỏi
của giống mới.

Nguyễn Thị Hòa

-5-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Năm 1991, diện tích trồng giống lai chưa đến 1% trên hơn 400 nghìn hecta
trồng ngô, năm 2007 giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta.

Năng suất ngô nước ta tăng nhanh liên tục với tốc độ cao hơn trung bình thế giới
trong suốt hơn 20 năm qua. Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với
trung bình thế giới (11/32 tạ/ha); năm 1990 bằng 42% (15,5/37 tạ/ha); năm 2000
bằng 60% (25/42 tạ/ha); năm 2005 bằng 73% (36/49 tạ/ha) và năm 2007 đã đạt
81,0% (39,6/49 tạ/ha). Năm 1994, sản lượng ngô Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn,
năm 2000 vượt 2 triệu tấn. Năm 2012, diện tích trồng ngô trong nước đạt gần 1,2
triệu ha, năng suất khoảng 40,09 tạ/ ha và sản lượng là 4,6 triệu tấn.
Những thách thức đối với sản xuất ngô tại Việt Nam: (1) năng suất thấp so với
trung bình thế giới (80%) và rất thấp so với năng suất thí nghiệm, (2) có sự chênh
lệch lớn giữa các vùng và mùa vụ, giá thành sản xuất còn cao, (3) sản lượng chưa
đáp ứng nhu cầu trong nước đang tăng rất nhanh, những năm gần đây phải nhập 1,5
triệu tấn ngô hạt để chăn nuôi, (4) sản phẩm từ ngô còn đơn điệu, (5) công nghệ sau
thu hoạch chưa được chú ý đúng mức....
Nhiều vấn đề còn đặt ra cho ngành sản xuất ngô trên thế giới nói chung và
nước ta nói riêng: (1) khí hậu toàn cầu đang diễn biến rất phức tạp, đặc biệt là hạn
hán lũ lụt và nhiều loại sâu bệnh hại mới xuất hiện, (2) giá nhân công ngày càng
cao, cạnh tranh gay gắt giữa ngô và các cây trồng khác, (3) tập đoàn giống ngô thực
sự chịu hạn và các điều kiện bất lợi khác như đất xấu, chua phèn, thời gian sinh
trưởng ngắn đồng thời cho năng suất cao ổn định.... cho người sản xuất vẫn chưa
nhiều.
1.1.4. Khái quát tình hình sâu hại ngô ở Việt Nam
Việc điều tra thành phần sâu hại ngô ở nước ta đã được tiến hành trong 2 năm
1967-1968 ở miền Bắc do Ban điều tra cơ bản côn trùng, Bộ Nông nghiệp tổ chức
và vào năm 1977-1978 ở miền Nam do Viện Bảo vệ thực vật. Đây là những dẫn liệu
quan trọng về thành phần, phân bố và mức độ tác hại của các loài côn trùng gây hại
trên cây ngô.

