Nghiên cứu xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn lẫn trong các chế phẩm thuốc đông dược bằng sắc ký mỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC
GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN LẪN TRONG
CÁC CHẾ PHẨM THUỐC ĐÔNG DƢỢC
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC
GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN LẪN TRONG
CÁC CHẾ PHẨM THUỐC ĐÔNG DƢỢC
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
2.Ths.NCS Đào Thị Cẩm Minh

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Kiều Anh, người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths. Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên
khoa Dược trường Đại học Y-Dược Huế, người đã động viên, giúp đỡ tôi rất
nhiều trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà - giảng viên
trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS. Lê Văn Vũ – trung tâm Khoa học
vật liệu, khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội đã giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học,
các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất - trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học
tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập
và nghiên cứu.

Hà Nôi, ngày 3 tháng 4 năm 2017
Học viên

Phạm Thị Tâm


MỤC LỤC

Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình ảnh
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ......................................................... 3
1.1.1.Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dược hỗ trợ điều trị
và điều trị tiểu đường ........................................................................ 3
1.1.2. Cấu trúc, tính chất lý hoá và tác dụng của metformin, glibenclamid 6
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ................................................... 8
1.2.1. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................... 8
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ........................................................ 9
1.2.3. Phương pháp quang phổ Raman ..................................................... 10
1.3. Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc giảm glucose máu
trộn trong các chế phẩm từ dược liệu ............................................. 14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 19
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu................................. 19
2.1.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ......................................... 19
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .......................................................... 19
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 20

2.2.1. Xây dựng quy trình định tính, định lượng metformin HCl và
glibenclamid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC.... 20
2.2.2. Thẩm định phương pháp ................................................................. 22


2.2.3. Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực ................ 23
2.2.4. Bước đầu khảo sát các điều kiện phát hiện glibenclamid bằng TLCSERS ............................................................................................... 23
2.3. Phương pháp xử lý số liệu...................................................................... 25
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ............................................. 26
3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC ...................................... 26
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC ......................................... 26
3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu HPTLC............................................ 27
3.1.3. Thẩm định phương pháp HPTLC ................................................... 30
3.1.4. Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực ............... 36
3.2. Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện glibenclamid bằng TLCSERS ............................................................................................... 40
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 49
4.1. Phương pháp HPTLC ............................................................................. 49
4.1.1. Lựa chọn phương pháp phân tích ................................................... 49
4.1.2. Lựa chọn xử lý mẫu ........................................................................ 50
4.1.3. Thẩm định phương pháp ................................................................. 51
4.1.4. Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực ................ 52
4.2. Phương pháp TLC-SERS ...................................................................... 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức
(Association of Official Analytical Chemists)

DMF

N,N-dimethylformamid

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SERS

Tán xạ Raman tăng cường bề mặt
(Surface- enhancedRamanspectroscopy)

TFA

Acid trifloracetic

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua
(Transmission Electron Microscopy)

TPBVSK

Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết metformin HCl, glibenclamid .........28
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp HPTLC....31

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của metformin HCl, glibenclamid .....32
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng của metformin ........................33
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng của glibenclamid....................34
Bảng 3.6 . Kết quả xác định LOD, LOQ của metformin HCl và glibenclamid ..36
Bảng 3.7. Kết quả hàm lượng glibenclamid trong các mẫu thử ...........................39
Bảng 3.8. Cách pha các nồng độ khác nhau của dung dịch keo M5 ....................44
Bảng 3.9. Thể tích chấm khảo sát LOD của phương pháp TLC-SERS ...............48


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Các thành phần tán xạ thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu...11
Hình 1.2.Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes, m, n, r: các mức năng lượng..12
Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động ...................................... 26
Hình 3.2. Kết quả quét phổ UV tại vị trí của chất phân tích........................... 27
Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết ..................................................... 28
Hình 3.4. Sơ đồ xử lý mẫu phân tích .............................................................. 29
Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC ......................................... 30
Hình 3.6. Sắc ký đồ analog của hỗn hợp hoạt chất xác định tính chọn lọc của
phương pháp.................................................................................... 30
Hình 3.7. Sắc ký đồ 3D khoảng tuyến tính của metformin HCl và
glibenclamid .................................................................................... 32
Hình 3.8. Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của
metformin và glibeclamid ............................................................... 32
Hình 3.9. Sắc ký đồ xác định LOD của glibenclamid và metformin HCl ...... 35
Hình 3.10. Sắc ký đồ analog xác định LOD của glibenclamid) ..................... 35
Hình 3.11. Sắc ký đồ analog xác định LOD của metformin HCl .................. 35
Hình 3.12. Sắc kí đồ phân tích các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường
bằng HPTLC ................................................................................... 37
Hình 3.13. Kết quả chồng phổ UV quét tại vị trí có Rf  0,77 (vết

