Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tannase từ các chủng nấm mốc

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
0


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

MỞ ĐẦU
Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme đã được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong nhiều lĩnh
vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế,… Trong thực tế, việc sử
dụng enzyme trong các lĩnh vực không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng
lượng nguyên tử. Theo thống kê, hàng năm lượng enzyme được sản xuất ra trên thế
giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD và được ứng dụng
nhiều lĩnh vực khác nhau. Đặc biệt trong ngành công nghiệp thực phẩm, các chế
phẩm enzyme được sử dụng phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase,
lipase, glucose oxydase...
Trong lĩnh vực sản xuất đồ uống, một vấn đề đang thu hút được nhiều quan
tâm đó là vấn đề đục cặn trong các sản phẩm. Nguyên nhân là do trong thành phần
nguyên liệu được lựa chọn để sản xuât đồ uống chứa hàm lượng tannin quá cao vẫn
chưa được xử lý. Tannin có nhiều trong trái cây, rau quả ăn được và chúng thường
được coi là thành phần không mong muốn, vì gây ra những vấn đề công nghệ do tạo
thành phức hợp với tinh bột, protein, enzyme tiêu hóa làm giảm giá trị cảm quan và
dinh dưỡng của thực phẩm. Do đó, ứng dụng chế phẩm enzyme tannase trong sản
xuất đồ uống từ các loại quả giàu tannin có thể nâng cao chất lượng sản phẩm.
Ngoài ra trong các ngành công nghiệp thuộc da thì trong thành phần của

nước thải rất giàu tannin, chất béo, protein,… Hiện nay thì người ta đã sử dụng một
số enzyme như enzym lipase để phân giải chất béo, enzym protease kiềm tính để
phân giải protein, còn hàm lượng tannin trong nước thải thì hầu như vẫn chưa được
được xử lí. Vì vậy, sử dụng enzym tannase phân giải tannin trong giai đoạn xử lí
sinh học cho phép xử lí nước thải trong các ngành công nghiệp thuộc da triệt để
hơn.
Từ những nhu cầu cấp thiết ở trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tannase từ các chủng nấm mốc Aspergilllus
theo phương pháp lên men rắn”, với các mục tiêu sau:
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
1


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

Mục tiêu của đề tài
- Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
enzyme tannase cao.
- Nghiên cứu điều kiện lên men tạo emzyme tannase theo phương pháp lên
men rắn.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt mục tiêu đặt ra, chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
- Phân lập và lựa chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
emzyme tannase cao từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
- Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme tannase
bằng phương pháp lên men rắn.
- Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp sinh tổng hợp emzyme tannase cao.

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
2


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Enzyme tannase
Enzyme tannase hay còn gọi là acyl tannin hydrolase (EC 3.1.1.20). Đây là
một enzym thủy phân hoạt động trên nguồn cơ chất là tannin, có khối lượng phân tử
khoảng 150 kDa đến 300 kDa tùy thuộc nguồn enzyme.
Bảng 1.1: Khối lƣợng phân tử và hàm lƣợng carbohydrat của tannase
Vi sinh vật

Khối lƣợng
phân tử (Da)

Hàm lƣợng
cacbohydrat (%)

Tài liệu tham khảo

Aspergillus
flavus

192 000

25,4

Yamada et al, 1968;
Adachi et al, 1971

Aspergillus
oryzae

186 000

43

Barthomeruf et al, 1994;
Parthasarathy & Bose,
1976

Aspergillus
niger

300 000

22,7

Hatamoto et al, 1996;
Abdel – Naby et al, 1999

Candida sp.K-1

250 000

61,9

Akio et al, 1976

Chryphonectria
parasitica

240 000

64

Akio et al, 1976

Gỗ sồi
Peduculate

300 000

Chưa xác định

Niehaus et al, 1997

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzyme trong khoảng 35- 60oC và pH tối ưu 3,58 tùy thuộc vào nguồn enzym. Enzyme tannase ổn định trong một vài tháng ở 30oC.
Tannase có điểm đẳng điện là 3,8.
Enzyme tannase xúc tác thủy phân các liên kết este và liên kết depside có
trong các tannin thủy phân để tạo thành glucose và axit gallic. Ngoài ra, enzyme
tannase còn xúc tác thuỷ phân liên kết este có mặt trong các hợp chất tannin như
axit tannic, metyl gallate, etyl gallate, n-propylgallate và izoamylgallate. Phản ứng
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
3


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

xúc tác điển hình của tannase là phá vỡ cầu nối hydro của epigallocatechin-3-ol
gallate. Theo nghiên cứu của Libuchi et al, 1972 tannase có thể thuỷ phân hoàn toàn
axit tannic (I) thành axit gallic và glucose thông qua 2,3,4,6 tetragalloyl glucose
(III) và hai kiểu của monogalloyl glucose (IV).

