Thiết kế vector nhị thế mang gen mã hóa hemagglutinin từ virus cúm gia cầm để chuyển hóa vào bèo tấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------

HÀ HỒNG HẠNH
ĐỀ TÀI:

THIẾT KẾ VECTOR NHỊ THẾ MANG GEN MÃ HÓA
HEMAGGLUTININ TỪ VIRUS CÚM GIA CẦM ĐỂ
CHUYỂN HÓA VÀO BÈO TẤM

LUẬN VĂN THẠC SỸ
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

HÀ NỘI – 2010


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần
Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh
học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nhánh. “Thiết kế vector tái tổ hợp mang
gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài. Nghiên cứu tạo giống bèo tấm
mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương
trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và các
thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Hà

Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN
Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, đặc biệt là PGS. TS. Nông Văn Hải, TS.
Lê Thị Thu Hiền – Trưởng ,phó phòng Công nghệ ADN Ứng dụng đã luôn
nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng như những góp ý quý báu
trong quá trình tôi thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 10 năm 2010
Tác giả luận văn

Hà Hồng Hạnh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Hà nội, tháng 10 năm 2010
Tác giả luận văn

Hà Hồng Hạnh


CÁC TỪ VIẾT TẮT
Amp
Bp
Car
ddNTP

DNA
dNTP
EDTA
EtOH
HA
Kan
Kb
kDa
LB
PCR
pJET
pBT
Rif
RNA
SDS
TAE
Tm
v/p

Ampicillin
Cặp base (base pair)
Carbenicillin
Dideoxynucleoside triphosphate
Deoxyribonucleotide acid
Deoxynucleoside triphosphate
Ethylenediaminetetraacetic acid
Cồn (Ethanol)
Hemagglutinin
Kanamycin
Kilo base (1kb=1000bp)

Kilo Dalton
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria Broth
Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase(Polymerase Chain
Reaction)
Vector pJET 1.2/blunt
Vector pBT
Rifamycin
Ribonucleic acid
Sodium Dodecyl Sulphate
Tris-Acetate-EDTA
Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature)
vòng/phút


TÊN VIẾT TẮT CÁC AMINO ACID
Tên viết tắt

Tên amino acid

Ba chữ

Một chữ

Ala

A

Alanine

Arg

R

Arginine

Asn

N

Asparagine

Asp

D

Aspartic acid (Aspartate)

Cys

C

Cysteine

Gln

Q

Glutamine

Glu

E

Glutamic acid

Gly

G

Glycine

His

H

Histidine

Ile

I

Isoleucine

Lys

K

Lysine

Met

M

Methionine

Phe

F

Phenylalanine

Pro

P

Proline

Ser

S

Serine

Thr

T

Threonine

Trp

W

Tryptophan

Tyr

Y

Tyrosine

Val

V

Valine


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Trang

Bảng 1.

Codon ƣu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và
virus H5N1

24

Bảng 2.

Các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng

30

Bảng 3.

Môi trƣờng nuôi cấy các chủng vi sinh vật

30

Bảng 4.

Các loại vector tách dòng và vector biểu hiện

31

Bảng 5.

Trình tự các cặp mồi nhân gen HA, HA1

31

Bảng 6.

Trình tự của các cặp mồi kiểm tra gen và nhân promoter

32

Bảng 7.

Trình tự các cặp mồi cải biến đoạn gen HA1

34

Bảng 8.

Các vị trí đã đƣợc cải biến trên gen HA1

56


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Trang

Hình 1.

Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) của virus cúm

5

Hình 2.

Cấu trúc protein Hemagglutinin

12

Hình 3.

Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid

16

Hình 4.

Sơ đồ vector nhị thể

18

Hình 5.

Cấu trúc hệ thống điều khiển gen Ubiquitin ở thực vật

20

Hình 6.

Sơ đồ minh họa phƣơng pháp Megaprimer

27

Hình 7.

Sơ đồ thí nghiệm thiết kế các vector mang gen HA

33

Hình 8.

Sơ đồ minh họa các vị trí cải biến bằng phƣơng pháp Megaprimer

35

trên gen HA1
Sơ đồ cải biến gen HA1 theo phƣơng pháp Quickchange

36

Hình 10. Sơ đồ cải biến gen HA1 theo phƣơng pháp kéo dài các đoạn gối lên
nhau

37

Hình 11. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA

46

Hình 12. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA1

47

Hình 13. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD2

48

Hình 14. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD5

50

Hình 15. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD3

51

Hình 16. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD4

52

Hình 17. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí M2

54

Hình 18. So sánh trình tự nucleotide và amino acid giữa gen HA1 và HA1M

55

Hình 9.


