Nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp pullulan và khảo sát điều kiện thu hồi pullulan từ aureobasidium pullulan IFO 4594

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
******************

PHẠM THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU SINH TỔNG HỢP
PULLULAN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU HỒI PULLULAN
TỪ AUREOBASIDIUM PULLULANS IFO 4594

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGÔ TIẾN HIỂN

PGS.TS. PHẠM THU THUỶ

HÀ NỘI


LỜI CẢM ƠN
Bản luận văn được thực hiện tại phòng Công nghệ đường bột – Viện Công
nghiệp thực phẩm từ tháng 2 đến tháng 10 năm 2010
Trước hết em xin được bày tỏ sự kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS Ngô Tiến Hiển và PGS.TS Phạm Thu Thuỷ đã hướng dẫn, chỉ bảo tận
tình cho em về chuyên môn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu và động viên tinh
thần cho em trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp.
Đồng thời em cũng xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các
cán bộ phòng Công nghệ đường bột – Viện Công nghiệp thực phẩm và các thầy
cô trong Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng em xin dành sự biết ơn đến những người thân trong gia đình và
bạn bè đã dành sự giúp đỡ quý báu cho em trong suốt thời gian vừa qua.
Hà nội ngày 25 tháng 10 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TÊN TÁC GIẢ LUẬN VĂN: PHẠM THỊ HẰNG

TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp pullulan

và khảo sát điều kiện thu hồi pullulan từ Aureobasidium pullulans
IFO 4594
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN 1

PGS.TS. NGÔ TIẾN HIỂN

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN 2

PGS.TS. PHẠM THU THUỶ


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

MỞ ĐẦU
Ngày nay khi cuộc sống ngày càng được nâng cao người ta không còn
chỉ quan tâm đến chất lượng sản phẩm mà còn quan tâm tới chất lượng cảm
quan của chúng như hương vị, màu sắc, kiểu dáng. Yếu tố này ảnh hưởng rất
lớn đến tâm hồn ăn uống của con người. Trong thực tế sản phẩm thực phẩm
nào có hình thức bắt mắt luôn đánh thức thị hiếu của người tiêu dùng. Đây
chính là động lực thúc đẩy các nhà sản xuất không ngừng nghiên cứu tạo ra sự
phong phú của sản phẩm.
Công nghệ sinh học ra đời và phát triển đã có nhiều đóng góp vào các
lĩnh vực đời sống của con người, nhất là trong lĩnh vực lương thực, thực
phẩm, nông nghiệp, năng lượng, tái tạo, y học…Trong đó kể đến những thành
công của công nghệ sinh học trong chế biến tinh bột với rất nhiều sản phẩm
và ứng dụng vô cùng phong phú của nó. Hiện nay pullulan là sản phẩm mới
được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong các ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược và các ngành công nghiệp khác nhờ
những tính chất ưu việt: tan hoàn toàn trong nước, có độ dính cao, chịu được
khoảng pH rộng, có thể tạo thành màng ngăn không cho không khí thấm qua.
Với những ứng dụng vô cùng phong phú đó mà pullulan được sản xuất
từ tinh bột bằng phương pháp lên men trên quy mô công nghiệp ở rất nhiều
nước trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ…với giá thành
sản phẩm tương đối cao. Tuy nhiên ở Việt Nam lại chưa có một cơ sở sản
xuất pullulan. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất pullulan là
tinh bột sắn lại có sản lượng rất lớn ở Việt Nam. Xuất phát từ yêu cầu thực tế
cấp thiết đặt ra em được giao nhiệm vụ nghiên cứu thực hiện đề tài: “ Nghiên
cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp pullulan và khảo sát điều kiện thu hồi
pullulan từ Aureobasidium pullulans IFO 4594”. Với các nội dung sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý của chủng Aureobasidium
pullulans IFO 4594.
2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pullulan.

3. Tối ưu hoá các yếu tố công nghệ để tổng hợp pullulan với hàm
lượng cao.
4. Khảo sát các điều kiện thu hồi pullulan.

1


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

PHẦN I:TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PULLULAN
1.1.1. Cấu tạo của pullulan
Pullulan là một polysaccarit mạch thẳng được cấu tạo chủ yếu bởi các
đơn vị maltotrioza liên kết theo liên kết α – 1,6 glucozit. Mà các đơn vị này
được cấu tạo gồm ba đơn vị glucoza theo liên kết α – 1,4 glucozit. [27]

Hình 1.1: Cấu trúc của pullulan
Đã có nhiều nghiên cứu về phân tử lượng của pullulan cho thấy trọng
lượng phân tử của pullulan là 2,5.105 – 4,5.105 dalton. Các phân tử pullulan
thành phẩm chứa khoảng 480 đơn vị maltotrioza [27]. Sở dĩ có sự dao động
như vậy là do phân tử lượng thay đổi theo thời gian lên men. Những công bố
gần đây của ông Lee và Yoo cho thấy pullulan bị thuỷ phân đơn giản bởi
nước ở pH 4,5 – 7,5 [32]. Còn ông Yeun cho thấy có thể điều chỉnh được
phân tử lượng bằng cách lựa chọn chủng và thay đổi các điều kiện nuôi cấy
[36]. Ông Sugimoto thì lại cho rằng pH và nồng độ photphat là hai yếu tố
quan trọng có ảnh hưởng tới phân tử lượng của pullulan. Phân tử lượng
pullulan giảm khi tăng pH và nồng độ photphat trong canh trường [35].