glibenclamid)của các mẫu dương tính với glibenclamid............... 38
Hình 3.14. Phổ Raman của bột glibenclamid chuẩn, phổ SERS của
glibenclamid sau khi nhỏ các hỗn dịch keo bạc M5 và F4 ............. 42
Hình 3.15. Hình ảnh đo TEM của các hỗn dịch keo bạc trong nước (M5) và
keo bạc trong DMF (F4) ở các độ phóng đại khác nhau ................ 43


Hình 3.16. Phổ hấp thụ UV-vis của các hỗn dịch keo bạc M5 và F4 ............. 44
Hình 3.17. Mối quan hệ giữa nồng độ keo bạc M5 với mức độ tương đối của
đỉnh cao nhất 1244 cm-1 của glibenclamid ..................................... 45
Hình 3.18. Phổ Raman ở glibenclamid bột chuẩn, vết glibenclamid khi không
nhỏ keo bạc và vết glibenclamid có nhỏ keo bạc ........................... 46
Hình 3.19. Hình ảnh thể hiện tính chọn lọc của phương pháp ....................... 47
Hình 3.20. Kết quả khảo sát LOD của phổ SERS của glibenclamid .............. 48


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, con người có xu hướng quay về thiên nhiên trong việc phòng
bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những bệnh mãn tính. Các thuốc đông
dược, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ (TPBVSK) có nguồn gốc tự nhiên đang là
mục tiêu mà các nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên
thế giới hướng tới. Tuy nhiên, tình trạng tân dược được trộn trái phép trong
đông dược, TPBVSK từ dược liệu đang diễn ra (thành phần có hoạt chất tân
dược nhưng không công bố trên nhãn).
Đái tháo đường là một bệnh mạn tính và có thể gây tổn hại nghiêm
trọng cho nhiều hệ thống cơ thể trong một thời gian dài. Theo ước tính
của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 422 triệu bệnh nhân đái
tháo đường trên toàn thế giới và khoảng 90% trong số đó là đái tháo
đường typ II (không phụ thuộc insulin) [31]. Hơn nữa, trên thị trường
dược phẩm, bốn loại thuốc tổng hợp chính bao gồm: sulfonylure,

biguanid, thiazolidin và các thuốc khác không phải sulfonylure, được sử
dụng phổ biến để điều trị tiểu đường typ II. Tuy nhiên, những thuốc giảm
glucose máu thường bị phát hiện trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm
đông dược như metformin, glibenclamid, gliclazid [23], [28]; ... Nếu sử
dụng các chế phẩm này trong một thời gian dài mà không biết rõ thành
phần, người sử dụng có thể xuất hiện tình trạng nhiễm toan lactic, rối loạn
tiêu hóa, tổn thương gan thận…[33], [35]. Do đó, một nhu cầu cấp thiết
nhằm phát triển một phương pháp nhanh chóng để sàng lọc các chế phẩm
đông dược bị trộn lẫn các thuốc tổng hợp hoá học này. Do metformin và
glibenclamid là hai thuốc tân dược thường được trộn nhiều nhất vào các
chế phẩm đông dược, nên đề tài đã chọn 2 dược chất này để nghiên cứu.
Hiện nay đã có một số nghiên cứu phát hiện các thuốc tân dược trộn
lẫn trong thuốc đông dược, TPBVSK được triển khai như sắc ký lớp mỏng
1