Hình 19. Sơ đồ thiết kế vector pPAM mang gen HA1

57

Hình 20. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA1

59

Hình 21. Hình ảnh điện di sản phẩm pPAM-HA, pPAM- HA1M

60

Hình 22. Hình ảnh điện di sản phẩm SpUbiquitin

61

Hình 23. Hình ảnh điện di plasmid pPAM-Sp-HA1

62

Hình 24. Hình ảnh điện di plasmid pPAM-Sp-HA1M

63

Hình 25. Sơ đồ thiết kế vector pCAMBI-HA1 và pCAMBIA-Sp-HA1

65

Hình 26. Sơ đồ cấu trúc SHA1N trong plasmid pJET-SHA1N

68

Hình 27. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt của pJET-SHA1N, pJET-SHA1MN

68

Hình 28. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt của pCAMBIA-HA1, pCAMBIAHA1M

70

Hình 29. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCAMBIA-Sp-HA1, pCAMBIA-SpHA1M

73


MỞ ĐẦU
Cúm gà (avian influenza-AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loại gia
cầm, thủy cầm, các loại chim bị gây ra bởi virus cúm týp A-một trong 4 nhóm virus
thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao và gây
bệnh trên ngƣời trong những năm 1996-2008 với những biến đổi sâu sắc, không những
gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết ngƣời. Đặc biệt, từ năm 2003 virus
H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng
chục quốc gia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam [8].
Trong hơn mƣời năm qua, trên thế giới đã có hàng trăm triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây
thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế.
Một trong những kháng nguyên bề mặt quan trọng nhất của cúm A/H5N1 là
Hemagglutinin (HA). Protein HA là một glycoprotein thuộc protein màng týp I
(lectin), có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm. Kháng thể đặc hiệu
với HA có thể phong tỏa sự ngƣng kết đó [72]. Protein HA còn là kháng nguyên chủ
chốt của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với từng
týp HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, là đích bảo vệ miễn dịch học nhằm
ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng
cúm hiện nay [51], [59], [70].
Đứng trƣớc nguy cơ về một đại dịch cúm lớn thì việc phòng bệnh bằng vaccine
là một chiến lƣợc hữu hiệu và cấp thiết nhất. Hiện nay, có một số vaccine khác nhau
đƣợc sản xuất, nhƣng các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những
loại vaccine mới có tính ƣu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản và phân phối hơn, an toàn và

hiệu quả hơn. Vaccine thực vật là một loại vaccine dƣới đơn vị hay protein tái tổ hợp,
đƣa vào cơ thể theo đƣờng tiêu hóa, sản xuất trong hệ thống thực vật [20]. Vaccin thực
vật hạn chế đƣợc sự phá hủy và ổn định bền vững trong cơ thể, dễ dàng sản xuất khối
lƣợng lớn và có độ an toàn cao, dễ bảo quản, sử dụng thuận tiện và có hiệu quả kinh tế.
Vaccine ăn đƣợc có khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể hiệu quả nhƣ các
loại vaccine tiêm [22], [45]. Nhƣ vậy, công nghệ gen thực vật đã mở ra một hƣớng chế
tạo vaccine mới với các vấn đề cấp thiết đƣợc đặt ra: thiết kế vector hữu hiệu mang

1


gen kháng nguyên của virus, tìm đối tƣợng thực vật để chuyển gen tạo lƣợng protein
tái tổ hợp lớn…
Nhằm nâng cao khả năng biểu hiện các gen tái tổ hợp, nghiên cứu phân lập và
sử dụng các đoạn điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ cây trồng là một trong những
vấn đề nghiên cứu đƣợc đặc biệt chú ý trong công nghệ gen thực vật. Trong các loại
thực vật, bèo tấm là thực vật một lá mầm, đối tƣợng nghiên cứu tƣơng đối mới, có hàm
lƣợng protein và polysaccharide cao. Với đặc thù cấu trúc và quá trình trao đổi chất,
bèo tấm đƣợc sử dụng trong công nghệ gen thực vật nhƣ nhà máy sản xuất protein tái
tổ hợp.
Hiện nay, một số nhóm trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu thiết kế vector
biểu hiện kháng nguyên HA (H5N1) của vịt, ngan để chuyển vào đậu tƣơng. Tuy
nhiên, việc tối ƣu các codon trong gen HA của virus cúm gà để biểu hiện trong thực
vật, cũng nhƣ thiết kế vector mang promoter đặc thù để phục vụ chuyển gen vào bèo
tấm còn chƣa đƣợc nghiên cứu. Với mục đích tạo cơ sở ban đầu cho việc sản xuất
vaccine cúm A/H5N1 ăn đƣợc từ bèo tấm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Thiết kế vector nhị thể mang gen mã hóa Hemagglutinin từ virus cúm gia cầm
để chuyển vào bèo tấm” với các nội dung sau:
1. Cải biến 4-5 vùng trên gen mã hóa Hemagglutinin từ virus cúm gà HG4 (mã số
EF051513 từ chủng A/chicken/Vietnam/HG4/2005 (H5N1) sử dụng các phƣơng

pháp đột biến điểm Megaprimer, Quickchange, kéo dài các đoạn gối lên nhau.
2. Thiết kế vector nhị thể pPAM mang các cấu trúc gen mã hóa Hemagglutinin (chƣa
cải biến, đã cải biến) với promoter CAMV35S hoặc promoter của gen Ubiquitin từ
giống bèo tấm Spirodela polyrrhiza để chuyển gen trực tiếp vào bèo tấm.
3. Thiết kế vector nhị thể pCAMBIA1300 chứa gen mã hóa Hemagglutinin (chƣa cải
biến, đã cải biến) với promoter CAMV35S hoặc promoter của gen Ubiquitin từ
giống bèo tấm Spirodela polyrrhiza) và biến nạp vào Agrobacterium để chuyển vào
bèo tấm thông qua vi khuẩn Agrobacterium.