Hình 1.1: Con đƣờng thuỷ phân axit tannic bởi enzyme tannase
1.1.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của enzyme tannase
1.1.1.1. Ảnh hƣởng của pH
Hoạt độ xác tác của enzyme phụ thuộc nhiều vào giá trị pH của môi trường.
Enzyme từ các nguồn khác nhau có khoảng pH thích hợp khác nhau. Ví dụ, enzyme
tannase được phân lập từ nấm mốc Aspergillus niger có pH tối ưu nằm trong
khoảng từ 5,0 – 6,0 và hoạt động ổn định trong khoảng rộng từ 3,5 – 8,0. Enzyme
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
4


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

tannase phân lập từ Chryphonectria parasitica có pH tối ưu là 5,5 (Libuchi et al,

1968), từ Candida sp có pH tối ưu 6,0 và hoạt độ ổn định ở phạm vi rộng pH 3,5 –
7,5 (Akio et al, 1976).
Tannase thực vật phân lập từ cây sồi Penduculate có phạm vi pH rộng với pH
tối ưu khoảng 5,0. Ngay cả khi enzyme này được ủ trong 24h ở pH là 5,0 thì hoạt
độ vẫn duy trì và ổn định tốt (Madhavakríhna & Bose, 1962).
1.1.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Hoạt độ xúc tác của enzyme tăng khi tăng nhiệt độ phản ứng, nhưng chỉ
trong một vùng nhiệt độ giới hạn. Theo các nghiên cứu trước đây, tùy vào các
chủng và phương thức nuôi cấy mà enzyme tannase có dải nhiệt độ tối ưu 30 60oC. Nhiệt độ tối ưu và ổn định của tannase phân lập từ các sinh vật khác nhau
được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1.2: Nhiệt độ tối ƣu và ổn định của enzym tannase
Vi sinh vật

Nhiệt độ tối

Nhiệt độ ổn

ƣu

định

Tài liệu tham khảo

Tannase từ nấm mốc
Aspergillus flavus

50 -60oC

≤ 70oC

Yamada et al,1968;
Pourrat et al,1982

Aspergillus oryzae

30 – 40oC

55oC

Beverini và Metche,
1990; Libuchi et al,1968

Aspergillus niger

35oC

≤ 50oC

Haslam và Tanner, 1970

Tannase từ vi khuẩn
Penicillium

30 -40oC

45oC

1983

chrysogenum

Chryphonectria

Rajakumar và Nandy,

30oC

25 – 40oC

Farias et al,1992;
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
5


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

Libuchi et al, 1968

parasitica
Tannase từ nấm men
Candida sp.K-1

Candida sp.K- Candida sp.K- Candida sp.K-1
1

1
Tannase từ thực vật

gỗ sồi Peduculate

35 và 40oC

≤ 50oC

Niehaus và Gross, 1997

1.1.1.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại
Một số nghiên cứu đã cho thấy enzyme tannase được hoạt hóa bởi một số
kim loại Ca2+, Fe2+, Na+, Mg2+ và Hg+( N. Lokeswari and K. Jay Raju ,2007) còn
một số ion khác như Ba2+, Ca2+, Zn2+, Hg2+, Ag+,…lại ức chế hoạt tính của tannase
(Alevden_Z öztürk ,2006)
1.4.4.3. Ảnh hƣởng của chất nền
Ảnh hưởng của nồng độ chất nền axit tannic trong môi trường nuôi cấy tới
sinh trưởng và tổng hợp tannase của vi sinh vật đã được nghiên cứu trong điều kiện
phòng thí nghiệm. Khi tăng nồng độ cơ chất cảm ứng axit tannic trong môi trường
nuôi cấy sẽ tăng cường khả năng sinh tổng hợp enzyme tannase. Nếu nồng độ chất
cảm ứng tannic cao sẽ gây ức chế sinh trưởng vi sinh vật dẫn tới hoạt tính tannase
được tổng hợp cũng giảm theo (Ruth Belmares , 2004)
1.1.2. Các nguồn thu nhận enzyme tannase
1.1.2.1. Nguồn tannase từ thực vật
Các loài thực vật giàu tannin có hàm lượng enzyme tannase cao. Trong thực
tế, các loại thực vật giàu tannin thuỷ phân và tannin ngưng tụ được sử dụng làm
nguồn chính để thu nhận enzyme tannase. Các thành phần này nằm trong những mô
riêng biệt trong cây (Lekha và Lonsane, 1997). Enzyme tannase nằm trong vỏ cây
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
6

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

và lá của thực vật.
Một số thực vật có chứa hàm lượng tannin cao như: quả Myrobolan
(Terminalia chebuna), quả Divi Divi (Caesalpinia coriaria), gỗ sồi (Quercus rubra)
và từ lá của cây Karee (Rhus typhina)…. Nghiên cứu vai trò của enzyme tannase
trong thực vật Madhavakrishna et al (1960) đã cho rằng khi sinh trưởng thực vật
tổng hợp một lượng lớn các axit gallic, axit chebulinic và axit hexahydroxyphenic
bị este hoá với glucose dưới sự xúc tác của tannase để tạo thành các tannin phức
tạp. Khi cây có hiện tượng rụng quả thì hoạt động của liên kết este trong tannase
góp phần tích cực vào việc thuỷ phân tannin. Mặt khác, thành phần tannin giúp cho
thực vật có thể tự bảo vệ mình chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật và sự tấn công
của động vật ăn cỏ. Khi lá của thực vật bị tấn công bởi thực vật ăn cỏ thì các tế bào
bị mất một số phần làm cho tannase tiếp xúc với tannin trong lá và thuỷ phân tannin
thành các chất độc hại trong thực vật bậc cao.
1.1.2.2. Nguồn enzyme tannase từ động vật
Đã có một số nghiên cứu chỉ ra rằng có một lượng nhỏ enzym tannase được
tìm thấy ở niêm mạc dạ cỏ của gia súc, ví dụ như màng niêm mạc và ruột non của
bò. Ngoài ra, tannase còn được sản sinh bởi các ấu trùng nốt sần phát triển trong nốt
sần thực vật để thuỷ phân axit tannic (Lekha và Lonsane, 1997).
1.1.2.3. Nguồn enzym tannase từ vi sinh vật
Vi sinh vật là nguồn cung cấp enzym vô cùng quan trọng. Tannase từ nấm
mốc hoạt động tốt hơn trong việc làm giảm tannin thuỷ phân, trong khi đó tannase
từ nấm men lại làm giảm axit tannic tốt hơn và có ái lực thấp với tannin tự nhiên
(Deschamps et al, 1983). Nhiều tác giả đã chứng minh nấm sợi có khả năng phân
giải tannin như một nguồn cacbon duy nhất (Lewis & Starkey, 1969; Hadi et al,
1994). Trong tất cả các vi sinh vật có khả năng tạo enzyme tannase thì Aspergillus