(TLC) [21], [25], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [21], sắc ký lỏng kết
nối khối phổ (LC-MS) [23], [15], TLC kết hợp tán xạ Raman tăng cường
bề mặt (TLC-SERS) [17], [35]…Trong đó, tách bằng TLC sau đó phát
hiện tại bước sóng 254 nm hoặc 366 nm đã được sử dụng để phát hiện
nhanh và có thể định lượng được các thuốc tân dược trộn trong đông
dược. Phương pháp này có khả năng tách các dược chất ra khỏi nền mẫu
vì nền mẫu của các chế phẩm đông dược rất đa dạng. Trong khi đó, tán xạ
Raman là một kỹ thuật nhạy trên bề mặt, có thể tăng cường từ 104-106 so
với quang phổ Raman bình thường [32]. Kết hợp TLC và SERS sẽ thuận
lợi cho việc phát hiện tại chỗ vì tính đơn giản, nhanh chóng, cung cấp
nhiều thông tin về dược chất và tăng độ chọn lọc của phương pháp, đồng
thời loại trừ khả năng phát huỳnh quang của dược liệu.
Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn
trong các chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn lẫn trong các chế phẩm
thuốc đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”.
Với mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng metformin và
glibenclamid trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao; đồng thời ứng dụng phương pháp này để phân tích một số
mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường.
2. Bước đầu khảo sát các điều kiện phát hiện glibenclamid bằng TLC
kết hợp với tán xạ Raman tăng cường bề mặt.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
1.1.1.Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dược hỗ trợ điều trị và
điều trị tiểu đường
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên
nang, viên hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có
chứa một hoặc hỗn hợp của các chất sau đây: a) Vitamin, khoáng chất, acid
amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác; b) Hoạt
chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc
thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa [2].
Thuốc y học cổ truyền (bao gồm cả vị thuốc y học cổ truyền và thuốc
thang) là thuốc có thành phần là dược liệu được chế biến, bào chế hoặc phối
ngũ theo lý luận và phương pháp của y học cổ truyền hoặc theo kinh nghiệm
dân gian thành chế phẩm có dạng bào chế truyền thống hoặc hiện đại [1].
Thuốc thành phẩm y học cổ truyền (thuốc đông y, thuốc từ dược liệu) là
dạng thuốc y học cổ truyền đã qua tất cả các giai đoạn sản xuất, kể cả đóng
gói và dán nhãn, bao gồm: Thuốc dạng viên, thuốc dạng nước, thuốc dạng

chè, thuốc dạng bột, thuốc dạng cao và các dạng thuốc khác [1].
Mặc dù trong những năm gần đây đã có sự cải tiến của các loại thuốc
chống đái tháo đường tổng hợp, điều trị bệnh tiểu đường vẫn không đạt được
thành công rõ rệt. Điều trị bệnh tiểu đường là phức tạp do đây là bệnh mạn
tính, người bệnh phải dùng thuốc cả cuộc đời, trong khi đó lại thiếu thuốc an
toàn và hiệu quả, không bền vững về lâm sàng…Ngược lại, các loại thuốc
thảo dược đã đạt được tầm quan trọng lớn hơn trên toàn thế giới, chủ yếu là
do tính an toàn cao hơn, ít tác dụng bất lợi hơn và khả năng hạ thấp lượng
đường trong máu ổn định. Ở các nước phát triển, việc sử dụng thuốc thảo
dược cho người mắc bệnh tiểu đường được khuyến khích bởi những lo ngại

3


về tác dụng phụ và chi phí liên quan tới việc sử dụng lâu dài các thuốc tổng
hợp. Ở Việt Nam, các thuốc đông dược và TPBVSK sử dụng hộ trợ điều trị
tiểu đường rất đa dạng. Người bệnh có thể đến các nhà thuốc để mua các
TPBVSK có số đăng ký, được bào chế thành dạng viên nén, viên nang hoặc
trà túi lọc thuận tiện cho việc sử dụng. Trong khi đó, các chế phẩm thuốc
đông dược của các lương y, lương dược (không có số đăng ký) được bào chế
dưới dạng viên hoàn hay thuốc bộtngoài được bán tại cơ sở chế biến còn được
bán trên các trang mạng xã hội, người bệnh không cần đến tận nơi cũng có thể
có được sản phẩm thuốc để sử dụng. Điều này vừa có lợi vừa bất lợi cho
người bệnh, khi những chế phẩm này chưa được kiểm soát chặt chẽ có thể có
những chế phẩm bị trộn lẫn tân dược mà người sử dụng không được biết.
Về thành phần của các thuốc đông dược và TPBVSK hỗ trợ điều trị tiểu
đường cũng rất đa dạng. Các chế phẩm có thể chỉ có 1 thành phần là dược liệu
như Diabetna, Dây thìa canh Gia Huy…trong thành phần có chứa dược liệu là
dây thìa canh.Các chế phẩm phổ biến có nhiều thành phần hơn, từ 2 tới 10
thành phần là dược liệu. Cũng có những chế phẩm có khá nhiều thành phần