2


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Gen Hemagglutinin (HA) của virus cúm A/H5N1
1.1.1. Virus cúm A/H5N1
1.1.1.1. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1
Cúm gà (avian influenza-AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loại gia
cầm, thủy cầm, các loại chim bị gây ra bởi virus cúm týp A, một trong 4 nhóm virus
thuộc họ Orthomyxoviridae. Trong họ này có 4 nhóm: virus cúm týp A (influenza A
virus); virus cúm týp B (influenza B virus); virus cúm týp C (influenza C virus) và
nhóm Thogotovirus. Chỉ có virus cúm A và B là gây dịch cúm nguy hiểm, còn virus
cúm C chỉ gây cảm cúm thông thƣờng. Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng
nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus cúm C là
Hemagglutinin esterase fusion (HEF) và ở Thogotovirus là glycoprotein (GP) [104].
Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao và gây bệnh trên ngƣời trong những
năm 1996-2008. Chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch

trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái xuất tại Quảng Đông
(1996) và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà
còn thích ứng và gây chết ngƣời bệnh. Có thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến
nay là cúm A hiện đại mới xuất hiện. Virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại
Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia của nhiều châu lục trên
thế giới, trong đó có Việt Nam. Cơ bản về cấu trúc virus cúm vẫn nhƣ trƣớc đó, nhƣng
xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch
và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trƣng hơn và khác với những biến chủng H5N1
trƣớc đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc
vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đầu lan sang một số nƣớc vùng
Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập vào các nƣớc vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ
Kỳ, các nƣớc Bắc-Trung Phi, đặc biệt Ai Cập và Nigeria là các nƣớc chịu thiệt hại
nhiều nhất [54], [88], [105]. Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, tái phát vào

3


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

năm 2004, 2005. Mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống, cho đến nay vẫn
còn những ổ dịch nhỏ [108].
Trong hơn mƣời năm qua, trên thế giới đã có hàng trăm triệu gia cầm bị tiêu
hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế. Riêng năm 2003, Việt Nam
phải tiêu hủy 43,9 triệu con và hàng năm vẫn phải tiêu hủy gia cầm do những ổ dịch
lớn nhỏ. Đặc biệt, số ngƣời nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1, mỗi năm một
cao, theo thống kê số ngƣời bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế
giới (WHO), từ năm 2003 đến 5/2010, đã có tới 489 trƣờng hợp mắc cúm A/H5N1,
trong đó, 289 trƣờng hợp đã tử vong, chiếm 59%. Việt Nam và Indonesia là hai quốc

gia có số ngƣời nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên thế giới. Trong
số 16 nƣớc có ngƣời chết do cúm gia cầm, Indonesia và Việt Nam đƣợc WHO xác
định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có đƣợc các điều kiện thuận lợi để
tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus cúm ở ngƣời [115].
1.1.1.2. Cấu trúc và đặc điểm của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A có dạng hình cầu hoặc hình cầu kéo dài với kích thƣớc từ 80120nm. Hạt virus (virion) có khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da. Chúng chứa
khoảng 0,8 – 1,1% RNA, 70 – 75% protein, 20 – 24% lipid và 5 – 8% carbohydrate.
Hạt virus có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là
RNA sợi đơn âm.
Vỏ virus với bản chất là protein bao gồm các protein đƣợc glycosyl hóa
(glycoprotein) và protein dạng trần không đƣợc glycosyl hóa. Protein bề mặt có cấu
trúc từ glycoprotein bao gồm: protein gây ngƣng kết hồng cầu HA (Hemagglutinin),
protein enzyme cắt thụ thể NA (Neuraminidase), đó là những gai mấu có độ dài
10−14nm, đƣờng kính 4−6nm. Phân bố không đồng đều, tỉ lệ khoảng: 1NA/4HA. Nằm
trên vỏ còn có protein đệm MA (matrix): MA1 nằm trong vỏ virus, còn MA2 nằm
ngay dƣới lớp vỏ virus. Hệ gen virus chứa duy nhất RNA một sợi, có cấu trúc là sợi
đơn âm, ký hiệu là ss(-)RNA (negative single stranded RNA). Sợi RNA có độ dài
13500 nucleotide không liên tục mà phân chia thành 8 phân đoạn, có cấu trúc riêng

4


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

biệt, mỗi phân đoạn là một gen mã hóa cho một loại protein. Trong đó phân đoạn M
mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS (non-structural proteins) mã hóa
cho 2 protein là NS1 và NS2, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2
[33], [55] (Hình 1). Nucleoprotein và 3 polymerase protein tƣơng tác với một trong 8

đoạn RNA để tạo thành phức ribonucleoprotein (RNP) [55]. Virus cúm A nhạy cảm
với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa,
với formaldehyde và với các tia phóng xạ [40].