có khả năng sản xuất enzyme thương mại hiệu quả nhất.
Chryphonectria parasitica đã được phát hiện là gây bệnh bạc lá ở cây hạt dẻ
Mỹ, tỷ lệ tăng trưởng của loại nấm mốc này đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh
học của vi nấm trong quá trình hình thành bệnh bạc lá. Sự tăng trưởng cho thấy loại
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
7


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

nấm mốc này có thể sử dụng các chất tannin có nhiều trong vỏ hạt dẻ. Điều này cho
thấy, loại nấm mốc này có thể sử dụng tannin trong vỏ cây như nguồn cacbon hữu
cơ trong quá trình nhiễm bệnh. Chất tannin trong vỏ cây đóng vai trò quan trọng, vì
nó rất nhạy cảm với bệnh bạc lá của cây hạt dẻ.
Enzyme tannase từ vi khuẩn có thể thuỷ phân tannin tự nhiên và axit tannic
rất hiệu quả (Deschamps et al, 1983; Lewis và Starkey, 1969). Deschamps (1983)
đã phát hiện thấy khả năng phân giải tannin của tannase ngoại bào và giải phóng
axit gallic và glucose. Tác giả cũng đã chỉ chứng minh rằng các chủng vi khuẩn
Bacillus pumilus, Bacillus polymyxia và Klebsiella planticola có thể sản xuất
tannase ngoại bào từ vỏ hạt dẻ như là nguồn cacbon duy nhất. Sự phong phú của các
nhóm vi khuẩn có thể phân giải tannin cũng được tìm thấy trong đường tiêu hoá của
động vật nhai lại (Deschamps et al, 1983).
Sự phân giải tannin từ nấm men đã không được đi sâu vào nghiên cứu. Aoki
et al, (1976) đã phân lập và báo cáo về sự suy thoái gallotannin bởi các loài nấm
men Candida có thể sản xuất enzyme tannase. Tannase từ nấm men này có thể thuỷ
phân các liên kết este và depside từ các axit tannic để tạo thành axit gallic và
glucose.

Bảng 1.3: Các vi sinh vật có khả năng sản sinh tannase (Bhat et al, 1998)
Nguồn vi sinh vật

Tài liệu tham khảo

Vi khuẩn
Bacillus pumilis

Deschamps et al, 1983

Bacillus polymyxa

Deschamps et al, 1983

Corynebacterium sp

Deschamps et al, 1983

Nấm mốc
Bradoo et al, 1996

Aspergillus oryzae

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
8


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương

pháp lên men rắn”

Aspergillus niger

Bradoo et al, 1996

Rhizopus oryzae

Hadi et al, 1994
Ganga et al, 1977

Penicillium notatum
Nấm men
Candida sp

Aoki et al, 1976

Pichia spp

Deschamps & Lebeault, 1984

1.1.3. Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme tannase
Trong những năm gần đây nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu sinh
tổng hợp enzyme tannase từ nhiều loại nấm sợi khác nhau, trong số đó các chi
Aspergillus và Penicillium được lựa chọn nhiều nhất cho mục đích sinh tổng hợp
enzym tannase (Bajpai and Patil, 1997; Banerjee et al, 2001; Pinto et al, 2001).
Ngoài ra sinh tổng hợp tannase còn được nghiên cứu ở các nguồn khác như nấm
men (Aoki et al; 1976) và vi khuẩn (Sivashanmugam and Jayaraman, 2011; Mondal
et al, 2000, 2001; sharma and John, 2011).
Một số nhà khoa học đã chứng minh nấm sợi có khả năng phân giải tannin

như một nguồn cacbon duy nhất và sự phân giải tannin tăng khi bổ sung các chất
trao đổi khác (Lewis & Starkey, 1969; Hadi et al, 1994). Ganga et al (1977) cho
rằng Aspergillus niger và Penicillium spp tăng trưởng tốt hơn trong môi trường có
chứa đường và tannin (Bhat et al, 1997, 1998), điều này cho thấy việc bổ sung
nguồn cacbon và nitơ thúc đẩy việc sản xuất tannase cho sự phân cắt tiếp theo của
các phân tử tannin để tăng cường giải phóng nguồn cung cấp cacbon.
Việc sản xuất enzyme tannase từ Aspergillus có thể thực hiện khi không có
mặt của axit tannic trong môi trường nuôi cấy, nhưng những loại nấm này có thể
chịu đựng được nồng độ axit tannic cao lên tới 20% mà không có ảnh hưởng xấu
nào tới sự phát triển và sự tạo thành enzyme. Các nghiên cứu về sự tạo thành
enzyme tannase từ Aspergillus có thể được thực hiện ở các môi trường khác nhau
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
9


