nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase, cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






LÊ HỒNG PHÚ







NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME
PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN







LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP.HCM - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





LÊ HỒNG PHÚ




NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME
PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN



Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 1.05.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG



TP. HCM – 2012
LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn đến thầy:

PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG
Ngƣời đã khơi gợi cho tôi những ý tƣởng về đề tài và cũng là ngƣời hƣớng dẫn cho
tôi thực hiện đề tài.

Trân trọng cảm ơn cô
PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG
là những giảng viên để tôi suốt đời học hỏi và đã hỗ trợ tôi rất nhiều về mặt tinh
thần và học thuật.

Trân trọng cảm ơn TS. LÊ PHI NGA đã giúp đỡ và tạo điều kiện hết sức cho tôi

hoàn thành đề tài.

Tri ân ba suốt đời tận tụy vì sự tiến bộ của con, vô cùng cảm ơn mẹ với trái tim
nhân hậu là nguồn động viên lớn lao trong con.

Cảm ơn NGUYỄN THỊ KIM CHÂU, ngƣời luôn hết lòng ủng hộ và giúp đỡ lớn lao
để tôi hoàn thành tốt luận án.

Cảm ơn tất cả những thành viên trong nhóm dự án nghiên cứu sản xuất cà phê chất
lƣợng cao nhằm mục đích xuất khẩu

1. Nguyễn Thảo Nguyên
2. Đỗ Đại Nghĩa
3. Nguyễn Thị Minh Trinh
4. Nguyễn Hữu Thái
5. Ngô Tiến Hiễn Vinh
6. Lê Thị Lệ
7. Phạm Mỹ Vẹn
8. Nguyễn Thị Kim Châu
9. Nguyễn Thị Ngà
10. Cao Hoàng Tấn
11. Nguyễn Văn Hân
12. Nguyễn Thị Bảo Anh
13. Nguyễn Thị Cẩm Vân
14. Võ Ngọc Thanh

Đã nỗ lực cùng tôi vƣợt qua nhiều khó khăn và hỗ trợ tôi hoàn tất những nội dung
nghiên cứu của luận án.

Và cuối cùng cho tôi đƣợc cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và đồng nghiệp tại Khoa

CNSH ĐH Quốc Tế nơi tôi đang công tác đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn
thành luận án.
Tác giả luận án
Lê Hồng Phú
I










LỜI CAM ĐOAN




Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
và kết quả trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả Luận án

II

MỤC LỤC
Lời cam đoan I
Mục lục II
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI
Danh mục các bảng VII
Danh mục các hình IX
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN 7
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ 7
1.1.1 Sơ lƣợc lịch sử phát triển cây cà phê ở Việt Nam 7
1.1.2 Giá trị kinh tế của cà phê 7
1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê 8
1.1.4 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê ở Việt Nam 8
1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu trong chế biến cà phê 8
1.2. TRÁI CÀ PHÊ 10
1.2.1 Cấu tạo trái cà phê 10
1.2. 2 Thành phần hóa học 11
1.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả 11
1.2.2.2 Thành phần hóa học của lớp nhớt 12
1.3 NHÂN CÀ PHÊ 12
1.3.1 Thành phần hóa học của nhân cà phê 12
1.3.1.1 Carbohydrates 13

1.3.1.2 Hợp chất chứa nitơ 14
1.3.1.3 Acid chlorogenic 17
1.3.1.4 Hương thơm cà phê 18
1.3.1.5 Acid carboxylic 19
1.3.1.6 Các chất khoáng 20
1.3.2. Tính chất vật lý 20
1.4 PECTIN 21
1.4.1 Cấu tạo pectin 21
1.4.2 Tính chất của pectin 22
1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc 22
1.4.2.2 Tính tạo gel của pectin 22
1.4.2.3 Tính nhớt của dung dịch pectin 22
1.4.2.4 Pectin ở trái cà phê 23
1.4.3 Ứng dụng 23
1.5 CELLULOSE 23
1.5.1 Cấu tạo 23
1.5.2 Tính chất 24
1.5.3 Ứng dụng 25
1.5.4 Cellulose ở trái cà phê 25
1.6 GIỚI THIỆU CHUNG ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE 25
III

1.6.1 Pectinase 26
1.6.1.1 Phân loại và cơ chế tác động 26
1.6.1.2 Ứng dụng 27
1.6.1.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase 27
1.6.2 Cellulase 27
1.6.2.1 Phân loại và cơ chế tác dụng 27
1.6.2.2 Ứng dụng 29
1.6.2.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase 30

1.7 GIỚI THIỆU VI SINH VẬT SINH PECTINASE VÀ CELLULASE ĐƢỢC NGHIÊN
CỨU TRONG LUẬN ÁN VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VSV 30
1.7.1 Tổng quan chung về vi sinh vật 30
1.7.2 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 31
1.8 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC TÁCH VỎ VÀ LÊN MEN CÀ PHÊ 32
1.8.1 Giới thiệu về tách vỏ cà phê 32
1.8.1.1 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trên thế giới 32
1.8.1.2 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trong nước 32
1.8.2 Giới thiệu về lên men cà phê 33
1.8.2.1 Sơ lược lên men cà phê trên thế giới 34
1.8.2.2 Sơ lược lên men cà phê trong nước 38
1.8.3 Tăng năng suất tách vỏ và lớp nhớt của cà phê tƣơi 39
1.8.4 Nâng cao hiệu suất trích ly cà phê bột 39
1.8.5 Cải thiện chất lƣợng cảm quan cà phê 39
CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1. VẬT LIỆU 41
2.1.1 Nhân cà phê 41
2.1.1.1 Giống 41
2.1.1.2 Nguồn gốc 41
2.1.2 Nguồn vi sinh vật nghiên cứu 41
2.1.2.1. Nấm sợi 41
2.1.2.2. Nấm men 41
2.1.2.3. Vi khuẩn 41
2.1.3 Môi trƣờng sử dụng 41
2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 41
2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 41
2.1.3.2 Môi trường nhân giống 42
2.1.3.3 Môi trường giữ giống 42
2.1.4 Hóa chất 42
2.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường 42

2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính enzyme 42
2.1.4.3 Hóa chất sử dụng cho các phương pháp xác định thành phần 43
2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 43
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44
2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh vật 44
IV

