Phân lập và nghiên cứu các đặc tính dịch tễ học phân tử của các chủng listeria monocytogenes được phân lập trên địa bàn hà nội
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.91 MB, 115 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------
PHAN THỊ HƯƠNG TRÀ
ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH DỊCH TỄ
HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG LISTERIA MONOCYTOGENES
ĐƯỢC PHÂN LẬP TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ QUANG HÒA
HÀ NỘI - 2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận nghiên cứu này sẽ không có thể thực hiện được nếu không có sự hỗ
trợ của nhiều người. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Lê Quang Hòa
– Phòng Hóa sinh và Sinh học phân tử - Viện CNSH & CNTP – Trường ĐHBK Hà
Nội, người đã hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian làm việc ở phòng thí nghiệm
và luôn sẵn sàng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Tôi cũng muốn bày tỏ lòng cảm ơn tới các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh
học và Công nghệ thực phẩm đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Đặc biệt cảm ơn đến tất cả các cán bộ nhân viên phòng thí nghiệm Hóa sinh và
Sinh học phân tử, phòng thí nghiệm Công nghệ cao và phòng thí nghiệm Công nghệ
sinh học cùng với các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh thực tập tại đây đã
nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình tôi, những người thân và bạn bè đã cổ vũ,
động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Học viên
Phan Thị Hương Trà
0
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, những nội dung được trình bày trong luận văn này là do sự
tìm tòi, nghiên cứu của chính bản thân. Các kết quả nghiên cứu là trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào của các tác giả khác.
Tôi xin chịu trách nhiện về những nội dung cam đoan trên.
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010
Tác giả
Phan Thị Hương Trà
1
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................0
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................1
MỤC LỤC..................................................................................................................2
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................5
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................6
PHẦN I. TỔNG QUAN ............................................................................................8
I.1. Tổng quan về L. monocytogenes ........................................................................8
I.1.1. Các đặc tính cơ bản của L. monocytogenes ...................................................8
I.1.1.1. Đặc hình thái .................................................................................................9
I.1.1.2. Đặc tính sinh lý ...........................................................................................10
I.1.1.3. Đặc tính sinh hoá ........................................................................................11
I.1.1.4. Đặc tính huyết thanh học ...........................................................................12
I.1.1.5. Đặc điểm về cấu trúc phân tử và con đường xâm nhiễm .......................14
I.1.2. Con đường lây nhiễm và bệnh do L. monocytogenes gây ra......................21
I.1.2.1. Con đường lây nhiễm L. monocytogenes ..................................................21
I.1.2.2. Bệnh do L. monocytogenes gây ra .............................................................22
I.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do L. monocytogenes gây ra......................24
I.1.3.1. Trên thế giới ................................................................................................24
I.1.3.2. Ở Việt Nam..................................................................................................28
I.1.3.3. Quy định kiểm soát L. monocytogenes......................................................30
I.2. Các phương pháp phát hiện L. monocytogenes..............................................31
I.2.1. Các phương pháp truyền thống ...................................................................31
I.2.1.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái vi sinh vật học.....................31
I.2.1.2. Phương pháp sinh hóa................................................................................32
I.2.1.3. Phương pháp huyết thanh học ..................................................................35
I.2.2. Các phương pháp không truyền thống........................................................36
I.2.2.1. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)..........36
I.2.2.2. Phương pháp lai phân tử DNA (DNA-Hybridization)............................37
2
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
I.2.2.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)...................................39
I.3. Các phương pháp xác định kiểu phụ của L. monocytogenes ........................42
I.3.1. Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu hình .................................43
I.3.1.1. Phương pháp huyết thanh học ..................................................................43
I.3.1.2. Phương pháp dựa trên kiểu của thể thực khuẩn.....................................43
I.3.1.3. Phương pháp MLEE (multilocus enzyme electrophoresis)....................44
I.3.1.4. Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu esterase.........................44
I.3.2. Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu gen ...................................45
I.3.2.1. Phương pháp PFGE (pulsed-field gel electrophoresis)...........................45
I.3.2.2. Phương pháp ribotyping ............................................................................47
I.3.2.3. Các phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR ...............................................48
I.3.2.4. Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên trình tự DNA .......................50
I.4. Các phương pháp xác định độc tính của L. monocytogenes .........................51
I.4.1. Thử nghiệm độc tính trên chuột...................................................................51
I.4.2. Thử nghiệm độc tính bằng các dòng tế bào ................................................52
I.4.3. Xét nghiệm dựa trên các gen và protein liên quan tới độc tính ................53
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................55
II.1. Vật liệu .............................................................................................................55
II.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................55