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

như ở bề mặt chất lỏng, lên men chìm, và lên men ở trạng thái rắn (Bradoo et al.
1997, Belmares et al. 2004), việc sử dụng môi trường lên men chìm có lợi thế trong
quá trình kiểm soát và giữ nguyên sự phục hồi của enzyme ngoại bào.
Nghiên cứu sản xuất enzyme tannase ngoại bào bởi Aspergillus tammarii
trong môi trường lên men chìm, có tốc độ tăng trưởng tối đa không đạt được cho
đến 4 ngày, nhưng sự tạo thành enzyme tối ưu xảy ra sau 2 ngày nuôi cấy. Axit
gallic được sử dụng làm chất nền cho việc tạo enzyme tannase có hoạt tính cao nhất
(20,6 U/ml) trong các môi trường nuôi cấy. Hoạt độ của tannase thu được trong các
môi trường có chứa axit tannic và methyl gallate cao (tương ứng là 12,4 và 10,1
U/ml). Các hợp chất phenol như axit gallic, pyrogallol, methyl gallate và axit tannic

đã được coi là các chất thúc đẩy sự tạo thành enzyme tannase (Bajpai and Patil
1997).
Bổ sung các nguồn cacbon như glucose, fructose, sucrose, maltose và
arabinose vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ ban đầu từ 10 đến 30g/l sẽ tăng cường
sự tạo thành enzym tannase từ Aspergillus niger (Belmares et al, 2004).
Tannase đã được chứng minh là một enzyme cảm ứng, do đó tannase chỉ
biểu hiện khi có mặt chất nền của nó hay một chất khác tương tự như chất nền
chẳng hạn như axit tannic hoặc sản phẩm cuối cùng của nó như axit gallic (Haslam
& Tanner, 1970). Khi tăng nồng độ cơ chất cảm ứng axit tannic trong môi trường
nuôi cấy sẽ tăng cường khả năng sinh tổng hợp enzym tannase. Nếu nồng độ chất
cảm ứng tannic cao sẽ gây ức chế sinh trưởng vi sinh vật dẫn tới hoạt tính tannase
được tổng hợp cũng giảm theo.
Gần đây nhằm khai thác lợi thế của phương pháp lên men ở trạng thái rắn
như đơn giản, chi phí sản xuất thấp hơn, sản lượng enzyme cao và lượng nước thải
ra thấp, nhiều nghiên cứu về sự tạo thành của enzyme tannase ở điều kiện lên men
rắn được thực hiện trên các môi trường bề mặt như cám gạo, lúa mì, cám, bột củ cải
đường, bột trái cây, chuối, sắn, phế liệu từ cà phê, bổ sung thêm axit tannic.
Sự tạo thành enzyme tannase từ Aspergillus niger trong môi trường lên men
rắn, enzyme đã được thanh lọc để đồng nhất với môi trường nuôi cấy tế bào và sử
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
10


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

dụng phương pháp trao đổi ion và sắc ký lọc gel (FPLC) để phân tích cũng như
nghiên cứu tính chất hóa học của enzyme tannase tinh khiết, có sự hiện diện của hai

loại enzyme có khối lượng phân tử là 90kDa và 180kDa. Tannase có điểm đẳng
điện là 3,8 và nhiệt độ tối ưu là 60-70oC, pH tối ưu là 3,5 - 8. Tannase ổn định
trong một vài tháng ở 30oC.
Một số chế phẩm enzyme tannase thương mại có mặt trên thị trường của thế
giới bao gồm: AESL và BioAgro (Ấn Độ), ATS Enzym (Hoa Kỳ), SEB group USA
(Mỹ), Fame (Hồng Kông), Biocon (Ấn Độ),…
Mặc dù tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme tannase từ vi sinh vật
trên thế giới đã có những thành tựu nhất định nhưng ở nước ta thì chưa có nghiên
cứu nào về việc sinh tổng hợp enzyme tannase từ vi sinh vật được công bố thậm chí
các ứng dụng của enzyme tannase thương mại vào trong lĩnh vực đồ uống từ các
loại quả giàu tannin, làm trong nước quả và duy trì sự ổn định hàm lượng của các
chất chống oxi trong dịch trà xanh uống liền và trong các ngành công nghiệp khác
hầu như chưa có nghiên cứu nào được thực hiện. Do vậy đây là một hướng nghiên
cứu cần thiết và có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn.
1.2. Tannin
Tannin là những hợp chất của polyphenol có trong thực vật, trong phân tử
không có nitơ. Tannin có phân tử lượng từ 300 đến 3000 Da thậm chí lên đến 20000
Da. Tannin tan trong nước, cồn, axeton, không tan trong ete và chlororm, có vị chát
và được phát hiện dương tính với thí nghiệm thuộc da.
Một số lượng lớn các nhóm phenolic hydroxyl cho phép tannin tạo phức với
các protein và một lượng thấp hơn thì hình thành phức hợp với các đại phân tử khác
như cellulose và pectin (Mueller Harvey et al, 1987).