2.2.1.1 Phương pháp phân lập giống vi sinh vật từ nhân cà phê 44
2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) 44
2.2.1.3 Phương pháp nhân giống 44
2.2.1.4 Phương pháp lên men 44
2.2.1.5 Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật trong chế phẩm 45
2.2.2 Phƣơng pháp hóa lý 45
2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 45
2.2.2.2 Phương pháp trích chất hòa tan 46
2.2.2.3 Phương pháp nghiền 46
2.2.2.4 Phương pháp rây 46
2.2.2.5 Phương pháp ngâm 46
2.2.3 Phƣơng pháp hóa sinh 47
2.2.3.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, pectinase 47
2.2.3.2 Các phương pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê 52
2.2.4 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 60
2.2.4.1 Phương pháp định danh nấm sợi 60
2.2.4.2 Phương pháp định danh vi khuẩn và nấm men 61
2.2.5 Cách bố trí thí nghiệm 62
Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt
và thành phần hóa học chủ yếu trong nhân cà phê 65
Thí nghiệm 2: Phân lập và định danh các chủng vi sinh vật từ vỏ,
nhân cà phê 65
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính

pectinase và cellulase 66
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê 71
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm trong lên men nhằm nâng
cao hiệu suất trích chất hòa tan và chất lượng cà phê 73
Thí nghiệm 6: Lên men cà phê theo cách kết hợp chế phẩm 75
Thí nghiệm 7: Kiểm tra độc tố aflatoxin, hàm lượng caffeine phẩm 75
Thí nghiệm 8: Đánh giá cảm quan 76
Thí nghiệm 9: Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ
nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 76
2.2.6 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan 76
2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 79
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 80
3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CÓ TRONG CÀ PHÊ 80
3.1.1 Thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt 80
3.1.2 Thành phần hóa học chủ yếu có trong nhân cà phê 80
3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT 82
3.2.1 Phân lập và định danh các chủng nấm sợi trên vỏ, nhân cà phê 82
3.2.2 Phân lập và định danh các chủng nấm men và vi khuẩn trên vỏ,
nhân cà phê 86
3.3 NGHIÊN CỨU TẠO CÁC CHẾ PHẨM VSV 89
V

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 89
3.3.1.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 89
3.3.1.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 94
3.3.1.3 Xác định thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase
của các chủng nấm sợi 96
3.3.1.4 Xác định nồng độ đường (
o
Brix ) của dung dịch malt đến

sự sinh tổng hợp enzyme pectinase 101
3.3.1.5 Xác định pH ban đầu dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase 103
43.3.1.6 Ảnh hưởng của lượng muối (NH
4
)
2
SO
4
bổ sung đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme pectinase 105
3.3.1.7 Xác định nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase 107
3.3.1.8 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 109
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 110
3.3.2.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 110
3.3.2.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 114
3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi đến quá trình sinh tổng hợp
cellulase của các chủng vi sinh vật 116
3.3.2.4 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 120
3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƢỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 121
3.4.1 Số lƣợng tế bào vsv thay đổi theo thời gian bảo quản 122
3.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase thay đổi theo thời gian bảo quản 123
3.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase thay đổi theo thời gian bảo quản 124
3.4.4 Tổng kết khảo sát chất lƣợng chế phẩm theo thời gian bảo quản
và sơ bộ hạch toán kinh tế 125
3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ 125
3.5.1 Khảo sát ảnh hƣởng lƣợng chế phẩm vsv đến khả năng tách vỏ
cà phê tƣơi 126
3.5.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian xử lý đến khả năng tách vỏ cà phê tƣơi 128

3.5.3 Tổng kết nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê và công nghệ tách vỏ cà phê 129
3.6 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN. 129
3.6.1 Ảnh hƣởng của thời gian ngâm và độ ẩm cà phê. 130
3.6.2 Ảnh hƣởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong nhân cà phê 130
3.6.2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea arabica 131
3.6.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea robusta 131
3.6.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea chari 132
3.6.3 Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan
trong nhân cà phê 133
VI

3.6.3.1 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea arabica 133
3.6.3.2 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea robusta 135
3.6.3.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea chari 137
3.6.4 Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong nhân cà phê 139
3.6.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea C. arabica của các CPVSV từ nấm sợi 139
3.6.4.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea C. C. robusta của các CPVSV từ nấm sợi 141
3.6.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea chari của các CPVSV từ nấm sợi 143
3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men nhân cà phê và quy trình lên men 145

3.6.6 Nghiên cứu đánh giá cảm quan cà phê 145
3.6.6.1 Đánh giá cảm quan cà phê C. arabica 146
3.6.6.2 Đánh giá cảm quan cà phê C. robusta 147
3.6.6.3 Đánh giá cảm quan cà phê C. chari 147
3.6.7 Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men
và vi khuẩn 148
3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan bởi lên men kết hợp 149
3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng bởi lên men kết hợp 151
3.6.8 Quy trình tách vỏ và lên men cà phê bởi chế phẩm 153
3.6.8.1 Quy trình tách vỏ bởi chế phẩm vsv 153
3.6.8.2 Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv 154
CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 157
DANH MỤC CÔNG TRÌNH 159
TÀI LIỆU THAM KHẢO 161
PHỤ LỤC 170










VII

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ tắt

Chữ nguyên
Ý nghĩa
C. arabica
Coffea arabica
Cà phê chè
C. chari
Coffea chari
Cà phê mít
C. robusta
Coffea robusta
Cà phê vối
CMC
Carboxymethyl-
cellulose
Một dẫn xuất cellulose
CPVSV
Chế phẩm vi sinh vật
Chế phẩm vi sinh vật
CQA
Caffeoxyl quinic acid
Hợp chất thơm trong cà
phê
CT
Canh trƣờng
Canh trƣờng
DNS
3,5 - dinitrosalicylic acid
Một chất thử cho xác định
đƣờng khử
ĐC

Đối chứng
Đối chứng
MT
Môi trƣờng
Môi trƣờng
NL
Nguyên liệu
Nguyên liệu
PGA
Potato glucose agar
Môi trƣờng giữ giống gồm
khoai tây, glucose và thạch
PTN
Phòng thí nghiệm
Phòng thí nghiệm
TCVN
Tiêu chuẩn Việt Nam
Tiêu chuẩn Việt Nam
TN
Thí nghiệm
Thí nghiệm
vsv
Vi sinh vật
Vi sinh vật

VIII

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tỷ lệ các phần cấu tạo quả cà phê 11
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của vỏ quả 11
Bảng 1.3: Thành phần của lớp nhớt 12
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của nhân cà phê 13
Bảng 1.5: Thành phần caffeine khan 15
Bảng 1.6: Hàm lƣợng amino acid tự do trong nhân cà phê 17
Bảng 1.7: Thành phần hƣơng vị cà phê rang 19
Bảng 2.1: Các bƣớc tiến hành đo độ hấp phụ của phản ứng
enzyme và phản ứng thử không 49
Bảng 2.2: Dựng đƣờng chuẩn glucose 50
Bảng 2.3: Bảng thực hiện phản ứng màu với antron 55
Bảng 2.4: Bảng điểm đánh giá chất lƣợng dịch cà phê 78
Bảng 2.5: Kết quả đánh giá chất lƣợng dịch cà phê thu đƣợc dựa theo bảng
tổng số điểm 78
Bảng 2.6: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu 79
Bảng 2.7: Kết quả đánh giá chất lƣợng dịch cà phê thu đƣợc
dựa theo bảng tổng số điểm 80

