Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích nitrit trong nước theo TCVN 6178:1996 ISO 6777:1984 tại Phòng thí nghiệm Môi trường – Trung tâm Nghiên cứu Môi trường – Viện Khoa học Khí tượng Thủy văn và Biến đổi khí hậu

MỞ ĐẦU
Ngày nay tốc độ thị hóa ở Việt Nam rất nhanh cùng với sự phát triển của các
ngành công nghiệp. Tỷ lệ dân số tại khu vực thành thì tăng cùng với tốc độ đô thị
hóa. Lượng nước thải từ các khu dân cư, khu công nghiệp cũng tăng theo mức độ
dân số với lượng các chất thải lớn, đặc biệt là nước thải. Đặc trưng của nước thải
sinh hoạt là có hàm lượng chất hưu cơ cao, chứa nhiều vi sinh vật trong đó có các
vi sinh vật gây bệnh. Thành phần các chất ô nhiễm trong nước thải thường vượt
gấp nhiều lần so với quy chuẩn như BOD, COD, hàm lượng nitrit.
Trong môi trường nitrit là hợp chất của Nito được hình thành trong quá
trình phân hủy hợp chất hữu cơ. Trong nước, nitrit là sản phẩm trung gian của phản
ứng oxy hóa dưới tác động của vi khuẩn từ amoniac thành nitrite và cuối cùng là
nitrat. Thời gian tồn tại của nitrit trong nước rất ngắn vì khi gặp oxy không khí sẽ
chuyển thành nitrat. Nitirt là chất có tính độc hại tới sinh vật và con người vì sản
phẩm nó chuyển hóa thành có thể gây độc cho cá, tôm, v.v, gây ung thư cho con
người. Do vậy, việc xác định lượng nitrit có trong nước là rất quan trọng để từ đó
có thể đưa ra các biện pháp xử lí phù hợp.
Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp định lượng nitrit như phương pháp
trắc quang, điện hóa và sắc ký. Tuy vậy, tại hầu hết phòng thí nghiệm môi trường ở
Việt Nam thì phương pháp trắc quang là một trong những phương pháp có nhiều
ưu thế vì tính đơn giản, dễ thực hiện và tính kinh tế.
Một phương pháp trước khi được đưa vào áp dụng thì cần có các chứng
minh rằng phương pháp đó có đáp ứng các yêu cầu đặt ra, tức là phương pháp đó
phải được thẩm định. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể sử dụng để đánh
giá chất lượng , độ tin cậy của kết quả phân tích. Xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp là một trong những yêu cầu về mặt kỹ thuật trong tiêu chuẩn
ISO/IEC 17025:2005, cung cấp bằng chứng khách quang rằng các yêu cầu xác
định cho việc lựa chọn và sử dụng phương pháp thử được đáp ứng.


Từ những lý do trên, em chọn đề tài “Xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp phân tích nitrit trong nước theo TCVN 6178:1996/ ISO 6777:1984 tại

Phòng thí nghiệm Môi trường – Trung tâm Nghiên cứu Môi trường – Viện
Khoa học Khí tượng Thủy văn và Biến đổi khí hậu”
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 và phòng thí nghiệm
1.1.1. Tổng quan về tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 [1]
ISO/IEC 17025:2005 là tiêu chuẩn thể hiện năng lực đối với phòng thử
nghiệm và hiệu chuẩn, là kết quả hợp tác giữa tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế
(ISO) với Ủy ban Kỹ thuật Điện Quốc tế (IEC) để chứng nhận khả năng của phòg
thử nghiệm và hiệu chuẩn. Tiêu chuẩn có vai trò quan trọng trong thương mại, phát
triển sản xuất, sản phẩm và trong việc bảo vệ khách hàng. Từ ngày 12/5/2007 các
phòng thử nghiệm, hiệu chuẩn được công nhận bắt buộc phải thực hiện các yêu cầu
của phiên bản tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005.
TCVN ISO/IEC 17025:2005 tăng cường mối quan hệ hợp tác giữa các
phòng thử nghiệm với các tổ chức khác nhằm hỗ trợ quá trình trao đổi thông tin,
kinh nghiệm, sự hòa hợp của các tiêu chuẩn và mụ
c tiêu đã định. Tiêu chuẩn này phản ánh xu hướng chung trong một lĩnh vực
hợp nhất tạo nên một bộ mặt mới cho luật pháp, thương mại, kinh tế và kỹ thuật
quốc tế.
Trên thế giới có khoảng 25000 phòng thử nghiệm được công nhận ISO/IEC
17025:2005. Tại Việt Nam có khoảng 400 đơn vị thực hiện TCVN ISO/IEC
17025:2005 đã được cấp chứng chỉ công nhận BOA/VILAS.
Cấu trúc của tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 bao gồm 5 thành phần, trong
đó phòng thử nghiệm cần phải đáp ứng các yêu cầu trong phần 4 và phần 5 của tiêu
chuẩn này:


-

Phạm vi
Tiêu chuẩn trích dẫn

Thuật ngữ và định nghĩa
Các yêu cầu về quản lý (bắt buộc)
Các yêu cầu về kỹ thuật (bắt buộc)
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ tin cậy của kết quả thử nghiệm/hiệu chuẩn bao
gồm:

-

Yếu tố con người
Điều kiện môi trường
Lấy mẫu
Các phương pháp thử
Quản lý
Các thiết bị
Yêu cầu đặt ra hết sức quan trọng đối với mỗi phòng thử nghiệm là phải xác
định mức độ tin cậy của kết quả phân tích, muốn thực hiện được thì phòng thử
nghiệm phải xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp thử. Xác nhận giá trị sử
dụng của phương pháp là một yêu cầu về kỹ thuật trong tiêu chuẩn ISO/IEC
17025:2005 bắt buộc phòng thử nghiệm phải thực hiện khi xây dựng hệ thống
phòng thử nghiệm đạt chuẩn.
1.1.2. Tổng quan về phòng thí nghiệm
1.2. Tổng quan về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
1.2.1. Ý nghĩa và vai trò của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

a) Ý nghĩa và vai trò [7]
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm
tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng
được các yêu cầu đặt ra. Kết quả của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp có
thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Xác

nhận giá trị sử dụng của phương pháp là một phần không thể thiếu nếu muốn có
một kết quả đáng tin cậy.
Các thuật ngữ khác nhau được sử dụng để chỉ khái niệm trên như định trị
phương pháp, đánh giá phương pháp, phê duyệt phương pháp, thẩm định phương
pháp. Tất cả các thuật ngữ này là tên gọi khác nhau của xác nhận giá trị sử dụng
của phương pháp.
Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào
nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm.
- Các phương pháp tiêu chuẩn: các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc
tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO,
AOAC,…
- Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ (non
-standard/alternative/in-house method): là các phương pháp do phòng thử nghiệm
tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của các nhà sản xuất thiết bị, phương
pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành…
b) Các yêu cầu của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp [7]
Theo yêu cầu của ISO/IEC 17025:2005, phương pháp phân tích phải được
xác nhận giá trị sử dụng khi:
- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn (non-standard
methord).
- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng
thành thường quy.
- Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương
pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn.
- Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được xác nhận (như thiết bị
với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người phân tích…)
- Để chứng tỏ sự tương đương giữa hai phương pháp.
Theo quy định của AOAC đối với các chỉ tiêu hóa học thì phải xác định các
thông số cần xác nhận giá trị sử dụng như bảng 1.1:

Bảng 1.1. Các thông số cần xác định khi tiến hành XNGTSD phương pháp tiêu
chuẩn

ST
T

Thông số cần xác
định

Phương
pháp
định
tính

Phương
pháp
bán
định
lượng

-

Phương pháp định
lượng
Định
lượng sử
dụng
đường

chuẩn

Định
lượng
không sử
dụng
đường
chuẩn

+

+

1

Độ đúng (Trueness)

-

2

Độ nhạy (Sensitivity)

+

+(1)

+(1)

3

Độ chọn lọc
(Selectibility)

+

+(1)

+(1)

4

Độ lặp lại
(Repeatability)

-

-

+

+

5

Độ tái lập
(Reproducibility)

-

-

+

+

6

LOD*
(Limit of Detection)

+

+

+

-(2)

7

LOQ*
(Limit of Quantitation)

-

-

+

-(2)

8

Độ thu hồi

-

-

+

-(2)

9

Độ tuyến tính
(Linearity)

-

-

+

-

10

Khoảng xác định

(Working range)

-

+

+

-(2)

11

Độ không đảm bảo đo
(Uncertanty)

-

-

+

+

Các ký hiệu trong bảng được hiểu như sau:
+: Cần xác định


-: Không cần xác định
*: Không phải tính đối với chỉ tiêu đa lượng
(1): Không cần xác định khi sử dụng phương pháp tiêu chuẩn

(2): Tùy chọn
Việc lựa chọn các thông số xác nhận giá trị sử dụng tùy thuộc vào kỹ thuật
áp dụng trong phương pháp, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của
phòng thử nghiệm…Từng trường hợp cụ thể các thông số xác nhận có thể có sự
khác nhau.
1.2.2. Khái niệm các thông số cần xác định khi XNGTSD [1]
a) Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có
sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định
hệ số hồi quy tương quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường
chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường
chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài
giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa
đường chuẩn.
b) Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ
không đảm bảo đo của phương pháp. Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong
mẫu có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết xác định hàm lượng trong điều
kiện thí nghiệm. Có giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và giới hạn phát hiện của
phương pháp (MDL). Là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân
tích.
c) Giới hạn xác định ( LOQ)
Là nồng độ nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể định
lượng được với độ chụm và độ đúng chấp nhận được trong điều kiện tiến hành


phân tích. Có giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) và giới hạn định lượng của
phương pháp (MQL).
d) Độ chính xác

Chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá
trị thực. Độ chính xác được biểu thị dưới dạng độ đúng và độ chụm.
e) Độ chụm
Chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung
bình. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị
thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ
lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số
biến thiên càng lớn và ngược lại.
f) Độ đúng
Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị
trung bình của kết quả thực nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là
đúng.
Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác,
tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng. Giống như độ
chụm, độ đúng là một khái niệm định tính và được lượng hóa bằng độ thu hồi khi
phân tích mẫu thêm chuẩn.
g) Độ lặp lại
Cho cùng một nhân viên thực hiện việc phân tích một chỉ tiêu, xác định trên
cùng một mẫu thử đồng nhất, trên cùng một thiết bị, cùng phương pháp trong một
khoảng thời gian tương đối ngắn và đánh giá mức độ lặp lại các kết quả kiểm tra.
h) Độ tái lặp
Cho các nhân viên khác nhau thực hiện cùng một phép thử nghiệm, cùng
một phương pháp cùng một thiết bị và đánh giá mức độ tái lặp các kết quả kiểm
tra.
i) Độ không đảm bảo đo
Độ không đảm bảo đo của phép đo là thông số gắn với kết quả của phép đo,
thông số này đặc trưng cho mức độ phân tán của các giá trị có thể chấp nhận được
quy cho đại lượng đo của phép đo.

1.2.3. Quy trình thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp [5]
Quy trình thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thể hiện
trong hình 1.1

Bước 1: Lựa chọn phương pháp áp dụng
Phương pháp tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ.

Bước 2: Xác định các thông số của phương pháp cần xác nhận

lựa chọn các thông số cần xác nhận phụ thuộc vào kỹ thuật phân tích áp dụng trong phương pháp, điều kiện kỹ thuật cụ thể của PTN.

Bước 3: Lập kế hoạch xác nhận

ao gồm thời gian, người thực hiện, chất cần phân tích, xác định mục đích cần phải đạt (LOD, LOQ, độ đúng…), xác định các thí nghiệm phải

Bước 4: Tiến hành các phép thí nghiệm để xác nhận
Bước 5: Báo cáo kết quả xác nhận

ề tên người thực hiện, thời gian bắt đầu, thời gian kết thúc, tóm tắt các phương pháp (nguyên lý, thiết bị, hóa chất, quy trình), các kết quả
tiêu chí yêu cầu đều đạt, các thông số cần xác định đều xác định được thì kết luận phương pháp phù hợp áp dụng và trình lãnh đạo phê du


Hình 1.1. Quy trình thực hiện xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
1.3. Tổng quan về nitrat và phương pháp phân tích nitrat trong nước
1.3.1. Sự tồn tại của nitrat trong môi trường
a) Nitrat trong môi trường đất

b) Nitrat trong môi trường nước
c) Nitrat trong sản phẩm từ động vật
1.3.2. Ảnh hưởng của nitrat tới hệ sinh thái và sức khỏe con người

1.3.3. Phương pháp định lượng nitrit
Nguyên tắc:
NO2- trong nước ngầm có được xác định thông qua hợp chất phức màu tím hồng ở pH=
2,0 – 2,5 bởi liên kết diazo của Sunlfanilamide với N-(1-naphthyl)-etylenendiamine
dihydrochloride. Đo mật độ hấp thụ quang của phức màu ở bước sóng 540nm. Phương
pháp này chỉ áp dụng để xác định hàm lượng nitrit trong khoảng từ 0.01-1.0 mgN/l
Phạm vi áp dụng
Phân tích NO2- trong mẫu nước ngầm, nước mặt, nước biển, và nước thải có hàm lượng
nitrit từ 0,01-0,1 mgN/l. Khi nồng độ cao hơn thì có thể xác định bằng cách pha loãng
mẫu.
Khoảng tuyến tính của phương pháp là từ 0.005 – 0.050 mgN/l khi độ rộng khe sáng là
5cm và ánh sáng màu xanh đã bị loại bỏ.
Yếu tố ảnh hưởng:
Dầu mỡ và chất lơ lửng
Các loại trừ:
Lọc và loại bỏ dầu mỡ bằng cách chiết mẫu trước khi phân tích bằng n-hexan
Mẫu có độ đục cao thì cần loại bỏ bằng phương pháp keo tụ ZnSO4
Hóa chất, dụng cụ:


Dung dịch N-(1-naphtyl)- etylendiamin hiroclorua 0.5g/l (C7H10NH(CH 2)2NH2.HCL)
Dung dịch axit sunfanilic (C6H4SO3HNH2)
Dung dịch axit axetic
Dung dich Nitrit chuẩn gốc: 1000mg/l
Dung dịch chuẩn Nitrit làm việc: 1mg/l; 2mg/l; 5mg/l.