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
11


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương

pháp lên men rắn”

Hình 1.2. Cấu tạo của tannin
Sau lignin, tannin là nhóm thứ hai chứa nhiều phenolic nhất trong thực vật.
Tanin được coi là hợp chất thứ cấp vì chúng không tham gia vào quá trình trao đổi
chất (Bhat et al, 1998). Tannin có chức năng làm lành vết thương và hoạt động như
các sắc tố.
Tannin bảo vệ cây khỏi sự tấn công bởi vi khuẩn, làm bất hoạt virut và xâm
lấn enzym ngoại bào của vi sinh vật. Các vi sinh vật tấn công bằng cách tiết enzym
sẽ bị bất hoạt toàn bộ hoặc một phần bởi sự hình thành phức hợp giữa cơ chất của
vi sinh vật với protein (không phải enzym) trong thực vật, và phân tử tannin (Lekha
và Lonsane, 1997). Tannin cũng đóng góp vào sự phòng vệ hóa học, bảo vệ thực vật
trước côn trùng và động vật có vú ăn cỏ (Hartzefelt et al, 2002).
Tannin gây ảnh hưởng xấu lên động vật, vi sinh vật, môi trường. Một lượng
lớn nhóm phenol hydroxyl cho phép tannin tạo phức hợp không hòa tan và khó tiêu
hóa, chủ yếu với protein, tinh bột, cellulose, pectin và các enzym tiêu hóa. Do đó,
chúng làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn và lượng thức ăn hấp thu được ở
động vật, đặc biệt đối với động vật nhai lại. Chúng cũng ức chế sự tăng trưởng của
một số vi sinh vật và chống lại vi khuẩn tấn công bằng cách ức chế enzym thông
qua phá vỡ màng tế bào. Tannin trong chất thải nông nghiệp gây ô nhiễm nghiêm
trọng trong môi trường. Do đó, tannin có tác động tiêu cực đến các sinh vật sống
(Kumar et al, 1999).

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
12


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương

pháp lên men rắn”

1.2.1 Phân loại tannin
Tannin có thể được chia làm hai nhóm chính trên cơ sở cấu trúc và tính chất
của chúng.
1.2.1.1. Tannin thuỷ phân (tannin pyrogallic)
Các tannin thuỷ phân là những thành phần phenolic thực vật có nguồn gốc
mono đến pentagalloylated β-D glucopyranose. Tannin thủy phân có chứa một
phân tử glucose làm lõi trung tâm có thể este hóa một phần hoặc hoàn toàn với axít
gallic và các dẫn xuất của axít gallic. Tanin thủy phân có thể gây độc nếu lượng
tannin trong thực vật quá cao (Bhat et al, 1998).
Khi thuỷ phân bằng axit hoặc bằng enzyme tannase giải phóng ra phần đường
là glucose (nhưng đôi khi cũng gặp những loại đường đặc biệt) phần không phải
đường là các axit, axit hay gặp là axit gallic. Các axit gallic nối với nhau bằng dây
nối depsid tạo thành axit digallic, axit tridigallic.

1.2.1.2. Tannin ngƣng tụ (tannin pyrocatechic)
Được hình thành từ những đơn phân cơ bản là catechin và epicatechin, đó là
hai chất đồng phân của nhau. Phân tử cơ bản thuộc loại flavonoid có cacbon số 4 là
nhóm metylen (-CH2-) dễ ngưng tụ thành các polyme. Sự ngưng tụ thường xảy ra ở
dây nối cacbon – cacbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo
thành dimer.
1.3.4.3. Tannin phức hợp
Có một nhóm tannin trung gian cũng tồn tại mà nó là sự kết hợp cả hai đặc
tính của tannin thuỷ phân và tannin ngưng tụ. Tannin phức hợp được cấu tạo từ
catechin hay epicatechin liên kết glycozit với một gallotannin hoặc một ellagitannin.
Tannin phức hợp thủy phân tạo catechin hoặc epicatechin và axít ellagic hoặc axít
gallic (Mingshu et al, 2006). Các tannin catechin khá phổ biến trong các loại đậu,
cây bụi nhiệt đới và lá chè (Bhat et al, 1998).
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
13


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

Bảng 1.4: Sản phẩm thủy phân của các loại tanin khác nhau bởi enzyme
tannase (Haslam & Tanner, 1970)
Tannin thủy phân

Tannin catechin

Gallotannin tạo thành axit Catechin và Epicatechin
gallic và glucoza khi thủy gallate tạo thành catechin,
phân
epicatechin và axit gallic
khi thủy phân

Tannin ngƣng tụ
Các polyme
proanthocyanidin, tạo
thành mono flavonoit như
là flavan-3,4-diol và
flavan-3-ol

Ellagitannin tạo thành
axit ellagic và glucoza khi
thủy phân

1.3. Ứng dụng của enzyme tannase
Teighem là người đầu tiên nghiên cứu về sự hình thành của axit gallic khi
nuôi Penicillium glaucum và Aspergillus niger trên môi trường có chứa axit tannic.
Tannase là enzyme chịu trách nhiệm thuỷ phân các liên kết este và liên kết depside
trong các tannin thuỷ phân như axit tannic để tạo thành axit gallic và glucose
(Lekha & Lonsane, 1994). Enzyme tannase được sử dụng trong chế biến thực phẩm
và nước giải khát, tuy nhiên việc sử dụng thực tế của enzyme này hiện nay còn đang
hạn chế do không đủ kiến thức về đặc tính của nó, điều kiện sản xuất tối ưu và ứng
dụng trên quy mô lớn.
Thị trường thế giới của nước ép trái cây là 5 tỷ USD/năm, Brazil có khoảng
33% của thị trường này và được đánh giá là phát triển tốt, nước táo hạt điều là một
loại nước uống giàu vitamin C được sản xuất từ cả hạt điều nhưng việc bán của loại
nước này trên thế giới đang bị cản trở bởi vị chát và sự không ổn định của sản
phẩm, nguyên nhân của vấn đề này là do sự có mặt của các hợp chất phenolic mà
điển hình là tannin. Do vậy mà người ta dựa trên việc sử dụng tiềm năng của
enzyme tannase để giảm hàm lượng chất tannin trong các loại nước ép trái cây. Axit
gallic cũng được sử dụng trong việc tổng hợp enzyme từ propyl gallate, và được sử
dụng chủ yếu như một chất chống oxi hóa chất béo và dầu (Belmares et al, 2004,
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
14