II.1.2. Chủng vi sinh vật .........................................................................................55
II.1.3. Hóa chất ........................................................................................................56
II.1.4. Thiết bị ..........................................................................................................57
II.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................57
II.2.1. Xây dựng quy trình phân lập L. monocytogenes từ thực phẩm...............57
II.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh từ mẫu thực phẩm ban đầu ...................................57
II.2.1.2. Giai đoạn chọn lọc trên môi trường rắn .................................................57
II.2.1.3. Giai đoạn tăng sinh thuần chủng và bảo quản giống ............................61
II.2.1.4. Thí nghiệm xác định chu kỳ phát triển của L. monocytogenes.............61
II.2.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được ...............63
II.2.2.1. Thu DNA làm khuôn cho phản ứng PCR...............................................63
3
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
II.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR.........................................................................63
II.2.2.3. Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose............................64
II.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen .......................................64
II.2.2.5. Phương pháp phân tích trình tự gen.......................................................66
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................68
III.1. Xây dựng quy trình phân lập L. monocytogenes từ thực phẩm ................68
III.1.1. Thí nghiệm xác định chu kỳ phát triển của L. monocytogenes ..............68
III.1.2. Kết quả phân lập L. monocytogenes trong môi trường chọn lọc............71
III.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được.................74
III.2.1. Kiểm tra độ nhạy của phản ứng PCR ......................................................74
III.2.2. Khảo sát số chu kỳ cần thiết trong phản ứng PCR .................................77
III.2.3. Kết quả tinh sạch DNA ..............................................................................79
III.2.4. Kết quả giải trình tự gen............................................................................81
II.2.4.1. Tinh sạch trình tự gen ..............................................................................81
III.2.4.2. Xác định kiểu phụ của các chủng dựa trên trình tự gen đặc trưng ...83
III.2.4.3. Phân tích dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được ..............87
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................94
IV.1. Kết luận...........................................................................................................94
IV.2. Đề nghị ............................................................................................................95
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................96
PHỤ LỤC...............................................................................................................104
4
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Ký hiệu
Tên đầy đủ
1
aw
Water activity (hoạt độ của nước)
2
DNA
Axit Deoxyribonucleic
3
bp
Base pair (cặp bazơ)
4
dNTP
Deoxynucleotide
5
EDTA
Ethylen Diamine Tetra acetic Acid
6
EtBr
Ethidium Bromide
7
MVLST
A multi-virulence-locus sequence typing
8
kDa
Kilo Dalton
9
LAMP
Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA
10
PCR
Polymerase Chain Reaction
11
PEG
Polyetylen Glycol
12
TAE
Tris - Acetate - EDTA
13
TE
Tris - EDTA
14
PBS
Phosphate Buffered Saline- muối đệm phosphate
15
HFb
Half Fraser Broth (Môi trường tiền tăng sinh Lm)
16
Fb
Fraser Broth (Môi trường tăng sinh Lm)
17
CFU
Colony forming unit (Số đơn vị hình thành khuẩn lạc)
18
CAMP
Christie, Atkins, Munch-Petersen
5
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là một trong những vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm
trên cả người và động vật. Trong tự nhiên, L. monocytogenes có phạm vi phân bố
khá rộng, có thể được tìm thấy ở nhiều nơi như đất, nước, thực vật, nhiều loại thực
phẩm, thức ăn gia súc và có cả trong phân người hoặc phân động vật. Một đặc tính
đặc biệt của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng tồn tại và phát triển trong điều
kiện nhiệt độ thấp nên các mặt hàng đông lạnh như thịt, xúc xích, các sản phẩm bơ,
sữa …có nguy cơ cao bị nhiễm loại vi khuẩn này .
Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là listeriosis. Đối tượng có
nguy cơ bị nhiễm bệnh cao thường là những người có hệ thống miễn dịch hoạt động
kém như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi hoặc các bệnh nhân mắc hội
chứng suy giảm miễn dịch. Hậu quả của bệnh gây ra rất lớn. Trong giai đoạn đầu
tiên khi bị nhiễm bệnh, người bệnh thường biểu hiện các triệu chứng lâm sàng
không đặc trưng giống như người bị cảm cúm thông thường (như ớn lạnh, mệt mỏi,
đau đầu, mỏi cơ và xương) – chính vì vậy người ta thường không nhận biết được
ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này. Nếu độc tính đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ
độc thực phẩm cấp tính với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, viêm dạ dày.
Tuy nhiên, khi không được điều trị kịp thời bằng thuốc kháng sinh, chúng có thể
phát triển gây nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và có thể gây tử vong.
Với tỷ lệ tử vong cao, lên tới gần 30%, L. monocytogenes nguy hiểm hơn rất nhiều
so với các tác nhân gây bệnh thông qua thực phẩm phổ biến như Salmonella (với tỷ
lệ tử vong 0,38%), Campylobacter (0,02-0,1%) và Vibrio (0.005-0,01%).
Vi khuẩn L. monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác
nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Các ca
nhiễm bệnh do L. monocytogenes đã xảy ra ở các nước Châu Âu, Châu Mỹ, Châu
Phi cũng như các nước trong khu vực Châu Á và có xu hướng ngày càng tăng.
Trong một vài trường hợp, chúng có thể bùng phát thành dịch bệnh trên diện rộng.
Ở Việt Nam, với sự phát triển của nền kinh tế , lối sống công ngiệp hóa và nhu cầu
sử dụng các thực phẩm chế biến sẵn như sữa và các sản phẩm của sữa, trứng và các
6
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
sản phẩm của trứng, đặc biệt là thực phẩm đông lạnh ngày càng gia tăng trong bữa
ăn hàng ngày của người dân thì nguy cơ nhiễm bệnh do L. monocytogenes ngày
càng cao. Tuy ở nước ta chưa có trường hợp nhiễm bệnh nào được báo cáo là liên
quan đến L. monocytogenes nhưng đã có một số nghiên cứu phát hiện được sự
nhiễm tạp của loại vi khuẩn này trong một số loại thực phẩm chế được biến sẵn.