1.3.4. Phương pháp xử lý số liệu [5]
Nghiên cứu sử dụng phương pháp hồi quy và phân tích tương quan để xác
định mối liên quan hệ số tương quan R 2 bằng cách sử dụng phần mềm trợ giúp
Excel, lập bảng tính để xác định phương trình hồi quy và hệ số tương quan.

Phương pháp xử lý số liệu thống kê được dùng để đánh giá độ lặp, độ tin cậy
của phép đo.
Một số đại lượng thống kê được sử dụng trong xử lý số liệu:
- Giá trị trung bình Ctb:
C1 + C 2 + C 3 + ... + C n
n

Ctb=
(1.1)
- Độ lệch chuẩn của phép đo:
SD =2
(1.2)
Trong đó:
Ctb : Là nồng độ trung bình của các mẫu, đơn vị : mgSO42-/l
Ci : Là giá trị nồng độ của từng mẫu, đơn vị : mgSO42-/l
n : Số lần thử nghiệm
- Giới hạn phát hiện (LOD):
Tính trên mẫu thực: LOD = 3 x SD
(1.3)
- Giới hạn định lượng (LOQ):
LOQ = 10 x SD
(1.4)


-

Độ lệch chuẩn tương đối RSD:
SD
C tb

RSD (%)=
x 100
- Hệ số biến thiên của kết quả đo:
CV (%) =
- Độ thu hồi:

SD
C tb

x 100

(1.5)

(1.6)

C m+c − C m
Cc

R (%) =
x 100
(1.7)
Trong đó:
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu đã thêm chuẩn
Cm: Nồng độ phân tích trong mẫu thực
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
- Độ không đảm bảo đo chuẩn loại A:
Phương pháp này đánh giá độ không đảm bảo đo bằng cách tiến hành phân tích
thống kê dãy giá trị, với số lần lặp lại ≥ 6 lần (phân phối chuẩn). Độ không đảm bảo
đo chuẩn có thể được biểu thị bằng độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối:
u = SD =2

(1.8)
u (%) = RSD (%) =

SD
C tb

x 100

(1.9)

Trong đó:

-

u: Độ không đảm bảo đo, đơn vị: mgSO42-/l
n: Số lần thử nghiệm
Hay tính độ không đảm bảo đo trên mẫu cùng nồng độ
Phân tích mẫu chuẩn đã biết hàm lượng, hoặc phân tích một mẫu đồng nhất có
hàm lượng xác định.
Phân tích mẫu lặp lại tối thiểu 20 lần, tính kết quả các lần phân tích (các lần
phân tích nên được bố trí các ngày khác nhau)
Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên của các kết quả phân tích
Độ không đảm bảo đo được tính theo theo công thức sau:
U(%) = tα,k x CV(%)
(1.10)


Trong đó:
U: Độ không đảm bảo đo tổng (%)
CV: Hệ số biến thiên của kết quả đo (%)

tα,k: Giá trị t tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05; bậc tự do k = n – 1 (Phụ lục 3)
n: Số lần phân tích lặp lại
- Xác định hệ số R:

R=

Ctb
LOD

(1.11)


CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1 Đánh giá điều kiện phòng thí nghiệm
Tên phương pháp: Phương pháp xác định Nitrit trong nước bằng phương pháp phổ
hấp thụ phân tử
Phương pháp tiêu chuẩn
 Số hiệu phương pháp: TCVN 6178:1996/ ISO
6777:1984
Phương pháp không tiêu chuẩn 
Tiêu chuẩn tham chiếu: Xác định Nitrit trong nước bằng phương pháp phổ hấp thụ phân
tử
Bảng 2.1. Đánh giá điều kiện cơ bản của phương pháp phân tích Sunfat trong nước.

TT

Nội
dung

Yêu cầu của phương pháp

Phù
hợp/
sẵn có

1

Nhân
lực

Có kỹ năng chuyên môn, nắm
vững các nội quy, quy trình thí
nghiệm, quy trình thao tác thiết bị

x

C7H10NH(CH 2)2NH2.HCL

x

C6H4SO3HNH2

x

Nitrit chuẩn gốc: 1000mg/l

x

Axit axetic

x

Kiểm soát môi trường thử nghiệm
không bị nhiễm bẩn

x

Kiếm soát độ ẩm, nhiệt độ, áp suất
phòng thử nghiệm

x

Phòng thử nghiệm đảm bảo hệ
thống điện, nước, có hệ thống
cảnh báo cháy nổ…

x

Phòng thử nghiệm chia thành các
khu vực ngăn cách thích hợp

x

2

3

Hóa
chất

Môi
trường

Chưa
phù
hợp/cần
bổ sung

Chi
phí

Ghi
chú


4

Thiết
bị,
Dụng
cụ

Các dụng cụ đầy đủ

x

Máy cất nước hai lần

x

Tủ bảo quản mẫu
Máy quang phổ UV-VIS (HP
8453), cuvet 1cm

x

2.2 Hóa chất
Dung dịch N-(1-naphtyl)- etylendiamin hiroclorua 0.5g/l (C7H10NH(CH 2)2NH2.HCL)
Dung dịch axit sunfanilic (C6H4SO3HNH2)
Dung dịch axit axetic
Dung dich Nitrit chuẩn gốc: 1000mg/l
Dung dịch chuẩn Nitrit làm việc: 1mg/l; 2mg/l; 5mg/l.