2


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

1.1.2. Tính chất của pullulan
Pullulan không mùi, không vị, hoà tan trong nước, dung dịch có độ
nhớt nhưng không tạo gel. Dung dịch pullulan có sức căng bề mặt, ổn định và
độ nhớt nó không thay đổi khi có mặt của các ion kim loại khác trong dung
dịch. Dung dịch pullulan có độ dính rất cao.
Pullulan có thể tạo được các loại vật liệu có hình dạng khác nhau.
Pullulan được tạo thành màng có tính chất ngăn ngừa không cho không khí
thấm qua.
Bảng 1.1: Bảng tính chất của pullulan [27]
Trạng thái

Dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng trắng

Các maltotrioza trong phân tử
(%)

Chiếm 94

Sự hoà tan trong nước

Dễ tan

Độ ẩm (%)

<6

Chất tro (%)

<0,1

Protein (%)

<0,1

Asenic (%)

<2ppm

Kim loại nặng

<5ppm

Độ nhớt

140cst

pH

2-12

Nhiệt độ nóng chảy (oC)

250 - 280

3


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

1.1.3. Ứng dụng của pullulan 
Pullulan được sử dụng rất nhiều trong ngành thực phẩm, dược phẩm,
hoá học và các ngành công nghiệp khác.
1.1.3.1. Ngành công nghiệp thực phẩm
Dựa vào khả năng tạo màng không cho không khí thấm qua nên
pullulan được sử dụng làm vật liệu phủ bên ngoài, gói và đóng kín cho từng
loại thực phẩm khác nhau. Thật vậy pullulan sử dụng làm vật liệu bao gói,
phủ ngoài để ngăn sự thất thoát hương, làm mất mùi vị của sản phẩm, đồng
thời tránh được sự oxi hoá chất béo có trong các sản phẩm thực phẩm.

Hình 1.2 :Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo
Ngoài ra do màng pullulan giữ được hình dạng trong suốt quá trình in
nên nó còn được ứng dụng trong các sản phẩm bánh kẹo. Nó dễ dàng tô màu
và làm tăng chất lượng cảm quan cho sản phẩm thực phẩm. Pullulan được cán
mỏng làm túi đựng chè và được dùng để bảo quản trứng và các sản phẩm từ
trứng. Pullulan được dùng để cải tiến chất lượng và hình dạng sản phẩm.
Thêm 0,1 % pullulan vào các sản phẩm thịt nướng, thịt nhồi, xúc xích… để
giữ hình dạng cho chúng.
Kết hợp 2-3% pullulan cho phép sáng tạo kẹo chewy mềm được thực
hiện bởi một quá trình làm lạnh thông thường mà không cần đến sôi. Điều này
cho phép vật liệu nhạy cảm nhiệt được sử dụng trong các sản phẩm này [35].
4

Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

Pullulan được sử dụng làm tăng độ nhớt của đồ uống, kem và xúc xích.
Pullulan còn đươc sử dụng làm để nối các đoạn các mảnh của sản phẩm thịt,
cá, bò và gia cầm đã được nấu để tạo hình dáng cho chúng trong các bữa ăn
nhanh hoặc thức ăn nhanh. Do khả năng kết dính tốt nên pullulan được bổ
sung vào trong nước sốt có tác dụng giữ nước sốt trên bề mặt của một số sản
phẩm thịt, cá đã được nấu chín, làm tăng sản phẩm thêm hấp dẫn và thu hút
khách hàng hơn [36].

Hình 1.3: Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước sốt thịt cá
Pullulan hầu như không bị phân huỷ bởi các enzim tiêu hoá nên nó
được sử dụng như thành phần thực phẩm ít calo. Để tạo thực phẩm ít calo,
người ta trộn bột mì, tinh bột amyloza và pullulan giống như bánh bích quy,
bánh xốp… mà trong đó pullulan thay thế các thành phần amyloza.
1.1.3.2. Ngành công nghiệp dược phẩm, y học
Pullulan dùng để duy trì áp suất thẩm thấu ở trong máu và mô tế bào và
có thể làm tăng cung cấp huyết tương. Nó được sử dụng như là huyết tương
mở rộng tạo ra những ảnh hưởng có lợi. Nó được tạo bằng cách hoà tan
pullulan có phân tử lượng từ 3000 – 9000 trong dung dịch muối sinh lí để tạo
nên dịch pullulan 4 – 10% V. Sau đó đem tiệt trùng, dung dịch này được cấp
vào thông qua việc tiêm vào tĩnh mạch một cách lặp đi lặp lại với sự an toàn

5

Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

tuyệt đối. Pullulan có thể được chuyển hoá và bài tiết hoàn toàn. Trong tương
lai, pullulan có thể được ứng dụng trong lĩnh vực tương đối mới của polyme
hoạt tính sinh lí học cho mục đích gọi là tác nhân chống ung thư điều chỉnh
miễn dịch trong việc chữa bệnh ung thư bằng tá dược.