Hình 1: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) của virus cúm [109], [112]
A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A duới kính hiển vi điện tử
B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên
HA; Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức
hợp enzyme polymerase của virus)
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Các phân týp
là kết quả tái tổ hợp của 16 HA (H1-H16) và 9 NA (N1-N9). Các týp này gây nhiễm
cho hầu hết các loài sinh vật bao gồm loài ngƣời, các loài lông vũ (gà, thủy cầm), lợn,
ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá voi... Chúng thích ứng hầu hết với mọi loại vật chủ
và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những dịch cúm kinh hoàng trong lịch
sử ở động vật và ngƣời. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để
tái tổ hợp tạo biến thể mới lây truyền trong quần thể sinh vật, cúm A là nhóm virus
nguy hiểm truyền bệnh từ động vật sang ngƣời (zoonotic infections). H5N1 đƣợc coi
là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất cho các loài động vật và ngƣời, có nhiều

5


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

chứng minh khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua
H9N2 (trên lợn) [44].
Về danh pháp, để ký hiệu và lƣu trữ một cách có khoa học và đầy đủ, các chủng
virus cúm sau khi phân lập phải đƣợc ký hiệu theo danh pháp quy định với trật tự nhƣ

sau: tên týp/ loài bị nhiễm/ nơi phân lập/ số hiệu chủng/ thời gian phân lập/loại hình
týp

(HA

(H)

và

NA

(N)).

Ví

dụ,

virus

cúm

có

ký

hiệu

A/chicken/Vietnam/HG4/2005(H5N1) có thông tin về danh pháp là Cúm nhóm A,
loài nhiễm là gà (chicken), nơi phân lập là Việt Nam, số hiệu chủng là HG4 − Hậu
Giang 4, thời gian phân lập là năm 2005, týp là H5N1.

1.1.1.3. Độc lực của virus cúm A/H5N1
HPAI (Highly pathogenic avian influenza) − loại virus có độc lực cao thƣờng
gây tổn thƣơng nhiều cơ quan nội tạng, gây chết 100% gia cầm trong vòng 48 giờ sau
nhiễm. Loại virus HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trên môi
trƣờng nuôi cấy không có trypsin. Từ năm 1959 đến 2001, trên thế giới đã có 19 chủng
cúm A của loài lông vũ đƣợc phân lập có độc lực cao thuộc loại HPAI, trong đó, một
số đã lây nhiễm và gây thích ứng bệnh trên ngƣời [32].
LPAI (Low pathogenic avian influenza) − loại virus có độc lực thấp thƣờng
nhiễm ở gia cầm, nhƣng không hoặc có rất ít biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết cũng rất
thấp. Tuy nhiên, sự bội nhiễm vi khuẩn hoặc các bệnh khác cùng với cúm gà làm cho
LPAI trở nên có độc lực cao hơn và gây bệnh ác liệt hơn. Bằng chứng cho thấy các
chủng có độc lực thấp trong quá trình lƣu trú trong thiên nhiên và đàn gia cầm sẽ đột
biến nội gen hoặc biến đổi tái tổ hợp trở thành các chủng HPAI. Cho đến nay, chỉ có
hai biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 đƣợc coi là loại có độc lực
cao HPAI gây bệnh ở gia cầm, đã tạo nên tái tổ hợp týp H7N7 gây đại dịch cúm gà ở
châu Âu và H5N1 ở châu Á những năm 1997-2004. Tuy nhiên, không phải tất cả các
chủng chứa gen H5 và H7 đều gây bệnh và chính bản thân H7N7 hoặc H5N1 cũng tồn
tại nhiều biến chủng vô độc hoặc độc lực thấp [32].

6


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

1.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1, ứng dụng
chuyển gen H5N1 vào cây trồng
1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine đƣợc coi là biện pháp có tính chiến lƣợc,

nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [88]. Đối với dịch cúm trên ngƣời,
nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm đƣợc bệnh ở gia cầm,
mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang ngƣời. Nhiều
công trình nghiên cứu về gen H5N1 và phát triển công nghệ cũng nhƣ vaccine gây
miễn dịch cho gia cầm đƣợc xúc tiến mạnh mẽ. Kháng thể đặc hiệu có thể đƣợc cơ thể
sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng
HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đƣơng nhiễm, góp phần vô hiệu hóa
virus cúm đúng đối tƣợng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhƣng
trƣớc hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình
trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền
thống và vaccine thế hệ mới [26], [88]. Virus cúm H5N1 rất độc có thể giết chết ngay
phôi gà (nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới cấy virus vào phôi. Vì
vậy loại bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản xuất vaccine.


Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng.

Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại vaccine đƣợc sản
xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống nhƣ chủng gây bệnh trên thực địa
[89]. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là vaccine sử dụng các chủng
virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhƣng có kháng nguyên
NA dị chủng.


Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine đƣợc sản xuất

dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang đƣợc nghiên cứu và đƣa vào sử
dụng phổ biến, bao gồm:
+ Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia
cầm làm vector tái tổ hợp mang gen H5 và N1 phòng chống virus týp H5N1 và H7N1

7


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

[78]. Ví dụ, Hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5
từ chủng A/Turkey/Ierland/83 (H5N2), sử dụng đƣợc cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.
+ Vaccine dƣới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách
chiết làm vaccine [77].


Vaccine nhƣợc độc virus cúm nhân tạo: đƣợc sản xuất bằng kỹ thuật di

truyền ngƣợc, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các
gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã đƣợc biến đổi bằng kỹ thuật gen [67], [91].
Có 3 loại vaccine đã đƣợc Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và
khuyến cáo đƣa vào chƣơng trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là
NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC).