như các thuốc gia truyền điều trị tiểu đường của các lương y, lương dược có
thể lên tới 14, 15 thành phần là dược liệu. Các dược liệu phổ biến nhất được
sử dụng trong các chế phẩm này là dây thìa canh, khổ qua, nhàu, giảo cổ lam,
sinh địa, hoài sơn…
Tuy thuốc từ thảo dược đã sử dụng lâu đời, nhưng người sử dụng có
rất ít kiến thức về tính an toàn của nó. Thuốc đông dược được tự do bán
trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị và được tiếp thị tràn
lan trên các trang mạng. Do quy định thiếu chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo
dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp không khai
báo. Đã có 85 tỷ USD các thuốc từ dược liệu bị làm giả được bán ra trong
năm 2010 và hàng năm tăng lên 5,4%. Có 222 trong số 332 các sản phẩm bị
làm giả đã được thu hồi. Hơn 95% các sản phẩm được tìm thấy bị làm giả với
4


các thuốc tăng cường tình dục [22]. Các nước chi tiêu hàng đầu cho các sản
phẩm này là: Singapore, Hồng Kông, Na Uy, Australia và Hàn Quốc [22].
Khảo sát gần đây được tiến hành bởi một nhóm người Pháp phát hiện ra rằng
61% trong số 150 thực phẩm chức năng đã được pha trộn với các chất ức chế
PDE-5 (27% sildenafil, tadalafil và vardenafil; 34% từ các chất có cấu trúc
tương tự) [30].
Đây cũng là vấn đề mà các cơ quan chức năng của nước ta cũng rất quan
tâm. Trong những năm gần đây, cùng với sự phối hợp của các cơ quan công
an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã
phát hiện nhiều loại thuốc và chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược.
Trong đó bao gồm cả chế phẩm có và không có nguồn gốc, được sản xuất
trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là các chế phẩm không
có số đăng ký. Các chế phẩm này ngày càng được làm giả một cách khéo léo
và tinh vi: ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều
dùng của thuốc…

Nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ
dược liệu sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành
nhiều văn bản chỉ đạo tăng cường công tác quản lý chất lượng dược liệu,
thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu, đặc biệt là Chỉ thị số 03/CTBYT ngày 24/02/2012 về việc tăng cường quản lý cung ứng, sử dụng
dược liệu, thuốc Y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khám
chữa bệnh bằng y học cổ truyền với nhiều giải pháp đồng bộ. Kết quả
kiểm tra đánh giá chất lượng thuốc năm 2013, toàn quốc có 56.179 mẫu
thuốc đã được kiểm tra đánh giá chất lượng (cả thuốc tân dược và đông
dược), trong đó phát hiện 1004 mẫu thuốc (1,79 %) không đạt chỉ tiêu
chất lượng và 08 (0,014%) mẫu thuốc giả; tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém
chất lượng là (1,8%). Tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng năm 2013
(1,8%) giảm so với năm 2012 (3,09%) [12].
5


Đã có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tình trạng trộn lẫn tân dược trong các
chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường tại các nước [15], [23]... Tại
Trung Quốc năm 2010, khi kiểm tra 30 mẫu thuốc cổ truyền và thực phẩm
chức năng trên thị trường đã phát hiện trong 14 mẫu có chứa các thuốc chống
đái tháo đường tổng hợp (gồm có: glibenclamid, metformin, rosiglitazon,
glimepirid, phenformin…) [23]. Trong một nghiên cứu khác tiến hành năm
2009 cũng tại nước này, trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5
thuốc được phát hiện có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, 3 thuốc
chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin [28]. Tại Ả
Rập Saudi, trong nghiên cứu công bố năm 2006, khi tiến hành kiểm tra các
mẫu chế phẩm nguồn gốc dược liệu cũng đã phát hiện một số mẫu dương tính
với glibenclamid [15].
Từ các nghiên cứu ở các nước trên thế giới, nhận thấy glibenclamid và
metformin thường được trộn vào các chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị tiểu
đường, do đó đề tài này đã lựa chọn 2 hoạt chất này để tiến hành nghiên cứu.