Bảng 3.1: Thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt cà phê 80
Bảng 3.2: Các thành phần hóa học chủ yếu trong nhân cà phê 81
Bảng 3.3: Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp pectinase
của các chủng nấm sợi phân lập 82
Bảng 3.4: Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp cellulase
của các chủng nấm sợi phân lập 83
Bảng 3.5: Kết quả định danh các chủng phân lập đƣợc trên cà phê 85
Bảng 3.6: Kết quả xác định hình thái khuẩn lạc các chủng nấm sợi tuyển chọn nghiên cứu 86
Bảng 3.7: Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp pectinase và cellulase (đƣờng kính
vòng phân giải) của các chủng vi khuẩn và nấm men phân lập 87
Bảng 3.8: Kết quả định danh các chủng nấm men và vi khuẩn có hoạt tính cellulase
và pectinase phân lập đƣợc từ cà phê 88
Bảng 3.9: Quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 109
Bảng 3.10: Quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 120
Bảng 3.11: Tên chủng vi sinh vật và tên chế phẩm tạo ra tƣơng ứng 121
Bảng 3.12: Khảo sát chất lƣợng chế phẩm theo thời gian bảo quản 122
Bảng 3.13: Sơ bộ chi phí trên một mẻ tạo chế phẩm 125
Bảng 3.14: Tỷ lệ tách vỏ cà phê 129
Bảng 3.15: Quy trình lên men cho 3 loại cà phê phổ biến ở Việt Nam 145
Bảng 3.16: Kết quả cảm quan trên đối tƣợng cà phê Arabica 146
Bảng 3.17: Kết quả cảm quan trên đối tƣợng cà phê Robusta 147
Bảng 3.18: Kết quả cảm quan trên đối tƣợng cà phê Chari 148


IX

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cà phê vừa thu hoạch 10
Hình 1.2: Cấu tạo bên trong quả cà phê 10

Hình 1.3: Cấu trúc caffeine 12
Hình 1.4: Cấu trúc của trigonelline 16
Hình 1.5: Cấu tạo một đoạn của chuỗi pectin 21
Hình 1.6: Cấu tạo cellulose 24
Hình 1.7: Chế biến theo phƣơng pháp ƣớt 35
Hình 1.8: Máy xát cà phê tƣơi 36
Hình 1.9: Các loại độc tố aflatoxin 40
Hình 3.1: Sự thủy giải CMC 85
Sơ đồ 2.1: Quy trình trích chất hòa tan 46
Sơ đồ 2.2: Các bƣớc xây dựng đƣờng chuẩn 49
Sơ đồ 2.3: Các bƣớc xác định hoạt tính pectinase 51
Sơ đồ 2.4: Các bƣớc xác định hàm lƣợng cellulose 53
Sơ đồ 2.5: Các bƣớc xác định hàm lƣợng pectin 54
Sơ đồ 2.6: Các bƣớc trích ly dung dịch đƣờng từ mẫu cà phê 56
Sơ đồ 2.7: Các bƣớc xác định hàm lƣợng đƣờng tổng số hòa tan 57
Sơ đồ 2.8: Các bƣớc xây dựng đƣờng chuẩn glucose 58
Sơ đồ 2.9: Các bƣớc xác định tổng lƣợng tro 59
Sơ đồ 2.10: Cách bố trí thí nghiệm 64
Sơ đồ 2.11: Quy trình lên men tách vỏ cà phê 72
Sơ đồ 3.1: Quy trình lên men tách vỏ cà phê 153
Sơ đồ 3.2: Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv có nguồn gốc từ nấm sợi 154
Sơ đồ 3.3: Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv có nguồn gốc từ nấm men và vi
khuẩn 155
Sơ đồ 3.4: Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv có nguồn gốc từ nấm sợi, nấm
men và vi khuẩn 156
Đồ thị 3.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ cà rốt/môi trƣờng đến sinh tổng hợp pectinase của các
chủng nấm sợi phân lập 90
Đồ thị 3.2: Ảnh hƣởng của tỷ lệ cà rốt/ môi trƣờng đến sinh tổng hợp pectinase của các
chủng nấm sợi PTN 91
Đồ thị 3.3: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

pectinase của 3 chủng nấm men 92
Đồ thị 3.4: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
pectinase của 5 chủng vi khuẩn 93
Đồ thị 3.5: Ảnh hƣởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi
phân lập 95
Đồ thị 3.6: Ảnh hƣởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm sợi
PTN 96
Đồ thị 3.7: Ảnh hƣởng của thời gian đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm
sợi phân lập 97
Đồ thị 3.8: Ảnh hƣởng của thời gian đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm
sợi PTN 98
X

Đồ thị 3.9: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
pectinase của 3 chủng nấm men 99
Đồ thị 3.10: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
pectinase của 5 chủng vi khuẩn 100
Đồ thị 3.11: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ đƣờng(
o
Brix) của dung dịch malt đến khả
năng sinh tổng hợp pectinase của 3 chủng nấm men 101
Đồ thị 3.12: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ đƣờng (
o
Brix) của dung dịch malt đến khả
năng sinh tổng hợp pectinase của 5 chủng vi khuẩn 102
Đồ thị 3.13: Khảo sát ảnh hƣởng pH đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của 3
chủng nấm men 103
Đồ thị 3.14: Khảo sát ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của
5 chủng vi khuẩn 104
Đồ thị 3.15: Ảnh hƣởng của lƣợng muối (NH

4
)
2
SO
4
đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase của 3 chủng nấm men 105
Đồ thị 3.16: Ảnh hƣởng của lƣợng muối (NH
4
)
2
SO
4
đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase của 5 chủng vi khuẩn 106
Đồ thị 3.17: Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi

đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
pectinase của 3 chủng nấm men 107
Đồ thị 3.18: Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
pectinase của 5 chủng vi khuẩn 108
Đồ thị 3.19: Ảnh hƣởng của tỷ lệ trấu/ môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của các chủng nấm sợi phân lập 110
Đồ thị 3.20: Ảnh hƣởng của tỷ lệ trấu/môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của các chủng nấm sợi PTN 111
Đồ thị 3.21: Ảnh hƣởng của tỷ lệ trấu/môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của 3 chủng nấm men 112
Đồ thị 3.22: Ảnh hƣởng của tỷ lệ trấu/môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của 5 chủng vi khuẩn 113
Đồ thị 3.23: Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng

nấm sợi phân lập 114
Đồ thị 3.24: Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng
nấm sợi PTN 115
Đồ thị 3.25: Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
các chủng nấm sợi phân lập 116
Đồ thị 3.26: Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
các chủng nấm sợi PTN 117
Đồ thị 3.27: Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của 3 chủng nấm men 118
Đồ thị 3.28: Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của 5 chủng vi khuẩn 119
Đồ thị 3.29: Khảo sát số lƣợng tế bào vsv của các chế phẩm theo thời gian 123
Đồ thị 3.30: Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase của các chế phẩm theo thời gian 123
Đồ thị 3.31: Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của các chế phẩm theo thời gian 124
Đồ thị 3.32: Biến thiên lƣợng vỏ tách ra theo thời gian của các chế phẩm
từ nấm sợi 128
XI

Đồ thị 3.33: Độ ẩm của 3 loại cà phê theo thời gian ngâm nƣớc 130
Đồ thị 3.34: Ảnh hƣởng độ ẩm của hạt cà phê trong lên men bởi chế phẩm từ nấm sợi
đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea arabica 131
Đồ thị 3.35: Ảnh hƣởng độ ẩm của hạt cà phê trong lên men bởi chế phẩm từ nấm sợi
đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea robusta 132
Đồ thị 3.36: Ảnh hƣởng độ ẩm của hạt cà phê trong lên men bởi chế phẩm từ nấm sợi
đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari 132
Đồ thị 3.37: Ảnh hƣởng của lƣợng CPVSV từ nấm sợi đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea arabica 133
Đồ thị 3.38: Ảnh hƣởng của lƣợng CPVSV từ nấm men và vi khuẩn đến khả năng chiết
chất hòa tan trong Coffea arabica 134
Đồ thị 3.39: Ảnh hƣởng của lƣợng CPVSV từ nấm sợi đến khả năng chiết chất hòa tan

trong Coffea robusta 135
Đồ thị 3.40: Ảnh hƣởng của lƣợng CPVSV từ nấm men và vi khuẩn đến khả năng chiết
chất hòa tan trong Coffea robusta 136
Đồ thị 3.41: Ảnh hƣởng của lƣợng CPVSV từ nấm sợi đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea chari 137
Đồ thị 3.42: Ảnh hƣởng của lƣợng CPVSV từ nấm men và vi khuẩn đến khả năng chiết
chất hòa tan trong Coffea chari 138
Đồ thị 3.43 Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong
Coffea arabica của các chế phẩm vsv từ nấm sợi 139
Đồ thị 3.44: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong
Coffea arabica của các chế phẩm vsv từ nấm men và vi khuẩn 140
Đồ thị 3.45 Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong
Coffea robusta của các chế phẩm vsv từ nấm sợi 141
Đồ thị 3.46: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong
Coffea robusta của các chế phẩm vsv từ nấm men và vi khuẩn 142
Đồ thị 3.47: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong
Coffea chari của các chế phẩm vsv từ nấm sợi 143
Đồ thị 3.48: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong
Coffea chari của các chế phẩm vsv từ nấm men và vi khuẩn 144
Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ tách vỏ theo lƣợng chế phẩm vi sinh vật 126
Biểu đồ 3.2: Mức chênh lệch tỷ lệ tách vỏ của mẫu thí nghiệm tăng so với mẫu đối
chứng 127
Biểu đồ 3.3: Khảo sát nồng độ chất tan bởi các chế phẩm đơn và chế phẩm kết hợp 150
Biểu đồ 3.4: Nồng độ chất tan tăng so với mẫu đối chứng bởi các chế phẩm đơn và chế
phẩm kết hợp 151
Biểu đồ 3.5: Nồng độ chất tan tăng so với mẫu đối chứng bởi các chế phẩm đơn và chế
phẩm kết hợp 152

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cà phê đã trở thành một thức uống không thể thiếu mỗi ngày. Cà phê
là một loại thức uống cao cấp có giá trị về mặt sinh lý và sức khỏe con ngƣời, là đặc
sản vùng nhiệt đới [50], [71]. Nhu cầu đòi hỏi của ngƣời tiêu dùng với các sản phẩm có
cà phê không ngừng tăng lên. Công nghiệp sản xuất cà phê ngày càng phát triển mạnh
mẽ, cà phê không chỉ là sản phẩm trong ngành công nghiệp cà phê mà còn là một thành
phần không thể thiếu trong các sản phẩm công nghiệp khác nhƣ bánh kẹo, thức uống,
hay thậm chí các chất trích từ cà phê đã đƣợc ứng dụng trong thuốc trị bệnh [76].
Thành phần cà phê làm tăng cao chất lƣợng sản phẩm và thỏa mãn nhu cầu ngày càng
đa dạng của ngƣời tiêu dùng.
Trên thế giới, ngành công nghiệp sản xuất cà phê hiện nay đang phát triển quy
mô lớn với yêu cầu cao về chất lƣợng cà phê. Ngày nay, cà phê đƣợc sản xuất theo hai
phƣơng pháp: phƣơng pháp khô và phƣơng pháp ƣớt. Phƣơng pháp khô là phƣơng
pháp sản xuất truyền thống trong khi phƣơng pháp ƣớt hay còn gọi là phƣơng pháp lên
men với sự hiện diện của enzyme hay chế phẩm vi sinh vật [55], [59]. Phƣơng pháp
này khắc phục những nhƣợc điểm của phƣơng pháp khô (thời gian phơi kéo dài, lệ
thuộc vào ánh sáng và ẩm độ, dễ bị nhiễm các vi sinh vật gây hại không mong muốn)
[75]. Đặc biệt, phƣơng pháp chế biến này cho cà phê chất lƣợng cao. Tuy nhiên,
phƣơng pháp ƣớt muốn triển khai tốt đòi hỏi phải có enzyme, cụ thể pectinase và
cellulase, cho đến nay các enzyme này chủ yếu là nhập từ nƣớc ngoài với giá cao (650-
1.000 USD/thùng 20 L và chỉ dùng để xử lý cho 4 tấn cà phê hạt). Bài toán đặt ra liệu
chăng có thể thay thế nguồn enzyme này bằng một nguồn chế phẩm vi sinh vật tƣơng
đƣơng tại Việt Nam với chất lƣợng tƣơng tự nhƣng giá thành rẻ hơn.
Ngoài ra, thực tế trong chế biến cà phê hiện nay tại Việt Nam, việc sử dụng các
phƣơng pháp truyền thống là dùng các hóa chất có tính acid và bazơ mạnh trong quy
trình xử lý cà phê đƣợc các nhà khoa học cảnh báo dễ sinh các chất độc hại không