Vaccine ăn đƣợc ở thực vật (plant edible vaccine): Do hiện tƣợng kháng

kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng các vi sinh vật mới, ngoài vaccine
tiêm chủng ra, từ năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới vaccine đƣờng miệng
(oral vaccine) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn đƣợc ở thực
vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới trong
công nghệ sinh học bao gồm cả lĩnh vực nghiên cứu sản xuất vaccine và nghiên cứu

cây trồng chuyển gen [64].
Vaccine ăn đƣợc ở thực vật là vaccine tiểu phần protein đƣợc sản xuất dựa trên
hệ thống thực vật để thu đƣợc protein làm kháng nguyên mong muốn. Chúng tác động
vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine
này bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đƣờng tiêu hóa mà không bị phân hủy [2].
Sản xuất vaccine ăn đƣợc có thể thực hiện theo quy trình sau đây:
-

Lựa chọn gen cần đƣợc biểu hiện và đƣa vào vector thích hợp;

-

Lựa chọn đối tƣợng thực vật thích hợp để chuyển gen;

-

Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các
phƣơng pháp chuyển gen khác nhau;

-

Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn đƣợc của thực
vật;

-

Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật;

8

Chương 1: Tổng quan

-

Hà Hồng Hạnh

Sử dụng vaccine đã đƣợc thử nghiệm thành công bằng cách ăn tƣơi hoặc dƣới
dạng thức ăn đã chế biến.

Các thành tựu về công nghệ chuyển gen ở thực vật trong hƣớng nghiên cứu vaccine
đƣờng miệng: nghiên cứu vaccine virus viêm gan B biểu hiện trong chuối [63], rau
diếp [69], vaccine chống bệnh đƣờng ruột [27], vaccine chống bệnh SARS-CoA ở
nhiều loài thực vật [66], vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng phấn hoa [90]. Tuy nhiên,
nghiên cứu về sử dụng H5N1 làm vaccine ăn đƣợc còn rất hạn chế.
1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam
Từ năm 2006 nhờ áp dụng chƣơng trình tiêm chủng mở rộng trên toàn quốc đã hạn
chế đáng kể sự lây lan dịch bệnh cúm gà. Nhu cầu sản xuất vaccine trở nên cấp bách
hơn bao giờ hết.
Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phƣơng pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A
với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng nhƣ phân biệt các phân týp HA và
NA đã đƣợc các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức
thế giới. Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ Sinh học kết hợp với Viện
Thú y, Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ƣơng, Công ty Thuốc thú y Trung ƣơng II, Trung
tâm kiểm nghiệm thuốc thú y trung ƣơng, thực hiện nghiên cứu có đƣợc vaccine sản
xuất từ chủng NIBRG-14 [1]. Đây là chủng vaccine đƣợc tạo ra bằng công nghệ di
truyền ngƣợc tại Viện Tiêu chuẩn và kiểm định sinh học quốc gia (Vƣơng quốc Anh),
thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi và vaccine tạo ra dƣới dạng vô hoạt nhũ đầu. Kết
quả là đã xây dựng đƣợc các quy trình sản xuất giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm
và bảo quản vaccine cúm A/H5N1, kiểm nghiệm miễn dịch đạt chất lƣợng bằng

phƣơng pháp huyết thanh học và thử thách cƣờng độc. Ngoài ra, một số đề tài khác
nhƣ nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền kháng
nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus. Và đặc biệt nghiên cứu các gen HA và
các biến chủng H5N1 làm cơ sở để chế tạo vaccine đƣợc tiến hành trên một số Viện
nghiên cứu ở nƣớc ta và trên thế giới [1], [62] [12].

9


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

1.1.3. Hemagglutinin
1.1.3.1. Gen Hemagglutinin
Gen HA có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm: A/H1N1 có độ dài
1778 bp, ở A/H9N1 – 1714 bp, còn ở A/H5N1 từ 1704 đến 1707 bp. Gen HA mã hóa
cho protein kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu có độ dài 568−569 amino acid. Gen HA
đƣợc phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha, chủng H5N1 (1996) ở Quảng
Đông, Trung Quốc nhƣ các chủng nguyên thủy. Nhiều gen HA phân lập từ các chủng
trong giai đoạn 1997-2003. Đó là các biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao. Hệ gen
của virus biến đổi nhanh, trong đó, những biến đổi gen HA thƣờng xảy ra nhiều và sử
dụng để phân định nhóm kháng nguyên, phân týp và phân tích mối quan hệ tiến hóa.
Các chủng từ 1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhƣng các chủng từ 2003
-2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên của A/H5N1. Cúm A/H5N1 có 12
genotype, những dạng cũ (A, B, C, D) trƣớc 2002 không còn tồn tại, mà tồn tại 8 dạng
mới (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+). Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ 2004
đến 2006 đều thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở genotype Z, nhƣng phân
thành 2 nhóm: nhóm N – miền Bắc và nhóm S- miền Nam thuộc nhóm tiến hóa (clade)
1. Năm 2007 đã phát hiện thêm dƣới dòng Phúc Kiến thuộc clade 2.3.4 [8]. Gen HA