Hình 1.4 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc
Gần đây, aureobasidins là những chất kháng sinh tự nhiên được tách ra
từ dịch lên men của chủng Aureobassidium pullulans R106 được chiết suất và
thu nhận từ lá cây của Nhật Bản. Aureobasidins có hoạt tính chống mốc cao,
chống lại bệnh nấm Candida albicans [29].
Pullulan có thể được sử dụng với các sản phẩm làm dược phẩm dinh
dưỡng. Nhờ có nguồn gốc thiên nhiên nên không biến đổi gen. Pullulan còn
có thể được sử dụng làm vỏ bọc thuốc trong các sản phẩm dược phẩm nhờ
tính chất chống oxy hoá tốt làm tăng thời hạn bảo quản cho sản phẩm.
1.1.3.3. Ngành công nghiệp khác
Các dẫn xuất của pullulan được este hoá có thể được sử dụng trong
công nghiệp sản xuất hồ dán, sử dụng làm chất nền cho các giấy khác nhau.
Vật liệu có độ hoà tan mong muốn có thể được tạo ra và sử dụng cho các sản
phẩm giấy có hoặc không có vật liệu khác (như là bột gỗ). Giấy pullulan có

6


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

tính thấm cao nên phù hợp cho việc in ấn và viết. Ứng dụng cụ thể của
pullulan trong một số ngành công nghiệp như :
Công nghiệp sản xuất thuốc lá: Pullulan có trong thành phần nhựa tổng
hợp nhạy ánh sáng để tạo điều kiện dễ dàng loại bỏ phần tối trên mảng bằng
sự hoà tan.
Công nghiệp dệt : Là tác nhân hồ vải
Công nghiệp sản xuất mỹ phẩm: Là tác nhân tạo gel mà để giữ ẩm và
tăng gel trong son môi và làm ổn định mỹ phẩm dạng kem và dạng lỏng, ví dụ
pullulan có trong thành phần của sản phẩm “Kem dưỡng mắt tinh hoa trứng
cá Beautycode Switzerland”, “Nhũ tương nâng da và làm trắng toàn diện
ngày và đêm”

Hình 1.5 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm
Công nghiệp sản xuất chất kết dính: Pullulan có trong chất dán khô và
chất dán giữ ẩm cho các nhãn hàng, tem thư, phong bì…
Công nghiệp sản xuất sơn: Pullulan có trong sơn nước tạo với sự tạo
thành các màng có thể tô màu, trang trí.
Công nghiệp sản xuất in ấn: Pullulan có trong thành phần thấm nước.

7


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

1.2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN
1.2.1. Tình hình sản xuất pullulan trên thế giới
Vào năm 1938, R. Bauer là người đầu tiên nghiên cứu về pullulan. Có

khá nhiều nước trên thế giới sử dụng chủng Aureobasidium pullulans để sinh
tổng hợp pullulan [27].
Năm 1977, tại Nhật Bản, sử dụng chủng Aureobasidium pullulansIFO
4464 để sinh tổng hợp pullulan, với nguồn cacbon là siro glucoza DE 45, lên
men trong 4 ngày thu được dịch pullulan là 6%. Nhưng ở Hàn Quốc, năm
1987 cũng sử dụng chủng này với nguồn cacbon là saccaroza 5%, nhiệt độ lên
men 28oC, vận tốc lắc 200 vòng/phút người ta chỉ thu được lượng pullulan là
27,5 g/l.
Năm 2003, các nhà khoa khọc trường Đại Học Ege – 35000 Bernova
Izmin – Turkey sử dụng chủng Aureobasidium pullulan P56 để sinh tổng hợp
pullulan với nguồn cacbon ban đầu là saccaroza 50 g/l, vận tốc lắc là 200
vòng/phút thu được lượng pullulan cao nhất là 21,4 g/l.
Năm 2009, tại Ấn Độ, người ta sử dụng chủng Aureobasidium pullulan
MTCC 2195 với nguồn nguyên liệu nước dừa, sau 6 ngày lên men sinh tổng
hợp pullulan nhận được tối đa là 58 g/l .
Hiện nay chưa có tài liệu nào công bố chính thức giá thành của
pullulan. Tuy nhiên qua tham khảo ở một số trang web trên mạng internet
chúng tôi thấy rằng giá thành của pullulan biến động trong khoảng rất rộng
tùy theo từng nước, theo chất lượng pulluan và theo mục đích sử dụng.
Bảng 1.2: Bảng giá thành pullulan ở một số nước trên thế giới
Quốc gia

Nhật

Trung Quốc

Mỹ

Giá ($/kg)

230

159 -209

790

8


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

1.2.2. Giới thiệu chủng giống Aureobasidium pullulans
Aureobasidium pullulans là một trong nhưng loại nấm mốc phổ biến
nhất trên trái đất. Chúng có mặt khắp mọi nơi cả trong môi trường nhân tạo và
tự nhiên. Chúng có thể được phân lập ở các vùng ôn đới, vùng nhiệt đới và
vùng khô cằn; ở các môi trường khác nhau như: nước bẩn, không khí, biển và
các loại đất khác nhau. Aureobasidium pullulans có những thuộc tính của nấm
như sự sắp xếp bào tử đính, người ta đã thấy nó có hình dáng, cấu tạo giống
với Ascomycotina. Aureobasidium pullulans là loại hiếu khí bắt buộc, ưa ấm,
sinh bào tử, sinh sản hữu tính bằng bào tử, nó chịu được khoản pH rộng,
muối trung hoà và lượng tia UV cao.

