Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính của enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay lambis chiragra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGÔ THỊ DUY NGỌC

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME
ALGINATE LYASE TỪ GAN TỤY
ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS. QUẢN LÊ HÀ

2. PGS. TS. BÙI MINH LÝ

HÀ NỘI - 2012


LỜI CAM ĐOAN
Học viên:

NGÔ THỊ DUY NGỌC

Nơi đào tạo:

Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn 1: PGS. TS. QUẢN LÊ HÀ
Ngƣời hƣớng dẫn 2: PGS. TS. BÙI MINH LÝ
Tên luận văn:

Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính của

enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra.
Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi
dƣới sự chỉ bảo của thầy cô hƣớng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu
Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha
Trang - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Các số liệu và kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Học viên

Ngô Thị Duy Ngọc

i


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến hai ngƣời thầy
hƣớng dẫn luận văn cho tôi: Thầy Bùi Minh Lý, Viện trƣởng Viện Nghiên cứu và
ứng dụng công nghệ Nha Trang, và Cô Quản Lê Hà, Phó viện trƣởng Viện Công
nghệ thực phẩm – Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội, luôn tận tình

hƣớng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ thực phẩm - Công nghệ sinh học,
Viện Sau đại học, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng quý thầy cô đã nhiệt tình
giảng dạy trong suốt thời gian học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ Viện Nghiên cứu
và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian
học tập, đặc biệt là tập thể cán bộ Phòng Công nghệ sinh học biển, đã giúp đỡ tôi
tận tình trong suốt quá trình làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân yêu trong gia đình và
bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, tháng 09 năm 2012

NGÔ THỊ DUY NGỌC

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii
MỤC LỤC .............................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... ix
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1

SƠ LƢỢC VỀ ALGINATE LYASE .......................................................... 3

1.1.1 Khái niệm về polysaccharide lyase và alginate lyase ............................. 3
1.1.2 Các nguồn thu nhận alginate lyase ......................................................... 4
1.1.3 Cấu trúc của alginate lyase .................................................................... 6
1.1.4 Cơ chế xúc tác của alginate lyase ......................................................... 10
1.1.5 Các đặc tính căn bản của alginate lyase ............................................... 13
1.1.6 Chức năng sinh học của alginate lyase ................................................. 16
1.1.7 Ứng dụng của alginate lyase ................................................................ 17
1.2

GIỚI THIỆU VỀ ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA ........................... 19

1.2.1 Phân loại khoa học............................................................................... 19
1.2.2 Đặc điểm hình thái............................................................................... 20
1.2.3 Phân bố sinh thái và ý nghĩa kinh tế ..................................................... 20
1.3

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ALGINATE LYASE TRÊN THẾ GIỚI
VÀ Ở VIỆT NAM ................................................................................... 21

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 24
2.1

NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................... 24

2.1.1 Nguyên liệu ......................................................................................... 24
2.1.2 Hóa chất .............................................................................................. 24
2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 24
iii

2.2

PHƢƠNG PHÁP ..................................................................................... 25

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................ 25
2.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu ............................................................. 26
2.2.2.1 Giai đoạn 1 : Khảo sát quá trình trích ly ........................................ 26
2.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh sạch alginate lyase bằng phƣơng pháp kết tủa ... 26
2.2.2.3 Giai đoạn 3: Tinh sạch alginate lyase bằng phƣơng pháp lọc gel ... 27
2.2.2.4 Giai đoạn 4: Xác định một số đặc tính của chế phẩm
alginate lyase ................................................................................. 28
2.2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu............................................................... 29
2.2.3.1 Xác định hoạt độ enzyme alginate lyase ........................................ 29
2.2.3.3 Xác định khối lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp điện di
SDS-PAGE ................................................................................... 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 35
3.1

TRÍCH

LY

ENZYME

ALGINATE

LYASE

TỪ

GAN

TỤY

ỐC BÀN TAY LAMBIS CHIRAGRA ....................................................... 35
3.1.1 Xác định tỷ lệ khối lƣợng gan tụy/ dung môi (w/v) cho quá trình trích ly
enzyme alginate lyase ......................................................................... 35
3.1.2 Xác định pH trích ly ............................................................................ 36
3.1.3 Xác định nhiệt độ trích ly .................................................................... 37
3.1.4 Xác định thời gian trích ly ................................................................... 39
3.2

KHẢO SÁT TINH SẠCH ALGINATE LYASE BẰNG PHƢƠNG PHÁP
KẾT TỦA ................................................................................................ 40

3.2.1 Tinh sạch enzyme alginate lyase trong dịch chiết từ gan tụy ốc bàn tay
Lambis chiragra bằng dung môi hữu cơ (ethanol và acetone) ............. 40
3.2.1.1 Kết tủa alginate lyase bằng ethanol ................................................ 40
3.2.1.2 Kết tủa alginate lyase bằng acetone ............................................... 42
3.2.2 Tinh sạch enzyme aginate lyase trong dịch chiết từ gan tụy ốc bàn tay
Lambis chiragra bằng (NH4)2SO4 ....................................................... 43
3.2.3 Kết luận chung .................................................................................... 44
iv


3.3

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ALGINATE LYASE BẰNG
SẮC KÝ LỌC GEL ................................................................................. 46

3.3.1 Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa ethanol 20:80 ............... 46
3.3.2 Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa ammonium sulphate 70%
........................................................................................................... 47
3.3.3 Kết luận chung .................................................................................... 49
3.4

XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ................................................... 50

3.5

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ALGINATE LYASE ................ 52

