Nghiên cứu chiết tách các catechin có hoạt tính sinh học từ chè xanh camellia sinensis l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------ĐỖ VĂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CATECHIN CÓ HOẠT TÍNH SINH
HỌC TỪ CHÈ XANH CAMELLIA SINENSIS L.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGHÀNH : KĨ THUẬT HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. TRẦN BẠCH DƯƠNG
2. PGS.TS. VŨ ĐÌNH HOÀNG

HÀ NỘI, NĂM 2011


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC

1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

6

LỜI MỞ ĐẦU

8

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

10

1.1 Giới thiệu chung về cây chè và EGCG

10

1.1.1 Vài nét về tình hình trồng và chế biến chè ở trong và ngoài nước

10

1.1.2 Chè xanh và chế phẩm trong thực phẩm và dược phẩm

11

1.2 Thành phần hóa học và sinh học của chè xanh

13

1.2.1 Tannin và catechin

14

1.2.2 Giới thiệu riêng về EGCG

17

1.2.3 Các thành phần khác

18

1.3 Các phương pháp công nghệ sản xuất catechin chè xanh
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20
26

2.1 Đối tượng nghiên cứu

26

2.2 Các phương pháp phân lập sản phẩm

27

2.2.1 Quy trình chiết tổng Polyphenol và caffeine thô

27

2.2.2 Phân tách các hợp chất catechin từ tổng pholyphenol

28

2.3 Các phương pháp phân tích sản phẩm

31

2.3.1 Sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ

31

2.3.2 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân

31

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

32

3.1 Tổng polyphenol thu nhận

32

3.2 Caffeine (T4)

35

1


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

3.2.1 Tinh chế caffeine thô

35

3.2.2 Kết quả phân tích cấu trúc caffeine bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
–NMR

37

3.3 Epicatechin - EC ( FT2)

42

3.3.1 Tinh chế EC thô

42

3.3.2 Kết quả phân tích cấu trúc FT2 bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
–NMR

42

3.4 Epigallocatechin - EGC ( TM2K)

47

3.4.1 Tinh chế EGC thô

47

3.4.2 Kết quả phân tích cấu trúc FT2 bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
–NMR

47

3.5 Epigallocatechin gallat – EGCG (TM3K)

53

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN

60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

61

PHỤ LỤC

64

2

Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)

13

C-NMR

Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy)

DEPT

Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimensional NMR)

HSQC

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence )

HMBC

Phổ HMBC ( heteronuclear multiple bond connectivity)

MS

ESI-MS

TLC

δ (ppm)
EGCG

Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

electron spray ionization mass spectroscopy

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Độ chuyển dịch hóa học (ppm)

Epigallocatechin gallate

(TM3K)
EGC

Epigallocatechin

(TM2K)

3


Luận văn thạc sĩ khoa học

ECG

EC (FT2)

Đỗ Văn Đạt

Epicatechin gallate

Epicatechin

T4

Caffeine

4


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

DANH MỤC CÁC BẢNG DÙNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.2a: Các catechin chính đã tìm thấy trong chè xanh ................................................ 13
Bảng 1.2b: Thành phần catechin trong các bộ phận chè xanh............................................. 14
Bảng 1.4: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theocác kỹ thuật sử dụng viba, siêu âm
và Soxhlet ..............................................................................................................................16
Bảng 1.5: Tiêu chuẩn các sản phẩm polyphenol của công ty FuZhou Corona Science &
Technology Development Co., Ltd. (Trung Quốc)..............................................................22
Bảng 3.1 Đánh giá cảm quan về polyphenol...........................................................................24
Bảng 3.2 : Hàm lượng Catechin trong polyphenol đo LC-MS ...............................................33
Bảng 3.3: Độ chuyển dịch hóa học δH và δC của T4 ( caffeine)............................................34
Bảng 3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất EC..........................................................39
Bảng 3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất TM2K (EGC)........................................45
Bảng 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất EGCG (epi-Gallocatechin gallate)........51
Bảng 1.1: Ứng dụng của chế phẩm polyphenol chè xanh trong chế biến thực phẩm...............57

5


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

DANH MỤC HÌNH DÙNG TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1: Búp chè xanh.................................................................................................10
Hình 1.2 Công thức tổng quát của catechin..................................................................14
Hình 1.3: Một số cấu trúc catechin chè xanh................................................................15
Hình 1.4: Tóm tắt công nghệ chiết Polyphenol chè xanh trên thế giới.........................21
Hình 2.1: Chè xanh nguyên liệu của đề tài....................................................................26
Hình 2.2 Thiết bị Soxhlet Pilot 20 lít............................................................................27
Hình 2.3 Cột chạy tách các hợp chất catechin thô từ polyphenol...............................29