Hình 1.6 Chủng Aureobasidium pullulans
Aureobasidium pullulans có rất nhiều tên gọi nhưng tên thông thường
nhất là Pullularia Pullulans và Dematium pullulans. Đã có nhiều tranh cãi
cho rằng có những cái tên khác phù hợp hơn Aureobasidium, nhưng cái tên
này lại chỉ ra được màu vàng và bào tử đính của nấm, trong khi đó hai tên gọi
kia đều không thích hợp và không xác định được hình thái của Aureobasidium

pullulans. Hình thái của Aureobasidium pullulans được miêu tả trong các
thuật ngữ đơn giản như là lưỡng bội, giả men, hoặc nấm men đen, mặc dù
trong thực tế nó có nhiều dạng và khả năng biểu diễn các dạng đó là vô số.

9


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

Bằng cách nuôi cấy giọt các đơn bào để nghiên cứu hình thái của nó, người ta
đã cho thấy có một vòng đời phức tạp bao gồm sáu vòng đời nhỏ.

Hình 2.7 Các hình thái đơn bào của Aureobasidium
Hình 1 .7. Các hình thái đơn bào của Aureobasidium pullulans
a. Hình dạng thay đổi của các đơn bào, một số tế bào thì đang nảy chồi
b. Các đơn bào đang mọc chồi ở cả hai đầu của tế bào.
c. Đơn bào phình to với sự nảy chồi lưỡng cực và dấu vết của vật liệu
có độ nhớt được kết hợp.
d. và e. Đơn bào và các tế bào phình to
f. Cấu hình chưa được xác định rõ
Vòng đời đầu tiên được mô tả bằng chồi bào tử sinh ra các chồi bào tử
khác thông qua vô số các chồi. Vòng đời thứ hai là sự hình thành sợi nấm. khi
mà các chồi không còn đủ để tách ra từ tế bào mẹ. Nitrat cần thiết cho vòng
đời này, sợi nấm quá dài làm cho khả năng phát triển và tồn tại độc lập của nó
thấp đi. Vòng đời thứ ba tế bào phồng lên với sự mọc chồi hoặc nảy chồi. Giai
đoạn này phụ thuộc vào nồng độ nuôi cấy và cần thiết bổ sung NH4+ làm
nguồn nitơ và pH môi trường lớn hơn 4. Vòng đời thứ tư miêu tả sản phẩm
của tế bào có vách ngăn mà sau đó mọc chồi, nảy chồi hoặc tạo thành

chlamydospore. Vòng đời này phụ thuộc vào nồng độ canh trường và nồng độ
nuôi cấy hoặc chỉ phụ thuộc vào nồng độ nuôi cấy. Hai vòng đời cuối được
miêu tả là sự nảy mầm của các chlamydospore. Nhưng những nghiên cứu sau
10


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

này trên môi trường rắn đã cho thấy sự tạo thành sản phẩm dạng sợi có thể
trực tiếp thông qua sự nảy chồi của các chồi bào tử.
Sự tạo thành các hình thái khác nhau của chủng phụ thuộc vào thành
phần dinh dưỡng của môi trường và các yếu tố khác. Brown và cộng sự (năm
1973) đã công bố việc điều chỉnh hình thái một phần nào đó của một vài
chủng thông qua nguồn nitơ, cụ thể NH4+ làm tăng hỗn hợp đơn bào và dạng
sợi, trong khi đó thì NO3 – chỉ tạo sợi đơn bào [25]. Nhưng mối liên hệ này
không được khẳng định trong các nghiên cứu sau này. Brown cũng đã thử
nghiệm một vài nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ với các nồng độ khác nhau, ông
nhận thấy cystein và metionin có tác dụng tạo nên các sợi, nhưng ông chưa
xét tới ảnh hưởng của pH lên khả năng này của chủng. Ông Park (năm 1982)
sử dụng môi trường rắn để nghiên cứu và ông không tìm thấy mối liên hệ nào
giữa nguồn nitơ và đặc trưng hình thái của chủng này [33]. Tuy nhiên, ông
cũng chỉ ra rằng NH4+ có khuynh hướng tạo khuẩn lạc dạng sợi nhiều hơn
NO3-. Nồng độ nitơ cũng ảnh hưởng đến việc hình thành cấu trúc và việc
chuyển từ dạng chồi bào tử sang dạng bào tử đòi hỏi nồng độ nhất định về
nồng độ nitơ. Nghiên cứu cho thấy pH cũng ảnh hưởng tới việc hình thành
hình thái của nấm mốc. pH ban đầu là 2,5 thì các dạng sợi được hình thành,
nếu pH ban đầu là 6,5 thì các chồi được hình thành [29].
Với sự có mặt của glutamat và (NH4)2SO4 ở nồng độ cao nấm mốc chủ

yếu tạo dạng sợi tại pH không đổi bằng 6,5, nhưng ở pH là 2,5 thì tạo các đơn
bào. Nồng độ nuôi cấy cũng quan trọng: nồng độ nuôi cấy thấp thì tạo thành
dạng sợi, nồng độ cao thì các đơn bào tử được hình thành.