3.5.1 Xác định nhiệt độ phản ứng tối ƣu ....................................................... 52
3.5.2 Xác định pH phản ứng tối ƣu ............................................................... 53
3.5.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ ổn định hoạt tính của chế phẩm
........................................................................................................... 55
3.5.5 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến độ ổn định hoạt tính của chế phẩm .... 56
3.5.6 Ảnh hƣởng của ion kim loại................................................................. 57
3.5.7 Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl.............................................................. 58
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 60
4.1

KẾT LUẬN ............................................................................................. 60

4.2

KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 62

PHỤ LỤC.............................................................................................................. 69

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS

Ammonium persulphate

BSA

Bovine serum albumin

cs

Cộng sự

G

Guluronate

kDa

Kilo Dalton

M

Mannuronate

MW

Molecular weight

OD

Optical density

PL

Polysaccharide lyase

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N, N, N‟, N‟-tetremethylethylenediamine

v/v

Volume/ volume

w/v

Weight/ volume

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc không gian (A) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)
của ALY1-III từ Sphingomonas sp. thuộc họ PL-5 .................................................. 8
Hình 1.2. Mô hình cấu trúc không gian (C) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (D) của A1-II‟
từ Sphingomonas sp. A1 thuộc họ PL-7 ................................................................... 9
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)
của Atu3025 từ Agrobacterium tumefaciens thuộc họ PL-15 ................................... 9
Hình 1.4. Cấu trúc của alginate.

........................................................................ 11

Hình 1.5. Sự phân cắt alginate bởi (A) endo alginate lyase (B) exo alginate lyase . 12
Hình 1.6. Ốc bàn tay Lambis chiragra .................................................................. 20
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 25
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn nồng độ β-D-mannuronate ............................................... 30
Hình 2.3. Đƣờng chuẩn protein theo Lowry dùng BSA làm chuẩn ........................ 32
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ gan tụy/dung môi đến quá trình trích ly
alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra ............................................ 35
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH dung môi đến quá trình trích ly alginate lyase
từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra................................................................... 37
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly alginate lyase từ gan tụy
ốc bàn tay Lambis chiragra ................................................................................... 38
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến quá trình trích ly alginate lyase
từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra................................................................... 39
Hình 3.5. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của dịch trích ly alginate lyase

từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa bằng ethanol ............................ 41
Hình 3.6. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của dịch trích ly alginate lyase
từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa bằng acetone ............................ 42

vii


Hình 3.7. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của dịch trích ly alginate lyase
từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra sau kết tủa bằng ammonium sulphate ........ 43
Hình 3.8. So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase sau tinh sạch
bằng phƣơng pháp kết tủa các tác nhân khác nhau ................................................. 45
Hình 3.9. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch alginate lyase với Sephadex G-75
của chế phẩm tủa ethanol ....................................................................................... 46
Hình 3.10. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch alginate lyase với Sephadex G-75
của chế phẩm tủa ammonium sulphate................................................................... 48
Hình 3.11. So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase sau tinh sạch
bằng sắc ký lọc gel ................................................................................................ 50
Hình 3.12. Kết quả điện di enzyme alginate lyase ................................................. 51
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy
ốc bàn tay Lambis chiragra ................................................................................... 52
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy
ốc bàn tay Lambis chiragra ................................................................................... 54
Hình 3.15. Độ bền hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra
theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. ................................................................ 55
Hình 3.16. Độ bền hoạt độ alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay Lambis chiragra
theo thời gian tại các pH khác nhau. ...................................................................... 56
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến hoạt độ alginate lyase từ gan tụy
ốc bàn tay Lambis chiragra ................................................................................... 58

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1.1. Trình tự amino acid bảo thủ của một số chủng vi khuẩn .......................... 6
Bảng 1.2. Trình tự 9 amino acid bảo thủ đầu tận cùng C của nhóm alginate lyase
có khối lƣợng phân tử 40 kDa.................................................................................. 7
Bảng 1.3. Trình tự 9 amino acid bảo thủ đầu tận cùng C của nhóm alginate lyase
có khối lƣợng phân tử 30 kDa.................................................................................. 7
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase qua các giai đoạn
tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa ethanol kết hợp với sắc ký lọc gel .................. 47
Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của alginate lyase qua các giai đoạn
tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa (NH4)2SO4 kết hợp với sắc ký lọc gel ............ 49
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 57
Bảng 3.1. Kết quả trích ly alginate lyase với các yếu tố trích ly khác nhau ............ 69
Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch alginate lyase bằng ethanol ........................................ 69
Bảng 3.3. Kết quả tinh sạch alginate lyase bằng acetone ....................................... 70
Bảng 3.4. Kết quả tinh sạch alginate lyase bằng ammonium sulphate .................... 70
Bảng 3.5. Tổng kết quá trình tinh sạch alginate lyase bằng phƣơng pháp tủa ........ 70
Bảng 3.6. Giá trị OD 280nm và hoạt độ alginate lyase của các phân đoạn
sau lọc gel (mẫu enzyme đã qua kết tủa bằng ethanol Venzyme:Vethanol=20:80) ......... 71
Bảng 3.8. Giá trị OD 280nm và hoạt độ alginate lyase của các phân đoạn
sau lọc gel (mẫu enzyme đã qua kết tủa bằng (NH4)2SO4 70% độ bão hòa) ........... 72
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase .............. 73
Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ alginate lyase .............. 73
Bảng 3.12. Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian ở các nhiệt độ
khác nhau .............................................................................................................. 74

Bảng 3.13. Độ bền hoạt độ enzyme alginate lyase theo thời gian tại các pH
khác nhau .............................................................................................................. 75
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl ............................................................. 76
ix