Nguyễn Thị Hòa

-6-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Cho tới nay có khoảng hơn 100 loài côn trùng phá hại trên cây ngô. Căn cứ
tính chất và mức độ phổ biến chia thành 3 nhóm như sau:
- Nhóm I: Sâu hại chủ yếu gồm sâu xám, sâu cắn lá nõn, sâu đục thân, rệp ngô.
- Nhóm II: Sâu hại phổ biến nhưng không gây thiệt hại đáng kể: Châu chấu
lúa, dế trũi, dế mèn, bọ xít xanh, bọ xít vân hoa đỏ, sâu róm, sâu xanh, sâu khoang.
- Nhóm III: Gồm những sâu hại có thấy trên cây ngô nhưng mật độ thấp và
chưa bao giờ gây ra tác hại đáng kể. Một số loài như bọ ba ba (Cassida circumdata
Hebst), bọ nhảy, bọ hung có sừng, bọ xít nhỏ.
Về tính chuyên thực thì hầu hết các loài sâu hại ngô đã phát hiện ở nước ta đều
là những côn trùng ăn rộng, chỉ một số ít loài có thể coi là những loài ăn hẹp chuyên
phá hại trên các cây hoà thảo.
Đặc tính phá hại của các loài sâu hại ngô rất khác nhau. Có loài phá hại trên
nhiều bộ phận của cây như sâu đục thân ngô có thể phá hại ở nõn, đục vào thân, ăn
hoa đực, đục phá bắp, ăn hạt, sâu cắn nõn có thể ăn lá ngô, hoa đực, hạt non, râu
ngô. Có loài chuyên phá hại trên các bộ phận sinh sản của cây như sâu xanh chỉ ăn
hoa đực, râu ngô và hạt ngô. Một số loài khác chỉ ăn hại trên các bộ phân của cây
như sâu róm chỉ ăn lá ngô, mọt thóc chỉ phá hại trên hạt ngô.
Do đặc tính phá hại khác nhau nên có những loài chỉ thấy xuất hiện vào những
giai đoạn sinh trưởng nhất định của cây ngô như sâu xám, dế dũi chỉ thấy trong thời
kỳ cây non, mọt thóc chỉ thấy ở thời kỳ sắp thu hoạch. Ngược lại, có loài có thể phá
hại gần suốt cả thời kỳ sinh trưởng của cây như sâu đục thân ngô phá hại từ khi ngô
7-8 lá cho tới lúc thu hoạch, sâu cắn nõn phá hại từ thời kỳ cây con cho tới khi cây
chín sáp. Rệp ngô phá hại từ cây con cho tới khi gần thu hoạch.

Nguyễn Thị Hòa

-7-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật
1.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh cây sống trong đất, có khả
năng xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ.
Trong tự nhiên, Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc
biệt là nhóm thực vật có hoa. Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình
thường, khối u do Agrobacterium tumefaciens sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong
điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là do Agrobacterium
tumefaciens đã chuyển một đoạn T-ADN (Transfer ADN) sang tế bào thực vật và
T-ADN điều khiển quá trình sinh tổng hợp các các chất đó. Ngoài ra, các khối u
cũng sinh tổng hợp các opin là các axit amin (amino acid-aa) đặc biệt là các dẫn
xuất của đường. Dạng opin được tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin,
mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens.
Trong đó, octapin và nopalin là hai dạng opin phổ biến. Opin được vi khuẩn sử
dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opin trên
plasmid gây khối u thực vật (Tumor inducing plasmid - Ti-plasmid) (Brock, 1991;
Hooykass, 1992). Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã được quan tâm
nghiên cứu nhằm tìm ra một phương thức phòng bệnh cho cây. Khi phát hiện ra Tiplasmid và khả năng tự chuyển T-ADN vào genom thực vật, người ta đã đặc biệt
chú ý và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vectơ tự nhiên để chuyển các

gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn
(Võ Thị Thương Lan, 2007).
1.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng Agrobacterium tumefaciens
gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 300 C. Đây là một phân tử ADN
dạng mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập, có
kích thước khoảng 200 kb. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và
dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó vùng T-

Nguyễn Thị Hòa

-8-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

ADN và vùng gây độc (VIRulence Region-vùng VIR), liên quan trực tiếp tới sự
hình thành khối u ở thực vật.

ùng gây độc có chứa các gen mã hóa các

protein/enzyme VIR. Có 9 loại protein VIR là A, B, C, G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H,
J/AcvB (Genlvin, 2000). Các protein VIR này có vai trò quan trọng trong việc
chuyển T-ADN sang tế bào thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc
sao chép plasmid và chuyển nạp.
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-ADN được chuyển từ vi khuẩn sang genom
của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng này lại không

mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T- ADN mà cần có sự trợ
giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi
khuẩn (chv genes). Vùng VIR dài khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. ở
Ti-plasmid dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do
các gen này mã hóa đã kích thích sự tách biệt T-ADN, bao bọc che chở và giúp
chúng tiếp cận với genom cây chủ (Hooykass, 1992).