11


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

1.2.3. Nguyên liệu sắn
1.2.3.1. Tình hình sản xuất sắn trong nước và ngoài nước
Trong những năm gần đây, năng lực sản xuất và biến sắn của Việt Nam
đã có bước tiến bộ đáng kể. Năm 2008 diện tích trồng sắn của nước ta đã tăng
mạnh từ 270.000 ha (năm 2005) lên 510.000 ha, sản lượng ước đạt hơn 8 triệu
tấn, tăng 2,3% so với năm ngoái, nhưng tăng gần gấp đôi so với 3 năm trước.
Đáng chú ý là diện tích tăng vượt 135 nghìn ha so với quy hoạch phát triển
sắn tới năm 2010. Năng suất những năm vừa qua cũng tăng, mặc dù không
nhiều, từ 15,35 tấn/ha vào năm 2005 (trung bình của thế giới là 12,16 tấn/ha)
lên 15,7 tấn/ha vào năm 2008 nhưng vẫn thấp so với Ấn Độ (31,43 tấn/ha),
Thái Lan (21,09 tấn/ha). Sản lượng cả năm 2009 ước đạt 8,1 đến 8,6 triệu tấn,
cao hơn năm ngoái khoảng 0,2 đến 0,4 triệu tấn.
Hiện nay trên phạm vi cả nước, có khoảng 60 nhà máy chế biến tinh
bột sắn có quy mô công nghiệp với tổng công suất chế biến mỗi năm hơn nửa
triệu tấn tinh bột sắn, tương ứng với nhu cầu sử dụng gần 2,5 triệu tấn củ sắn
tươi, bằng 30% sản lượng cả nước, tăng gấp đôi số nhà máy và gấp 3 về công
suất so với 5 năm trước đây.
Từ đầu năm đến nay, sắn là một trong ít các mặt hàng có khối lượng
xuất khẩu cũng như kim ngạch xuất khẩu tăng mạnh. Theo thống kê của

Trung tâm thông tin công nghiệp và thương mại - Bộ Công Thương, trong 7
tháng đầu năm 2009, cả nước đã xuất khẩu được 2,66 triệu tấn sắn và tinh bột
sắn, đạt kim ngạch 408 triệu USD, tăng 4,4 lần về sản lượng và tăng 2,8 lần
về kim ngạch so với cùng kỳ 2008.

12


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

Bảng 1.3. Sản lượng sắn củ tươi trên thế giới (ngàn tấn)
Các vùng
Thế giới
Châu phi
Nigêria
Mỹ Latinh
Braxin
Thái Lan
Inđônêxia
Việt Nam
Ấn Độ
Trung Quốc
Campuchia

2006
224.483
117.449
45.721

36.311
26.639
22.584
19.987
7.783
7.620
7.500
2.182

2007

2008

2009

217.536
104.952
34.410
36.429
26.541
26.411
19.988
7.985
8.429
7.875
2.215

233.391
118.461
42.770

37.024
26.600
25.156
20.269
8.300
8.959
8.300
3.604

242.069
121.469
45.000
36.606
26.000
30.088
20.500
8.600
9.200
8.700
3.275

Về nhu cầu tiêu thụ sắn tại thị trường Trung Quốc tăng mạnh, mặc dù
nhu cầu cho chăn nuôi giảm nhẹ nhưng nhu cầu cho sản xuất nhiên liệu sinh
học lại tăng đã giúp cho tổng tiêu thụ sắn trong năm 2009 nhìn chung vẫn
được duy trì. Trong đó, nhu cầu của Trung Quốc để đáp ứng nguyên liệu cho
các nhà máy chế biến nhiên liệu sinh học được dự báo sẽ tăng mạnh.
Nhu cầu đối với mặt hàng sắn của Trung Quốc là rất lớn. Dự kiến mỗi
năm nước này phải nhập khẩu từ 6 - 6,5 triệu tấn sắn/năm mới đáp ứng đủ
nhu cầu.
1.2.3.2. Cấu tạo và tính chất của tinh bột sắn

Hình dạng : Hạt tinh bột sắn có nhiều hình dạng chủ yếu là hình tròn,
bầu dục bề mặt nhẵn, một bên mặt có chỗ lõm hình nón và một núm nhỏ ở
giữa.
Kích thước : Quan sát bằng SEM (Scanning Electron Microscope), hạt
tinh bột sắn có kích thước từ 5 đến 40µm với những hạt lớn 25- 35µm, hạt
nhỏ 5- 15µm. Dưới ánh sáng phân cực, các liên kết ngang với mật độ từ trung
bình tới dày đặc có thể thấy rõ.
13