1.1.2.Cấu trúc, tính chất lý hoá và tác dụng của metformin, glibenclamid
1.1.2.1 Metformin

Công thức hoá học: C4H11N5. HCl
Tên khoa học: 1,1 – dimethylbiguanid hydroclorid [6].
Tính chất: Tinh thể trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%,
thực tế không tan trong aceton và dicloromethan. Điểm chảy từ 2220C đến
226oC [3], [6].
Liều dùng: Viên nén 500 mg: Bắt đầu uống 500 mg/lần, ngày 2 lần. Tăng
liều thêm một viên mỗi ngày, mỗi tuần tăng 1 lần, tới mức tối đa là 2.500
mg/ngày [5].
6


Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng ức chế hấp thu glucose ở ruột,
tăng nhập glucose vào tế bào, kích thích phân huỷ và ức chế tái tạo glucose.
Ngoài ra còn làm giảm lipid máu [4].
Tác dụng không mong muốn [5]: thường gặp là tình trạng tăng acid lactic
gây toan máu; miệng có vị kim loại, chán ăn, nôn, buồn nôn, ỉa chảy, đầy
thượng vị, táo bón, ợ nóng; ban, mày đay, cảm thụ với ánh sáng; giảm nồng
độ vitamin B12. Ít gặp hơn là các tác dụng không mong muốn trên huyết học
như: loạn sản máu, thiếu máu bất sản, thiếu máu tan huyết, suy tuỷ, giảm tiểu
cầu, mất bạch cầu hạt.
1.1.2.2.Glibenclamid

Công thức hoá học: C23H28ClN3O5S
Tên

khoa

học:

1–(4–(2–(5–cloro–2–methoxybenzamido)

ethyl)

benzensulfonyl)–3 – cyclohexylure [6].
Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong
dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung
dịch kiềm loãng. Nóng chảy ở 1690C đến 1740C [3], [6].
Liều dùng: Liều ban đầu từ 2,5 - 5 mg mỗi ngày. Liều duy trì từ 1,25 - 10
mg/ngày. Liều tối đa là 15 mg/ngày [5].
Tác dụng: kích thích trực tiếp tế bào beta đảo Langerhan của tuyến tuỵ
tăng sản xuất insulin làm giảm nồng độ glucose trong máu. Làm tăng số
lượng receptor của insulin ở các tế bào, đặc biệt là các tế bào mỡ, hồng cầu,
bạch cầu đơn nhân, do đó làm tăng tác dụng của insulin. Ức chế nhẹ tác dụng

7


của glucagon. Thuốc không có tác dụng khi cơ thể không còn khả năng tiết
insulin [4].
Tác dụng không mong muốn [5]: thường gặp là nôn, buồn nôn, hạ glucose
huyết, ban da, mày đay. Ít gặp hơn là mất bạch cầu hạt, giảm huyết cầu toàn
thể, giảm tiểu cầu; viêm mạch dị ứng, mẫn cảm với ánh sáng, vàng da do
viêm gan hoặc ứ mật, tổn thương thị giác tạm thời.
1.2.Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu
1.2.1.Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) trong kiểm nghiệm dược phẩm đã được phát
triển từ lâu. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Pha tĩnh của TLC là các hạt

có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng
nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất
dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan,
cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất là
silica (SiO2) và nhôm oxyd. Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có
thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion...[7], [3].
Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường sức rửa
giải, thường kết hợp 2-3 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số
phân bố giữa hai pha. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn.
Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản
chất của chúng, kết quảlà chúng được tách riêng có vị trí khác nhau trên
bản mỏng [7].
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ Rf . Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân
tích và quãng đường dịch chuyển của pha động [7], [3].
Rf = d R /dM
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).

8


dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
Rf: có giá trị dao động giữa 0 và 1.
TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu
điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được
tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm
xuất phát); thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể
thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử
với mẫu chuẩn; phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành

phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của
thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm
dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh
khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả [7].
1.2.2.Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến
của TLC. HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính
ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra. Trong đó,
các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ,
do đó có độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu,
nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm
thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun
mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích
mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với
chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt
độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi
tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm
khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm
giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [14].
9


Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử
dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản này được
tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có
kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, hiệu
quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được
tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung
môi ít hơn so với TLC [14].
Ưu điểm của HPTLC:

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.
- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều
mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản
mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ,
độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa
các lần phân tích.
- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung
môi như lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu.
Do những ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC cho
nghiên cứu này.
1.2.3.Phương pháp quang phổ Raman
1.2.3.1. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman
Khi chiếu chùm bức xạ tán xạ vào một tấm kính ảnh thì nhận được một dải
vạch khác nhau, gọi là phổ Raman. Trong phổ Raman có một vạch đậm ở
giữa có tần số vo bằng tần số của bức xạ kích thích, còn ở hai bên là các vạch đối
xứng nhau có tần số lớn hơn hoặc nhỏ hơn. Các vạch có tần sốvo– vgọi là « tán
xạ Stokes », còn vạch có tần số vo+ v gọi là « tán xạ đối Stokes » [9], [11].
Quang phổ Raman xuất hiện là do sự tương tác giữa ánh sáng với các phân
tử. Qua sự tương tác này mà lớp vỏ electron của các nguyên tử trong phân tử
bị biến dạng tuần hoàn. Hay nói cách khác là nguyên tử trong phân tử bị dao

10


động. Sự dao động này cần năng lượng lấy ra từ năng lượng của bức xạ kích
thích ban đầu, nhưng khi dao động thì đồng thời nó cũng bức xạ năng lượng
trở lại, nhưng năng lượng bức xạ có thể bằng hoặc lớn hơn hay nhỏ hơn năng
lượng mà bức xạ kích thích cung cấp cho nó [11].
Ánh sáng tới với tần số v0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các

photon với năng lượng E=hv0. Nếu phân tử nhận năng lượng hv từ photon tới
thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h(v0-v), và tần số của photon tán
xạ khi đó là (v0-v). Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng hv từ phân tử,
các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h(v0+v) và tần số của
photon tán xạ là (v0+v) [9], [11].
Tần số của các vạch Stokes (v0+v) và đối Stokes (v0-v) phụ thuộc vào bản
chất của chất tán xạ và tần số vo của bức xạ kích thích nhưng hiệu số Δv=v chỉ
phụ thuộc vào bản chất của chất tán xạ (mẫu đo). Vì vậy phổ Raman ghi theo
v (cm-1) đặc trưng cho cấu tạo của các hợp chất hoá học [11].

Hình 1.1. Các thành phần tán xạ thu được sau khi cho ánh sáng kích thích
đến mẫu
Hình 1.1 và 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes. Tán xạ Stokes xảy
ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản,
còn tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái
năng lượng kích thích. Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng

11


thái năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số. Vì
vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes [9].

Hình 1.2. Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes, m, n, r: các mức năng lượng
1.2.3.2. Đại lượng đặc trưng
Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman là Raman shift.
Raman shift đặc trưng cho sự thay đổi tần số trong hiệu ứng Raman tạm gọi là
« dịch chuyển Raman ». Đối với một chất, cường độ của những bức xạ tương
ứng trên Raman shift là khác nhau, các dải phổ hấp thụ là hẹp và nhọn, chúng
tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm

chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau. Vì vậy, phổ Raman
được xem là phổ vân tay để xác định chất phân tích. Phân tích phổ Raman có
thể xác định được chính xác một chất khi so sánh với phổ chuẩn, đồng thời
phổ Raman của một chất cũng là cơ sở quan trọng để nghiên cứu cấu trúc của
chất ấy [9].
1.2.3.3. Phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS)
Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (surface-enhancedRamanspectroscopy:
SERS) là một kỹ thuật quang phổ dao động nhạy trên bề mặt, có thể tăng
cường từ 104 - 106 so với quang phổ Raman bình thường, và hệ số tăng cường
có thể lên đến 1014 - 1015 với sự cộng hưởng [32]. Các huỳnh quang nền bắt
nguồn từ các chất màu của mẫu thực vật có thể khắc phục bằng kỹ thuật này.
SERS đã được áp dụng trong các lĩnh vực sinh hóa và khoa học đời sống, cho
12


cả phân tích định tính và định lượng. Các cơ chế lý thuyết của SERS liên
quan đến việc tăng cường điện từ (EME) và tăng cường hoá học (CE). EME
liên quan đến độ nhám bề mặt tạo bởi các hạt nano kim loại (còn gọi là chất
nền SERS) và thậm chí sự kết tập các hạt nano có thể mang lại hệ số tăng
cường lớn lên đến 1012. EME cũng phụ thuộc vào khoảng cách giữa các chất
phân tích và bề mặt kim loại (cũng được gọi là một điểm nóng). CE là kết quả
của sự tương tác giữa các phân tử hoá chất hấp thụ và bề mặt kim loại. Hoá
chất hấp thụ gây ra sự dịch chuyển vị trí, tăng tán xạ Raman cắt ngang, và có
thể mang lại hệ số tăng cường lớn tới 102. Như vậy, hiệu ứng kết hợp của
những yếu tố tăng cường có thể mở rộng độ nhạy phát hiện của quang phổ
SERS tới một mức độ đơn phân tử [19].
Yin và cộng sự đã thử nghiệm với điều kiện pH khác nhau để phát triển
một cơ sở dữ liệu dấu vân tay SERS cho các thuốc cổ truyền Trung Quốc,
được hấp thụ trên các hạt nano Ag. Phương pháp này có thể giúp người dùng
tránh mua phải các sản phẩm có chứa các chất thêm vào không rõ ràng [32].