Hình 1.1 Bản đồ Ti- plasmid dạng octopin

1.2.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-ADN
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-ADN ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T-ADN được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ
khoảng 25 bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển
T-ADN và xâm nhập của T-ADN vào tế bào thực vật. Ở đoạn biên bên phải (Right

Nguyễn Thị Hòa

-9-

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

border-RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-ADN. Đoạn bên
trái (Left border-LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-ADN và là dấu hiệu
để quá trình này kết thúc bình thường (Narasimhulu , 1996; Lê Thị Thu Hiền,
2003).
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một

đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T- ADN là một đoạn
gen liên tục dài 13 kb. T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) các gen mã hóa những
enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u như tms1,
tsm2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và
cytokinin (Hooykass, 1992).
1.2.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi khuẩn
như: acetosyringon, hydroxy-acetosyringon... Dưới tác dụng của các hợp chất này,
Agrobacterium tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển TADN vào tế bào thực vật. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen VIR
và RB, LB (Võ Thị Thương Lan, 2007). Cũng chính các hợp chất này, với vai trò
cảm ứng, giúp cho các gen vùng VIR hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Hoạt động của các gen VIR sinh ra sợi đơn T-ADN làm xuất hiện bản copy
sợi bên dưới của T-ADN. Chỉ đoạn sợi đơn ADN giữa hai trình tự biên (LB và RB)
của T-ADN mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được gắn vào genome của tế
bào. Đó là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T-ADN. Protein VIRD1,
D2 đóng vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T-ADN và
cắt sợi bên dưới tại mỗi bên. Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái sinh. Sau
đó, protein VIRD2 vẫn còn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T-ADN và tế bào thực
vật. Nếu gây đột biến hay loại bỏ đọan RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng
chuyển T-ADN, còn nếu đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T-ADN (Hille,
1983). Điều đó chứng tỏ tổng hợp sợi T-ADN là từ đầu 5’đến 3’, được bắt đầu từ
đoạn RB và kết thúc ở LB.

Nguyễn Thị Hòa

- 10 -

Hà Nội, 09/2013

Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Phương tiện để chuyển đoạn T-ADN vào nhân tế bào thực vật là phức protein
và sợi T-ADN. Theo đa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi đơn T-ADN VIRD2 được bao bọc bởi protein VIRE2 có trọng lượng 96kDa. Sự phối hợp này
giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi đơn T- ADN duỗi thẳng làm
giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ 2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
di chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào (Gustavo, 1998). Protein
VIRE2 chứa đựng hai tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein
VIRD2 (Bravo Angel, 1998). Thực tế cho thấy hai protein này có vai trò quan trọng
trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào trong nhân tế bào thực vật (Rossi, 1996;
Zupan, 1996). Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong các protein này
bị giảm, nhưng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T-ADN và tương tác giữa
T-ADN với gennom tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác có thể đảm
nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu (Gustavo, 1998). Protein VIRE
cần thiết đối với quá trình bài xuất protein VIRE2 sang tế bào thực vật (Binns,
1995).
Protein VIRD4 cũng là bắt buộc đối với sự vận chuyển phức ss-T- ADN.
Chức năng của protein VIRD4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần
thiết với quá trình di truyền T-ADN (Firth và CS., 1996).
Các nghiên cứu công bố đã miêu tả vai trò của operon VIRB có kích thước
9,5kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển
phức từ vi khuẩn sang tế bào thực vật (Fernandez, 1996; Finberg, 1995).
Protein VIRB là protein có tính kị nước tương tự protein kết hợp trên màng
khác (Shirasu, 1990). Phần lớn protein VIRB đã được phát hiện giống như kênh
protein xuyên màng (Stephens, 1995; Ward, 1998). Tuy nhiên, cũng có thể vài
protein VIRB khác được phân phối lại trong quá trình phát sinh sinh vật và thực
hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận chuyển. Đáng chú ý là trong đó
protein VIRB2, VIRB11 là thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển T-ADN từ tế
bào vi khuẩn sang tế bào thực vật (Berger, 1994). Sau khi T-ADN qua màng tế bào

Nguyễn Thị Hòa

- 11 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản
sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào
lân cận dẫn đến sự hình thành khối u.