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

Cấu tạo: Tinh bột sắn có cấu tạo bởi hai cấu tử amyloza và amylopectin
giống như các tinh bột khác.
Hàm lượng amylopectin và phân tử lượng trung bình có trong tinh bột
sắn tương đối cao, 215.000g/mol so với 30.500, 130.00, 224.500 và 276.000
tương ứng ở amyloza của ngô bắp, tinh bột lúa mì, tinh bột khoai tây và tinh
bột ngô bắp sáp. Hàm lượng amyloza nằm trong khoảng 8- 29%, nhưng nói
chung đa số các giống sắn có tỷ lệ amyloza 16- 18%.

Hình 1.8. Cấu trúc của amyloza va amylopectin
Tinh bột sắn có những tính chất tương tự các loại tinh bột chứa nhiều
amylopectin như độ nhớt cao, xu hướng thoái hoá thấp và độ bền gel cao.
Hàm lượng amylopectin và amyloza trong tinh bột sắn liên quan tới độ dính
của củ nấu chín và nhiều tính chất trong các ứng dụng công nghiệp
Tinh bột sắn có nhiệt độ hồ hoá trong khoảng 58,5- 700C so với 56660C ở khoai tây và 62- 720C ở tinh bột ngô.

14

Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

1.2.4. Cơ chế lên men sinh tổng hợp pullulan
Catley và cộng sự [29] đã nghiên cứu cơ chế tạo thành pullulan từ
Aureobasidium pullulans và đưa ra giả thuyết để tạo thành pullulan cần có
chất mang lipit – photphat. Giai đoạn đầu nhờ có lipit – photphat sẽ biến đổi
cơ chất thành lipit – pyrophotphat – isopanoza và lipit – pyrophotphat –
panoza. Sau đó chất mang được tách ra và tạo thành panoza và isopanoza, hai
chất này được trùng hợp tạo oligosacarit trong phân tử pullulan. Ông đã
chứng minh những chất đó là chất trung gian để sinh tổng hợp pullulan (hình
1.9 và 1.10).

Hình 1.9. Cơ sở hoá học cho sự tạo thành isopanoza, panoza (sự trùng hợp
các đơn vị này để tạo thành pullulan)

15


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

Hình 1.10 Cơ sở hoá học cho sự tạo thành oligosaccharit trong pullulan
Cathey và cộng sự đã cho rằng sự tạo thành pullulan ở bên trong hay
bên ngoài tế bào chất trong quá trình tổng hợp là chưa rõ ràng. Tuy nhiên họ
khẳng định sự tạo thành pullulan phụ thuộc nhiều vào thành tế bào vì sản

phẩm được tạo ra bởi chủng Aureobasidium pullulans ở trong thành tế bào
nhiều hơn. Nhưng Frinkleman và Vardanis thì cho rằng thể nguyên sinh và cả
tế bào có thể tổng hợp nên pullulan mặc dù kích thước phân tử khác nhau.
Một điều đáng chú ý là không có nghiên cứu nào chỉ ra các enzim liên
quan đến quá trình tổng hợp pullulan mặc dù chúng có thể tồn tại.
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.2.5.1. Ảnh hưởng của giống vi sinh vật
Hiện nay Aureobasidium pullulans được sử dụng phổ biến để sinh tổng
hợp pullulan. Chủng giống Aureobasidium pullulans có vai trò rất lớn trong
quá trình sinh tổng hợp tạo pullulan, mỗi loại chủng khác nhau cho hàm
lượng pullulan khác nhau. Khi sử dụng chủng Aureobasidium pullulan P56
16


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

cho hàm lượng pullulan 21,4 g/l, còn chủng Aureobasidium pullulan IFO
4464 cho hàm lượng pullulan là 27,5 g/l. Đặc biệt với chủng Aureobasidium
pullulan MTCC 2195 cho hàm lượng pullulan lên đến 58 g/l.
1.2.5.2. Thành phần môi trường
* Nguồn cacbon
Mỗi chủng vi sinh vật khác nhau sử dụng nguồn cacbon khác nhau để
sinh trưởng và phát triển cũng như sinh tổng hợp tạo sản phẩm. Đối với
Aureobasidium pullulans thì nguồn cacbon thường là glucoza, saccaroza, siro
glucoza DE 45, tinh bột chuyển hoá… ShinChulet cho rằng nồng độ cacbon
cao sẽ ức chế nấm mốc phát triển và ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp
pullulan, nhưng nếu nồng độ cacbon quá ít thì lại không đủ để vi sinh vật sinh
trưởng, phát triển được và sinh tổng hợp tạo ra sản phẩm. Ông đã nghiên cứu