Bên cạnh đó, khả năng gây bệnh và dịch của các chủng L. monocytogenes có nguồn
gốc từ thực phẩm ở nước ta nói chung và ở Hà Nội nói riêng vẫn còn chưa được xác
định..
Do vậy, trong khuôn khổ của luận văn cao học này, chúng tôi đã nghiên cứu
“Phân lập và xác định độc tính bằng dịch tễ học phân tử của các chủng Listeria
monocytogenes từ các mẫu thực phẩm thu thập được trên địa bàn Hà Nội”.
Nghiên cứu này đã giải quyết các vấn đề sau:
¾ Xây dựng quy trình phân lập L. monocytogenes từ thực phẩm.
¾ Áp dụng quy trình đã xây dựng để phân lập các chủng L. monocytogenes từ
các mẫu thực phẩm trên địa bàn Hà Nội.
¾ Nghiên cứu dịch tễ học của các chủng đã phân lập dựa trên việc phân tích
trình tự của các gen mang độc tính – MVLST (Multi-virulence-locus sequence
typing).
7
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
PHẦN I. TỔNG QUAN
I.1. Tổng quan về L. monocytogenes
I.1.1. Các đặc tính cơ bản của L. monocytogenes
L. monocytogenes là một loại vi khuẩn có thế khiến phụ nữ mang thai bị sẩy
thai, gây ra bệnh viêm màng não ở người già hoặc những người có hệ miễn dịch yếu
[51].
L. monocytogenes được biết đến lần đầu tiên vào năm 1911 khi Hulpher, nhà
vi sinh vật học Thụy Điển, phân lập được một loài vi khuẩn từ bệnh hoại tử gan thỏ
và ông đặt tên là Bacillus hepatic. Các đặc tính của loài vi khuẩn do Hulpher mô tả
cho thấy nó rất giống với L. monocytogenes. Năm 1926, Muray đã đặt tên
monocytogenes cho loài này và các đồng nghiệp của ông cho rằng đây là một loài
bacillus mới có khả năng hoạt động sinh monocytosis (hiện tượng tăng lượng bạch
cầu quá mức bình thường) ở thỏ và chuột lang. Đồng thời vào năm 1927, Pirie trong
quá trình nghiên cứu nguyên nhân gây ra bệnh dịch đối với động vật ở Nam Phi đã
phát hiện ra một vi sinh vật mới và đặt tên là Listerella hepatolytica. Hai tác giả
Murray và Pirie cùng gửi chủng của họ tới NCTC (National Collection of Type
Cultures) ở London. Sự giống nhau về các đặc tính của hai chủng này dẫn đến kết
quả Murray và Pirie đã thống nhất gọi vi khuẩn này là Listerella monocytogenes.
Năm 1929, Nyfeldt đã lần đầu tiên phân lập loài vi khuẩn này từ người. Sau đó,
Pirie đã đề xuất đổi tên từ Listerella monocytogenes thành L. monocytogenes [51].
Về phân loại học, chi Listeria được chia làm sáu loài là L. monocytogenes, L.
ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, và L. gray. Tuy vậy, chỉ có L.
monocytogenes và L. ivanovii có khả năng gây bệnh [56]. Nhiều nghiên cứu cho
thấy, L. monocytogenes có khả năng gây bệnh cho cả người và động vật trong khi
đó L. ivanovii chủ yếu gây bệnh cho động vật và hiếm khi thấy chúng gây bệnh cho
người [43].
8
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Bảng 1. Vị trí phân loại Listeria
Giới
Bacteria
Ngành
Firmicutes
Lớp
Bacilli
Bộ
Bacilales
Họ
Listeriaceae
Chi
Listeria
I.1.1.1. Đặc hình thái
L. monocytogenes là trực khuẩn Gram dương, có khả năng di chuyển kích
thước dao động từ (0.4-0.5) x (0.5-2) µm. Các tế bào L. monocytogenes có thể tồn
tại độc lập hoặc tạo chuỗi ngắn. Thông thường các tế bào có dạng hình que dài
nhưng trong một số điều kiện nhất định chúng có thể ở dạng hình cầu với đường
kính trung bình khoảng 0.5 µm.
Loài vi khuẩn này không hình thành capsul và không sinh bào tử. Do có các
lông roi nên L. monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trường.
Khi nuôi cấy ở 20-250C trong tiêu bản giọt treo, vi khuẩn L. monocytogenes di động
xoay tròn thành đợt còn trong môi trường thạch mềm chúng di động tạo thành dạng
một chiếc ô cách bề mặt vài mm [51].
Hình 1.Vi khuẩn L. monocytogenes
9
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
I.1.1.2. Đặc tính sinh lý
L. monocytogenes là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, không sinh bào tử.
Chúng có khả năng sinh trưởng trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và
thậm chí trong điều kiện chân không. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của L.
monocytogenes phụ thuộc vào các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH, nồng độ
muối và các chất dinh dưỡng.
Người ta nhận thấy, L. monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện
nhiệt độ từ -4 tới 500C, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển
của chúng là 30-370C. Về lý thuyết, nhiệt độ càng thấp thì vi khuẩn sinh trưởng
càng chậm. Thời gian phát triển trung bình của L. monocytogenes ở 40C là 43 giờ, ở
100C là 6,6 giờ và ở 370C là 1,1 giờ. Nhiệt độ dưới 00C sẽ gây ức chế sự phát triển
của L. monocytogenes [51].