LỜI MỞ ĐẦU
Alginate là hetero-polysaccharide tạo thành từ các monomer đơn vị acid
α-D-mannuronate và acid -L-guluronate qua liên kết 1,4-O-glycoside, có nhiều
trong thành tế bào của rong nâu (Phaeophyta). Trong nhiều năm gần đây, các
oligosaccharide đƣợc tạo ra do quá trình phân cắt alginate bởi enzyme alginate lyase
đã thể hiện các hoạt tính sinh học khác nhau nhƣ kích thích sự tăng trƣởng rễ ở thực
vật bậc cao, tăng tỉ lệ phát triển của Bifidobacterium sp., kích thích sự phân chia tế
bào, có hoạt tính kháng u, kháng khuẩn ... đang thu hút sự chú ý của các nhà nghiên
cứu. Việt Nam có hơn 120 loài rong nâu với sản lƣợng ƣớc tính trên 10.000 tấn
khô/năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất alginate và các sản phẩm
khác có giá trị. Vì vậy việc sử dụng alginate lyase để tận dụng nguồn alginate khổng
lồ này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
Việc nghiên cứu alginate lyase không chỉ mở rộng việc điều chế và sử dụng
các oligosaccharide alginate mà còn là công cụ để xác định cấu trúc alginate cũng
nhƣ tƣơng quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide này. Bên
cạnh đó, alginate lyase là một enzyme quan trọng trong việc tiêu hóa alginate để
cung cấp carbon và năng lƣợng cho các động vật thân mềm biển ăn rong. Vì vậy,
alginate lyase đƣợc xem nhƣ là một nhân tố chìa khóa để giúp hiểu rõ cơ chế tiêu
hóa của các loài động vật thân mềm biển.
Alginate lyase có thể thu nhận từ rong biển, động vật thân mềm biển (tuyến
tiêu hóa của các loài) và vi sinh vật. So với alginate lyase từ các nguồn khác, việc
thu nhận enzyme từ động vật thân mềm còn ít đƣợc đề cập, một số công trình
nghiên cứu trên thế giới chỉ tập trung chủ yếu vào một số loài nhƣ bào ngƣ
(Haliotis rufescens, H. corrugate, H. tuberculata, H. discus hannai), ốc nón

(Turbo cornutus), thỏ biển (Dolabella auricula, Aplysia kurodai)…
Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc một số enzyme có khả năng
phân giải polysaccharide của rong biển từ bộ phận tiêu hóa của 60 loài động vật
1


thân mềm biển. Trong số các mẫu đƣợc sàng lọc, chúng tôi nhận thấy, enzyme từ
gan tụy của ốc bàn tay Lambis chiragra thể hiện hoạt tính phân giải alginate tƣơng
đối tốt. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận
và xác định một số đặc tính của enzyme alginate lyase từ gan tụy ốc bàn tay
Lambis chiragra”. Hiện nay chƣa có đề tài trong nƣớc nghiên cứu về alginate lyase
từ động vật thân mềm biển. Do đó thành công của đề tài này sẽ góp phần mở ra một
định hƣớng nghiên cứu mới và mang tính ứng dụng cao.
 Mục tiêu nghiên cứu
-

Xác định điều kiện tối ƣu để tách chiết, tinh sạch alginate lyase từ gan tụy
ốc bàn tay Lambis chiragra

-

Xác định một số các tính chất của chế phẩm alginate lyase từ gan tụy
ốc bàn tay Lambis chiragra.

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
-

Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về enzyme từ động vật biển đã
mở ra nhiều hƣớng nghiên cứu thú vị về một nguồn tài nguyên đa dạng của
quốc gia.

-

Kết quả nghiên cứu này cũng là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong
mục đích tìm kiếm nguồn enzyme thủy phân các polysaccharide chiết từ rong
biển.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1

SƠ LƢỢC VỀ ALGINATE LYASE
1.1.1

Khái niệm về polysaccharide lyase và alginate lyase

 Polysaccharide lyase
Polysaccharide lyase (PL) hay eliminase (EC 4.2.2-) là một nhóm enzyme
phân cắt các liên kết glycoside trong các phân tử polysaccharide chứa acid uronic,
thông qua cơ chế khử β tạo ra các oligosaccharide không bão hòa [27]. Đây là một
phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau có nhiều trong tự nhiên, đƣợc sinh ra bởi
cả sinh vật không nhân và sinh vật có nhân. Việc phân loại các PL chủ yếu dựa vào
sự tƣơng đồng trình tự amino acid, liên quan đến đặc điểm cấu trúc của các enzyme.
PL đƣợc phân thành 22 họ (PL-1 đến PL-22) dựa trên cơ sở dữ liệu CaZy [20].
 Alginate lyase
Alginate lyase hay alginase hoặc alginate depolymerase là một loại enzyme
thuộc nhóm enzyme PL, đƣợc xếp vào 7 họ của PL là PL-5, -6, -7, -14, -15, -17 và 18 dựa trên cấu trúc bậc một ( Alginate lyase phân
cắt các liên kết glycoside ở trong phân tử alginate bằng cơ chế khử β, tạo ra các

oligosaccharide không bão hòa chứa một nối đôi giữa cacbon thứ 4 và carbon thứ 5
ở đầu không khử.
Enzyme alginate lyase đƣợc phân loại dựa vào việc phân cắt đặc hiệu với cơ
chất alginate giàu mannuronate (M) hay giàu guluronate (G), nhƣ poly (M) lyase
[(1,4)-β-D-mannuronate lyase] (EC 4.2.2.3) hoặc là poly(G) lyase [(1,4)-α-Lguluronate lyase] (EC 4.2.2.11) [55].
Alginate lyase đƣợc tìm thấy cả ở sinh vật tổng hợp đƣợc alginate và ở sinh
vật không tổng hợp alginate. Ở những sinh vật không tự tổng hợp đƣợc alginate,
alginate lyase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa alginate nhƣ nguồn