mong muốn, tích lũy sinh học các chất này có thể gây ra các bệnh nan y nhƣ ung bƣớu
hay ung thƣ. Để khắc phục hậu quả này, công nghệ sinh học ngày nay ứng dụng những
2

chế phẩm sinh học có bản chất hữu cơ tác động đặc hiệu có kiểm soát và thân thiện với
con ngƣời và môi trƣờng vào quá trình xử lý cà phê [41], [92]. Đó là chế phẩm vi sinh
mà bản chất là ứng dụng vsv và những enzyme đƣợc hình thành trong quá trình sinh
trƣởng và phát triển vi sinh vật đƣợc sử dụng để xử lý cà phê.
Cơ sở khoa học hƣớng nghiên cứu của đề tài
Tại Việt Nam, cây cà phê có mặt gần 150 năm, từ đó đến nay, sản lƣợng cà phê
đã tăng gấp 100 lần, đứng thứ hai trong số các nƣớc sản xuất cà phê, đứng đầu về sản
xuất cà phê vối Coffea robusta. Xuất khẩu cà phê mỗi năm đã mang lại cho đất nƣớc ta
hàng trăm triệu đô la, thậm chí cả tỉ đô la Mỹ (2,7 tỉ USD năm 2011). Chúng ta vẫn chế
biến cà phê chủ yếu theo phƣơng pháp truyền thống cho chất lƣợng cà phê trung bình.
Trong một vài năm gần đây, đã có một số công ty mạnh dạn ứng dụng phƣơng pháp
mới nhƣng quy mô còn nhỏ và chế phẩm ứng dụng chƣa nhiều. Một thực tế ở nhiều
nƣớc (Indonesia, Đài Loan,…) xuất hiện loại cà phê đặc biệt, đó là cà phê “chồn”. Loại
cà phê này có chất lƣợng cao và rất phù hợp với ngƣời tiêu dùng cả ở Indonesia và ở
Việt Nam. Hằng năm, ngƣời ta sản xuất ra loại cà phê chồn không nhiều vì phụ thuộc
chủ yếu vì sự tham gia chủ yếu của loài chồn hƣơng có ở nông trƣờng cà phê. Loài
chồn hƣơng này chỉ ăn những trái cà phê chín và khi đi qua hệ tiêu hóa của chúng,
nhân cà phê đƣợc trải qua giai đoạn lên men [90]. Nhƣ vậy bản chất của cà phê chồn là
nhân cà phê đã đƣợc lên men nên chất lƣợng rất cao. Tƣơng tự nhƣ vậy ở Đài Loan
ngƣời ta cho khỉ ăn trái cà phê và nhân cà phê sau khi qua hệ tiêu hóa của khỉ cũng có
chất lƣợng tƣơng đƣơng cà phê chồn. Nhƣ vậy bản chất sinh học ở đây là một quá trình
chuyển hóa tác động bởi enzyme có trong hệ thống tiêu hóa của các động vật. Chính vì
thế đề tài đƣợc đặt ra theo hƣớng nghiên cứu mới dạng “phỏng sinh học” nhằm tìm ra
bản chất sinh hóa và từ đó xây dựng nên kỹ thuật mới nâng cao chất lƣợng cà phê. Đề
tài đƣợc xác định là: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzyme
pectinase, cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê theo phương pháp lên men”.

3

Mục tiêu đề tài:
Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase
và cellulase, tìm ra quy trình kỹ thuật lên men để nâng cao khả năng tách vỏ, trích ly
chất hòa tan từ cà phê cũng nhƣ cải thiện tốt hƣơng và vị nhằm nâng cao chất lƣợng cà
phê.
Những nội dung nghiên cứu của đề tài:
1. Phân lập và thuần hóa các chủng nấm sợi, nấm men và vi khuẩn trong tự nhiên
từ vỏ cà phê.
2. Khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase của những
chủng thuần hóa và từ bộ sƣu tập có sẵn của PTN và định danh các vi sinh vật
có hoạt tính các enzyme cao.
3. Kiểm tra sơ bộ sự sinh tổng hợp độc tố của các chủng vi sinh vật (nếu có, chủng
vi sinh vật sẽ bị loại bỏ vì không thể sử dụng trong chế biến thực phẩm).
4. Nghiên cứu các điều kiện phù hợp để tạo các chế phẩm vsv bao gồm thành phần
môi trƣờng, độ ẩm, thời gian, pH ban đầu, nhiệt độ, …
5. Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện nhằm tăng khả năng tách vỏ của cà phê
tƣơi.
6. Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện lên men nhằm tăng khả năng trích ly các
chất hòa tan nhƣ độ ẩm nhân cà phê, tỉ lệ chế phẩm đƣa vào lên men, thời gian
lên men thông qua chỉ số
o
Brix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan).
7. Xây dựng quy trình công nghệ lên men cà phê.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Những đóng góp mới của luận án:
- Định danh và thuần hóa hệ các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
pectinase và cellulase từ đối tƣợng cà phê Việt Nam: Kết quả thu đƣợc 7 chủng vsv
từ nguồn phân lập sinh tổng hợp đƣợc cả hai enzyme trên. Kết quả định danh cho thấy

1 chủng thuộc giống Rhizopus và 6 chủng đều thuộc giống Aspergillus. Tuy nhiên, kết
4

quả lại cho thấy có hai chủng dƣơng tính có sản sinh độc tố aflatoxin, ochratoxin là
Rhizopus oryzae và Aspergillus fumigatus. Năm chủng còn lại không sinh độc tố là
Aspergillus carbonarius, A. japonicus, A. flavus, A. phoenicis, A. tubingensis. Ngoài 5
chủng nấm sợi phân lập, đề tài cũng xác định có 5 chủng nấm sợi tại PTN có khả năng
sinh tổng hợp pectinase và cellulase cao có thể ứng dụng trong xử lý cà phê. Các chủng
nấm sợi này bao gồm Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma
longibrachiatum, Trichoderma piluliferum, Trichoderma reesei. Phân lập nấm men và
vi khuẩn từ vỏ và nhân cà phê, kết quả thu đƣợc 18 chủng. Bƣớc đầu khảo sát sơ bộ
khả năng sinh tổng hợp pectinase và cellulase cho thấy có 8 chủng có khả năng này.
Trong đó có 3 chủng nấm men và 5 chủng vi khuẩn. Định danh các chủng nấm men
bằng kỹ thuật giải trình tự gen 28S
r
RNA và xác định trên BLAST NCBI và vi khuẩn
bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S
r
RNA và xác định trên BLAST NCBI. Kiểm tra khả
năng sinh độc tố của các chủng này bằng phƣơng pháp AOAC 999.07 – 2000. Kết quả
thu đƣợc 3 chủng nấm men và 5 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp pectinase,
cellulase và không sinh độc tố, có tên Candida tropicalis, Issatchenkia orientalis,
Pichia guilliermonii, Bacillus megaterium D, B. subtilis E, B. subtilis K, B. subtilis N,
B. subtilis T. Việc phân lập những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp pectinase và
cellulase từ đối tƣợng cà phê Việt Nam chƣa có nghiên cứu trong và ngoài nƣớc đề cập
đến cho đến nay.
- Tối ƣu hóa một số điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật: Đã nghiên cứu các
điều kiện tối ƣu để sản xuất 18 chế phẩm nhƣ thành phần môi trƣờng, độ ẩm, thời gian
để sinh tổng hợp pectinase và cellulase đối với các chủng nấm sợi, và thành phần môi
trƣờng, độ ẩm, thời gian, độ Brix, pH ban đầu và (NH

