Nghiên cứu sàng lọc các chủng xạ khuẩn và đánh giá khả năng sinh hoạt chất kháng xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Nguyễn Kim Nữ Thảo, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tơi trong suốt q
trình nghiên cứu và hồn thiện luận văn.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trương Quốc Phong, người đã hỗ trợ
và giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.
Tơi xin cảm ơn các anh chị ở Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – Đại
học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ dạy và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tơi hồn thành luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Quỹ IFS (Mã số: F/5369 – 1) và Quỹ
NAFOSTED (Mã số: 106 – 4S.04 – 2013.07) cho nghiên cứu này.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ và người thân trong
gia đình tơi, những người đã luôn sát cánh, động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q
trình học tập, nghiên cứu, hồn thiện luận văn.
Hà Nội, ngày 29/09/2015
Học viên

Trần Thị Hằng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... v
TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................. 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. Bệnh bạc lá lúa ................................................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh bạc lá lúa............................................................................. 3

1.1.2. Tình hình bệnh bạc lá lúa trên thế giới và ở Việt Nam .............................................. 4
1.1.3. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)........................................................ 6
1.1.4.Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa .................................................................... 7
1.2. Xạ khuẩn ............................................................................................................ 9
1.2.1. Đặc điểm chung.............................................................................................................. 9
1.2.2. Xạ khuẩn và các hoạt chất thứ cấp từ xạ khuẩn .......................................................10
1.2.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong khống chế bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam 12
1.3. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .................................................................... 12
1.3.1. Mục tiêu nghiên cứu.....................................................................................................12
1.3.2. Nội dung ........................................................................................................................12
CHƢƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...... 13
2.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................ 13
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................13
2.1.2.Hóa chất .........................................................................................................................13
2.1.3.Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ...............................................................13
2.1.4. Môi trường nghiên cứu ................................................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 15
2.2.1.Hoạt hóa các chủng xạ khuẩn .....................................................................................15
2.2.2.Thử hoạt tính kháng Xoo bằng phương pháp thỏi thạch. .........................................15
2.2.3.Xác định hoạt tính kháng Xoo theo phương pháp khuếch tán trên thạch. ..............15
2.2.4. Xác định điều kiện ni cấy xạ khuẩn thích hợp. .....................................................16
2.2.5.Xác định điều kiện tách chiết dịch chiết thô ...............................................................16
2.2.6. Xác định hoạt chất kháng Xoo bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)16
2.2.7. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).17

ii


2.2.8. Phân tích khối phổ .......................................................................................................17
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 18

3.1. Kết quả sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng Xoo ....................... 18
3.2. Xác định điều kiện ni cấy xạ khuẩn thích hợp ............................................. 19
3.3. định dung môi và phương pháp tách chiết dịch ni xạ khuẩn ....................... 25
3.4.Tinh sạch và phân tích hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi các chủng xạ khuẩn. ........ 26
3.5. Kết quả phân tích trọng lượng phân tử hai hoạt chất sinh ra từ hai chủng
VTCC-A-378 và VTCC-A-3247 ............................................................................ 44
4.1. Kết luận ............................................................................................................ 47
4.2. Kiến nghị.......................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 48

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Mơi trường hoạt hóa giống ......................................................................... 14
Bảng 2.2. Môi trường để xác định điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn ................................ 14
Bảng 2.3. Nồng độ các kênh phân tích mẫu trong thời gian 35 phút .......................... 17
Bảng 3.1. Mơi trường và thời gian ni cấy thích hợp của các chủng xạ khuẩn ................. 24
Bảng 3.2. Bảng tóm tắt các nhóm hoạt chất được dự đốn......................................... 42

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh lúa bị nhiễm bệnh bạc lá. A. Lá lúa không bị nhiễm Xoo. B. Lá
lúa bị nhiễm Xoo [57] .................................................................................................... 4
Hình 1.2. Tình hình bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam từ 2010 - 2013 [75] .......................... 5
Hình 1.3.A. Hình ảnh khuẩn lạc Xoo [48]. ................................................................... 6
Hình 1.3.B. Hình ảnh tế bào Xoo [4]. ........................................................................... 6
Hình 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng xạ khuẩn kháng Xoo ...................................... 18

Hình 3.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-289 ............................................................................................. 19
Hình 3.3. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-378 ............................................................................................. 20
Hình 3.4. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-2271 ........................................................................................... 20
Hình 3.5. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-456 ............................................................................................. 21
Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-465 ............................................................................................. 21
Hình 3.7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-3969. .......................................................................................... 23
Hình 3.8. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-3247 ........................................................................................... 23
Hình 3.9. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng Xoo
của chủng VTCC-A-3970 ........................................................................................... 24
Hình 3.10. Ảnh hưởng dung môi đến khả năng tách chiết hoạt chất từ dịch ni cấy
của các chủng xạ khuẩn............................................................................................... 26
Hình 3.11. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-289. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 27
Hình 3.12. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-289. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 28
Hình 3.13. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-378. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 29

v

Hình 3.14. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-378. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 30
Hình 3.15. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-2271. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 35
Hình 3.16. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-2271. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 36
Hình 3.17. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-456. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 36
Hình 3.18. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-456. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 36
Hình 3.19. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-465. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 36
Hình 3.20. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-465. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 36
Hình 3.21. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thơ từ chủng VTCC-A-3969. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 39