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

Vaquero et al, 2004, Yu et al, 2004).
Việt Nam là một đất nước có khí hậu nhiệt đới nên có nguồn tài nguyên thiên
nhiên vô cùng dồi dào và phong phú nhất là nguồn nguyên liệu quả. Và trái cây

nhiệt đới ở nước ta là một trong những nguồn nguyên liệu giàu vitamin C. Đó là
thuận lợi rất lớn cho ngành công nghiệp chế biến đồ uống phát triển. Các loại quả
có giá trị dinh dưỡng cao được lựa chọn làm nguồn nguyên liệu trong việc chế biến
nước giải khát, rượu vang,.. như nho, cam, chanh, táo, xoài, dứa,...Còn một số loại
quả có hàm lượng tannin cao như táo mèo, lựu, ổi, ...có chứa hàm lượng vitamin C
cao và có hương thơm đặc trưng nhưng lại chưa được sử dụng rộng rãi trong việc
chế biến nước quả, nguyên nhân là do trong các loại quả này có chứa hàm lượng
tannin cao làm cho nước quả bị chát và đắng. Hơn thế nữa hàm lượng tannin cao sẽ
làm cho các sản phẩm đồ uống bị lắng cặn làm giảm giá trị dinh dưỡng và chất
lượng cảm quan của sản phẩm. Hiện nay thì việc xử lý tannin trong thành phần
nguyên liệu để sản xuất ra các sản phẩm đồ uống ở Việt Nam vẫn chưa được giải
quyết.
Gần đây ở nước ta đã có một số đề tài nghiên cứu về ứng dụng của enzyme
tannase trong công nghiệp thực phẩm mà chủ yếu đi sâu vào trong lĩnh vực đồ
uống. Cụ thể:
Ứng dụng trong sản xuất trà lạnh: Xử lí trà bằng tannase nâng cao mức độ
tự nhiên của epicatechin và axit gallic, trong đó ưu tiên sự hình thành axit
epitheaflavic, tạo cho trà có màu đỏ tươi sáng. Điều này có nghĩa là việc xử lí sản
phẩm trà bằng tannase cho năng suất trà có độ hoà tan trong nước lạnh tốt hơn và
màu sắc đẹp hơn, hiệu suất cao và tính axit ổn định.
Ứng dụng trong sản xuất bột chiết xuất từ lá ổi: Trong công nghệ sản xuất
bột chiết xuất từ lá ổi cũng đã sử dụng enzyme tannase để xử lí tannin trong quá
trình sản xuất bột lá ổi với các thành phần polyphenol, tannin và các thành phần
khác tạo đục hoặc kết tủa sản phẩm làm giảm hình thức sản phẩm, ảnh hưởng đến
tâm lý tiêu dùng .
Ứng dụng trong sản xuất bia và rƣợu: Chế phẩm enzyme tannase được sử
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
15

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

dụng để thuỷ phân các hợp chất phenol phức tạp để loại sự hình thành chất lạ trong
sản xuất bia. Trong sản xuất rượu vang tannase đang được sử dụng để thuỷ phân
axit chlorogenic thành axit caffeic và axit quinic, ảnh hưởng tới hương vị cảm quan
của rượu (Chae et al, 1983).
Ứng dụng trong các lĩnh vực khác: Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, chế
phẩm tannase được sử dụng để loại bỏ các tác dụng không mong muốn tác động của
tannin (Lekha và Lonsane, 1997).
Tannase được sử dụng trong xử lý nước thải bị ô nhiễm với các hợp chất
phenolic (Aguilar et al, 2002). Tannase cũng được sử dụng trong mỹ phẩm để loại
bỏ độ đục của các chất chiết xuất từ thực vật và trong ngành công nghiệp da để
đồng nhất tannin chuẩn bị cho tannin thuộc da cao cấp (Lekha & Lonsane, 1997).
Hơn nữa, có thể được sử dụng như một đầu dò phân tích nhạy cảm để xác định cấu
trúc các este của axít gallic trong tự nhiên (Seth & Chand, 2000).