đƣợc phân lập từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang) có 9 vị trí nucleotide
sai khác hoàn toàn so với các chủng phân lập ở Việt Nam và Đông Nam Á, đƣợc xác
định thuộc nhóm dƣới dòng Quảng Đông và clade 1 [12].
1.1.3.2. Protein Hemagglutinin
Hemagglutinin (HA) có thể đƣợc coi là một loại protein vừa quyết định tính
kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA là một
glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu gà
trong ống nghiệm (in vitro). Kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngƣng kết
đó, đƣợc gọi là kháng thể ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI-Hemagglutinin Inhibitory
andibody). Có 16 phân týp HA đã đƣợc phát hiện (H1-H16), ba phân týp (H1, H2 và
H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở ngƣời liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch

10


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

sử [72]. Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá
trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ [18], [97].
Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130Å, thƣờng ở dạng kết 3 (trimer),
mỗi đơn phân (monomer) đƣợc tạo thành từ chuỗi HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa).
Các đơn phân liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi
tổng hợp đã đƣợc glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là chuỗi
HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu đƣợc tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn với
thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [23], [97]. Sự kết hợp của HA
với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu
quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải
phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết

hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế
bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm
nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [96], [100]. Vị trí amino acid
226 (aa226) của chuỗi HA1 đƣợc xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ
thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lƣu hành trong tự nhiên vị trí
này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2.3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với
nhóm hydroxyt (4-OH) của galactose ở góc quay α-2.3) của tế bào biểu mô đƣờng hô
hấp của chim và cúm gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Ngoài ra, một số vị
trí amino acid khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR
cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề
mặt màng tế bào chủ [59]. Đặc biệt, một số chủng cƣờng độc A/H5Nx; A/H7Nx lƣu
hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên ngƣời, khi chúng có tải lƣợng cao trong đƣờng
hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) [17], [53], [100].
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng nhƣ
các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng đƣợc coi là chỉ
thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA [59]. Protein HA còn là
kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng
miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng týp HA và tham gia vào phản ứng trung hòa

11


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

virus, đƣợc coi là protein vừa quyết định độc lực của virus, là đích bảo vệ miễn dịch
học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các
vaccine phòng cúm hiện nay [51], [59], [70].
Hemagglutinin là polypeptide gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 (hình 2) nối với nhau

bằng một đoạn oligonucleotide ngắn, thuộc loại hình motif riêng biệt, đặc trƣng cho
các týp H (H1-H16) trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng [95]. Chuỗi nối này
cũng chính là điểm cắt của protease tạo nên 2 phân đoạn HA rời nhau. Motif của chuỗi
nối oligonucleotide này chứa một số amino acid mang tính kiềm làm khung, thay đổi
đặc hiệu theo từng loại hình subtýp H và sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết
định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới [49].

Hình 2: Cấu trúc protein Hemagglutinin [112, 113]
A: Dải biểu đồ protein bề mặt Hemagglutin của virus cúm H5 giới hạn bởi
kháng thể F10 (màu đỏ). Hai chuỗi của HA là HA1 (màu vàng) và HA2 (màu xanh)
B: Protein Hemagglutinin đại diện từ 1918 virus cúm. Vị trí bám receptor là nơi
protein cúm tấn công vào phổi con ngƣời
Đối với týp H5 cƣờng độc, loại H5N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là
TPQRERRKKR, loại H5N2: motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRKRKTR, trong
khi đó, đối với subtýp H5 vô độc (hoặc nhƣợc độc thấp), tất cả các loại H5N1, H5N2,

12


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

H5N3, H4N6, và H1N1, motif chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR [50], [106]. Đối
với chủng cƣờng độc H7, motif này là P−K−G−R [50]. Đã có nhiều nghiên cứu chứng
minh, mặc dù trên bề mặt virus có hai kháng nguyên glycoprotein là HA và NA nhƣng
chỉ có HA có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ [29], [56]. Để chứng minh có
điều đó, gần đây nhất, các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo vaccine tái tổ
hợp bằng cách đƣa các đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA hoặc tiểu đơn vị của kháng
nguyên HA (HA1, HA2) của chủng H5N1 vào biểu hiện trong adenovirus. Điều đáng