Nhìn chung, pH thích hợp cho sự phát triển của L. monocytogenes là 7,0 tuy
nhiên nó có thể phát triển với pH biến động từ 4,5 tới 7. Sự sinh trưởng ở pH thấp
còn phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy và loại axit có trong môi trường. Ở giá trị pH
thấp dưới 4,2, các tế bào L. monocytogenes có thể tồn tại nhưng không sinh trưởng.
Một số thí nghiệm cho thấy rằng nếu có khoảng 0,1% axit axetic, axit xitric và axit
lactic trong môi trường lỏng tryptose sẽ gây ức chế sự sinh trưởng của L.
monocytogenes và sự ức chế sẽ tăng lên khi tỉ lệ thuận với nhiệt độ nuôi cấy. Sự
sinh trưởng cũng sẽ bị suy giảm khi có mặt vi khuẩn lactic. Nguyên nhân chủ yếu là
do vi khuẩn lactic tạo môi trường pH thấp và trong một số trường hợp tạo ra các
chất có tính diệt khuẩn.
Hoạt độ nước (aw) thích hợp cho sự sinh trưởng và phát trển của L.
monocytogenes từ 0,97 trở lên. Hoạt độ nước tối thiểu cho sự sinh trưởng của hầu
hết các chủng là 0,93, tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trưởng trong điều kiện
aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại với một thời gian dài trong
tình trạng aw rất thấp.
L. monocytogenes có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối
khá cao 10-12%. Loài vi khuẩn này sinh trưởng mạnh trong môi trường có nồng độ
10
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
muối vừa phải (6,5%). Khả năng chịu được nồng độ muối cao của
L.
monocytogenes tăng khi nhiệt độ nuôi cấy càng thấp[51].
Farber và Hartwing đã tổng kết các điều kiện tại đó L. monocytogenes không
thể phát triển trong các loại thực phẩm ăn liền là:
pH 5,0-5,5 và aw < 0,95
pH <5,0 với bất kỳ aw nào
aw < 0,95 với bất kỳ pH nào
I.1.1.3. Đặc tính sinh hoá
L. monocytogenes là loài vi khuẩn có khả năng lên men nhiều loại đường và
không sinh khí H2S. Trong 6 loài Listeria chỉ có L. monocytogenes, L. ivanovii, và
L. seeligeri làm tan huyết trên môi trường thạch máu và cho kết quả thử nghiệm
CAMP dương tính. L. monocytogenes và L. seeligeri có phản ứng dương tính trong
thử nghiệm CAMP với Staphylococus aureus và âm tính với Rhodococus equi trong
khi L. ivanovii lại cho phản ứng ngược lại.
Hình 2. Kết quả thử nghệm CAMP của L. monocytogenes
11
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
L.monocytogene
L.ivanovii
L.innocua
L.welshimeri
L.seeligeri
L.grayi
Bảng 2. Đặc tính sinh hóa của các chủng trong chi Listeria
Khả năng di động
+
+
+
+
+
+
Catalase
+
+
+
+
+
+
Oxidase
-
-
-
-
-
-
Urea
-
-
-
-
-
-
NO2
-
-
-
-
-
-
β-haemolysis
+
+
-
-
+
-
Thử nghiệm CAMP (S. aureus)
+
-
-
-
+
-
Thử nghiệm CAMP (R. equi)
-
+
-
-
-
-
L-rhamnose
+
-
d
d
-
-
D-xylose
-
+
-
+
+
-
β-methyl-D-mannoside
+
-
+
+
-
+
Mannitol
-
-
-
-
-
+
Thủy phân Hippurate
+
+
+
+
+
-
Thủy phân Esculin
+
+
+
+
+
+
Gây bệnh cho chuột
+
+
-
-
-
-
Đặc tính
Khả năng tạo axit từ:
-: 90% số chủng cho phản ứng âm tính
+: 90% số chủng cho phản ứng âm tính
d: 11-89% số chủng cho phản ứng dương tính
I.1.1.4. Đặc tính huyết thanh học
Ngoài các đặc điểm sinh hóa, L. monocytogenes còn đặc trưng bởi kiểu huyết
thanh. Chi Listeria có các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu theo nhóm là kháng
nguyên tế bào (somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H. Nhóm kháng
nguyên O có 15 loại (I-XV) còn kháng nguyên H gồm 4 loại (A-D).