4
)
2
SO
4
để sinh tổng hợp pectinase
và cellulase đối với các chủng nấm men và vi khuẩn. Những chủng nấm sợi nhƣ
Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, T. reesei hay các chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium, B. subtilis đã có nhiều nghiên cứu đƣợc thực hiện để sinh tổng hợp nhiều
loại enzyme và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực lên men, kháng bệnh và cân bằng sinh
học trong nông nghiệp cũng nhƣ trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Tuy vậy, việc
nghiên cứu những chủng vi sinh vật nêu trên đã thích nghi trên đối tƣợng cà phê là
chƣa nhiều và kết quả của đề tài góp phần thêm vào sự hiểu biết chung, cụ thể các điều
5

kiện tối ƣu sinh tổng hợp các enzyme này. Ở nƣớc ngoài, nghiên cứu về sinh tổng hợp
cellulase của các chủng vsv nhƣ Aspergillus phoenicis, Trichoderma longibrachiatum,
Aspergillus flavus đã có một số công trình nhƣng ở Việt Nam thì còn hạn chế. Đặc biệt,
việc nghiên cứu sinh tổng hợp pectinase ở 3 chủng này chƣa đƣợc công bố trƣớc đây ở
cả trong nƣớc và nƣớc ngoài. Ngoài ra, tính mới đặc biệt thể hiện trong những khảo sát
tối ƣu quá trình sinh tổng hợp pectinase và cellulase ở các chủng Trichoderma
piluliferum, Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus tubingensis,
Candida tropicalis, Pichia guilliermonii, Issatchenkia orientalis. Những chủng nấm sợi
và nấm men vừa đƣợc nêu chủ yếu đƣợc nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp các loại
enzyme phân giải liên kết α-glucosidic. Nhƣng nghiên cứu tìm điều kiện tối ƣu để sinh
tổng hợp enzyme thủy phân β-glucosidic là pectinase, cellulase thì chƣa đƣợc thực hiện
cho đến luận án này.
- Đã tạo đƣợc các chế phẩm có thể ứng dụng quy mô công nghiệp trong việc
tách vỏ cà phê: Đã thử nghiệm và thấy rằng có 5 chế phẩm có thể ứng dụng cho tách
vỏ cà phê tƣơi cụ thể là những chế phẩm đƣợc tạo ra từ các chủng nấm sợi sau:

Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Aspergillus phoenicis, Trichoderma reesei,
Aspergillus tubingensis. Lƣợng chế phẩm sử dụng từ 5 đến 6% và thời gian lên men
tách vỏ là 9 - 10 giờ tùy từng loại chế phẩm.
- Đã tạo đƣợc các chế phẩm có thể ứng dụng quy mô công nghiệp trong việc
làm tăng chất trích hòa tan và cảm quan tốt về hƣơng và vị: Nghiên cứu tối ƣu hóa
các điều kiện lên men các loại cà phê: nhƣ độ ẩm nhân cà phê, tỉ lệ chế phẩm đƣa vào
lên men, thời gian lên men thông qua chỉ số độ Brix sản phẩm sau lên men (thành phần
chất hòa tan). Cà phê lên men phải đƣợc ngâm trong nƣớc 1,5 giờ để đạt độ ẩm 53-
60%W, để ráo nƣớc và tiến hành lên men với 8 chế phẩm. Các chế phẩm biocoffee-1,
biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8, và biocoffee-10 lên men cà phê trong môi trƣờng
rắn ẩm. Còn các chế phẩm còn lại Biocoffee-12, Biocoffee-14 và biocoffee-15 tiến hành
lên men trong môi trƣờng lỏng. Cà phê lên men đã đƣợc tiến hành đánh giá cảm quan
và kết quả cho thấy các loại cà phê lên men đạt điểm cao hơn (tốt và xuất sắc) so với cà
phê không lên men (trung bình hoặc dƣới trung bình). Cà phê lên men có hƣơng vị đậm
đà, hậu vị tốt. Trích ly đƣợc nồng độ các chất hòa tan tăng đến 53% so với mẫu đối
6

chứng khi sử dụng các chế phẩm đơn, đặc biệt nồng độ chất trích hòa tan tăng đến 68%
khi sử dụng phối hợp các chế phẩm. Khảo sát hàm lƣợng caffeine trong hạt cà phê sau
lên men chế phẩm đơn hoặc phối hợp chế phẩm cũng thu đƣợc kết quả ấn tƣợng, tăng
38% đối với chế phẩm đơn và đặc biệt tăng 46% đối với phối hợp chế phẩm. Ngoài ra,
cà phê lên men ở điều kiện thu đƣợc chất hòa tan, cũng nhƣ caffeine cao hƣơng vị, và
các chỉ tiêu cảm quan hình thái màu sắc của cà phê đều đạt, thậm chí chất lƣợng cảm
quan cải thiện khá rõ rệt.
- Ý nghĩa thực tiễn của luận án
- Đề tài thành công đã góp phần làm sang tỏ quy trình sản xuất chế phẩm vsv
mang hoạt tính pectinase và cellulase và ứng dụng của chúng trong việc tách vỏ và lên
men cà phê nhằm tăng hiệu suất trích ly các chất hòa tan và cải thiện hƣơng vị cà phê
trong điều kiện Việt Nam. Kết quả có thể ứng dụng tại các công ty sản xuất nhân cà
phê, đặc biệt có thể ứng dụng tại các công ty sản xuất cà phê hòa tan.