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
16


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Tiến hành thu thập 11 mẫu nguyên liệu thực vật ở miền bắc Việt Nam giàu
tannin như lá, vỏ cây, quả.
Quả sung:

Hà Nội

Trà mạn: Thái Nguyên

Quả chuối xanh: Hà Nội

Cùi cọ:

Táo ngọt:

Trà đen: Phú Thọ

Hà Nội

Quả Mác kham: Cao Bằng
Múi mít:

Phú Thọ

Quả nho:

Trung Quốc

Quả lê:

Trung Quốc

Phú Thọ

Cám gạo: Trung Quốc

Gạo nếp lật Thái Bình là nguồn nguyên liệu giàu tannin thô và được sử dụng
làm môi trường trong quá trình lên men ở trạng thái rắn.
2.1.2. Các chủng vi sinh vật
03 chủng nấm mốc Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp tannase cao ký
hiệu TQ 38, TQ 41, TQ 42 của bên đối tác Trung Quốc cung cấp cho Viện Công
nghiệp Thực phẩm.
2.1.3. Hóa chất
Các loại hóa chất tinh khiết của hãng Merck (Đức), BDH (Anh), và một số
hóa chất có nguồn gốc Trung Quốc.
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
17


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

Hóa chất nuôi cấy: cao nấm men, pepton, axit tannic, ure, muối các loại,
tween 80
Hóa chất tách chiết enzym: NaCl, CH3COOH 0,2 M; CH3COONa 0,2M;
đệm axetat pH= 5,0 và pH=5,5
Hóa chất xác định hoạt lực emzym tannase theo phương pháp vi sinh: axit

tannic, BSA, SDS, FeCl3 0,01M; HCl 0,01N
2.1.4. Thiết bị máy móc
- Tủ cấy vô trùng Biolock Scientific – Pháp
- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g Presisa 62A – Thụy Điển
- Cân điện tử độ chính xác 0,1g Ohaus CT1200 – Mỹ
- Máy ly tâm Universal 12A - Đức
- Máy khuấy Kika RW16 - Đức
- Máy đo quang Cecil CE 1021 – Anh
- Tủ nuôi vi sinh vật Sanyo – Nhật Bản
- Kính hiển vi Ceti - Đức
- Máy điều nhiệt Vision VS 1205SW1 – Hàn Quốc
- Tủ sấy Sanyo – Nhật Bản
- Máy đo pH
2.1.5. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy
 Môi trường PDA( Potato dextrose agar) (g/l): môi trường phân lập enzyme
Khoai tây

:

200g/l

Glucose

:

20g/l

Agar
pH=5÷ 6,

:

20g/l

Hấp 121oC/20 phút
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
18


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

 Môi trường TTA( tannic axít agar): môi trường sơ tuyển enzyme
Tannic

:

2g/l

Agar

:

20g/l. Hấp 1210C/ 20 phút

 Môi trường T1 (g/l): môi trường lựa chọn enzyme
K2HPO4

: 0,5g/l

KH2PO4

: 0,5g/l

MgSO4

: 2g/l

NH4 Cl

: 3g/l

CaCl2

: 1g/l

Axít tannic

: 2g /l

Agar

: 20g

pH = 6, hấp 121oC/20 phút
 Môi trường T2: môi trường rắn thử nghiệm
Gạo hấp
K2HPO4

: 0,05%

KH2PO4

: 0,05%

MgSO4

: 0.2%

NH4 Cl

: 0,3%

CaCl2

:0,1%

Axít tannic : 0,1%
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
19


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

2.2. Phƣơng pháp phân tích hóa sinh

2.2.1. Xác định hoạt độ enzym tannase
 Thu dịch chiết enzym: Sau khi kết thúc nuôi cấy, cân 10g mốc và cho vào
100 ml dung dịch NaCl 0,5%. Đưa hỗn hợp vào máy lắc trong thời gian 3 giờ, sau
đó lọc và thu được dịch chiết enzym.
 Phƣơng pháp định tính (phƣơng pháp đục lỗ thạch): nhỏ 0,02 ml dịch
chiết enzym vào các đĩa petri chứa môi trường T1 đã được đục lỗ trước đường kính
lỗ 0.5 cm và được nuôi ở 300C trong 36h. Đổ dung dịch FeCl3 0,01M lên bề mặt đĩa
thạch. Đo vòng phân giải thể hiện hoạt tính tannase của nấm mốc.
 Phƣơng pháp định lƣợng:
Nguyên tắc: phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân axít tannic bởi enzyme
tannase có trong mẫu cần phân tích, sản phẩm tạo thành là đường glucose và axít
gallic. Xác định cường độ màu tạo thành của axít tannic còn lại với FeCl3 là chất
hiện màu.
Một đơn vị hoạt độ của tannase là lượng enzyme có thể xúc tác thủy phân
1mmol axit tannic sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
Chuẩn bị hoá chất:
- Dung dịch đệm axetat pH 5 và ph 5,5 :
Dung dịch A (CH3COOH 0,2M): cân 11,55 g axetic axit hoà tan trong 1 lít
nước cất.
Dung dịch B (CH3COONa 0,2M): cân 27,21 g CH3COONa.3H2O hoà tan
trong nước cất rồi định mức đến 1000 ml.
Sau khi chuẩn bị xong dung dịch A và B, lấy 5,9 ml dung dịch A trộn với
14,1 ml dung dịch B rồi điều chỉnh pH 5 bằng dung dịch A hoặc dung dịch B.
Sau khi chuẩn bị xong dung dịch A và B, lấy 4 ml dung dịch A trộn với 14,1
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
20