với nguồn cacbon là saccaroza với hàm lượng 30g/l; 50g/l; 70g/l và thu được
hàm lượng pululan tương ứng 9,2 g/l; 16,7g/l; 5,6 g/l.
Trong khi đó năm 1977, tại Nhật Bản, nguồn cacbon là siro glucoza
DE45 thu được dịch pullulan lên tới 6%, cao hơn hẳn so với sử dụng nguồn
nguyên liệu saccaroza.
* Nguồn nitơ
Sự sinh tổng hợp pullulan không chỉ phụ thuộc vào loại nguyên liệu mà
còn phụ thuộc vào nồng độ nguồn nitơ. Nguồn nitơ mà vi sinh vật dễ hấp thụ
nhất là muối amôn. Ngoài ra người ta còn bổ sung nấm men thuỷ phân, yeast
extract. Nồng độ yeast extract thường sử dụng từ 2 – 4 g/l. Ở Hàn Quốc, năm
1987, sử dụng yeast extract với nồng độ 3 g/l. Sản xuất pullulan bởi
Aureobasidium pullulans HP-2001 sử dụng dịch nhão đậu tương là 7,5 g/l.
Năm 2003, tại Thổ Nhĩ Kỳ sử dụng yeast extract là 4g/l.

17


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

*Nguồn nguyên tố khoáng
Chỉ cần một lượng nhỏ nguyên tố vi lượng cũng có thể làm tăng rất
mạnh hoạt động sống của vi sinh vật. Trong các nguyên tố vi lượng thì các
nguyên tố P, K, Mg, S… có ảnh hưởng rất rõ đến khả năng sinh trưởng, sinh
tổng hợp của chủng vi sinh vật nói chung và chủng Aureobasidium pullulans
nói riêng. P là nguyên tố có tỷ lệ cao nhất trong các nguyên tố vi lượng. Bởi
vì việc bổ sung photphat (nhất là photphat kali) vào môi trường dinh dưỡng
ngoài tác dụng cung cấp P còn có tác dụng tạo ra tính đệm cho môi trường.
Với mỗi loại vi sinh vật thì nhu cầu đối với mỗi loại nguyên tố vi lượng là

khác nhau. Do đó tuỳ từng loài, từng giai đoạn phát triển mà cung cấp nguyên
tố vi lượng thích hợp. Đối với chủng Aureobasidium pullulans thì nguyên tố
cần dùng thường là K2HPO4 5g/l; MgSO4.7H2O 0,2g/l; (NH4)2SO4 0,6 g/l;
NaCl 1g/l.
1.2.5.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* pH môi trường
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp
của vi sinh vật. Do đó việc xác định pH ban đầu thích hợp và việc duy trì pH
cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là quan trọng. Đối với chủng
Aureobasidium pullulans thì khoảng pH hoạt động trong khoảng rộng từ 2 –
12. Tuy nhiên không phải ở bất kì khoảng pH nào lượng pullulan cũng tạo
thành nhiều, bởi vì pH còn ảnh hưởng đến sự phát triển hình thái của chủng.
Một số tác giả cho rằng nếu hạ thấp pH của môi trường hoặc giảm nồng
độ ion photphat sẽ làm tăng đáng kể khả năng trùng hợp tạo pullulan, làm
khối lượng phân tử pullulan lớn. Trong sản xuất người ta cần pullulan có
trọng lượng phân tử cao để ứng dụng trong một số sản phẩm như phim, tạo
dạng sợi, màng, tấm…Khi đó người ta điều chỉnh pH thấp và tăng ion
18


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

photphat để tạo ra pullulan có khối lượng phân tử mong muốn. Ngược lại với
môi trường có pH cao, nồng độ photphat cao lại tạo ra pullulan có trọng lượng
phân tử thấp, dịch lên men có độ nhớt thấp hơn, do đó thuận tiện cho quá
trình tinh chế tạo sản phẩm.
Năm 2003, các nhà khoa khọc trường Đại Học Ege – 35000 Bernova
Izmin – Turkey sử dụng chủng Aureobasidium pullulan P56 để sinh tổng hợp

pullulan đã nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu từ 4,5 – 8,5 kết
quả thu được tại pH = 7,5 cho hàm lượng pullulan cao nhất.
* Nhiệt độ môi trường
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật. Mỗi loại vi sinh vật khác nhau chỉ tồn tại và phát triển ở
một khoảng nhiệt độ nhất định, nếu cao quá hoặc thấp quá nó sẽ ức chế vi
sinh vật, thậm chí còn làm vi sinh vật bị chết. Trên thế giới người ta sử dụng
nấm mốc Aureobasidium pullulans lên men sinh tổng hợp pullulan ở nhiệt độ
26 – 320C. Với chủng Aureobasidium pullulans CGMCC 1234 nhiệt độ tối
ưu cho sự tăng trưởng tế bào là 32°C, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp
pullulan là 26°C. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng quá trình lên men
bằng cách sử dụng hai giai đoạn nhiệt độ là một phương pháp đầy hứa hẹn
cho sản xuất pullulan.
Năm 2009, tại Ấn Độ, sử dụng chủng Aureobasidium pullulan MTCC
2195 lên men ở 30oC. Năm 2003, tại Thổ Nhĩ Kỳ, sử dụng chủng
Aureobasidium pullulans P56 lên men ở 28oC.
* Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian nuôi cấy cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng,
phát triển và sinh tổng hợp tạo sản phẩm của vi sinh vật. Có những vi sinh vật
khi ở pha logarit tế bào phát triển rất mạnh thì khả năng sinh tổng hợp là tối
19