7

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ
1.1.1 Sơ lƣợc lịch sử phát triển cây cà phê ở Việt Nam
Ở Việt Nam cây cà phê chè (C. arabica) xuất hiện vào năm 1857 tại Bố Trạch
(Bình Trị Thiên). Sau đó vào năm 1905 thì thực dân Pháp nhập loại cây cà phê vối (C.
robusta) và cà phê mít (C. chari) trồng ở Hòa Bình, Sơn Tây. Mãi đến năm 1920 -
1925, sau khi phát hiện các vùng đất bazan phì nhiêu ở Tây Nguyên thì ngƣời Pháp bắt
đầu khai thác và trồng trọt tại đây 6 , 13 .
Qua hơn 1 thế kỷ từ ngày trồng thử cây cà phê đầu tiên ở nƣớc ta đến nay cây cà
phê đã đứng vững trên một thị trƣờng rộng lớn từ Bắc đến Nam. Diện tích trồng cà phê
ở Việt Nam lên đến 500.000 ha, hằng năm cho sản lƣợng xuất khẩu trên 1,3 triệu tấn.
Hiện nay giá trị kim ngạch giá trị xuất khẩu của cà phê chỉ đứng sau lúa gạo 13 .
1.1.2 Giá trị kinh tế của cà phê
Cà phê đƣợc trồng và xuất khẩu ở hơn 70 nƣớc đang phát triển ở vành đai nhiệt
đới và á nhiệt đới, phần lớn sản phẩm đƣợc nhập khẩu và tiêu thụ ở các nƣớc ôn đới và
công nghiệp phát triển và mức tiêu thụ cà phê trên thế giới ngày càng cao. Giá trị kinh
tế của cà phê rất to lớn:
- Là mặt hàng tiêu thụ nội địa mạnh
- Là mặt hàng buôn bán lớn của thế giới. Giá trị xuất khẩu của cà phê lớn hơn
nhiều so với ca cao và chè. Ở Việt Nam, giá trị xuất khẩu của cà phê chỉ đứng
sau gạo 18 .
- Cà phê ngoài dùng để pha uống thông thƣờng còn là nguyên liệu cho một số
ngành công nghiệp phát triển: bánh, kẹo, rƣợu, sữa cà phê.
- Sản xuất cà phê thu hút nhiều lao động 17 .
- Sản xuất cà phê làm quan hệ hợp tác quốc tế, thƣơng mại đƣợc củng cố, phát
triển Việt Nam sau ngày thành lập Hiệp hội cà phê Việt Nam (1/1990) và gia nhập tổ
chức cà phê quốc tế (3/1991) đã có quan hệ buôn bán cà phê với nhiều nƣớc châu Âu

8

và châu Á. Những nƣớc Đức, Pháp, Ý cũng thông qua quan hệ buôn bán giúp đỡ Việt
Nam về vật tƣ, thiết bị, và đầu tƣ vào sản xuất cà phê 3 .
1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê
Cà phê là một nông sản có giá trị và dần đƣợc các nƣớc trên thế giới quan tâm.
Những nƣớc có khả năng trồng trọt những loại cây này luôn tìm cách phát triển diện
tích, sản lƣợng và năng suất vì chúng mang lại một nguồn ngoại tệ lớn. Có nhiều giống
cà phê nhƣng hiện nay có ba giống: Coffea arabica, C. robusta, C. chari đƣợc trồng
rộng rãi trên thế giới 6 , 17 . Hiện nay theo số liệu thống kê của Mỹ, có khoảng 79
nƣớc đang trồng cà phê với diện tích 12 triệu ha. Trong đó cà phê chè C. arabica chiếm
khoảng 70%, và chiếm 75% tổng sản lƣợng xuất khẩu cà phê.
Diện tích trồng cà phê ở Việt Nam lên đến gần 500.000 ha và tiến đến ổn định
diện tích trồng cà phê. Cà phê chủ yếu đƣợc trồng ở Việt Nam là cà phê vối do ƣu thế
năng suất bình quân của cà phê Việt Nam cao gấp 3 lần năng suất trung bình trên thế
giới và điều kiện thổ nhƣỡng đặc biệt thuận lợi của Việt Nam 8 .
1.1.4 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê ở Việt Nam
Việt Nam là nƣớc đứng thứ 2 sau Braxin về xuất khẩu cà phê; tuy nhiên, Việt
Nam chủ yếu vẫn xuất khẩu cà phê thô, giá thành thấp [21]. Cà phê đƣợc chế biến theo
phƣơng pháp truyền thống có chất lƣợng trung bình và lệ thuộc rất lớn vào nhiệt độ và
ánh sáng tự nhiên. Thế giới đã nghiên cứu chế biến cà phê bằng các công nghệ lên men
ngay sau khi thu hoạch nhằm loại bỏ hoàn toàn vỏ và lớp nhớt pectin. Điều này làm
thay đổi căn bản cảm quan và chất lƣợng cà phê [6], [21]. Tại Việt Nam, có khoảng 20
công ty đang ứng dụng công nghệ lên men ƣớt nhằm tách vỏ và lớp nhớt cà phê để thu
đƣợc cà phê đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Tuy nhiên, chế phẩm đƣợc sử dụng là enzyme
đƣợc nhập rất đắt tiền từ nƣớc ngoài. Trong xu thế hội nhập đòi hỏi cao về chất lƣợng,
ngành chế biến cần có nhiều nghiên cứu mới để sản xuất cà phê đạt chất lƣợng thế giới,
đòi hỏi nguồn enzyme thay thế rẻ hơn sản xuất tại Việt Nam.
1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu trong chế biến cà phê
Trong chế biến cà phê tƣơi, vỏ cà phê có thể đƣợc loại bỏ một phần nhờ biện

pháp cơ học. Tuy nhiên muốn tách bỏ hoàn toàn vỏ cà phê và làm sạch lớp nhớt pectin
là một việc rất khó nếu chỉ sử dụng phƣơng pháp cơ học, vì nhân cà phê sẽ bị bể gãy
9