Bên cạnh đó, Du và cộng sự đã sử dụng các hạt nano Au hoặc Ag để thiết lập
một tương quan tuyến tính giữa phát hiện SERS và nồng độ aminopyrin. Giới
hạn phát hiện (LOD) là 2.50 × 10-7 M trong dung dịch nước [34]. Những
phương pháp này có thể giúp người dùng xác định sự hiện diện của các thành
phần bất hợp pháp trong các chế phẩm thuốc cổ truyền.
Ngoài ra, SERS còn được sử dụng trong phân tích các dược liệu để xác
định các thông tin sinh hoá của nước sắc dược liệu hay các thành phần hoá
học của các thảo dược [19].
Các nghiên cứu về Raman ở Việt Nam hiện nay đang là xu hướng mới. Đã
có một số nghiên cứu bước đầu sử dụng quang phổ Raman trong sàng lọc
nhanh thuốc giả [8], [10]…Có thể thu phổ Raman trực tiếp trên bề mặt mẫu
qua đầu đo nhanh, đo mẫu bên trong các bao bì lớn thông qua các đầu dò
quang học, đo mẫu lỏng bằng curvet, đo mẫu rắn (như mẫu viên) bằng thiết bị
13


giữ mẫu…Đối với TLC-SERS, sau khi rửa giải, tấm TLC được để làm khô tự
nhiên, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu trên một máy quét TLC
ở bước sóng 254 nm. Hỗn dịch keo bạc được nhỏ trực tiếp tới mỗi điểm được
đánh dấu trên tấm TLC. Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng
máy quang phổ Raman khi những điểm này vẫn còn ướt. Hiện nay, các hỗn
dịch keo bạc vẫn chưa được thương mại hoá mà thường được tạo ra trước khi
tiến hành nghiên cứu. Hoạt tính của chất nền SERS này phụ thuộc vào kích
thước và hình thái của các hạt keo.
1.3.Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng nhóm thuốc giảm glucose
máu trộn trong các chế phẩm từ dƣợc liệu
Ning Li [23] sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để phát hiện và định
lượng 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp bổ sung bất hợp pháp
trong thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng của Trung Quốc. Các mẫu ở
các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên, thuốc hạt được chuyển về dạng bột

đồng nhất. Lượng bột mẫu tương đương với một đơn vị liều được cân chính
xácvà chuyển vào một bình nón 100ml, thêm 40 ml methanol, siêu âm trong
20 phút, lọc qua giấy lọc. Mẫu được tách trên cột C18 với pha động gồm
acetonitril và nước (cả hai có chứa 0,1% acid formic) rửa giải theo gradient,
tốc độ dòng 0,20 ml/phút, thể tích tiêm 10µl, chế độ phát hiện MRM, các
LOD dao động 0,03-5,45 ng/mL. Kết quả có 9 loại thuốc chống đái tháo
đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, rosiglitazon,
glimepirid, phenformin, gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và mitiglinid)
được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30 mẫu thu thập từ thị trường. Lượng
glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,88 mg/viên đến 6,78 mg/viên; lượng
metformin thay đổi từ 4,33 mg/viên đến 341 mg/viên.
Wensheng Pang [28] đã tiến hành phát hiện và xác định cấu trúc của
các thuốc hạ đường huyết tổng hợp thêm trái phép vào các sản phẩm thuốc từ
thảo dược để chống bệnh tiểu đường bằng phương pháp LC-MS-MS, phân
14