Hình 3.22. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-3969. A. Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch.
B. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt chất tinh sạch và chất chuẩn. ..................... 39
Hình 3.23. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-3247. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 39
Hình 3.24. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-3247. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 39

vi


Hình 3.25. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết thô từ chủng VTCC-A-3970. A.
Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 254 nm. B. Kết quả thử hoạt tính kháng Xoo của
các phân đoạn sau HPLC. ........................................................................................... 40
Hình 3.26. Kết quả phân tích HPLC của hoạt chất kháng Xoo tinh sạch từ chủng
VTCC-A-3970. A. Phổ hấp thụ HPLC tại bước sóng 360 nm. B. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 – 600 nm của hoạt chất tinh sạch. C. Kết quả so sánh phổ hấp thụ của hoạt
chất tinh sạch và chất chuẩn. ....................................................................................... 41
Hình 3.27. Kết quả phân tích khối phổ hoạt chất kháng Xoo của chủng VTCC-A-378 ...... 44
Hình 3.28. Kết quả phân tích khối phổ hoạt chất kháng Xoo của chủng VTCC-A-3247 .. 45
Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của factumycin [70] ...................................................... 45
Hình 3.30. Cấu trúc hóa học của actinomycin X2 [81] .............................................. 46

vii


TỪ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

FDA

Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ)

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

MT
SKS
VTCC
Xoo
PSA

Môi trường
Sinh kháng sinh
Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật)
Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Potato sugar agar (Môi trường khoai tây)

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạc lá lúa là một trong những bệnh gây tổn thất nghiêm trọng nhất trên

lúa ở Việt Nam cũng như các khu vực trồng lúa khác trên thế giới. Các thống kê cho
thấy bệnh bạc lá lúa có thể làm giảm năng suất lúa của khu vực châu Á đến 60% [6]. Ở
Việt Nam, bệnh bạc lá lúa được phát hiện ở rất nhiều nơi trên cả nước. Đặc biệt trong
hai thập niên trở lại đây, tập quán cấy lúa dầy và bón nhiều phân đạm làm gia tăng cơ
hội phát triển của bệnh bạc lá lúa khiến tổn thất do bệnh này gây ra là rất lớn.
Bệnh bạc lá lúa do một loại vi khuẩn gram âm Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo) gây ra. Có nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng cho đến nay,
chưa có một phương pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa nào được đánh giá là hiệu quả,
an toàn và kinh tế. Phương pháp chuyển gen để tạo giống lúa kháng bệnh chưa đạt
được hiệu quả cao do phổ kháng quá hẹp của một hoặc hai gen được chuyển vào
lúa. Các phương pháp hố học cũng chưa thực sự thành cơng do tính đa dạng rất cao
của các nịi Xoo, dẫn đến sự phát triển nhanh chóng của nịi kháng thuốc [11].
Chính vì vậy, phương pháp kiểm sốt sinh học (biocontrol) hiện nay được đánh giá
rất cao do tính hiệu quả và mức độ an tồn đối với mơi trường của phương pháp
này. Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng các chủng Bacillus sp., Streptomyces
sp. có khả năng kháng Xoo bước đầu cho thấy tiềm năng của phương pháp kiểm
soát sinh học đối với bệnh bạc lá lúa [11, 37].
Xạ khuẩn được đánh giá là nguồn sinh các chất có hoạt tính sinh học lớn
nhất. Khoảng ba phần tư các chất kháng sinh và các nhóm chất trao đổi thứ cấp có
hoạt tính khác được sinh ra bởi xạ khuẩn. Dưới sự tài trợ của quỹ NAFOSTED, TS.
Phan Thị Phương Hoa và các cộng sự tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC),
Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã sàng lọc 2690
chủng xạ khuẩn hiện đang lưu giữ ở VTCC và phát hiện 17 chủng xạ khuẩn có khả
năng kháng cả 10 nịi Xoo được tìm thấy ở Việt Nam [15, 16]. Thử nghiệm dịch
nuôi cấy của một chủng VTCC-A-2776 trên lúa cho kết quả rất khả quan, giảm đến
43,2% khả năng giảm năng suất lúa do Xoo .

1

Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp kiểm soát sinh học hiện nay chỉ dừng
lại ở mức độ phun bào tử, phun dịch nuôi cấy lên cây trồng mà không hề biết thành
phần, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học cũng như các chất có thể gây hại
khác do các chủng vi sinh vật này sinh ra. Chính vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài
"Nghiên cứu sàng lọc các chủng xạ khuẩn và đánh giá khả năng sinh hoạt chất
kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá lúa" nhằm sàng lọc các
chủng kháng Xoo mạnh nhất cũng như tinh sạch và bước đầu xác định bản chất hóa
học của các chất có hoạt tính. Kết quả của nghiên cứu này sẽ tạo một bước tiến gần
hơn đến việc chế tạo và ứng dụng chế phẩm sinh học khống chế bệnh bạc lá lúa từ
xạ khuẩn.
Mục tiêu:
Sàng lọc và đánh giá khả năng sinh các hoạt chất kháng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae từ xạ khuẩn
Nội dung:
-

Sàng lọc một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng Xanthomonas oryzae pv.
oryzae tốt.