-

-

2.3 Dụng cụ và thiết bị
Pipet loại thẳng loại: 1ml, 5ml,10ml
Pipet loại bầu: 20 ml, 50ml,
Giá để dụng cụ
Bình định mức 25ml, 50ml, 100ml và 1000ml
Cốc thủy tinh 250ml có mỏ
Bình tam giác, bình tia nước cất
Quả bóp
Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa với axit HNO 3 loãng và tráng kỹ với
nước cất hai lần.
Máy quang phổ UV-VIS (HP 8453), cuvet 1cm;
Tủ hút khí độc.
2.4 Quy trình xác định Nitrit trong nước

Các mẫu nước thực nghiệm được tiến hành đo nồng độ NO2- được kí hiệu như sau:

- Tiến hành: Hút 25ml mẫu + 1 ml dung thuốc thử, lắc đều rồi so màu ở bước sóng 540 nm.
- Thang chuẩn: Cân 0,1479g Na2SO4 pha thành 1 lít bằng nước cất được dung dịch
100mgSO42-/l.
Từ dung dịch 5 mg NO2-/l hút lần lượt thể tích vào bình định mức 25ml, định mức
đến vạch bằng nước cất rồi thêm 1 ml thuốc thử được các dung dịch làm việc có các
nồng độ 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0 . (mg/l)


2.5 Quy trình xác định khoảng tuyến tính của phương pháp
Bước 1: Chuẩn bị 6 bình định mức 50 ml có dán nhãn đánh số từ 1 đến 6.
Bước 2: Từ dung dịch làm việc có nồng độ 100mgSO42-/l pha dải đường chuẩn với
các nồng độ như trên cụ thể được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Số liệu chuẩn bị để xây dựng đường chuẩn phân tích Sunfat.
Điểm

Điểm
1

Điểm
2

Điểm
3

Điểm
4

Điểm

5

Dải đường chuẩn
0
0,01
0,05
0,1
0,5
(mgNO2-/l)
V hút từ dung dịch chuẩn
0
0,2
1
2
10
5 mgNO2-/l (ml)
Bình định mức (ml)
100
100
100
100
100
Định mức tới vạch bằng nước cất
Hút 25ml dung dịch từ điểm 1 đến điểm 6 vào bđm 25ml
Thêm 1 ml thuốc thử
Đo trên máy quang phổ UV-VIS

Điểm
6
1

20
100

Bước 3: Dựng đường chuẩn. Vẽ đường phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau
đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có
khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình:
y = ax + b
Hệ số tương quan R: Chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ số
tương quan hồi quy (R) phải đặt yêu cầu sau:
0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1
2.6 Quy trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
2.6.1 Quy trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp được thực hiện theo một quy trình. Dưới
đây là các bước tóm tắt của quy trình đó:
Bước 1: Lựa chọn phương pháp
Căn cứ vào điều kiện và khả năng cụ thể của phòng thí nghiệm để lựa chọn phương
pháp phù hợp. Đối với quy trình phân tích Nitrit trong môi trường nước tác giả chọn
phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử.
Bước 2: Xác định thông số của phương pháp cần xác định


Việc lựa chọn thông số phụ thuộc vào kỹ thuật phân tích áp dụng cho phương pháp,
điều kiện kỹ thuật cụ thể của phòng thí nghiệm. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm
của Phòng Phân tích Thí nghiệm Môi trường – Trung tâm Nghiên cứu Môi trường – Viên
Khoa học Khí tượng Thủy văn và Biến đổi khí hậu và kỹ thuật phân tích áp dụng trong
quy trình xác định Nitrit bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử tác giả lựa chọn
các thông số: Xác định khoảng tuyến tính, xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn
định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ tái lập, độ thu hồi, xác định độ không đảm bảo đo của
phương pháp.

Bước 3 : Lập kế hoạch xác nhận
Kế hoạch xác nhận bao gồm thời gian, người thực hiện, chất cần phân tích, xác định
mục đích cần phải đạt (LOD, LOQ, mức chấp nhận), xác nhận các thí nghiệm cần phải
thực hiện. Chi tiết được thể hiện trong bảng 2.3:
Bảng 2.3. Kế hoạch xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xác định Nitrit
STT
1
2
3
4
5
6

Thông số xác nhận
Khoảng tuyến tính
LOD, LOQ
Độ lặp lại
Độ tái lập
Độ thu hồi
Độ không đảm bảo đo