chú ý là kháng nguyên HA1 và HA tái tổ hợp có mức bảo hộ 100% đối với gà thực
nghiệm, trong đó kháng nguyên HA2 có mức độ bảo hộ 60%.
1.1.3.3. Hemagglutinin với nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật
Vấn đề biểu hiện và sản xuất kháng nguyên HA ở lƣợng đáng kể đƣợc quan tâm
nghiên cứu từ năm 2002 trở lại đây. Nhiều loại protein, enzyme và kháng nguyên đã
biểu hiện thành công trong tế bào vi sinh vật và đã đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế
cuộc sống nhƣ dùng làm thuốc, thực phẩm chức năng… Kháng nguyên HA cũng nhƣ
các tiểu phần HA1, HA2 của một số virus cúm A nhƣ H1N1, H3N2, H7N9 và H5N1
đã đƣợc nghiên cứu biểu hiện trong tế bào vi sinh vật nhƣ E.coli, Baculorvirus, nấm
men P. pastoris và S. cerevisiiae [103]. Việc biểu hiện gen này trong thực vật đang
đƣợc tiến hành nghiên cứu, tuy nhiên, có những kết quả trái ngƣợc nhau đƣợc công bố.
Nghiên cứu của Bruchmüller và cộng sự, 2007, cho thấy HA1 đã cải biến mã codon
thích hợp với thực vật đƣợc biểu hiện cao trong cây đại mạch dƣới sự điều khiển của
promoter gliadin lúa mỳ. Phân tích bằng Western blot khẳng định sự biểu hiện của
HA1 trong hạt của 84 dòng chuyển gen HA1 [24]. Những nghiên cứu của D’Aoust và
cộng sự, 2008, đã biểu hiện đƣợc gen HA từ virus H5N1 (A/Indonesia/5/05) và H1N1
(A/New Caledonia/20/99) tạm thời trong cây thuốc lá Nicotiana bethamiana. Biểu
hiện lƣợng lớn HA tích tụ trong dạng hạt (virus like particles) vùng giữa các tế bào
(apoplastic) ở cây thuốc lá cho hiệu suất đến 50mg/kg [35], [81]. Spitsin và các cộng
sự, 2009, thử biểu hiện HA, HA1 từ chủng A/Vienam/1203/2004 vào thuốc lá nhƣng
kết quả lai miễn dịch cho thấy thí nghiệm chƣa thành công [86]. Trong khi đó, Shoji
và các cộng sự, 2009, đã biểu hiện thành công gen HA từ chủng A/Indonesia/05/05 sử

13


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

dụng vector pGRD4 [85]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đã thành
công trên cây thuốc lá và đang đƣợc tiến hành trên đối tƣợng thực vật nhƣ cây đậu
tƣơng [7], [11].
Tạo vaccine thực vật là một hƣớng đi cần thiết nhƣng cho đến nay vẫn đang còn
nghiên cứu, chƣa có vaccine thực vật mang gen HA đƣợc đƣa vào sử dụng.
1.2. Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng
1.2.1. Chuyển gen vào thực vật
Một trong những mục đích chủ yếu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công
nghệ DNA tái tổ hợp là tạo ra các sản phẩm chuyển gen có giá trị thƣơng mại cao. Để
có thể tiến hành ứng dụng công nghệ sinh học trong quy mô sản xuất lớn, một đòi hỏi
cấp thiết là cần phải có hệ thống tái sinh tốt với khả năng sinh trƣởng và phát triển
nhanh, ổn định [19]. Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử
dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm: vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực
vật, động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào… So với các
hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp.
Trƣớc hết, phải kể đến khả năng glycosit hóa các protein, bởi các glycoprotein là
nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch. Lợi thế thứ hai là
protein tạo thành từ thực vật tƣơng đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật
bậc cao. Thứ ba là lợi thế về giá thành: thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi
phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào.
1.2.2. Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen
Trong các loài thực vật đƣợc nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, các loài thuộc
họ bèo tấm đang đƣợc đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn và khả năng tăng sinh khối
nhanh. Bèo tấm có tốc độ sinh sản rất nhanh, nhân đôi trọng lƣợng trong vòng 24 – 72
giờ. Một số giống bèo tấm có tốc độ tăng sinh khối cao hơn hẳn so với các loài thực
vật khác. Đối với cây ngô, từ 1 g chất khô ban đầu, sau một tuần không thể tạo ra
lƣợng chất khô lớn hơn 2,3 kg. Trong khi đó một số loài bèo tấm lại có thể tạo ra 64 g

14

Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

chất khô từ 1 g chất khô ban đầu sau 1 tuần [65]. Mặt khác hàm lƣợng các chất dinh
dƣỡng của bèo tấm rất cao với sự đa dạng về thành phần các vitamin (A, B1, B2…),
các amino acid không thay thế. Riêng protein của bèo tấm có thể đạt từ 6,8 – 45 %
trọng lƣợng khô tùy theo loài [65], tức là tỷ lệ tƣơng đƣơng với đậu tƣơng. Theo tính
toán, chỉ cần 1−3 % tổng số protein nói trên có hoạt tính sinh học quan tâm là đủ để
bèo tấm đƣợc coi là hệ thống tái sinh hiệu quả. Do những ƣu điểm đó, trong những
năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen để sản xuất các hoạt chất sinh học từ
bèo tấm. Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các loài Lemna để chuyển các
gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt chất sinh học khác nhau, trong đó, có
vacine. Các loài thuộc họ bèo tấm còn có khả năng chuyển gen sử dụng nguyên cây
mà không cần nuôi cấy mô và vật liệu vô trùng. Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp
đã tài trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng bèo
tấm trong công nghệ sinh học [110].
1.2.3. Agrobacterium và phƣơng pháp chuyển gen thực vật
1.2.3.1. Agrobacterium và hiện tƣợng biến nạp gen vào thực vật
Agrobacterium là vi khuẩn đất đƣợc biết đến nhƣ một tác nhân gây bệnh ở thực
vật. Chúng có khả năng gây nhiễm thực vật, tạo khối u ở các cây chủ, chủ yếu là ở cây
hai lá mầm. Cơ chế gây bệnh cho thực vật của Agrobacterium đã đƣợc hiểu rõ khi các
nhà khoa học phát hiện ra sự tồn tại của Ti-plasmid trong vi khuẩn và việc chuyển gen
từ Ti-plasmid này sang genome của thực vật [94]. Trên cơ sở cấu trúc và chức năng
của Ti-plasmid, các hƣớng nghiên cứu khai thác, sử dụng chúng làm vector đƣa các
gen mong muốn vào tế bào và mô thực vật đã đƣợc thực hiện. Đến nay, phƣơng pháp
chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn này đã đạt đƣợc những thành tựu to lớn,
đặc biệt trên đối tƣợng cây hai lá mầm [6].
1.2.3.2 Cấu tạo và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid là một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể, có kích thƣớc khoảng
200 kb. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào nhƣ một
đơn vị sao chép độc lập. Ti-plasmid có khả năng tạo khối u do mang các gen gây độc.