-

Lựa chọn mơi trường thích hợp để nuôi cấy xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng
Xanthomonas oryzae pv. oryzae cao.

-

Nghiên cứu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bước đầu xác định bản chất hóa học
của một số hoạt chất có hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae từ xạ
khuẩn.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Bệnh bạc lá lúa
1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh bạc lá lúa
Lúa gạo là loại cây lương thực phổ biến trên thế giới. Tuy nhiên, chúng rất
dễ bị nhiễm các loại bệnh như đạo ôn, khô vằn, lùn xoắn lá, tungro, đốm nâu, bạc lá
lúa… do nấm, vi khuẩn và virus gây ra. Trong đó, bệnh bạc lá lúa gây ra bởi vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) là một trong các loại bệnh nguy hiểm,
gây nhiều thiệt hại nhất đối với các quốc gia trồng lúa nước.
Bạc lá lúa là loại bệnh chủ yếu xuất hiện ở các nước thuộc vùng khí hậu
nhiệt đới [30]. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1884. Sau
đó, bệnh lan rộng ra các quốc gia thuộc nhiều châu lục như Châu Úc, Châu Phi…
[31]. Thiệt hại do loại bệnh này gây ra rất lớn. Ở châu Á, nó có thể làm giảm năng
suất lúa đến 60% tùy vào giống lúa, địa hình và điều kiện khí hậu [6].
Cây lúa có thể bị nhiễm bệnh bạc lá lúa ở tất cả các giai đoạn trong quá trình
sinh trưởng và phát triển, đặc biệt giai đoạn đẻ nhánh đến ra địng, trổ bơng. Khi
bệnh mới nhiễm, các mép lá bị héo xanh, sau đó lan dần vào trong phiến lá và từ
trên xuống dưới, thường các lá bánh tẻ bị bệnh trước sau đó lan lên các lá non. Khi
bệnh nặng, toàn bộ lá bị héo khơ, teo tóp làm mất khả năng quang hợp của lá dẫn tới
giảm năng suất. Bệnh đặc biệt phát triển mạnh ở khí hậu ấm, ẩm 28 – 34oC.

3


Hình 1.1. Hình ảnh lúa bị nhiễm bệnh bạc lá. A. Lá lúa không bị nhiễm Xoo . B. Lá
lúa bị nhiễm Xoo [40]
1.1.2. Tình hình bệnh bạc lá lúa trên thế giới và ở Việt Nam
Bệnh bạc lá lúa là một trong những loại bệnh gây thiệt hại nặng nề nhất trong

lĩnh vực trồng lúa trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Hàng năm, bệnh bạc lá lúa có
thể làm giảm tới 60% năng suất lúa của châu Á [6]. Trong một vài năm gần đây,
Nhật Bản có diện tích lúa bị nhiễm bệnh bạc lá lên đến 300.000 – 400.000 ha. Ở Ấn
Độ, hàng triệu ha lúa bị nhiễm bệnh bạc lá, đó là nguyên nhân làm cho hiệu suất lúa
của một số vùng ở nước này bị giảm từ 6 – 60%. Tỉ lệ diện tích lúa bị nhiễm bệnh ở
một số vùng thuộc các nước Tây Phi 70 – 85% và thiệt hại năng suất lúa đối với
diện tích lúa bị nhiễm bệnh dao động từ 50 – 90%.

4


Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa thường xuyên gây hại ở các vùng trồng lúa.
Theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, diện tích lúa
nhiễm bệnh bạc lá năm 2013 là 1354 ha, tăng gấp 6,5 lần so với năm 2010 (Hình
1.2). Diện tích cây mắc bệnh tăng nhẹ từ năm 2010 đến năm 2011 và đột ngột tăng
cao trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2012. Diện tích lúa bị mắc bệnh năm
2012 là 90543 ha, cao gấp gần 4 lần so với năm 2011 (26000 ha) đến năm 2013
diện tích lúa bị mắc bệnh đã tăng đến 135400 ha. Trong báo cáo kết quả thực hiện
kế hoạch tám tháng đầu năm 2014 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thơn,
tổng diện tích lúa nhiễm bệnh là 24310 ha, giảm so với cùng kỳ năm trước, diện tích
lúa nhiễm nặng là 206 ha và tỷ lệ nhiễm bệnh phổ biến là 8 - 10%, có nơi lên đến 15
- 25% [2]. Bệnh xuất hiện chủ yếu tại các tỉnh Nam Bộ, với 17877 ha lúa bị nhiễm
bệnh bạc lá, tỷ lệ gây hại phổ biến từ 10 - 20%. Một số địa phương có bệnh bạc lá
lúa khá phổ biến là Bạc Liêu, Long An, Đồng Tháp, Trà Vinh, Tiền Giang, Bà Rịa
Vũng Tàu... Theo khảo sát của Chi cục bảo vệ thực vật Lâm Đồng trong vụ hè thu
2014, trên địa bàn huyện Đạ Tẻh có đến 25 ha lúa bị bệnh bạc lá và tỷ lệ gây hại lên
đến 50 - 80% [4].