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

đa. Nhưng với một số loài nấm mốc thì khả năng sinh tổng hợp là lớn khi xuất
hiện bào tử đính. Nếu thời gian quá ngắn thì tế bào chưa phát triển tối đa,
không tạo nhiều sinh khối và khả năng sinh tổng hợp pullulan ít. Tuy nhiên,

thời gian quá dài cũng không tạo ra nhiều pullulan thậm chí còn tạo ra nhiều
tạp chất ảnh hưởng đến quá trình thu hồi pullulan sau này. Do vậy việc xác
định thời gian tối ưu là rất quan trọng đối với quá trình lên men nhằm tạo hàm
lượng pullulan cao.
* Ảnh hưởng của hàm lượng oxi
Đối với vi sinh vật thì việc cung cấp oxi là yếu tố quyết định đến quá
trình sinh trưởng và phát triển của chúng. Nhất là đối với loài nấm mốc (là vi
sinh vật hiếu khí) thì cần phải cung cấp oxi liên tục trong quá trình nuôi cấy.
Nếu lượng oxi không đủ sẽ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vi sinh
vật và tạo môi trường yếm khí sẽ làm ức chế sự phát triển của chủng nuôi.
1.2.6. Phương pháp thu hồi pullulan
Một số tác giả sử dụng phương pháp sau để thu hồi pullulan sau quá
trình lên men bởi chủng Aureobasidium pullulans: Dịch lên men nhận được
chứa pullulan được ly tâm để tách tế bào nấm mốc, tẩy màu. Sau đó pullulan
được tách ra bằng phương pháp kết tủa pullulan bởi dung môi metanol,
etanol, axeton. Tuy nhiên với phương pháp này pullulan nhận được vẫn chứa
40 – 60% nước, thậm chí cả dung môi bổ sung vào, ngoài ra còn chứa một
lượng tạp chất đường, tri -; di -; monosacarit; các chất vô cơ; protein; chất
màu. Các chất này tồn tại trong kết tủa pullulan rất khó tách ra và làm sạch,
đặc biệt lượng nước lớn nằm trong khối bầy nhầy, rất khó để xử lý nhiệt. Các
phương pháp này đòi hỏi bổ sung một lượng rất lớn các dung môi hữu cơ,
thường gấp từ hai đến ba lần thể tích dịch lên men. Mặc dù các dung môi có

20


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

thể thu hồi bằng chưng cất nhưng đó vẫn là có một bất lợi trong trong chi phí
sản xuất.
Việc bổ sung metanol gấp khoảng ba lần so với thể tích dịch lên men
cho kết tủa pullulan dễ dàng và gần như hoàn toàn.
Năm 1977, tại Nhật Bản, với dịch lên men chứa 6 -7 % pullulan cũng
sử dụng dung môi metanol, etanol, axeton để kết tủa pullulan.
Trong trường hợp này các sắc tố hiện diện trong dung dịch lên men
được hấp phụ vào và kết tủa với pullulan gây khó khăn để tẩy pullulan này.
Hơn nữa, ngay cả bổ sung cacbon hoạt tính để tẩy màu trước khi lọc cũng rất
khó vì dịch lên men có độ nhớt cao, do đó đòi hỏi phải pha loãng đến mức độ
nào đó. Hiện nay chưa có tài liệu nào nói về tỷ lệ than hoạt tính cần thiết
trong quá trình tẩy màu. Tuy nhiên trong sản xuất maltodextrin, có nguồn gốc
từ tinh bột như pullulan thì đều được tẩy màu bằng than hoạt tính ở 80oC, thời
gian từ 20 - 30 phút. Dịch đường fructoza thu hồi được sau quá trình đường
hoá được tẩy màu bằng than hoạt tính ở 800C trong thời gian 30 phút rồi lọc
bằng máy lọc chân không.

21


Phạm Thị Hằng

Luận văn tốt nghiệp cao học2008 - 2010

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Giống vi sinh vật
Chủng vi sinh vật: Aureobasidium pullulans IFO 4594. Chủng này nằm
trong bộ sưu tập giống vi sinh vật của viện Công nghiệp thực phẩm.
2.1.2. Nguyên vật liệu

Tinh bột sắn, siro glucoza DE45, saccaroza, chế phẩm enzim
pullulanaza.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
a. Môi trường thạch nghiêng
- Thạch 22 g /l
- Đường glucoza 20g /l
- Nấm men thuỷ phân, Yeast extract 2,5 g/l
- K2HPO4 5 g/l
- MgSO4.7H2O 0,2g/l
- (NH4)2SO4 0,6 g/l
- NaCl 1g/l
b. Môi trường nhân giống
- Glucoza 50 g/l
- Nấm men thuỷ phân, Yeast extract 2,5 g/l
- K2HPO4 5 g/l
- MgSO4.7H2O 0,2g/l
- (NH4)2SO4 0,6 g/l
- NaCl 1g/l
22