12
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Bảng 3.Sự kết hợp giữa kháng nguyên của soma (O) và flagellar (H) trong
các kiểu huyết thanh của Listeria
Dựa trên Seeliger & Jones (1986)[60]
Serotype
Kháng nguyên O
Kháng nguyên H
1/2a
I, II
A, B
1/2b
I, II
A, B, C
1/2c
I, II
B, D
3a
II, IV
A, B
3b
II, IV
A, B, C
3c
II, IV
B, D
4a
(V), VII, IX
A, B, C
4b
V, VI
A, B, C
4c
V, VII
A, B, C
4d
(V), VI, VIII
A, B, C
4e
V, VI, (VIII), (IX)
A, B, C
7
XII, XIII
A, B, C
5
(V), VI, (VIII), X
A, B, C
6a
V, (VI), (VII), (IX), XV
A, B, C
6b
(V), (VI), (VII), IX, X, XI
A, B, C
13
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Kiểu huyết thanh của các chủng thuộc Listeria được xác định dựa trên sự hiện
diện của các kháng nguyên O và H. Theo đó, L. monocytogenes có ít nhất 12 kiểu
huyết thanh là 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4ngày, 4e và 7 [33][60]. Theo
thống kê, người ta nhận thấy 3 kiểu huyết thanh 4b, 1/2a, 1/2b là nguyên nhân gây
ra khoảng 98% các vụ nhiễm độc ở người còn kiểu huyết thanh 4a và 4c hiếm khi
liên quan đến các trường hợp gây bệnh . Các chủng có kiểu huyết thanh 4b được
phân lập từ hầu hết các vụ bùng phát listeriosis và các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b
thường là nguyên nhân của các trường hợp nhiễm bệnh rải rác [28][67]. Các nghiên
cứu còn cho thấy, L. monocytogenes phân lập từ viêm não cừu thường có kiểu huyết
thanh 1/2b hoặc 4b, và những trường hợp người bị nhiễm trùng huyết hoặc sẩy thai
chủ yếu là do chủng có kiểu huyết thanh 1/2a gây ra [43].
I.1.1.5. Đặc điểm về cấu trúc phân tử và con đường xâm nhiễm
L. monocytogenes là một loại vi khuẩn gây bệnh nội bào nguy hiểm . Thông
qua con đường ăn uống chúng lây nhiễm vào cơ thể vật chủ do các thức ăn bị nhiễm
khuẩn. Quá trình xâm nhiễm và gây độc của L. monocytogenes gồm các bước: bám
vào tế bào chủ, xâm nhập vào tế bào chủ, phá huỷ không bào, di chuyển trong nội
bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác.
L. monocytogenes có khả năng kháng lại được với enzyme phân hủy protein
của vật chủ, chịu đựng được môi trường axit của dạ dày (pH 2,0), muối mật và khi
tấn công vào tế bào vật chủ chúng không gây triệu chứng viêm. Điều này có được
dự trên hoạt động của một số gen hưởng ứng gây stress (opuCA, lmo1421 và bsh)
và các protein có liên quan (Sleatoret và cộng sự, 2003). Để sống sót qua giai đoạn
ban đầu này, L. monocytogenes tuân thủ và tham gia như là một bộ phận của tế bào
chủ với sự giúp đỡ của một họ các protein bên mặt được gọi là các internalin [22].
Các internalin đáng chú ý nhất là InlA và InlB.
14
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Bảng 4. Các nhân tố quyết định tính độc của L. monocytogenes
Kích
Gene
Protein
thước
( bp)
Khối
Khối
Số axit
lượng
lượng
amin
phân
phân
tửa
tửb
Điểm
đẳng
điện
prfA
PrfA
705
235
27.1
27
plcB
PC-PLC
867
289
29
29
plcA
PI-PLC
95 1
317
36.3
34
10.1
mpl
Mpl
1533
5 10
57.4
67/35
6.6
lmsodh
Catalase
606
202
22.6
24
lmaAh
LmaA
5 10
170
18.0
21
4.2
inlCh
InlC
891
297
29.6
30
6.7
inlB
InlB
1890
630
71.1
65
10.1
inlA
InlA
2400
800
86.0
95
4.4
iap
P60
1452
484
50.7
60
10.0
hly
LLO
1617
529
58.6
58
4.2
clpc
ClpC
2478
826
91.0
1464
488
55.9
67
1917
639
67.0
92
cat
actA
ActA
7.3
7.8
a: khối lượng phân tử tính toán dựa trên dữ liệu trình tự nucleotit (kDa)
b : khối lượng phân tử tính toán dựa trên SDS- PAGE (kDa)
15
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Hình 3. Quá trình sinh trưởng và xâm nhiễm của L. monocytogenes
¾ InlA và InlB
Các protein bề mặt InlA (Internalin A) và InlB (Internalin B) được mã hóa bởi
gen inlA và inlB thuộc một họ gen ngoài nhiễm sắc thể, là những protein có vai trò
trong sự xâm nhập vào các tế bào biểu mô của vi khuẩn này.
InlA có 800 axit amin và có chứa hai vùng lặp lại: vùng LRR gồm 22 axit
amin lặp đi lặp lại liên tiếp 15 lần và một vùng gồm 70 axit amin lặp lại 2 lần. InlA
tương tác với E- cadherin để làm trung gian giúp L. monocytogenes xâm nhập vào
16
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
các tê bào biểu mô. Vùng đầu cacbon linh động của InlA có khả năng liên kết đồng
hóa trị với thành tế bào, khi vắng mặt vùng này hoặc vùng này bị loại bỏ, protein
InlA bị tách ra hoàn toàn và khả năng xâm nhiễm của một vài chủng bị suy giảm
đáng kể.
Protein InlB có 630 axit amin giúp nhận biết C1q-R (hoặc Met) tạo điều kiện
cho L. monocytogenes xâm nhập vào nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm cả tế bào
gan, nguyên bào sợi và một vài tế bào biểu mô (Vero, HeLa, HEp-2, CHO và tế bào
L2). InlB có các vùng lặp lại tương tự InlA và đầu cacbon của protein này bám với
bề mặt tế bào tạo thành 3 vùng lặp lại của các module GW (lặp lại bắt đầu bằng
dipeptide GW). Vùng tương tự LRR có mặt ở protein InlB cũng hoạt hóa
phosphoinositide kinase (PI), một lipid kinase cần cho sự xâm nhiễm gián tiếp của
InlB đối với các tế bào chủ. Sự xâm nhập vào tế bào chủ của L. monocytogenes
không bị các hoạt động của hệ miễn dịch phát hiện [61].