Hình 2.1 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật

1.2.5 Tương tác giữa T-ADN và genome tế bào thực vật
Trong tế bào thực vật, phức ss-T-ADN được đưa qua màng nhân vào nhân.
Hai protein đóng vai trò quan trọng trong bước này là VIRD2 và VIRE2. Tín hiệu
định vị trong nhân của VIRD2 và VIRE2 đóng vai trò chủ yếu. Protein VIRD2 có
chức năng xác định vị trí cho T-ADN trong nhân. Phức ss-T- ADN là phức
nucleoprotein lên đến 20Kb chứa một đầu 5’ gắn với protein VIRD2. Nhưng phức
được bao bọc bởi số lượng lớn phân tử VIRE2 (xấp xỉ 600/20kb T-ADN) và mỗi
phức này có hai tín hiệu định vị trong nhân. Hai tín hiệu này của VIRE2 đóng vai
trò quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T-ADN của nhân, có khả năng kích
thích mở lỗ màng nhân. Khả năng nhận phức của nhân được điều khiển bởi protein
kết hợp tín hiệu định vị đặc trưng trong nhân, protein này được tìm thấy trong tế
bào chất của tế bào thực vật (Gustavo, 1998).
Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T-ADN là sự tương tác trong

genom tế bào thực vật. Các phản ứng trong sự tương tác T-ADN không có tính điển

Nguyễn Thị Hòa

- 12 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

hình. Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật. Theo cách
nhìn nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, được cần đến đối với bước
lặp lại giữa cặp vận chuyển T-ADN với VIRD2 và ADN thực vật. Sự tương đồng
này rất thấp và cung cấp đặc trưng nhỏ nhất đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác
định vị trí của VIRD2 để gắn kết (Gustavo, 1998). Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của
T-ADN tìm thấy một vài sự tương đồng nhỏ với ADN thực vật, kết quả ở sự tương
tác đầu tiên giữa sợi T-ADN và ADN thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của ADN
thực vật. Sau đó ADN thực vật được cắt ở vị trí đầu 3’ của lỗ hổng bởi
endonuclease và nucleotit của đầu 5’ bắt cặp với VirD2 bởi một nucleotid của đầu
5’ bắt cặp với VIRD2 bởi một nucleotid trong đầu sợi (5’-3’) ADN thực vật. Phần
3’ nhô ra của T-ADN cũng như ADN thực vật thay thế bị phân hủy bởi
endonuclease hay 3’-5’ enxonuclease. Đầu 5’ của T-ADN gắn với VIRD2 còn đầu
3’ kia cặp đôi với ADN thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trình tương tác, nối
liền với vết cắt trong sợi ADN dưới của thực vật. Sự đưa vào của sợi T-ADN trong
sợi 3’-5’ của ADN thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong
sợi đối ngược được sản sinh.
Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung
được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T-ADN như là sợi khuôn (Gustavo,

1998). VirD2 có vai trò hoạt hóa trong sự kết hợp chính xác sợi T-ADN vào nhiễm
sắc thể thực vật. Giải phóng protein VIRD2 có thể cung cấp năng lượng chứa đựng
trong các liên kết phosphodieste, như Tyr29 với nucleotid đầu tiên của sợi T-ADN,
qui định đầu 5’ của sợi T-ADN không còn (Tinland, 1995). Ngoài ra quá trình
chuyển T-ADN còn có sự tương tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của
Agrobacterium tumefaciens quy định và protein trong tế bào thực vật.
1.3 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens vào tế bào thực vật
Ti-plasmid của A.tumefaciens đã được nghiên cứu cải biến như cắt bỏ các gen
không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng, tạo hai hệ