Thời gian

Mức chấp nhận
0,995 ≤ R ≤ 1
4 – 10
RSD < 11 %
RSD < 11 %
R% = 80% -110%

Người thực hiện

Bước 4: Tiến hành các phép thí nghiệm để xác nhận
a) Xác định khoảng tuyến tính
Cách tiến hành theo các bước ở phần 2.4.
Sau đó vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa giá trị Abs và nồng độ. Xác định
khoảng tuyến tính. Xây dựng đường chuẩn và tính hệ số hồi quy tương quan R 2 được
thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel. Đường chuẩn xây dựng được phải nằm trong
giới hạn chấp nhận: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1.
• Khảo sát tuyến tính: Tiến hành khảo sát điểm trên và điểm dưới của khoảng tuyến tính
-

(đã được khảo sát và cho độ tương quan R2 tốt).
Bước 1: Chuẩn bị 7 bình định mức 50 ml có dán nhãn đánh số từ 1 đến 7.
Bước 2: Từ dung dịch làm việc có nồng độ 100mgSO42-/l pha dải đường chuẩn với các
nồng độ như sau thêm điểm dưới 1mgSO 42-/l và điểm trên 50mgSO42-/l cụ thể được thể
hiện ở bảng 2.4.


Bảng 2.4. Số liệu chuẩn bị để xây dựng đường chuẩn khảo sát tuyến tính
Điểm

Điểm
1

Điểm
dưới

Điểm
2

Điểm
3

Điểm
4

Điểm
5

Điểm
trên

Dải đường chuẩn
(mgNO2-/l)

0

0,01

0.05

0.1

0,5

1

2

0

0,2

1

2

10

20

40

100

100

100

100

100

100

100

V hút từ dung dịch chuẩn
5mgNO2-/l (ml)

Bình định mức

Định mức tới vạch bằng nước cất
Hút 25ml dung dịch điểm dưới đến điểm trên vào bình đm 25ml
Thêm 1 ml thuốc thử
Đợi 15p hút đem đo trên máy quang phổ UV-VIS
b) Xác định giới hạn phát hiện (LOD)
Cách xác định:

- Mẫu thử nghiệm: Hút 25ml mẫu NN1, NM1, NT1 (mẫu có nồng độ NO2- thấp), thêm 1ml
thuốc thử . Làm lặp 10 mẫu đối với 3 mẫu môi trường nước ngầm, nước mặt, nước thải
như vậy (n=10), kí hiệu mẫu từ đến NN1-NN10, NM1-NM10, NT1-NT10

- Dựng thang chuẩn: Tiến hành như bảng 2.2 ở trên.
Đem các mẫu đo trên máy UV-VIS tại bước sóng λ = 540nm
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) sử dụng công thức (1.1); (1.2); (1.3) để tính
toán.
Tính hệ số R theo công thức (1.11)
Đánh giá LOD đã tính được: R = Ctb / LOD
Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD được tính là đáng tin
cậy.
Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn
vào dung dịch thử đã dùng rồi làm thí nghiệm và tính lại R.
Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch loãng hơn, hoặc pha loãng dung dịch thử đã
dùng rồi làm lại thí nghiệm và tính lại R
c) Xác định giới hạn định lượng (LOQ)
Xác định giới hạn định lượng (LOQ) sử dụng công thức (1.4) để tính toán.


-

d) Xác định độ lặp lại, độ tái lập
Độ lặp lại: Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 3 mẫu môi trường sau đó thêm chuẩn ở 3 nồng
độ 1mgNO2-/l, 2mgNO2-/l, 5mgNO2-/l từ dung dịch chuẩn 20 mgNO2-/l như sau: Mỗi mẫu
tại mỗi nồng độ thêm chuẩn lặp lại 10 lần.

• Hút 25ml dung dịch mẫu + 1 ml dung dich chuẩn 50 mgNO 2-/l rồi định mức 50ml. Thêm
1 ml dung dịch thuốc thử rồi lắc đều trước khi đo.

• Hút 25ml dung dịch mẫu + 2 ml dung dich chuẩn 50 mgNO 2-/l rồi định mức 50ml. Thêm
1 ml dung dịch thuốc thử rồi lắc đều trước khi đo..

• Hút 25ml dung dịch mẫu + 5 ml dung dich chuẩn 50 mgNO 2-/l rồi định mức 50ml. Thêm
1 ml dung dịch thuốc thử rồi lắc đều trước khi đo.

• Dựng thang chuẩn : tiến hành như bảng 2.2 ở trên.
-

-

Độ tái lập: Tiến hành chuẩn bị và phân tích mẫu như độ lặp lại và được tiến hành với hai
ngày phân tích khác nhau, lần 1 (ngày?????) và lần 2 (Ngày???) đều do Trịnh Thị Hiền
thực hiện.
Tính giá trị độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối để đánh giá độ lặp lại và độ tin cậy
của phép phân tích.

- Sử dụng công thức (1.1), (1.2) và (1.5) để tính toán.