3


cacbon. Còn ở vi sinh vật tổng hợp alginate, alginate lyase đóng vai trò nhất định
trong cả quá trình tổng hợp và phân giải alginate [20].
1.1.2

Các nguồn thu nhận alginate lyase

 Alginate lyase từ rong biển
Ở rong biển, năm 1973 tác giả Madgwich và cs đã phát hiện trong dịch chiết
của rong Laminaria digitata có chứa enzyme alginate lyase [30]. Tiếp đó năm 1978
tác giả cũng đã tìm ra alginate lyase có trong rong Pelvetia canaliculata [31]. Một
nghiên cứu về alginate lyase ở rong Undaria pinnatifida đã đƣợc công bố bởi hai
tác giả Watanabe và Nisizawa vào năm 1982 [54]. Tác giả Shiraiwa và cs [48] đã
công bố về hoạt tính enzyme alginate lyase ở các loài rong khác nhau. Các tác giả
nhận thấy rằng hoạt tính enzyme khác nhau tùy theo mùa và tùy theo phần lá rong
đƣợc lấy mẫu. Ở mô tế bào lá rong già cho hoạt tính enzyme cao hơn ở tế bào lá
rong non và ngoài ra hoạt tính cũng cao hơn trong mùa lá rong phóng bào tử.
Alginate lyase từ rong biển đóng một vai trò trong quá trình chuyển hóa alginate ở
vách tế bào rong.

Mặc dù các công bố về alginate lyase từ rong biển còn khá ít nhƣng các dẫn
chứng khoa học ở trên đã chứng tỏ rằng trong một vài loài rong biển có chứa
alginate lyase với mức độ khác nhau.
 Alginate lyase từ động vật thân mềm biển
Alginate lyase có nguồn gốc từ động vật thân mềm biển cũng đƣợc phát hiện
ở khá nhiều loài. Trong dịch tiêu hóa của các động vật không xƣơng sống ở biển
nhƣ bào ngƣ, sò điệp, nhím biển … có chứa nhiều loại enzyme phân cắt các
polysaccharide có trong rong biển thuộc chế độ ăn của chúng nhƣ là cellulose,
alginate, mannan, laminarin … giúp cho việc tiêu hóa các chất dinh dƣỡng trong
rong đƣợc dễ dàng [36], [14], [60], [35]. Các oligosaccharide và monosaccharide
tạo ra từ quá trình phân cắt sẽ đƣợc hấp thụ trực tiếp bởi chính các động vật thân
mềm hoặc gián tiếp thông qua quá trình lên men của vi khuẩn đƣờng ruột, cung cấp
một nguồn cacbon và năng lƣợng cho các động vật thân mềm biển này [8].
4


Alginate lyase trong giới động vật thân mềm biển đƣợc phát hiện đầu tiên
vào năm 1968 từ gan tụy của hai loài bào ngƣ Haliotis rufescens và H. corrugate
[34]. Một số loài bào ngƣ khác cũng đã đƣợc nhiều tác giả công bố có chứa alginate
lyase trong dịch tiêu hóa nhƣ là H. tuberculata [5], [15], H. discus hannai [47], [49]
và H. iris [14]. Bên cạnh bào ngƣ, ốc thỏ biển là một trong những đối tƣợng có khả
năng sinh tổng hợp alginate lyase khá phong phú nhƣ loài Dolabella auricular [37],
Aplysia depilans [5], A. californica [5] và A. kurodai [41]. Nhiều loài ốc biển có
kích thƣớc khá nhỏ nhƣ loài Littorina sp. [7], Omphalius rusticus [14] và Littorina
brevicula [14] cũng đƣợc nghiên cứu là có chứa alginate lyase. Ngoài ra ở lớp hai
mảnh vỏ, hoạt tính enzyme alginate lyase còn đƣợc phát hiện có trong sợi thủy tinh
thể của các loài Choromytilus meridionalis, Perna perna, và Spisula solidissima
[46].
 Alginate lyase từ vi sinh vật
Vi khuẩn biển, vi khuẩn đất và nấm cũng đƣợc công bố có chứa alginate

lyase nhƣ là Agarivorans sp. [22], Pseudomonas fluorescens [26], Streptomyces sp.
[19], Vibrio sp.[25], Alginovibrio aquatilis, Alteromonas sp., Azotobacter
vinelandii, Bacillus circulans, Dendryphiella salina, Enterobacter cloacae,
Flavobacterium

multivorum,

Klebsiella aerogenes,

Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa và Ochrobactrum sp. [61], ….
Hầu hết những vi sinh vật này đều có khả năng sử dụng các monomer đơn vị
mannuronate và guluronate từ quá trình phân giải alginate nhƣ là nguồn cacbon và
nguồn năng lƣợng. Vi sinh vật biển và vi sinh vật đất có chứa nhiều hơn một loại
alginate lyase cho việc phân giải các alginate có cấu trúc phức tạp. Đặc biệt ở một
vài loài Pseudomonas và Azotobacter vừa có thể sinh enzyme alginate lyase, vừa có
thể tổng hợp đƣợc alginate [55].
Việc xác định sự phân bố của alginate lyase trong sinh giới vẫn đang tiếp
diễn. Đến nay đã có hơn 50 enzyme alginate lyase đặc hiệu với các cơ chất đa dạng
đã đƣợc tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau.
5