Hình 1.2. Tình hình bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam từ 2010 - 2013 [1]

5


1.1.3. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo )
Trong hầu hết các báo cáo và công bố khoa học, Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (Xoo) là loại vi khuẩn trực tiếp gây ra bệnh bạc lá lúa. Xoo là vi khuẩn gram
âm, hỡnh que, kớch thc (0.7-2) ì (0.4-0.7) àm, khụng sinh bào tử, có khả năng
chuyển động (Hình 1.3). Xoo có khuẩn lạc hình trịn, lồi, nhầy, màu vàng do tiết sắc
tố xanthomonadin [32]. Xoo khơng có khả năng phân giải nitrat, khơng dịch hóa
gelatin, khơng tạo NH3 nhưng tạo H2S. Nếu trong mơi trường có đường thì khí H2S
khơng tạo thành axit. Nhiệt độ thích hợp cho loại vi khuẩn này sinh trưởng là 26 –
30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 - 5oC, tối đa 40oC, nếu cao hơn 53oC sẽ làm vi khuẩn chết.
Xoo sống trong dải pH khá rộng 5,7 – 8,5 thích hợp nhất ở 6,8 – 7,2 [34].
Con đường xâm nhiễm của Xoo vào cây lúa là thơng qua khí khổng hoặc
những vết tổn thương ở rễ và lá. Khi đã xâm nhập vào trong thân cây, Xoo không
ngừng nhân lên và di chuyển theo cả hai hướng trong thành mạch dẫn đến toàn bộ
thân cây bị nhiễm khuẩn [32]. Xoo có khả năng đột biến thành nhiều nòi. Hiện nay,
theo các báo cáo khoa học, khoảng 30 nịi Xoo đã được cơng bố [32].

Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc (A) [36] và tế bào (B) [3] của vi khuẩn Xoo.

6


1.1.4.Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa
1.1.4.1. Biện pháp canh tác
Với người trồng lúa nước, canh tác là biện pháp đơn giản, dễ thực hiện và ít
tốn kém trong việc phòng trừ bệnh bạc lá lúa. Việc vệ sinh đồng ruộng, khử trùng
hạt giống cần luôn được thực hiện để hạn chế tối đa mầm bệnh lây lan, phát triển.
Hệ thống cấp thoát nước phải phù hợp. Quá trình sinh trưởng của lúa cần được theo

dõi thường xuyên, phát hiện bệnh kịp thời. Bón phân với tỉ lệ N:P:K thích hợp,
tránh bón phân giàu nitơ do có thể gây kích thích cây tăng trưởng nhanh dẫn đến
cây dễ nhiễm bệnh [32]. Tuy nhiên, hiệu quả của các biện pháp canh tác này trong
cơng tác phịng trừ bệnh bạc lá lúa là khơng cao.
1.1.4.2. Biện pháp hóa học
Năm 1950, lần đầu tiên biện pháp hóa học được sử dụng trong việc phòng
trừ bệnh bạc lá lúa [10]. Một số hóa chất đã được sử dụng như Bordeaux có hoặc
khơng có đường, hỗn hợp đồng xà phịng, thuốc diệt nấm, đồng thủy ngân, dịch
phun đồng oxychloride 44. Cơ chế hoạt động của các loại hóa chất này là ngăn chặn
việc trao đổi chất của vi khuẩn dẫn đến tình trạng vi khuẩn bị ức chế hoặc chết. Một
số hợp chất hữu cơ diệt khuẩn cũng đã được sử dụng: Niken dimethyl
dithiocarbamate, dithianone, phenazine, phenazine N – oxit [59]. Năm 1970, Trung
Quốc đã đưa zinc thiazol và bismerthiazol vào danh mục thuốc diệt khuẩn và được
sử dụng trong phòng chống Xoo [4]. Bột tẩy trắng chứa 30% clorua khi được phun
lên cây làm giảm đáng kể tổn thương do Xoo gây ra [10]. Một số chất diệt khuẩn
như kasugamycin, phenaxin hay streptomycin có thể ức chế sự nhân lên của vi
khuẩn bạc lá tuy nhiên chúng lại có nhược điểm là giá thành cao và không thân
thiện với môi trường [13]. Biện pháp hóa học vẫn đang giữ vai trị chủ đạo trong
việc phòng trừ bệnh bạc lá lúa. Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều thuốc hóa học
đang gây ra hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe con người, làm mất cân bằng sinh
thái và gây ô nhiễm môi trường.