15


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

Ở các chủng Agrobacterium khác nhau, Ti-plasmid đều có 4 vùng. Trong đó, vùng TDNA (DNA chuyển – transfer DNA) là vùng duy nhất đƣợc chuyển từ vi khuẩn
Agrobacterium sang genome của cây bị bệnh. Vùng vir (virulence) đảm nhận chức
năng lây nhiễm, làm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA. Hai vùng còn lại chứa
gen mã hóa cho việc tái bản plasmid (replication) và chuyển nạp (conjugative
transfer).
Nghiên cứu vùng T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau, ngƣời ta thấy rằng TDNA đƣợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nhƣ hoàn toàn gọi là đoạn biên
(T-DNA border sequence). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm
nhập của T-DNA vào tế bào thực vật. Các phân tích trình tự gen trên T-DNA cho thấy
chúng cũng mang các dấu hiệu khởi đầu phiên mã (hộp TATA) và kết thúc phiên mã
(hộp AATAAA). Các gen tồn tại trên T-DNA đƣợc chia thành hai nhóm chính [48]:
 Nhóm gen gây khối u mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình tổng hợp các
phytohormon nhƣ auxin và cytokinin;
 Nhóm gen mã hóa các enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine cung
cấp năng lƣợng cho vi khuẩn.
Tổng hợp cytokinin
Tổng hợp opine
Biên phải

Các gen gây khối u

Tổng hợp auxin
Biên trái
Vùng gây độc

Vùng chuyển nạp
Vùng T-DNA
Ti-plasmid

Phân giải nopalin

(vir)
Vùng khởi đầu tái bản
của Agrobacterium
Vùng khởi đầu sao chép

Hình 3: Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid [6]
Vùng vir trên Ti-plasmid dài khoảng 40kb, gồm có các đơn vị điều hòa
(operon) (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, virH). Mỗi operon chứa nhiều gen

16


Chương 1: Tổng quan

Hà Hồng Hạnh

với số lƣợng khác nhau nhƣng chúng cùng giữ chức năng gây nhiễm. Sản phẩm
protein do các gen này mã hóa đã kích thích sự tách biệt T-DNA, giúp chúng tiếp cận
với genome của cây chủ. Ngoài các gen trên vùng vir, các gen trên nhiễm sắc thể của
A. tumefaciens cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của A.

tumefaciens vào thành tế bào thực vật [48].
1.2.3.3. Các loại vector Ti-plasmid
Các Ti-plasmid có kích thƣớc quá lớn nên không thể dùng làm vector, do vậy,
các vector nhỏ hơn đã đƣợc thiết kế cho phù hợp với thao tác in vitro. Các vector này
đƣợc thiết kế trên cơ sở của Ti-plasmid đã cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm
các gen cần thiết, chứa vùng tạo dòng đa năng (Multi Cloning Site – MCS). Có hai hệ
thống vector Ti-plasmid chuyển gen hiệu quả: vector liên hợp (co-integrate vector) và
vector nhị thể (binary vector) [98].
Vector liên hợp là loại vector Ti-plasmid cải biến đầu tiên đƣợc dùng để chuyển
gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Tuy vector liên hợp cho phép sự tái tổ
hợp đặc hiệu vị trí song trình tự tƣơng đồng rất dài giữa Ti-plasmid và plasmid của E.
coli đã gây ra những khó khăn khi thiết kế và sử dụng, hiệu quả chuyển gen thấp với
số lƣợng các bản sao trong vi khuẩn rất ít, do vậy, ngày nay chúng không còn đƣợc sử
dụng rộng rãi.
Vector nhị thể: trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một
plasmid với vùng T-DNA mà vẫn điều khiển đƣợc sự chuyển và xâm nhập của T-DNA
vào genome thực vật, ngƣời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống chuyển gen thực
vật nhờ vector nhị thể trong đó vùng T-DNA và vùng VIR nằm trên hai plasmid khác
nhau nhƣng trong cùng một chủng A. tumefaciens. Có hai loại vector đƣợc sử dụng
trong hệ thống vector nhị thể: (1) Plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật
chủ rộng chứa gen quan tâm trên T-DNA, đoạn biên phải và trái, chỉ thị chọn lọc và
sao chép trong E. coli và A. tumefaciens, chỉ thị chọn lọc thực vật; (2) Ti-plasmid trợ
giúp nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng VIR đƣợc giữ lại nhƣng loại bỏ hoàn
toàn vùng T-DNA và đoạn biên phải, trái (hình 4) [47]. Nhìn chung, quá trình biến nạp

17