-

Tiêu chí đánh giá :
Đối chiếu giá trị tính được với giá trị mong muốn hay giá trị yêu cầu hoặc so với
RSD % lặp lại cho trong bảng (RSD% tính được không được lớn hơn giá trị trong bảng ở
hàm lượng chất tương ứng). Độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích được so sánh
ở phụ lục 1 (Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC).
e) Độ thu hồi
Dựng thang chuẩn: Tiến hành như bảng 2.2

- Xác định độ thu hồi trên 3 nền mẫu thực: nước ngầm, nước thải, nước mặt + thêm chuẩn :

-

Tiến hành thêm chuẩn trên mẫu thực nghiệm ở 3 khoảng nồng độ là 1 mgNO 2-/l, 2
mgNO2-/l, 5mgNO2-/l, tiến hành phân tích lặp 6 lần.
Mẫu ĐL230 sau khi thêm chuẩn được tiến hành theo các bước như mẫu thực nghiệm ở

-

phần trên.
Độ thu hồi được tính theo công thức (1.7).
Tiêu chí đánh giá:


Sau khi đánh giá độ thu hồi, so sánh kết quả với các giá trị ở phụ lục 2 (Độ thu hồi
chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC).
f) Xác định độ không đảm bảo đo.
Đánh giá độ không đảm bảo đo bằng cách sử dụng các kết quả của phép đo trước là
mẫu của độ lặp lại.
Xác định độ không đảm bảo đo theo công thức (1.8) và (1.9).
Bước 5: Báo cáo kết quả xác nhận

Trong báo cáo cần có các thông tin: Tên người thực hiện, thời gian bắt đầu, tóm tắt
các phương pháp (nguyên lý, thiết bị, hóa chất, quy trình) và các kết quả.
2.6.2 Bố trí thí nghiệm
Mẫu được thử nghiệm tại Phòng Phân tích Thí nghiệm Tổng hợp Địa lý - Viện Địa
lý và được tổng hợp ở các bảng 2.5; 2.6; 2.7; 2.8; 2.9; 2.10; 2.11; 2.12; 2.13; 2.14; 2.15;
2.16; 2.17; 2.18 như sau:


Bảng 2.5. Mẫu thử nghiệm thêm chuẩn để xác định LOD, LOQ đối với mẫu nước ngầm
Định
Dung dịch
Ký hiệu mẫu
mức bình
đệm (ml)
25 (ml)
1
NN1
25
1
25
2
NN2
25
1
25
3
NN3
25
1
25

4
NN4
25
1
25
5
NN5
25
1
25
6
NN6
25
1
25
7
NN7
2
1
2
8
NN8
25
1
25
9
NN9
25
1
25

10
NN10
25
1
25
Bảng 2.6. Mẫu thử nghiệm thêm chuẩn để xác định LOD, LOQ đối với mẫu nước mặt
ST
T

V mẫu
(ml)

Định
Dung dịch
Ký hiệu mẫu
mức bình
đệm (ml)
25 (ml)
1
NM1
25
1
25
2
NM2
25
1
25
3
NM3

25
1
25
4
NM4
25
1
25
5
NM5
25
1
25
6
NM6
25
1
25
7
NM7
2
1
2
8
NM8
25
1
25
9
NM9

25
1
25
10
NM10
25
1
25
Bảng 2.7. Mẫu thử nghiệm thêm chuẩn để xác định LOD, LOQ đối với mẫu nước thải
ST
T

V mẫu
(ml)

ST
T

Ký hiệu mẫu

V mẫu
(ml)

1
2
3
4
5
6

Nt1
NT2
NT3
NT4
NT5
NT6

25
25
25
25
25
25

Định
Dung dịch
mức bình
đệm (ml)
25 (ml)
1
25
1
25
1
25
1
25
1
25
1

25


7
8
9
10

NT7
NT8
NT9
NT10

2
25
25
25

1
1
1
1

2
25
25
25

Bảng 2.8. Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 1mgNO2-/l đối với mẫu nước
ngầm

STT

Ký hiệu
mẫu

1
2
3
4
5
6

NNC1.1
NNC1.2
NNC1.3
NNC1.4
NNC1.5
NNC1.6

V dung
dịch mẫu
nước
ngầm
25
25
25
25
25
25

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

1
1
1
1
1
1

50
50
50
50
50
50

Dung
dịch
thuốc thử
(ml)
2
2
2

2
2
2

Bảng 2.9. Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 2 mgNO2-/l đối với mẫu nước
ngầm

STT

Ký hiệu
mẫu

1
2
3
4
5
6

NNC2.1
NNC2.2
NNC2.3
NNC2.4
NNC2.5
NNC2.6

V dung
dịch mẫu
nước
ngầm

25
25
25
25
25
25

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

2

50
50
50
50
50
50

2
2
2
2

Dung

dịch
thuốc thử
(ml)
2
2
2
2
2
2

Bảng 2.10. Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 5mgNO2-/l đối với mẫu nước
ngầm
STT