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

ml dung dịch B rồi điều chỉnh pH 5,5 bằng dung dịch A hoặc dung dịch B.
- Dung dịch huyết thanh bò: cân 0,1g BSAvà 0,9945g NaCl sau đó hòa tan
bằng dung dịch đệm acetat 0,2M (pH= 5,0), định mức đến 100ml bằng dung dịch
đệm acetat 0,2M (pH= 5,0).
- Dung dịch SDS- triethanolamine: cân 0,001g SDS hòa tan vào nước cất,
định mức tới 100ml bằng nước cất, nhỏ thêm 5 ml dung dịch triethanolamine.
- Dung dịch FeCl3 0,01M: cân 0,2705g hòa tan vào 100ml dung dịch axít
HCl 0,01N.
- Dung dịch NaCl 0,5%: cân 5g NaCl hoà tan với nước cất rồi định mức tới
1000 ml bằng nước cất.
Cách tiến hành:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 0,3 ml axít tannic 1%.
Bổ sung vào ống nghiệm 1 – mẫu đối chứng 0,5 ml nước cất.
Bổ sung vào ống nghiệm 2 – mẫu thí nghiệm 0,5 ml dịch chiết enzym. Tiến hành
lắc đều hai ống và để ổn định trong máy ổn nhiệt ở 600C trong 30 phút.
Dừng phản ứng bằng cách bổ sung dịch 3ml BSA. BSA phản ứng với axit
tannic tạo kết tủa. Sau khi phản ứng kết thúc, ly tâm dịch ở 4000 vòng/phút trong 5
phút. Thu kết tủa và hòa tan trong 3ml SDS-triethanoamine. Sau đó bổ sung 1ml
FeCl3 và giữ trong 15 phút để ổn định màu.
Đo độ hấp thu quang của dung dịch phản ứng ở bước sóng λ=530nm.
Công thức tính hoạt độ của enzym

Trong đó: V là thể tích enzym phân tích (ml)
t là thời gian của phản ứng thuỷ phân axit tannic, t = 30 phút
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu

21


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

f là hệ số pha loãng của enzym
0,577 là hệ số thực nghiệm
ΔOD = ODDC - ODTN
ODDC là cường độ màu của mẫu đối chứng
ODTN là cường độ màu của mẫu thí nghiệm
2.3. Phƣơng pháp vi sinh
2.3.1. Phân lập nấm mốc
Các nguồn nguyên liệu được thái nhỏ hoặc băm nát và nuôi trong điều kiện
tự nhiên để lên mốc. Các chủng mốc được cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ
30oC trong 72h để phân lập.
2.3.2. Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme tannase cao
Sơ tuyển các chủng nấm mốc nhận được từ phân lập bằng cách cấy chấm
điểm trên môi trường TTA có chứa axit tannic và nuôi cấy ở nhiệt độ 300C trong 72
giờ. Trong quá trình sinh trưởng phát triển nấm mốc sinh tổng hợp enzyme tannase
và thủy phân axít tannic. Kết thúc nuôi cấy, đổ dung dịch FeCl3 0,01M lên bề mặt
đĩa thạch. Dung dịch FeCl3 phản ứng với nhóm phenol của axit tannic tạo ra màu
nâu. Dựa trên đường kính vòng phân giải để lựa chọn chủng nấm mốc có khả năng
sinh tổng hợp enzyme tannase cao.
Sau đó, tiến hành tuyển chọn chủng nấm mốc trên môi trường thạch T1, môi
trường có bổ sung thêm các khoảng chất và nitơ so với môi trường TTA. Tiêu chí
lựa chọn là đường kính vòng phân giải.

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
22


“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

2.3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện lên men tới sinh tổng hợp
enzyme tannase
Các thí nghiệm khảo sát các thành phần môi trường có ảnh hưởng tới quá trình
tổng hợp enzyme tannase được thực hiện với nhiệt độ 30oC, độ dày 2cm, có đậy vải
giữ ẩm và không đảo trộn thông khí.
Gạo nếp lật sau khi hấp chín được đổ ra khay. Bổ sung pepton 0,3%; CaCl2
0,1% ngoài ra còn bổ sung các thành phần khác tùy thuộc vào từng nghiên cứu như
nitơ vô cơ (NH4Cl), nitơ hữu cơ (cao nấm men, ure, pepton), axit tannic, glucose.
MgSO4, KH2PO4, FeSO4…, chủng giống nghiên cứu được cấy với mật độ 10g/ 1kg
gạo.
Các nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện lên men tới sinh tổng hợp enzyme
tannase được nghiên cứu với thành phần môi trường đã được lựa chọn từ các thí
nghiệm trên và tiến hành lên men sinh tổng hợp enzyme được thực hiện ở các giá trị
pH, nhiệt độ lên men và chế độ thông khí đảo trộn khác nhau. Kết thúc lên men,
tiến hành thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ enzyme trong dịch chiết. Chỉ
tiêu lựa chọn là hoạt độ enzyme nhận được trong dịch chiết enzyme.

Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
23

“ Nghiên cứu sinh tổng hợp emzyme tanase từ các chủng nấm mốc Aspergillus theo phương
pháp lên men rắn”

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc tự nhiên có khả năng sinh tổng
hợp enzym tannase
3.1.1 Phân lập các chủng nấm mốc tự nhiên từ các nguồn nguyên liệu môi
trường khác nhau
Các nguồn nguyên liệu được thái nhỏ hoặc băm nát và nuôi trong điều kiện
tự nhiên để lên mốc. Các chủng mốc được cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ
30oC trong 72h để phân lập. Sau nhiều lần cấy chuyển trên các đĩa petri, chúng tôi
đã thu được 14 chủng mốc thuần.

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc một số chủng nấm mốc đã phân lập đƣợc
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật

Phạm Hoài Thu
24