1.1.3

Cấu trúc của alginate lyase

 Cấu trúc bậc nhất
Khi nghiên cứu trình tự amino acid trong phân tử enzyme các nhà khoa học

nhận thấy : thứ tự các amino acid trong chuỗi có vai trò quan trọng vì là cơ sở cho
việc hình thành cấu trúc không gian của enzyme và từ đó qui định đặc tính của
enzyme. Cấu trúc bậc nhất là bản phiên dịch mã di truyền. Vì vậy, cấu trúc này nói
lên quan hệ họ hàng và lịch sử tiến hóa của thế giới sống.
Đối với enzyme AlgL từ chủng Pseudomonas aeruginosa khi tiến hành so
sánh sự tƣơng đồng bắt cặp trình tự bậc nhất cho thấy mức độ tƣơng đồng và mức
độ quan hệ họ hàng so với các enzyme alginate lyase khác là 65% và 78% đối với
enzyme từ chủng Halomonas marina, 65% và 78% đối với enzyme từ chủng
Azotobacter vinelandii, 65% và 77% cho enzyme từ chủng P. syringae. Sự giống
nhau rõ rệt về trình tự giữa enzyme từ dòng Pseudomonas và Azotobacter có lẽ liên
quan đến mối quan hệ tiến hóa, một giả thuyết đã đƣợc đƣa ra bởi sự giống nhau về
tổ chức của các gen này với các operon sinh tổng hợp alginate tƣơng ứng của chúng
[55].
Mặc dù có một vài đoạn amino acid tƣơng đồng tồn tại giữa các enzyme,
nhƣng có các vùng trung tâm đƣợc bảo thủ toàn bộ. Đặc biệt đáng chú ý là trình tự
gồm 6 amino acid “NNHSYW” đƣợc bảo thủ ở trung tâm của chuỗi protein ở các
alginate lyase từ 6 chủng vi khuẩn (Bảng 1.1) [55].
Bảng 1.1. Trình tự amino acid bảo thủ của một số chủng vi khuẩn
Loài
A.chroococcum
A.vinelandii
P.aeruginosa
P.syringae
H.marina
Sphingomonas sp.

Alginate lyase
AcAlgL
AvAlgL
PaAlgL

PsAlgL
HmAL
ALY1-III
Vùng bảo thủ

Trình tự bảo thủ
- I N N H S Y W A 202-196I N N H S Y W A 203-199I N N H S Y W A 206-201I N N H S Y W A 208-201T N N H S Y W A 208-189C N N H S Y W R 196-N N H S Y W195

Chiều dài chuỗi protein
372 aa
374 aa
367 aa
379 aa
375 aa
364 aa

Một vùng khác gồm 9 amino acid “WLEPYCALY” ở đầu C đƣợc bảo thủ tốt
ở các alginate lyase từ chủng P. aeruginosa và Azotobacter sp. Block gồm 9 amino
6


acid này đƣợc bán bảo thủ ở alginate lyase từ chủng H.marina và chủng P. syringae
và bảo thủ kém ở ALY1-III từ chủng Sphingomonas sp. ( Bảng 1.2) [55].
Bảng 1.2. Trình tự 9 amino acid bảo thủ đầu tận cùng C của nhóm alginate lyase có
khối lƣợng phân tử 40 kDa
Loài
P.aeruginosa
A.chroococcum
A.vinelandii
P.syringae

H.marina
Sphingomonas sp.

Enzyme
PaAlgL
AcAlgL
AvAlgL
PsAlgL
HmAL
Vùng bảo thủ
ALY1-III

Trình tự đầu C
-324W L E P Y C A L Y332-320W L E P Y C A L Y328-322W L E P Y C A L Y330-326W L E P Y C S L Y334-326W L E P F C T L Y334-W L E P Y C A L Y317
- W I E I Q R A R F325-

Cơ chất đặc hiệu
M
M
M
M
M
M

Ngoài ra, một block gồm 9 amino acid “YFKAGVYNQ” đƣợc bảo thủ ở
đầu C của enzyme poly(G) lyase, AlyA từ chủng Klebsiella pneumonia và enzyme
poly(M) lyase, AlxM từ vi khuẩn biển ATCC 433367. Trình tự này cũng đƣợc bảo
thủ ở enzyme poly(G) lyase, ALY-1 của chủng Corynebacterium sp., enzyme
poly(M) lyase và poly(G) lyase ở chủng Alteromonas sp. dòng H-4 và 2 enzyme từ
chủng Vibrio halioticoli. Sự khác nhau về cơ chất đặc hiệu ở các enzyme này cho

thấy vùng bảo thủ ở đầu C này không liên quan đến sự liên kết O-glycoside với cơ
chất M hay G mà đây chính là thành phần cần thiết để duy trì hình thể cấu trúc ba
chiều ổn định cho enzyme (Bảng 1.3) [55].
Bảng 1.3. Trình tự 9 amino acid bảo thủ đầu tận cùng C của nhóm alginate lyase có
khối lƣợng phân tử 30 kDa
Loài
K.pneumonia
ATCC 433367
Corynebacterium sp.
Alteromonas sp. H-4
V.halioticoli
V.halioticoli

Enzyme
AlyA
AlxM
ALY-1
Aly
AlyVGI
AlyVGII
Vùng bảo thủ

Trình tự đầu C
-274Y F K A G V Y N Q282-257Y F K A G V Y N Q265-221Y F K A G A Y T Q229-365Y F K F G N Y L Q282-214Y F K A G N Y N Q222-307Y F K A G I Y P Q315-Y F K A G V Y N Q-

Cơ chất đặc hiệu
G
M
G
G,M

M
M

Sự khác nhau về các đoạn ở đầu C của các enzyme này („WLEPYCALY‟ và
„YFKAGVYNQ‟) cũng có thể chỉ ra sự khác nhau ở vị trí cuộn khúc trong cấu trúc.
7