7


1.1.4.3. Cải tạo và lựa chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá lúa
Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra được 30 gen kháng bệnh bạc lá ở cây
lúa trồng và lúa hoang từ Xa1 đến Xa31 [13, 34, 44, 45]. Tính kháng có thể quy
định bởi một gen đơn trội như Xa1 [46], Xa26 [13], Xa27 [56], Xa3 [28], một gen
đơn lặn như: xa5 [5] và xa13 [24]; hoặc do hai gen kết hợp với nhau như Xa1/Xa4,

Xa4/Xa7. Trong đó các gen Xa4, Xa5, Xa7 và Xa21 được các nhà nghiên cứu quan
tâm nhất vì các gen này khi tổ hợp cùng nhau cho phổ kháng rộng [27, 41]. Tại Ấn
Độ, việc chuyển nhiều gen kháng vào cùng một tổ hợp gen đã được quan tâm và tạo
ra các dòng mang nhiều gen kháng làm nguồn vật liệu tốt để chuyển tổ hợp gen này
vào các giống lúa thương mại tăng sức kháng bệnh bạc lá của các giống.Ví dụ như
dịng NH56 mang 4 gen (Xa4, Xa5, Xa7 và Xa21) [58]. Ở Trung Quốc, việc quy tụ
các gen kháng bệnh vào các dòng phục hồi để tăng tính kháng của lúa lai cũng được
quan tâm. Ví dụ như các gen Xa7, Xa21 đã được quy tụ vào giống lúa Minhhue 63
[60].
Ở Việt Nam, từ các kết quả nghiên cứu đã cơng bố, bước đầu có thể khẳng
định Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên
các giống lúa đang canh tác. Việc nghiên cứu và tạo ra các giống lúa chứa gen
kháng vi khuẩn Xoo đã đạt được một số thành công nhất định. Tuy nhiên biện pháp
này vẫn chưa phải là biện pháp cho kết quả cao do các giống lúa chứa gen đơn hay
tổ hợp gen kháng này vẫn có phổ kháng hẹp. Đó là nguyên nhân của hiện tượng ban
đầu giống biểu hiện tính kháng rất tốt ở một vùng canh tác nhưng sau một vài năm
thì giống này lại trở nên nhiễm bệnh.
1.1.4.4. Khống chế sinh học
Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học, con người ngày càng hướng
đến những sản phẩm công nghệ thân thiện với mơi trường, tốt cho sức khỏe và có
hiệu quả sử dụng cao trong việc phòng chống dịch bệnh. Vì vậy biện pháp khống
chế sinh học đang được các nhà khoa học rất quan tâm và tập trung nghiên cứu. Ở
Ấn Độ, đã có khoảng 40 chủng vi khuẩn được phân lập có khả năng kháng Xoo,

8


trong đó có lồi Pseudomonas fluorescens và Pseudomonas putida có khả năng
kháng khá tốt khi được phun vào lá lúa [11]. Ji và cộng sự đã có một nghiên cứu
cho thấy chủng Lysobacter antibioticus 13-1 phân lập từ một giống lúa ở tỉnh Vân

Nam, Trung Quốc có khả năng kháng nấm và một số vi khuẩn gây bệnh trong đó có
Xoo. Chủng này cho hiệu quả kìm hãm sự phát triển của Xoo lên tới 69,7%. Những
thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy hiệu quả làm giảm sự có mặt của Xoo trên lúa
từ 59,1 - 73,5%. Hiệu quả ức chế Xoo của chủng Lysobacter antibioticus 13-1 thử trên
các dòng lúa khác nhau có biến động tùy theo từng dịng lúa [20]. Theo một nghiên
cứu của Velusamy và cộng sự, chủng Pseudomonas fluorescens PDY7 giúp cải
thiện năng suất lúa trong nhà kính lên 58,83% [53]. Mặc dù biện pháp khống chế
sinh học đã đạt được những kết quả nhất định trong việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa,
hiệu quả từ các chủng vi sinh vật đối kháng này mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên
cứu, chưa được áp dụng trong thực tiễn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu và tạo chế
phẩm sinh học từ xạ khuẩn để áp dụng rộng rãi vào việc phòng chống bệnh bạc lá
lúa là một việc làm cần thiết.
1.2. Xạ khuẩn
1.2.1. Đặc điểm chung
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ G+C trong
ADN cao hơn 55% [22]. Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong
đất. Chúng có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn như kích thước tế bào nhỏ, khơng có
nhân thật, thành tế bào khơng chứa celulose hay chitin.
 Khuẩn lạc: Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc có
kích thước khác nhau tùy loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc thường chắc, xù
xì, có dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác
nhau: đỏ, vàng, nâu, xám, trắng, da cam, đen… Kích thước và hình dạng của khuẩn
lạc có thể thay đổi tùy điều kiện ni cấy. Đường kính mỗi khuẩn lạc có thể dao
động từ vài mm đến 1 cm [8].
 Bào tử: Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử với phương pháp
phân đoạn hay cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn thường có hình oval, hình cầu, hình trụ
với bề mặt nhẵn, xù xì hoặc có gai. Điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, nhiệt độ… ảnh