Ký hiệu
mẫu

V dung
dịch mẫu
nước

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

Dung

dịch
thuốc thử


1
2
3
4
5
6

NNC5.1
NNC5.2
NNC5.3
NNC5.4
NNC5.5
NNC5.6

ngầm
25
25
25
25
25
25

5
5
5
5

5
5

50
50
50
50
50
50

(ml)
2
2
2
2
2
2

Bảng 2.11 Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 1mgNO2-/l đối với mẫu nước mặt

STT

Ký hiệu
mẫu

V dung
dịch mẫu
nước mặt

1

2
3
4
5
6

NMC1.1
NMC1.2
NMC1.3
NMC1.4
NMC1.5
NMC1.6

25
25
25
25
25
25

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

1
1

1
1
1
1

50
50
50
50
50
50

Dung
dịch
thuốc thử
(ml)
2
2
2
2
2
2

Bảng 2.12. Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 2 mgNO2-/l đối với mẫu nước
mặt

STT

Ký hiệu
mẫu

1
2
3
4
5
6

NMC2.1
NMC2.2
NMC2.3
NMC2.4
NMC2.5
NMC2.6

V dung
dịch mẫu
nước
ngầm
25
25
25
25
25
25

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

2
2
2
2
2
2

50
50
50
50
50
50

Dung
dịch
thuốc thử
(ml)
2
2
2
2
2
2

Bảng 2.13. Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 5mgNO2-/l đối với mẫu nước

mặt
STT

Ký hiệu
mẫu

V dung
dịch mẫu
nước

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

Dung
dịch
thuốc thử


ngầm
(ml)
1
NMC5.1
25
5
50

2
2
NMC5.2
25
5
50
2
3
NMC5.3
25
5
50
2
4
NMC5.4
25
5
50
2
5
NMC5.5
25
5
50
2
6
NMC5.6
25
5
50

2
Bảng 2.14 Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 1mgNO2 /l đối với mẫu nước mặt

STT

Ký hiệu
mẫu

V dung
dịch mẫu
nước mặt

1
2
3
4
5
6

NTC1.1
NTC1.2
NTC1.3
NTC1.4
NTC1.5
NTC1.6

25
25
25
25

25
25

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

1
1
1
1
1
1

50
50
50
50
50
50

Dung
dịch
thuốc thử
(ml)
2

2
2
2
2
2

Bảng 2.15. Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 2 mgNO2-/l đối với mẫu nước
thải

STT

Ký hiệu
mẫu

1
2
3
4
5
6

NTC2.1
NTC2.2
NTC2.3
NTC2.4
NTC2.5
NTC2.6

V dung
dịch mẫu

nước
ngầm
25
25
25
25
25
25

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

2

50
50
50
50
50
50

2
2
2
2

Dung
dịch
thuốc thử
(ml)
2
2
2
2
2
2

Bảng 2.16 Mẫu thực bị để xác định độ lặp lại ở nồng độ 5mgNO2-/l đối với mẫu nước
thải
STT

Ký hiệu
mẫu

V dung
dịch mẫu
nước

V hút từ dung
dịch chuẩn
50mgNO2-/l

Định mức
bình 50
(ml)

Dung
dịch
thuốc thử


1
2
3
4
5
6

NTC5.1
NTC5.2
NTC5.3
NTC5.4
NTC5.5
NTC5.6

ngầm
25
25
25
25
25
25

5
5

5
5
5
5

50
50
50
50
50
50

(ml)
2
2
2
2
2
2

Bảng 2.6. Mẫu chuẩn bị để xác định độ tái lập lần 1 ở nồng độ 1mgSO42-/l
STT

Ký hiệu mẫu

1
2
3
4
5

6
7
8
9
10

MC1.1
MC1.2
MC1.3
MC1.4
MC1.5
MC1.6
MC1.7
MC1.8
MC1.9
MC1.10

V hút từ dung
dịch chuẩn
100mgSO42-/l
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

Dung dịch
đệm (ml)

Định mức
bình 50 (ml)

BaCl2 (g)

20
20
20
20
20
20
20
20
20
20

50
50
50
50
50
50
50
50
50
50

1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00

Bảng 2.7. Mẫu chuẩn bị để xác định độ tái lập lần 1 ở nồng độ 5mgSO42-/l
ST
T

Ký hiệu mẫu

V hút từ dung
dịch chuẩn
100mgSO42-/l

1

MC5.1

2,5

20

50

1,00

2

MC5.2

2,5

20

50

1,00

3

MC5.3

2,5

20

50

1,00

4

MC5.4

2,5

20

50

1,00

5

MC5.5

2,5

20

50

1,00

6

MC5.6

2,5

20

50

1,00

7

MC5.7

2,5

20

50

1,00

8

MC5.8

2,5

20

50

1,00

Dung dịch Định mức
đệm (ml) bình 50 (ml)

BaCl2 (g)


9

MC5.9

2,5

20

50

1,00

10

MC5.10

2,5

20

50

1,00