 Cấu trúc không gian
Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong
không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ
chất. Chính sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme dẫn tới sự khác
nhau về hoạt tính và tính chất lý hóa của chúng.
Cấu trúc không gian của alginate lyse ALY1-III (thuộc họ PL-5) và A1-II‟
(thuộc họ PL-7) từ chủng Sphingomonas sp. A1, enzyme ALY-1 (thuộc họ PL-7) từ
chủng Corynebacterium sp. và alginate lyase Atu3025 (thuộc họ PL-15) từ chủng
C58 Agrobacterium tumefacients đã đƣợc giải mã bằng phép phân tích tinh thể học
tia X. Alginate lyase ALY1-III từ Sphingomonas sp. chứa 351 amino acid đƣợc biết
có hoạt tính đặc hiệu với poly(M). Cấu trúc ba chiều của alginate lyase ALY1-III
gồm hầu hết cấu trúc xoắn α và một rãnh sâu trong cấu trúc (α/α)6 barrel (Hình 1.2)
[59]. Cấu trúc (α/α)6 barrel cũng đƣợc phát hiện ở enzyme glucoamylase và
cellulase.

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc không gian (A) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của
ALY1-III từ Sphingomonas sp. thuộc họ PL-5
So với alginate lyase ALY1-III, cấu trúc của các enzyme thuộc họ PL-7
(ALY-1 từ Corynebacterium sp. và A1-II‟ từ Sphingomonas sp. A1) có nhiều sợi β
và có một rãnh sâu trong cấu trúc gấp nếp β–sandwich (Hình 1.3) [39]. Cấu trúc gấp
nếp này tƣơng tự với cấu trúc gấp nếp β–jellyroll ở enzyme β–glucanase.

8


Hình 1.2. Mô hình cấu trúc không gian (C) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (D) của A1-II‟
từ Sphingomonas sp. A1 thuộc họ PL-7
Enzyme A1-II‟ từ Sphingomonas sp. A1 đƣợc xác định đặc tính sâu hơn
bằng kỹ thuật đột biến. Cấu trúc của A1-II‟ có nhiều nếp gấp β-sanwich nhƣ
enzyme ALY-1 [57].
Gần đây, cấu trúc của enzyme exo alginate lyase Atu3025 từ Agrobacterium
tumefaciens thuộc họ PL-15 đã đƣợc xác định. Atu3025 gồm có một cấu trúc (α/α)6
barrel ở trung tâm và phiến β đối song nhƣ một giàn giáo (Hình 1.4) [38].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A) ; Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của
Atu3025 từ Agrobacterium tumefaciens thuộc họ PL-15
 Cấu trúc trung tâm xúc tác
Các kết quả có đƣợc từ nghiên cứu biến đổi hóa học, so sánh trình tự protein,
gây đột biến định hƣớng điểm và dữ liệu cấu trúc tinh thể đã chỉ ra rằng,
tryptophan, lysine, histidine và cysteine đóng vai trò thiết yếu trong cơ chế xúc tác
9


của các enzyme alginate lyase. Trong đó tryptophan có thể đóng vai trò liên kết với
carbohydrate, gốc lysine và histidine có thể liên quan trực tiếp hơn trong cơ chế xúc
tác. Bởi tính chất tích điện nên lysine và histidine có thể là các gốc liên kết trực tiếp
với alginate bằng cách hình thành cầu muối với nhóm carboxyl ở cacbon thứ 5 hoặc
có thể là các proton xúc tác cơ chế cho-nhận [55].
Khi nghiên cứu về cấu trúc không gian của enzyme ALY1-III, tác giả Yoon
và các cs phát hiện thấy với bất kỳ sự biến đổi hóa học nào của amino acid His192
thuộc vùng bảo thủ „NNHSYW‟ nằm ở trung tâm rảnh hoạt động đều làm cho
enzyme ALY1-III mất hoạt tính. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của gốc

histidine cho hoạt tính xúc tác của ALY1-III. Gốc histidine có thể là chất tách
proton làm biến đổi vòng uronate thành uranosyl, kết quả tạo ra liên kết không bão
hòa tại vị trí cacbon thứ 4 và cacbon thứ 5. Trong trung tâm xúc tác của ALY1-III, 4
gốc tryptophan cùng với các gốc thơm nằm dọc theo vị trí khe xúc tác và 2 gốc
arginine nằm ở phía ngoài khe. Các nhóm lysine và arginine mang điện tích và các
chuỗi thơm trong trung tâm xúc tác đƣợc xem là các phân tử liên kết với cơ chất
[59].
Hai enzyme SP1 và SP2 từ ốc Turbo cornutus cũng đã đƣợc nghiên cứu về
cấu trúc. Cysteine, lysine và tryptophan là các gốc amino acid quan trọng tác động
đến hoạt tính xúc tác của enzyme [32].
Theo tác giả Takeshita, các gốc tryptophan, histidine, arginine, lysine và
methionine có vai trò trong việc xúc tác cơ chất và duy trì hình thể hoạt động của
enzyme poly(G) lyase từ vi khuẩn biển [50].
Việc so sánh đa trình tự cho thấy mối tƣơng quan giữa các họ PL-5 và PL-7
tƣơng đối thấp. Tuy nhiên, các amino acid quan trọng có vai trò xúc tác nhƣ
arginine, asparagin đối với PL-5, glutamine đối với PL-7, histidine và tyrosine có
mặt đáng kể trong trung tâm xúc tác [20].
1.1.4