9

hưởng đến quá trình hình thành bào tử. Hình dạng, kích thước, cuống sinh bào tử,
bề mặt bào tử góp phần quan trọng vào việc phân loại xạ khuẩn [9].
 Khuẩn ty: Trên mơi trường đặc, xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty. Khuẩn ty
cơ chất là hệ sợi cắm sâu vào mơi trường. Khuẩn ty khí sinh, là hệ sợi phát triển trên
bề mặt môi trường với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ
chất nhưng cũng có loại chỉ có khuẩn ty khí sinh như chi Sporichthya. Khi đó, khuẩn ty
khí sinh vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa đảm nhiệm vai trò dinh dưỡng [38].
1.2.2. Xạ khuẩn và các hoạt chất thứ cấp từ xạ khuẩn
Trong các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học do vi sinh vật sinh ra đã
được cơng bố thì 45% (10100 chất) được sinh ra từ xạ khuẩn, 38% (8600 chất) từ
nấm và 17% (3800 chất) từ vi khuẩn đơn bào [7, 18]. Với tỷ lệ 45%, xạ khuẩn được
xếp vào nhóm vi sinh vật sinh ra lượng hoạt chất thứ cấp lớn nhất và tập trung chủ
yếu ở chi Streptomyces (7600 chất) [26]. Vì vậy, có thể nói, xạ khuẩn là nhóm vi
sinh vật rất quan trọng trong lĩnh vực tìm kiếm hoạt chất thứ cấp ứng dụng trong
công nghiệp sản xuất thuốc cũng như khống chế sinh học trong nơng nghiệp.
Nhiều nhóm chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư,
chống sốt rét, tác nhân miễn dịch đã được tìm thấy từ xạ khuẩn. Trong đó, các chất
kháng sinh từ xạ khuẩn có cấu trúc hố học rất đa dạng như β-lactam, macrolide,
nucleoside, polyene...
Cephamycins, clavulanic acid… thuộc nhóm kháng sinh β-lactam, là một
trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất sinh ra từ xạ khuẩn. Cephamycins,
có cấu trúc tương tự như cephalosporins, được sinh ra từ nhiều loài khác nhau thuộc
chi Streptomyces như S. griseus, S. viridochromogenes, S. fimbriatus. Ngoài ra,
nhiều loại kháng sinh được sinh ra từ cùng một chủng xạ khuẩn. Ví dụ như S.
jumonjinensis, S. katsurahamanusvà S. clavuligerus sinh cephamycin C đồng thời
cũng sinh clavulanic acid [3].
Amphotericin B là chất thuộc nhóm polyene được tìm thấy từ chủng S.
nodosus từ năm 1955 [51]. Nó là chất kháng nấm phổ rộng nhưng bị hạn chế sử
dụng vì có nhiều tác dụng phụ. Các chất polyoxins and nikkomycins được sinh ra từ

hai lồi S. cacaoivarasoensis và S. ansochromogenes có khả năng ức chế tổng hợp

10


chitin của nấm và côn trùng [23]. Oligomycins được tách chiết từ dịch nuôi cấy của
S. diastaticus, S. diastatochromogenes. Oligomycins A và C thuộc nhóm macrolide
đã được chứng minh là hoạt chất kháng rất mạnh các loại nấm như: Aspergillus
niger, Alternaria alternata, Botrytis cinerea và Photophthora capsici [58].
Năm 1971, tunicamycinđược tách chiết từ dịch nuôi cấy chủng S. lyososuperficus
bởi Takatsuki và cộng sự [49]. Tunicamycin là một nucleoside acyl béo có chứa uracyl.
Treptovirudin and corynetoxin có cấu trúc tương tự tunicamycin cũng được tìm thấy từ
xạ khuẩn như S. griseoflavus subsp. thuringiensis. Các hợp chất này khi tiếp xúc với vi
rút sẽ tấn công lớp vỏ bọc của vi rút. Một hợp chất JBIR-68 từ Streptomycessp. Rl18
cũng có khả năng ức chế sự phát triển của vi rút cúm tuy nhiên cơ chế hoạt động của nó
vẫn chưa được tìm ra [48].
Các nhóm chất kháng ung thư như anthracyclines, daunorubicin (daunomycin),
doxorubicin (adriamycin) đều được tìm thấy ở xạ khuẩn. Epirubicin thuộc nhóm
anthracycline được tổ chức FDA cho phép sử dụng vào năm 1999. Nó được dùng trong
điều trị ung thư vú, ung thư phổi, ung thư buồng trứng [1]. Bleomycin từ S. verticillu
được FDA cấp phép sử dụng năm 1973 [17].
Cùng với việc nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất tự nhiên cho sản xuất thuốc,
các nhà khoa học đã khai thác xạ khuẩn cho mục đích khống chế sinh học các loại
bệnh trong nơng nghiệp. Chủng Streptomyces griseus H7602 có khả năng kháng
loài nấm Phytophthora capsici gây bệnh thối rễ cây tiêu. Mặt khác, chủng này cũng
sinh các chất hoạt động như enzyme chitinase, β-1,3-glucanase, lipase và protease
tăng cường khả năng sinh trưởng của cây tiêu [35]. Theo một nghiên cứu của
Kathiresan và cộng sự, một số loại xạ khuẩn biển có khả năng ức chế các loại nấm
Rhizoctonia Solani gây bệnh đạo ôn, Pyricularia oryzae gây bệnh khô vằn,
Helminthosporium oryzae gây bệnh đốm lá ở cây lúa và Colletotrichum falcatum gây

bệnh thối đỏ cây mía [21]. Năm chủng Streptomyces spp. (CAI-24, CAI-121, CAI-127,
KAI-32 và KAI-90) được phân lập từ cỏ ở các đống ủ đã được báo cáo là có hoạt tính
chống lại bệnh héo lá ở đậu xanh do Fusarium oxysporum gây ra. Ngoài ra, các
chủng xạ khuẩn Streptomyces được chọn lọc này cũng có khả năng sinh siderophore,

11


indole acetic acid (trừ KAI-90), hydrocyanic acid, cellulase (chỉ KAI-32 và KAI-90) và
protease (chỉ CAI-24 và CAI-127) [12].