Nguyễn Thị Hòa

- 13 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

thống vector chuyển gen hiệu quả như vector hai nguồn (binary vector) và vector
liên hợp (co intergrate vector) (Walkerpeach, 1994). Nhờ vậy, cây trồng được biến
nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát
triển bình thường (Hajdukiewicz , 1994).
1.3.1 Hệ vector hai nguồn
Nghiên cứu của Zhao và Ranch (2006) đã thành công trong việc chuyển gen
vào phôi non dòng ngô lai HiII và các dòng ngô khác sử dụng hệ thống vector mới:
vector hai nguồn. Quy trình chuyển gen này có thể áp dụng để chuyển gen vào các
dòng ngô khác nhau, thậm chí các dòng ngô chọn lọc.

Trên cơ sở phát hiện hai vùng VIR không cần nằm trên cùng một plasmid
với vùng T-ADN mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vào
hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector hai nguồn
trong đó vùng T-ADN và vùng VIR nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong
cùng một chủng Agrobacterium tumefaciens
Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector hai nguồn:
(a) Vector chuyển gen là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ
vật chủ rộng với đoạn T-ADN được cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai
trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới: i)
các đơn vị sao chép để ADN plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E.coli và
Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt
của các enzyme giới hạn (vùng tạo dòng đa năng nằm ở giữa hai trình tự biên trái
và biên phải để chèn gen mong muốn).
(b) Vector bổ trợ: nằm trong Agrobacterium tumefaciens, với toàn bộ vùng
IR được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-ADN và RB, LB. Plasmid này
được cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng
vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật.

Nguyễn Thị Hòa

- 14 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Hai cấu trúc này cũng được đưa vào Agrobacterium tumefaciens, khi các gen
trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-ADN

trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-ADN sang tế bào thực vật. Quá
trình biến nạp ở vectơ hai nguồn diễn ra như sau: (i) Plasmid nhỏ được nhân lên
trong E.coli, sau đó được chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp hợp vào tế bào
Agrobacterium tumefaciens để chuyển T-ADN vào genom thực vật; (iii) chọn lọc tế
bào thực vật trong những điều kiện thích hợp (Armstrong, 1991).
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững
trong E. coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector hai nguồn có
một số ưu điểm như: (i) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; (ii)
Kích thước của vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E.coli
sang Agrobacterium tumefaciens đã tăng lên.
1.3.2 Hệ vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng
nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E.coli) với vùng T-ADN trên Ti-plasmid
của Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng
mã hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn ADN mới trong Tiplasmid (hình 1.3)

Nguyễn Thị Hòa

- 15 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp

Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
(a) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kanamycin của vi

khuẩn (Hệ thống vector SEV) hoặc một đoạn trình tự của vector pBR322 (Hệ thống
vector pGV).
(b) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và được
bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid. Chúng được nhân lên trong E.coli
và chuyển sang Agrobacterium tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể
sao chép trong Agrobacterium tumefaciens nên chúng mang những đoạn tương
đồng với T-ADN.
(c) Vector trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có kích thước nhỏ, chứa các gen di
động (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào
Agrobacterium tumefaciens (Walkerpeach , 1994).
1.3.3 Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vector biến
nạp
Việc xem xét tính hữu hiệu của vector chuyển nạp cần chú ý đến việc chọn
gen chỉ thị phù hợp cho chọn lọc các sản phẩm chuyển gen và có tác dụng trong sự
Nguyễn Thị Hòa