Cơ chế xúc tác của alginate lyase

Alginate lyase xúc tác quá trình phân cắt alginate bằng cơ chế khử β, cắt liên
kết 1,4-O-glycoside giữa các monomer trong phân tử alginate. Một liên kết đôi
10


đƣợc hình thành giữa cacbon thứ 4 và cacbon thứ 5 của vòng sáu cạnh từ vị trí liên
kết 4-O-glycoside bị khử, đồng thời tạo ra sản phẩm chứa 4-deoxy-L-erythro-hex-4enopyranosyluronic acid tại đầu cuối không khử [55].
Alginate là một copolymer mạch thẳng đƣợc cấu tạo từ hai gốc uronat là
β-D-mannuronate (M) và α-L-guluronate (G) liên kết với nhau bằng liên kết

1,4-O-glycoside thành các chuỗi khác nhau. Hai gốc uronat phân bố trong mạch
alginate theo các block [11]. Có 3 loại block là:
Block homopolygluronat G-G-G-G. [poly(G)]
Block homopolymannuromat M-M-M-M. [poly(M)]
Block heteropolyme G/M thành một chuỗi sắp xếp ngẫu nhiên G và M, hoặc
là chuỗi luân phiên MG(GM) hoặc là các block ngắn poly(M) và poly(G) thay đổi
với các đơn vị M và G riêng biệt đặt rải rác.

Hình 1.4. Cấu trúc của alginate. a) Các monomer đơn vị
b) Cấu tạo chuỗi
c) Sự sắp xếp các block
Enzyme alginate lyase đƣợc phân loại dựa vào việc phân cắt đặc hiệu với cơ
chất alginate giàu M hay giàu G, nhƣ EC 4.2.2.3, poly(M) lyase [(1,4)-β-Dmannuronate lyase] hoặc là EC 4.2.2.11, poly(G) lyase [(1,4)- α-L-guluronate lyase]
[55]. Tính đặc hiệu cơ chất có thể phụ thuộc vào môi trƣờng mà sinh vật sinh
11


enzyme đƣợc tìm thấy, và nó phù hợp với loại alginate có sẵn trong môi trƣờng.
Phần lớn các alginate lyase đƣợc nghiên cứu cho đến nay đều liên quan đến cơ chất
poly(M), mặc dù có một ít enzyme đặc hiệu với cơ chất G đã đƣợc xác định và mô
tả đặc tính. Đa số enzyme đã đƣợc nghiên cứu có hoạt tính phân cắt endo, tuy nhiên,
có một vài enzyme có hoạt tính exo loại các monomer hoặc các dimer từ hai đầu
polymer.
Gacesa [10], [11] đã đề xuất cơ chế xúc tác của enzyme alginate lyase, đó là
một quá trình phân cắt alginate gồm 3 bƣớc. Ba bƣớc bao gồm:
A/ loại điện tích âm trên anion carboxyl – trung hòa điện tích bằng một cầu muối
(lysine có thể là nhân tố khử),
B/ xúc tác tách proton ở cacbon thứ 5 ( aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine
và cystein đóng vai trò này), ở cacbon thứ 5 một chất khử đóng vai trò là nhận
proton và một chất khác đóng vai trò là cho proton, mặc dù proton có thể có nguồn

gốc từ dung dịch môi trƣờng,
C/ dịch chuyển electron từ nhóm carboxyl để hình thành liên kết đôi giữa cacbon
thứ 4 và cacbon thứ 5

Hình 1.5. Sự phân cắt alginate bởi (A) endo alginate lyase (B) exo alginate lyase

12


1.1.5

Các đặc tính căn bản của alginate lyase

 Khối lượng phân tử
Alginate lyase từ các nguồn khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc
khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối lƣợng phân tử,
thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Dựa trên
thông tin về chuỗi, hầu hết khối lƣợng phân tử (MW) của các alginate lyase đƣợc
chia làm 3 nhóm: 20-35 kDa, ~40 kDa, và ~60 kDa [55].
Alginate lyase nguồn gốc từ các loài động vật thân mềm biển có MW chủ
yếu ở nhóm 20-35 kDa. MW của các alginate lyase từ loài bào ngƣ là 28 kDa và 32
kDa ở Haliotis discus hannai [14], [49], là 34 kDa ở H. iris [14] và H. tuberculata
[5]. Rahman và cs (2010) đã tinh chế và xác định hai loại alginate lyase isozymes,
AkAly28 và AkAly33 từ loài thỏ biển Aplysia kurodai có MW là 28 kDa và 33 kDa
[41].
Một số alginate lyase từ các loài ốc biển nhỏ cũng đã đƣợc xác định khối
lƣợng phân tử. Alginate lyase từ loài Omphalius rusticus có MW là 34 kDa [14]. Ba
enzyme alginate lyase ở loài Littorina brevicula có MW là 35, 32 và 28 kDa [14].
MW của alginate lyase từ vi sinh vật thƣờng dao động ở cả 3 nhóm. Alginate
lyase có MW bé nhất là alginate lyase ngoại bào từ chủng A. chroococcum khoảng

23 kDa [13]. Nhiều công trình đã công bố về các alginate lyase nguồn gốc vi sinh
vật có khối lƣợng phân tử khá khác nhau. Một số loài có khả năng sinh tổng hợp
alginate lyase có MW khá lớn nhƣ chủng Vibrio sp. YKW-34 là 60 kDa [9], từ
Vibrio sp. YWA là 62,5 kDa [53], từ Vibrio harveyi AL-128 là 57 kDa [21],
Pseudomonas fluorescens là 60,25 kDa [26]. Trong khi đó, alginate lyase từ V.
alginolyticus ATCC 17749 có MW là 47 kDa [21], từ Streptomyces sp. [45] và
Alteromonas sp. H-4 [45] có MW là 32 kDa, từ Agarivorans sp. là 31 kDa [22].
Từ các dẫn liệu về khối lƣợng phân tử của alginate lyase, cho đến nay chƣa
có kết luận nào về mối quan hệ giữa khối lƣợng phân tử và hoạt tính của enzyme.