hay bị tổn thƣơng. Để giải quyết vấn đề này, ngày nay ngƣời ta sử dụng phối hợp biện
pháp cơ học và biện pháp sinh hóa, mà trong đó enzyme đóng vai trò quan trọng. Với
bản chất chứa nhiều pectin và cellulose trong vỏ cà phê và đặc biệt trong lớp nhớt, vì
vậy pectinase và cellulase là hai enzyme đƣợc quan tâm nhiều nhất. Hiện nay, hai
enzyme này có thể dễ dàng nhập khẩu nhƣng giá thành rất cao từ 650-1000 USD/thùng
20l, vì vậy giá thành cà phê cao. Tại Việt Nam những enzyme này chƣa sản xuất rộng
rãi và thƣơng phẩm hóa những enzyme này còn nhiều hạn chế. Việt Nam đƣợc biết là
nơi giàu nguồn vi sinh vật, liệu chăng bằng công nghệ tế bào và công nghệ enzyme có
thể sản xuất chế phẩm vi sinh vật hay chế phẩm enzyme để thay thể nguồn ngoại nhập
đắt tiền.
Trong các dòng sản phẩm cà phê chế biến hiện có thì cà phê hòa tan là một loại
sản phẩm mang lại giá trị gia tăng cao (có thể tăng 45% giá trị so với tiêu thụ nhân cà
phê). Trên thế giới cà phê hòa tan đang bị các tập đoàn sản xuất nổi tiếng ở Anh, Hà
Lan, Đức và Ý chi phối. Tại nƣớc ta đến nay chỉ mới có 3 doanh nghiệp đầu tƣ sản xuất
cà phê hòa tan gồm: Nestlé Việt Nam, Vinacafe Biên Hòa và Công ty TNHH An Thái
(Đắc Lắc), với công suất khoảng 3.500 tấn sản phẩm/năm. Sản phẩm cà phê của Công
ty Việt Nam đƣợc các đơn vị xuất khẩu cà phê trong nƣớc đặt mua khoảng 80%, xuất
sang một số nƣớc nhƣ Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan.
Cà phê hòa tan 100% nguyên chất, dạng bột là nguyên liệu cần thiết cho nhiều
dòng sản phẩm, trong đó phải kể đến các loại bánh kẹo, thực phẩm, rƣợu, sữa cà phê
Cà phê hòa tan “3 in 1” và “4 in 1”. đang khá thông dụng trên thị trƣờng. Thông
thƣờng, để sản xuất đƣợc 1 kg cà phê bột hòa tan ta cần từ 3 - 3,2 kg nguyên liệu nhân
cà phê, gần đây một số công nghệ thế giới đã tăng lên đáng kể là 1 kg cà phê bột hòa
tan/ 2,4 kg cà phê thƣờng. Vấn đề ở đây, trong điều kiện Việt Nam, những nghiên cứu
nhằm tăng cƣờng khả năng trích ly chất hòa tan vẫn còn hạn chế, chƣa đƣợc nghiên cứu
nhiều.

Lên men cà phê để tăng cƣờng trích ly các chất hòa tan có thể từ nguồn nguyên
liệu ban đầu từ nhân cà phê ƣớt hay nhân cà phê khô, quá trình này làm thay đổi căn
bản sinh hóa cà phê, đặc biệt sự tác động của pectinase và cellulase làm tăng cƣờng
chất trích hòa tan. Cơ sở khoa học của việc này là do vách tế bào của nhân cà phê bị
10

nới lỏng hay phá vỡ, nhờ đó các chất trích hòa tan đƣợc giải phóng ra ngoài. Vấn đề cốt
lõi là có sản xuất đƣợc các chế phẩm enzyme hay chế phẩm vi sinh vật đủ mạnh để
trích hoàn toàn các chất hòa tan từ nhân cà phê. Đồng thời ở thời điểm thu đƣợc chất
tan nhiều nhất, cà phê còn giữ nguyên hay tăng cảm quan về trạng thái, hƣơng và vị
hay không.
1.2 TRÁI CÀ PHÊ
1.2.1 Cấu tạo trái cà phê

Hình 1.1: Cà phê vừa thu hoạch Hình 1.2: Cấu tạo bên trong quả cà phê
Trái cà phê thuộc loại quả thịt, gồm có những thành phần: vỏ quả, lớp thịt, lớp nhớt,
lớp vỏ trấu, lớp vỏ lụa, nhân 7 , 21 .
Lớp vỏ quả: là lớp vỏ ngoài, mềm có màu vàng hay đỏ. Vỏ quả cà phê chè mềm hơn
vối và mít. Trong vỏ quả có vết của alkaloid, tannin, caffeine, các loại enzyme. Trong
vỏ quả có 21,5 – 30% chất khô.
Lớp vỏ thịt: dƣới lớp vỏ quả. Vỏ thịt cà phê chè mềm, dễ xay xát. Vỏ thịt cà phê mít thì
cứng và dày. Vỏ thịt chứa nhiều đƣờng và pectin.
Lớp nhớt: nằm sát nhân, khó tách ra. Thành phần chính của lớp nhớt là pectin, các loại
đƣờng khử và không khử, cellulose. Ngoài ra còn có pectinase phân giải pectin trong
quá trình lên men. Đặc tính của lớp này là không hòa tan trong nƣớc, hút ẩm rất mạnh
vì vậy trở ngại cho việc phơi sấy khô và bảo quản nhân cà phê [98].
Lớp vỏ trấu: bao bọc quanh nhân, có màu trắng ngà, cứng, nhiều chất xơ. Vỏ trấu cà
phê chè mỏng, dễ đập vỡ hơn vỏ trấu của cà phê vối và mít. Thành phần chính của vỏ
trấu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose và đƣờng [43], [79].
11

Lớp vỏ lụa: bọc sát nhân, rất mỏng, mềm, có màu sắc và đặc tính khác nhau tùy mỗi loại cà
phê: vỏ lụa cà phê chè màu trắng bạc, dễ bong ra khỏi hạt trong quá trình chế biến. Vỏ lụa
cà phê vối màu nâu nhạt, vỏ lụa cà phê mít màu vàng bám sát vào nhân [43].
Nhân: ở trong cùng, là phần chính của trái, mỗi trái thƣờng có hai nhân, có khi một hay ba
nhân. Lớp tế bào phần ngoài của nhân cứng có những tế bào nhỏ, trong đó có chứa những
chất dầu. Phía trong là những tế bào lớn và mềm hơn.
Bảng 1.1: Tỷ lệ các phần cấu tạo quả cà phê [43 ]
Thành phần
quả cà phê
Cà phê chè
(C. arabica) (%)
Cà phê vối
(C. robusta) (%)
Vỏ quả
43 - 45
41- 42
Lớp nhớt
20 - 23
21 – 22
Vỏ trấu
6 -7,5
6 - 8
Nhân và vỏ lụa
26 - 30
26 – 29
1.2. 2 Thành phần hóa học
1.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả
Là chất altoxian trong đó có các vết của alkaloid, tannin, caffeine và các loại men,
vỏ quả có từ 21,5- 30% chất khô 6 , [14].

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của vỏ quả [43 ]
Thành phần
Cà phê chè
(Arabica) (%)
Cà phê vối
(Robusta) (%)
Protein
9,2-11,2
9,17
Chất béo
1,73
2,00
Cellulose
13,16
27,65
Tro
3,22
3,33
Hợp chất không nitơ
66,16
57,15
Chất đƣờng
-
-
Tannin
-
14,42
Pectin
-
4,07

Caffeine
0,58
0,25