¾ P60
P60 cũng có vai trò trong sự xâm nhiễm và gen mã hóa protein này là iap.
Protein P60 có 484 axit amin. Trong quá trình nuôi cấy các L. monocytogenes dại,
P60 có mặt trên cả các bề mặt tế bào và cả trong canh trường. Protein này có khả
năng hoạt động tiêu hủy vi khuẩn và có thể là một enzyme thủy phân peptidoglycan
của màng tế bào vi khuẩn có trong vách tế bào. Vai trò chính xác của protein này
trong quá trình xâm nhiễm chưa được biết rõ, mặc dù người ta đã thấy chúng có vai
trò chính trong việc xâm nhập vào bên trong nguyên bào sợi và gen iap mã hóa cho
protein này cũng được coi như một gen đặc trưng cho L. monocytogenes.
¾ InlC
InlC (Internalin C) kích thước 30 kDa, có 12 vùng gắn LRR gấp thành một cấu
trúc giống như móng ngựa, trên bề mặt L. monocytogenes và tế bào vật chủ; được
điều hòa bởi PrfA. Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng L. monocytogenes
lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người. Vi khuẩn lớn lên
trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón
tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề. Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh
cho tế bào liền kề đó.
17
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Hình 4. Hình ảnh quá trình xâm nhiễm của L.monocytogenes
(Ảnh: Keith Ireton)
Trong hình, Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người sử
dụng một phần của khung tế bào gọi là các sợi actin, Vi khuấn Listeria có mày xanh
và sợi actin màu đỏ. Qua ảnh có thể nhận thấy rằng sợi actin hình thành một cấu
trúc dạng đuôi phía sau vi khuẩn. Những sợi actin này có tác dụng đẩy Vi khuẩn
Listeria qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người. Những mũi tên trong ảnh cho
thấy một con vi khuẩn đang chuyển động trong tế bào chất.
InlC đóng vai trò quan trọng trong quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi
khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh. Thông thường, màng tế bào hay lớp ngoài
cùng của những tế bào khỏe mạnh căng ra. Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có
tác dụng ngăn chặn vi khuẩn Listeria không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm
bệnh liền kề. Tuy nhiên, với sự có mặt của InIC làm giảm đi độ căng của màng tế
bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để
xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe manh liền kề dễ
dàng hơn.
¾ Listeriolysin O
Khi đã xâm nhập đưsợc vào bên trong một không bào của tế bào chủ, L.
monocytogenes có thể thoát ra khỏi không bào một cách nhanh chóng và chuyển
vào trong tế bào chất, ở đó chúng sẽ sinh trưởng và phát triển. Nhân tố chính liên
quan tới việc dung giải không bào là một protein có khả năng phá hủy không bào
tạo thành dạng lỗ thủng. Protein này có tên là listeriolysin O (LLO).
18
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
LLO là một độc tố thuộc nhóm có độc tố chứa nhóm thiol (-SH). Nhóm độc tố
này gồm có steptolysin O của Streptococus pyogenes, pneumolysin của
Streptococus pneumoniae và perfringolyssin của Clostridium perfringens. Các độc
tố này chỉ hoạt động trên các màng có cholesterol, tại đó cholesterol hoạt động như
một cơ quan thụ cảm của màng. Người ta cho rằng, sau khi LLO liên kết với bề mặt
của màng tế bào thứ hai để chuẩn bị lan truyền sang, protein này sẽ tạo thành các
oligomer dẫn đến tạo thành dạng lỗ thủng trên màng. Hoạt lực của các độc tố này
thường được xác định bằng hoạt lực phân giải của chúng đối với các tế bào hồng
cầu, vì thế chúng thường được gọi là các chất tan huyết (hemolysin). Khả năng làm
tan huyết là một đặc điểm quan trọng để phân biệt L. monocytogenes với các chủng
vi khuẩn khác theo phương pháp hóa sinh truyền thống.
LLO là một protein 58-kDa được mã hóa bởi gen hlyA, định vị trên nhóm gen
độc của L. monocytogenes. HlyA là một gen đặc trưng cho L. monocytogenes mà
nhiều nhà nghiên cứu đã dựa vào hlyA để phát hiện và phân biệt L. monocytogenes
với các vi sinh vật khác. LLO là thành viên duy nhất thuộc nhóm các độc tố chứa
nhóm (-SH) được sinh ra trong nội bào của vi khuẩn. Nó có hoạt lực mạnh nhất ở
pH 5,5 là pH trong không bào. Ở pH trung tính của tế bào chất chúng hoạt đông
kém hơn, do đó các tác động có hại của LLO đối với màng tế bào khi vi khuẩn L.
monocytogenes tồn tai tự do trong tế bào chất bị hạn chế. LLO có một vai trò quan
trọng giúp L. monocytogenes thoát khỏi không bào của tế bào chủ.