1.2.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong khống chế bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam
Ở Việt Nam, khả năng ứng dụng xạ khuẩn trong khống chế bệnh bạc lá lúa
đã bước đầu được nghiên cứu bởi nhóm nghiên cứu của TS. Phan Thị Phương Hoa
tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội từ năm 2005.
Trong nghiên cứu này, 17 chủng có khả năng kháng cả 10 nòi vi khuẩn Xoo được
phân lập tại Việt Nam đã được sàng lọc từ 2690 chủng xạ [15]. Trong 17 chủng này,
chủng xạ khuẩn VTCC-A-2776 được chứng minh có khả năng kháng đặc hiệu với
chủng vi khuẩn Xoo. Từ kết quả kháng Xoo khả quan của chủng VTCC-A-2776 ở
qui mơ phịng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm kiểm tra hoạt
lực kháng Xoo của chủng này với hai giống lúa đã bị bệnh bạc lá đó là Oryza sativa L.
SS1 và Oryza sativa L. KD18. Dịch nuôi cấy của chủng VTCC-A-2776 được phun lên
cây lúa sau 1, 3 và 7 ngày nhiễm Xoo . Hiệu quả ức chế của VTCC-A-2776 trên
giống lúa được đánh giá theo chiều dài tổn thương do Xoo gây ra và năng suất lúa
sau 2 mùa trồng lúa. Kết quả phun dịch nuôi cấy của chủng VTCC-A-2776 đã làm
giảm đáng kể tác hại của bệnh bạc lá. Đối với giống lúa SS1 đã bị nhiễm Xoo, việc
phun dịch nuôi cấy VTCC-A-2776 có khả năng giảm chiều dài tổn thương đến
38,3%. Đối vớigiống lúa KD18, chiều dài tổn thương do Xoo giảm 29,8% chỉ nhờ
phun dịch nuôi cấy xạ khuẩn một lần. Tương tự như vậy, việc phun dịch nuôi cấy xạ
khuẩn giúp tăng năng suất cho giống lúa SS1 nhiễm Xoo lên 36,6% và giống KD18

nhiễm Xoo lên 29,4% [16]. Các kết quả trên cho thấy khi khống chế bệnh bạc lá lúa
bằng dịch nuôi cấy của chủng xạ khuẩn VTCC-A-2776 đạt hiệu quả tương đối cao.
Những kết quả nghiên cứu đã phần nào chứng minh tiềm năng to lớn của
việc sử dụng xạ khuẩn trong khống chế sinh học nói chung và kiểm sốt bệnh bạ lá
lúa nói riêng.

12


CHƢƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
16 chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được lựa chọn từ nghiên cứu
của TS. Phan Thị PHương Hoa và cộng sự [15] và đang được bảo quản tại Bảo tàng
giống chuẩn vi sinh vật VTCC.
Chủng Xanthomonas oryzae pv. oryzae (phân lập từ lá lúa bị bệnh ở miền
bắc Việt Nam) được cung cấp bởi PGS. TS. Phan Hữu Tôn (Học viện Nông nghiệp
Việt Nam).
2.1.2. Hóa chất
Các loại hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu gồm: tinh bột, cao men, cao
malt, pepton, cao thịt, casitone, pharmamedia, glyxerol, diaion Hp 20, thạch, nước
cất, methanol, butanol, acetone, acid formic, glucose, MgSO4, CaCO3… là những
hóa chất đạt tiêu chuẩn của các hãng có uy tín như Merck, Sigma...
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
-

Bốc cấy vơ trùng Esco, Đức

-

Tủ hút hóa chất Bestlab, Mỹ

-

Tủ ấm, Trung Quốc

-

Máy cô quay chân không IKA, Đức

-

Máy li tâm Eppendorf, Đức

-

Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc

-

Kính hiển vi điện tử Olympus, Nhật Bản

-

Máy HPLC Agilent, Mỹ

- Máy khử trùng, bể siêu âm, cân phân tích, pipet, que cấy, bình duran, ống
nghiệm, đĩa petri... của các hãng trong và ngoài nước.

13

2.1.4. Mơi trường nghiên cứu
Mơi trường hoạt hóa xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm được sử dụng trong nghiên
cứu được liệt kê trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Mơi trƣờng hoạt hóa giống
Môi trƣờng

Thành phần

Khối lƣợng (g/l)

YS

Tinh bột
Cao men
Thạch

10
2
15

PSA

Khoai tây
Na2HPO4
Ca(NO3)2
Peptone
Glucose
Thạch

300
2
0,5
5
15
15

Các môi trường được sử dụng để xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho
xạ khuẩn được liệt kê trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trƣờng để xác định điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn
Môi trƣờng
SKS

3M

2M

Thành phần
Tinh bột
Glucose
Đậu tương
Peptone
CaCO3

Khối lƣợng (g/l)