- 16 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

phối hợp với các quy trình nuôi cấy mô và tế bào. Có hai loại chỉ thị chọn lọc đó là
chỉ thị chọn lọc di truyền và chi thị chọn lọc sinh hóa.
1.3.3.1 Các gen chỉ thị chọn lọc di truyền
Bảng 1.1 là danh mục các chỉ thị chọn lọc di truyền đã và đang được sử dụng
phổ biến hiện nay trong quá trình biến nạp gen. Việc chọn các gen chỉ thị di truyền
cần chú ý một số yêu cầu: Thứ nhất là chất chọn lọc ức chế sinh trưởng các tế bào

không được biến nạp; thứ hai là sự thể hiện của gen chọn lọc không ảnh hưởng tới
trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp; thứ ba là sự thể hiện của gen chọn lọc bảo
vệ tế bào khỏi tác dụng của chất chọn lọc và cho thấy rõ ràng sự khác nhau về sinh
trưởng giữa tế bào được chuyển nạp và tế bào không được chuyển nạp, thứ tư là
không ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây hoàn chỉnh tạo được từ cây chuyển gen.
Bảng 1.1 Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen

Chỉ thị

Chất trao đổi chất đối kháng

Tác giả

nptII

Aminoglycoside

Bevanvà CS.,1983

Kháng sinh (kanamycin
Neomycin, G418)
hyg

hygromycin

Waldron và CS.,1985

gent

Gentamycin

Hayford và CS., 1988

bleo

Bleomycin

Hille và CS.,1986

aat

Stretomycin, spectinomycin
(thể hiện của Aminoglycoside
Adenyl-transferase)

str/spc

Streptomycin, spectinomycin

Etzold và CS.,1987

(đột biến rARN)
cat

Chloramphenicol

Haring và De Block,1990

bar

Phosphinothricin

D’Halluin và CS.,1992

bxn

Bromoxynin

Stalker và CS.,1998

sul

Sulfonamide

Guerineau và CS.,1998

Nguyễn Thị Hòa

- 17 -

Hà Nội, 09/2013


Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định của gen chuyển trong các dòng
ngô chuyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Ngoài ra để đảm bảo mức độ an toàn sinh học đối với những cây trồng biến
đổi gen, một số hệ thống chọn lọc tích cực (positive selection system) đang được sử
dụng nhằm thay cho các gen kháng sinh và kháng thuốc diệt cỏ. Các gen này như:
isopentyl transferasr (ipt) (Sugita, 1999) và gen tăng trưởng rễ (root proliferation-rol

gen system) (Puddephat, 2001) thuộc hệ thống biến dưỡng hocmon sinh trưởng;
xylose isomerase (xylA) (Haldrup, 1998) và phosphomanose isomerase (pmi)
(Joerbo, 1998) thuộc hệ thống biến dưỡng đường. Tế bào thực vật được chuyển gen
pmi có khả năng biến dưỡng mannose 6-phosphate thành fructose 6-phosphate,
dạng đường được hấp thụ bởi tế bào thực vật. Hệ thống chọn lọc bằng mannose đã
được sử dụng thành công trong chuyển gen cho lúa (Hille, 1983), lúa mì và ngô
(Wright, 2001).
1.3.3.2 Các gen chỉ thị
Để phân biệt thể chuyển gen, các nhà nghiên cứu đã đưa vào các gen chỉ thị
được điều khiển bởi chuỗi khởi động đặc thù của thực vật và sản phẩm của các gen
này có thể phân tích bằng con đường sinh hóa. Một gen chỉ thị thực vật lý tưởng cần
có một số đặc điểm như: Sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào
thực vật chủ; các enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao; có các
phương pháp phân tích sản phẩm của gen thuận tiện rẻ tiền, nhạy và đặc thù, có khả
năng kết hợp với các polypeptide bên ngoài mà vẫn giữ được hoạt tính của enzym.
Bảng 1.2 Các gen chỉ thị sinh hóa

Gen chỉ thị

Sản phẩm gen

Tác giả

gus (Ecoli uidA)

- glucuronidase

Jefferson và CS.,1987

gus cải tiến

- glucuronidase

Vancanneyt và CS.,1990

Sinh hóa

GUS::NPT
gfp

Green fluorecent protein

lac (Ecoli lacZ)

-glucuronidase

Helmer và CS.,1984

nptII

neomycin

Redke và CS.,1988

Phosphotransferase
Nguyễn Thị Hòa

- 18 -

Hà Nội, 09/2013