¾ Phospholipases C
Một nhân tố thứ hai có vai trò trong việc phá vỡ không bào để lan truyền vào
tế bào chất là các phospholipase C (PLC).
L. monocytogenes có hai phospholipase C (PLC) đó là phosphatidylinositolPLC (PI-PLC, một protein 33kD mã hóa bởi plcA) và phosphatidylcholine-PLC
(PC-PLC, 29 kD mã hóa bởi plcB). Các PLC không đặc trưng cho L.
monocytogenes nhưng lại là các nhân tố độc trong một vài mầm bệnh vi khuẩn như
B. cereus, S. aureus, C. perfringens và Pseudomonas aeruginosa. Các enzym này
phân cắt phospholipids thành glycerol và một nhóm phosphate và thường dẫn đến
làm thay đổi cấu trúc và thành phần của màng tế bào. PI-PLC có khả năng hoạt
19
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
động phối hợp với PC-PLC hỗ trợ LLO trong quá trình dung giải không bào sơ cấp.
Do đó, cả hai loại PLC có vai trò trong việc giải phóng L. monocytogenes thoát khỏi
không bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác [11].
¾ ActA
Sau khi đã thoát ra khỏi không bào, L. monocytogenes đi vào tế bào chất, ở
đây chúng trải qua quá trình phát triển và tăng sinh trong tế bào. Để biến đổi và
phân chia bên trong tế bào, L. monocytogenes cần một protein bề mặt khác là ActA.
ActA không đặc trưng cho L. monocytogenes mà là một protein cấu thành sợi lông
có 639 axit amin, khối lượng 67-kDa được tìm thấy ở tất cả các tế bào nhân thật.
Gen actA mã hóa protein bề mặt ActA, là một nhân tố duy nhất cần thiết cho khả
năng di chuyển của vi khuẩn.
Khi các đầu sợi actin đẩy vi khuẩn tới màng sinh chất tế bào chủ của chúng,
màng sẽ trở nên căng phồng và tạo thành vị trí nhô ra bên trong khoảng trống nội
bào. Khi vị trí màng có bám vi khuẩn của một tế nào đã nhô sang một tế bào bên
cạnh thì quá trình lan truyền sẽ diễn ra. Tuy nhiên, ở vị trí này tế bào vi khuẩn bị
bao quanh bởi một không bào màng kép, trong đó một màng là của tế bào cho và
màng còn lại của tế bào nhận vi khuẩn. Sự phá hủy màng kép này đòi hỏi phải có sự
tham gia của LLO, PI-PLC, PC-PLC và một metalloprotease mã hóa bởi gen mpl.
Sau khi phân giải màng kép này một vòng mới gồm di chuyển trong nội bào và lan
truyền của vi khuẩn lại được bắt đầu.
¾ PrfA
Toàn bộ các bước trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes được diễn ra
thông qua sự hoạt động của tám gen: hlyA, plcA, plcB, mpl, actA, prfA, inlA và inlB.
Sự biểu hiện của những gen này được điều khiển bởi cùng một điều kiện môi
trường, bị ức chế ở nhiệt độ thấp và được biểu hiện rõ ràng nhất ở 370C. Tuy nhiên
trong số tám gen trên có một gen là prfA mã hóa protein PrfA 27 kDa lại có vai trò
điều hòa các gen còn lại.
Sự hoạt động của các gen độc được bắt đầu bằng sự liên kết của chúng với một
trình tự đối xứng (palindromic) 14 bp bảo thủ (gọi là hộp PrfA) trên các vùng
promoter của PrfA. Người ta cũng cho rằng sự oligomer hóa của prfA cũng đóng vai
20
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
trò đối với sự hoạt động của các gen độc và nồng độ của prfA có thể quyết đinh khả
năng hoạt động của cac gen độc khác. Như vậy, sự biểu hiện của các gen độc tố
được điều khiển khá cao bởi prfA. Do đó, một số nhà nghiên cứu đã sử dụng prfA
như một gen đặc trưng cho L. monocytogenes.
¾ InlJ
InlJ là một trong những protein bề mặt của L. monocytogenes, một internalin
mới được xác định liên quan tới tính độc của vi khuẩn L. monocytogenes, không có
mặt tại các loài listeria khác. InlJ hỗ trợ khả năng bám dính lên tế bào vật chủ.
Nói tóm lại, L. monocytogenes là một mầm bệnh vi khuẩn có khả năng gây
bênh cho người và động vật. Khả năng xâm nhiễm và gây bệnh của chúng phụ
thuộc vào một số gen như hly, plcA, plcB, mpl, actA, prfA, inlA và inlB. Trong số
đó, sáu gen: hly, plcA, plcB, mpl, actA và prfA được tập hợp tại cùng một operon
trên nhiễm sắc thể, hai gen còn lại là inlA và inlB thuộc một họ đa gen và nằm tại
một operon khác. Ngoài ra, gen iap mã hoá protein p60 cũng tham gia trong quá
trình xâm nhiễm của L. monocytogenes.