Glucose
Glycerol
Tinhbột

Pharmamedia
Caomen
Diaion Hp 20

5
20
20
15
3
2

Tinh bột
Đậu tương
Cao men
CaCO3

20
15
2
4

14

10
10
10
5
3

Tinh bột
Glucose
Peptone
Cao thịt
Cao men
CaCO3

24
1
3
3
5
4

A16

Glucose
Pharmamedia
CaCO3

20
10
5

N8

Casiton
Caomen
Glycerol
NaCl

7.5
7.5
15
2.5

301

2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Hoạt hóa các chủng xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn được lấy ra từ lạnh sâu và ria trên đĩa thạch YS (Bảng
2.1). Sau 5, 7 ngày ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC, sự phát triển, độ thuần chủng và khả
năng hình thành bào tử của xạ khuẩn được kiểm tra.
2.2.2. Thử hoạt tính kháng Xoo bằng phương pháp thỏi thạch
Chủng Xoo được trang trên môi trường PSA (Bảng 2.1), ủ 24 giờ ở 37ºC. Các
thỏi thạch có đường kính 5 mm chứa xạ khuẩn được đặt trên môi trường đã trải
Xoo. Đĩa thử hoạt tính được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đường kính vịng kháng khuẩn
được xác định bằng thước đo.
2.2.3. Xác định hoạt tính kháng Xoo theo phương pháp khuếch tán trên thạch
Chủng Xoo được trang trên môi trường PSA (Bảng 2.1), ủ 24 giờ ở 37oC.
Sau đó, đục các giếng với đường kính 5 mm. Tiếp theo, 100 µl dịch nuôi cấy xạ
khuẩn được nhỏ vào trong các giếng đã được đục sẵn. Sau 24 giờ ủ ở 37oC, hoạt
tính kháng Xoo được xác định dựa trên kích thước vịng kháng khuẩn.

15


2.2.4. Xác định điều kiện ni cấy xạ khuẩn thích hợp
Sáu loại môi trường được sử dụng để nuôi cấy gồm 3M, A16, 2M, 301, N8
và SKS (Bảng 2.2). Các chủng xạ khuẩn được nuôi trong 25 ml của mỗi loại mơi

trường trong bình tam giác 100ml, tốc độ lắc 160 vòng/ phút ở nhiệt độ 28 - 30oC.
Sau ngày lắc thứ 2, bắt đầu tiến hành thu mẫu bằng cách hút 1ml dịch nuôi cấy/mẫu.
Việc thu mẫu kết thúc sau ngày lắc thứ 7. Dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt
tính kháng Xoo theo phương pháp đục lỗ thạch.
2.2.5. Lựa chọn dung môi tách chiết dịch chiết thô
Dịch nuôi cấy xạ khuẩn được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút.
Chia phần dịch trong thành 2 phần bằng nhau. Phần 1 bổ sung ethylacetate với tỉ lệ
1:1, gọi là mẫu 1. Phần 2 bổ sung n-butanol với tỉ lệ 1:1, gọi là mẫu 2. Lắc đều 2
mẫu, để lắng thu phần dịch nổi. Phần cặn sau ly tâm được bổ sung ethanol với thể
tích bằng 1/3 so với dịch nuôi cấy, lắc 1 h ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành ly tâm ở
tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ cặn, thu được mẫu 3.
2.2.6. Xác định hoạt chất kháng Xoo bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Dịch chiết thô của các chủng xạ khuẩn được phân tích bằng phương pháp sắc
ký lỏng cao áp sử dụng cột sắc ký phản pha Cadenza CD-C18 (75x 4,6 mm; 3 µm).
Dung mơi chạy mẫu được chuẩn bị với hai kênh: kênh A - nước MQ : axit formic
(1000 :1), kênh B - acetonitrile. Các mẫu được phân tích qua cột C18 cùng với việc tăng
dần nồng độ acetonitrile từ 15 - 85% trong 35 phút với tốc độ 1,2 ml/phút. Chương trình
chi tiết được thể hiện trong bảng 2.3. Các phân đoạn sau cột được thu và thử hoạt
tính để xác định phân đoạn chứa hoạt chất kháng Xoo .

16


Bảng 2.3 Nồng độ các kênh phân tích mẫu trong thời gian 35 phút
Thời gian (phút)

%A

%B

Lƣu lƣợng (ml/phút)

0

85

15

1.2

3

85

15

1.2

25

15

85

1.2

29

15

85

1.2

32

85

15

1.2

35

85

15

1.2

Sau khi xác định được các phân đoạn chứa hoạt chất kháng Xoo, các phân
đoạn này được thu lại bằng cách chạy nhiều lần mẫu dịch chiết thơ qua HPLC. Sau
đó, các mẫu được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp HPLC với chương trình
chạy tương tự như bước xác định hoạt chất kháng Xoo ở trên. Phổ hấp thụ từ bước
sóng 200 - 600 nm của các chất tinh sạch được đánh giá và so sánh với thư viện hồ
sơ sắc ký của trường Đại học Osaka, Nhật Bản.
2.2.7. Phân tích khối phổ
Chất kháng Xoo sau tinh sạch qua phân tích HPLC được gửi sang Viện Hàn
Lâm Khoa học để xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp khối phổ. Mẫu
được bơm trực tiếp vào máy khối phổ ở trạng thái tích điện dương.

17