13


 Điểm đẳng điện
Điểm đẳng điện của hầu hết các enzyme từ vi khuẩn rất thấp khoảng từ 4.3
đến 6.7. Điểm đẳng điện của enzyme từ V. harveyi AL-128 là 4.3 còn từ
V. alginolyticus ATCC 17749 là 4.6 [21]. Điểm đẳng điện của ba loại enzyme
alginate lyase từ Pseudomonas fluorescens có giá trị không khác nhau nhiều,
tƣơng ứng là 4; 4.36 và 4.59 [26]. Tuy nhiên enzyme từ Halomonas marina
(Deleya marina) có giá trị khá cao là pI = 7.8 [23].
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở một nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ tối
ƣu của nhiều enzyme từ động vật thân mềm biển vào khoảng 30-50oC. Theo các
nghiên cứu trƣớc đây, nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của alginate lyase từ ốc bào
ngƣ H.iris là ở 35oC [14]; của enzyme alginate lyase từ loài thỏ biển A. kurodai
ở 40oC [24], trong khi đó alginate lyase từ loài H. discus hannai và O. rusticus
là 45oC [14], còn hoạt tính xúc tác của alginate lyase từ loài L. brevicula đạt tối đa
ở 50oC [14].
Phần lớn enzyme alginate lyase từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ƣu khoảng từ
250C-500C. Enzyme ngoại bào poly(1,4-β-D-mannuronate) lyase từ chủng

Vibrio sp. YWA nhiệt độ tối ƣu 250C [53], enzyme A1m từ Agarivorans sp. có
nhiệt độ tối ƣu là 300C [22].
 Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH tối ƣu của enzyme alginate lyase từ 5.6 đến 9.6 đối với các
alginate từ động vật thân mềm biển, enzyme ở vi sinh vật là 7.5 đến 8.5. Enzyme từ
3 loài H. iris, H. discus hannai và O. rusticus hoạt động mạnh ở pH khoảng 8.0-8.5
[14], trong khi đó 2 isozyme AkAly28 và AkAly33 từ A. kurodai là 6.7 [24].
Tuy nhiên, enzyme alginate lyase từ gan tụy bào ngƣ do hai tác giả Nakada và
Sweeny nghiên cứu thì có pH tối ƣu là 4.0 và cho hoạt tính exo đặc hiệu với cơ chất
poly(G) [34].

14


Enzyme poly(G) lyase từ V. harveyi AL-128 có độ bền trong khoảng pH từ
6.0 đến 11 và có hoạt tính mạnh nhất tại pH 7.8 [21], còn enzyme poly(M) lyase từ
V. alginolyticus ATCC 17749 có pH tối ƣu là 8.2 [21]. Ba enzyme khác nhau từ vi
khuẩn biển Pseudomonas fluorescens HZJ216 đều có pH= 7.0 [26]. Trong khi đó
pH tối ƣu của enzyme A1m từ Agarivorans sp. là 10 [22].
 Ảnh hưởng của ion kim loại
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các
enzyme. Các cation đƣợc xem nhƣ là tác nhân làm giảm mật độ điện tích bề mặt của
cơ chất, làm yếu đi liên kết ion giữa phân tử alginate với enzyme. Canxi đƣợc nhận
thấy là cũng có ảnh hƣởng đến việc làm tăng hoạt tính của enzyme từ rong
Pelvetia canaliculata [31] và rong Undaria pinnatifida [54].
Ngoài ra, các cation hóa trị hai cũng cần thiết cho hoạt tính tối ƣu của
enzyme. Hoạt tính enzyme ngoại bào từ Vibrio sp. YWA tăng hoạt tính khi có mặt
EDTA và Zn2+ nhƣng lại bị ức chế bởi Ba2+ [53]. Các ion Ca2+ và Mg2+ làm tăng
hoạt tính alginate lyase từ V. harveyi AL-128, trong khi đó Ag2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+,
Hg2+, Fe3+ và EDTA làm giảm hoạt tính enzyme (hoạt tính còn 20-70%). Đối với

poly(M) lyase từ V. alginolyticus ATCC 17749, ion Ca2+ ở nồng độ 5-10 mM là
nhân tố kích thích mạnh nhất làm hoạt tính enzyme tăng 33 lần so với đối chứng.
Zn2+ và EDTA làm enzyme hoàn toàn bị mất hoạt tính tại nồng độ 1 mM, trong khi
Ag2+, Cu2+, Fe3+ làm enzyme giảm hoạt tính từ 30-80% so với đối chứng [21].
 Ảnh hưởng của NaCl
Đối với một vài loài vi khuẩn biển, nồng độ NaCl cao có ảnh hƣởng đến hoạt
động xúc tác, hoặc là cần thiết hoặc là làm tăng hoạt tính của enzyme. Hoạt tính
enzyme từ V. harveyi AL-128 cho hoạt tính cao nhất tại nồng độ NaCl 0.3-1.0 M
trong khi đó enzyme từ V. alginolyticus ko chịu ảnh hƣởng của NaCl [21]. Enzyme
A1m từ Agarivorans sp. đạt hoạt tính mạnh nhất với NaCl 0.6-0.8 M tại pH 9.0.
Mặc dù ảnh hƣởng của NaCl đến hoạt tính của enzyme A1m tại pH 10 thấp hơn so

15