I.1.2. Con đường lây nhiễm và bệnh do L. monocytogenes gây ra
I.1.2.1. Con đường lây nhiễm L. monocytogenes
L. monocytogenes là một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho cả người và
động vật. Chúng là một trong số ít các loài có phạm vi phân bố rộng. Có thể tìm
thấy loài này ở nhiều nơi như: đất, thức ăn gia súc, nước, thực vật, nhiều loại thực
phẩm và trong phân người và phân động vật. Những thực phẩm thường bị nhiễm L.
monocytogenes là: xà lách trộn, sữa thanh trùng, tiệt trùng, pho mát mềm, patê, thịt
lợn đóng gói và xúc xích. Do thời gian ủ bệnh lâu dài nên
việc xác định nguồn
thực phẩm gây dịch bệnh listeriosis thường rất khó khăn. Người ta cho rằng một số
chủng L. monocytogenes phân lập được ở trẻ sơ sinh bắt nguồn từ bệnh viện do sử
dụng những dụng cụ bị nhiễm khuẩn. Những người trồng rau và tiếp xúc gần gũi
với động vật bị nhiễm khuẩn cũng dễ mắc bệnh. Hình dưới đây mô tả các con
đường lây nhiễm của L. monocytogenes trong thực phẩm.
21
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
Hình 5. Sơ đồ phân bố L. monocytogenes trong chuỗi thực phẩm từ môi
trường tự nhiên
I.1.2.2. Bệnh do L. monocytogenes gây ra
L. monocytogenes là nguyên nhân gây ra một loại bệnh nguy hiểm lây nhiễm
thực phẩm mang tên listeriosis. Thuật ngữ listeriosis bao gồm một phổ rộng các
triệu chứng bệnh tương tự nhau của người và động vật. Viêm não là dạng phổ biến
nhất trong các loại bệnh do vi khuẩn này gây nên trên động vật nhai lại. Nhiễm
trùng máu hoặc viêm tạng cũng thường xảy ra ở các con vật còn non. Nhiễm trùng
cổ tử cung của các bào thai thông qua nhau thai cũng thường dẫn đến xảy thai ở cừu
và gia súc. Một số nghiên cứu cho thấy 20-30% bệnh nhân mắc bệnh tử vong hoặc
chết chu sinh. Các trường hợp mắc bệnh do L. monocytogenes thường xảy ra riêng
lẻ, nhưng cũng đã có một vài trận dịch bùng phát do nguồn thực phẩm bị nhiễm L.
monocytogenes..
Người ta nhận thấy có hai thể bệnh listeriosis là listeriosis khu trú ở ruột và
listeriosis xâm nhập và lan tỏa. Listeriosis khu trú ở ruột gây ảnh hưởng trực tiết tới
hệ thống tiêu hóa. Người bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm
thường như sốt và đau mỏi cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy. Listeriosis thể xâm
nhập và lan tỏa là sự nhiễm bệnh không chỉ tập trung tại đường tiêu hóa mà còn
22
Công nghệ sinh học 2008-2010
Luận văn thạc sĩ
Phan Thị Hương Trà
xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu hoặc lan sang cả hệ thần kinh
trung ương và não bộ gây viêm màng não. Cả hai tổn thương do nhiễm khuẩn này
đều có thể dẫn đến chết người. Listeriosis lan tỏa là một bệnh lý khá nguy hiểm, đòi
hỏi phải nhập viện ngay lập tức để được điều trị tích cực bằng các loại thuốc kháng
sinh.
Nhìn chung, listeriosis chủ yếu xảy ra đối với phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh và
những người trưởng thành có hệ miễn dịch bị tổn thương nhưng cũng có thể xảy ra
đối với những người bình thường. Thống kê ở Pháp năm 2008 cho thấy tần suất
mắc bệnh listeriosis là 4,8 ca/1.000.000 dân và có xu hướng ngày càng gia tăng [8].
Listeriosis xảy ra dễ dàng hơn gấp 300 lần ở người mắc hội chứng suy giảm miễn
dịch (AIDS) so với những người bình thường. Phụ nữ mang thai dễ bị nhiễm L.
monocytogenes có lẽ là do sự thay đổi về miễn dịch tại chỗ và toàn thân trong thai
kỳ.
Ở phụ nữ mang thai, hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn đều xảy ra vào 3
tháng cuối của thai kỳ. Đa số phụ nữ mang thai bị nhiễm L. monocytogenes có dấu
hiệu sốt, mệt mỏi và đau lưng, có khi thấy tiêu chảy, đau bụng, buồn nôn hoặc nôn
trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn. Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau thai dẫn đến
nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng đệm và màng ối, sinh non, hoặc bệnh khởi phát ở
giai đoạn sớm ở những trẻ mới sinh. Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sảy thai tự nhiên. Trẻ
sơ sinh tuần lễ đầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khó thở
những tổn thương ở da, hội chứng u hạt nhiễm khuẩn đặc trưng bởi những ổ áp-xe
rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác. Một số trẻ sơ
sinh phát bệnh ở giai đoạn muộn thường bị viêm màng não nhiều hơn so với trẻ
khởi phát ở giai đoạn sớm. Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai đoạn sớm thường đi
kèm với những biến chứng sản khoa như sinh non và viêm màng đệm và màng ối
[1].
Nhiễm khuẩn L. monocytogenes còn xảy ra ở những người suy giảm miễn
dịch, nhất là những người điều trị lâu dài bằng glucocorticoid, có khối u ác tính
hoặc bệnh lý máu ác tính, đái tháo đường, bệnh thận, bệnh gan và AIDS. Nhiễm
khuẩn huyết là biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất ở những người bị tổn thương hệ
23
Công nghệ sinh học 2008-2010