tích theo chế độ MRM. Các mẫu dạng viên nén hoặc nang được nghiền thành
bột, sau đó chiết siêu âm với methanol (2 lần x 100 ml; 20 phút mỗi lần); gộp
dịch chiết và ly tâm 10 phút, gạn dịch và chuyển sang bình định mức 250 ml
và pha loãng đến vạch bằng methanol; 1ml dung dịch này được chuyển sang
bình định mức 10ml và pha loãng đến vạch bằng methanol. Sử dụng cột C18
(2,1mm x 150mm, 5µm); pha động là hỗn hợp của acetonitril và dung dịch
acid formic 0,05% trong nước tỷ lệ 60:40; tốc độ dòng 0,2ml/phút tại 40,7
bar; thể tích tiêm 10µl. Trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5
thuốc phát hiện thấy có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, và 3 thuốc
chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin. Hàm lượng
glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,28 mg/viên đến 4,9 mg/viên, tính
theo liều dùng tối đa hàng ngày là 1,56 mg đến 29,4 mg; lượng metformin
được trộn là 21,3 mg/viên, tính theo liều dùng tối đa hàng ngày là 127,8 mg.

Kenichi Kumasaka [21] đã sàng lọc và định lượng cho 6 sulfonylure
chữa tiểu đường: tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid, gliclazid,
glibenclamid, và glimepirid pha trộn trong thực phẩm chức năng. Các
sulfonylure được chiết với aceton, sau đó dịch chiết đem tiến hành TLC và
HPLC. Trong phân tích TLC, các chất tách tốt với pha động gồm n-butyl
acetat có chứa 0,4% acid formic. Quan sát vết ở UV 254nm. Thuốc thử phát
hiện: Dragendoff, acid phosphomolybdic 10%/methanol, acid sulfuric
30%/methanol. Giá trị Rf tương ứng của tolbutamid, acetohexamid,
chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid và glimepiridtrong các mẫu là 0,78;
0,58; 0,69; 0,48; 0,40 và 0,35. Với phương pháp HPLC sử dụng cột Cadenza
CD-C18, pha động: acetonitril-đệm amoni acetat theo gradient, tốc độ dòng
1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện: 230 nm, 247 nm.
Mei Cui [16] sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC) kết hợp
với DAD để xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp
trong các thuốc cổ truyền của Trung Quốc. Các mẫu ở các dạng: viên nén,
15


viên nang, thuốc viên và thuốc hạt được nghiền thành bột đồng nhất. Lượng
bột tương đương 1 liều dùng được cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml
methanol, chiết siêu âm trong 20 phút, pha loãng đến vạch bằng methanol.
Việc tách được thực hiện trên cột C18 với pha động gồm acetonitril và dung
dịch chứa 1,0mmol natri dodecyl sulfat và triethylamin 0,1% (sử dụng acid
phosphoric điều chỉnh tới pH 3,75), tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo
gradient, thể tích tiêm 20µl, phát hiện ở UV 220nm. Kết quả, có 7 loại thuốc
chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin,
phenformin, rosiglitazon, gliclazid, glimepirid và mitiglinid) được tìm thấy từ
9 trong số 26 mẫu thuốc cổ truyền thu thập được. Hàm lượng glibenclamid
được trộn lẫn thay đổi từ 0,58 mg/viên đến 3,25 mg/viên, tính theo liều dùng
là 3,34 mg/ngày đến 13,8 mg/ngày; hàm lượng metformin được trộn thay đổi

từ 2,28 mg/viên đến 2,57 mg/viên, tính theo liều dùng là 21,5 mg/ngày đến
65,4 mg/ngày.
Yan Zhang và cộng sự [32] đã xây dựng phương pháp phân tích sử
dụng tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) cho năm loại thuốc bổ sung
bất hợp pháp (rosiglitazon, phenformin, metformin, pioglitazon và
sibutramin) trong thuốc cổ truyền Trung Quốc. Các chất chuẩn được hoà tan
trong nước khử ion. Mẫu phân tích là các chế phẩm thuốc cổ truyền dạng viên
nang được mua tại thị trường Trung Quốc. Các mẫu phân tích (bao gồm cả vỏ
nang) được trộn lẫn với một lượng xác định các chất phân tích mục tiêu và
sau đó hỗn hợp được hoà tan trong nước khử ion. Sử dụng máy quang phổ
Raman cầm tay (i-Raman, BWTEK, USA) để phát hiện. Bước sóng kích thích
là785 ±1 nm, phổ SERS được ghi từ 175-3100 cm-1 với độ phân giải của phổ
là 5 cm-1, và thời gian thu là 20s. Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua
(TEM) (JEM-2010, JEOL Ltd, Nhật Bản) để thu được hình ảnh TEM. Các
điều kiện pH tối ưu cho mỗi loại thuốc cũng đã được thăm dò. Đỉnh đặc trưng

16