Hình 2.4 Cột tinh chế EGCG.........................................................................................31
Hình 3.1 Mẫu tinh thể polyphenol.................................................................................32
Hình 3.2.a : Sắc ký đồ mẫu tổng polyphenol................................................................33
Hình 3.2.b Các thông số phân tích mẫu tổng polyphenol.............................................34
Hình 3.3: Tinh thể caffeine............................................................................................35
Hình 3.4 Sơ đồ tinh chế Caffeine..................................................................................36
Hình 3.5a : Phổ 1H của caffein( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6..................38
Hình 3.5b : Phổ 13C của caffein( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6................39
Hình 3.6 Phổ DEPT của caffein ( T4) được ghi trong dung môi DMSO-d6.................40
Hình 3.7 Công thức cấu tạo của caffein........................................................................41
Hình 3.8 a: Phổ 1H của EC trong dung môi DMSO-d6.................................................43
Hình 3.8 b: Phổ 13C của EC trong dung môi DMSO-d6...............................................44
Hình 3.9 Phổ DEPT của EC được ghi trong dung môi DMSO-d6................................46
Hình 3.10 Công thức cấu tạo của EC............................................................................47
Hình 3.11 a. Phổ 1H của EGCG được ghi trong dung môi DMSO-d6..........................49
Hình 3.11 b: : Phổ C13 được ghi trong dung môi DMSO-d6........................................50
Hình 3.12 Phổ DEPT của EGC được ghi trong dung môi DMSO-d6...........................52
Hình 3.13 Công thức cấu tạo của EGC.........................................................................53

6


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

Hình 3.14 Quy trình tách EGCG...................................................................................54
Hình 3.15a : Phổ 1H của EGCG được ghi trong dung môi DMSO-d6..........................55
Hình 3.15 b : Phổ C13 được ghi trong dung môi DMSO-d6.........................................56
Hình 3.16 Phổ DEPT của EGCG được ghi trong dung môi DMSO-d6........................58

Hình 3.17 Công thức cấu tạo EGCG.............................................................................59

7


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

LỜI MỞ ĐẦU

Chè được sử dụng như một loại đồ uống và phương thuốc trong y học phương
đông từ hàng ngàn năm trước Công nguyên. Tuy nhiên, việc đẩy mạnh các nghiên
cứu cơ chế và tìm cách ứng dụng các hoạt chất phenolic trong chè xanh vào y học
hiện đại mới chỉ bắt đầu từ nửa sau thế kỷ 20. Cho đến nay, với hoạt tính chống ôxy
hóa mạnh, các hợp chất catechin trong chè xanh (chiếm tới 30 % hàm lượng khô) đã
được sử dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Trong y học, các catechin
(EC, EGC, ECG, EGCG) đã được áp dụng trong điều trị nhiều loại bệnh tim mạch,
viêm và ung thư. Các hoạt chất này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng phối hợp với các
biệt dược xử lý các bệnh viêm, dị ứng, tim mạch như Alzheimer, béo phì, tiểu đường
phụ thuộc Insulin, Parkinson, HIV-1, ung thư da và một số loại ung thư khác. Năm
2006, Cục Quản lý Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã công nhận cao chiết chè
xanh, polyphenol chè xanh và các catechin là các loại dược phẩm và thực phẩm chức
năng được phép sử dụng tại Mỹ. Trong lá chè xanh, thành phần catechin chủ yếu
Epigallocatechin gallat (EGCG, có hàm lượng > 50 % trong tổng polyphenol) cũng
là chất có hoạt tính mạnh nhất.
Vì vậy mà làm thế nào tách được các catechin riêng biệt có độ tinh khiết cao,
phương pháp chiết tách đơn giản mà kinh tế là vấn đề rất được quan tâm. Tuy nhiên,
các catechin chè xanh có cấu trúc tương tự nhau làm cho quá trình tách riêng từng
catechin trở nên rất khó khăn. Hơn thế nữa thường các catechin chè xanh bị nhiễm

một lượng caffein, chất chiếm tới 4 % trọng lượng khô của lá chè và không dễ dàng
loại bỏ trong quá trình tách catechin. Với tác dụng to lớn của các catechin mà đặc
biệt là EGCG, việc nghiên cứu chiết xuất những chất này từ chè được quan tâm và
để ý tới.Với hướng đó tác giả đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu chiết tách các
catechin có hoạt tính sinh học từ chè canh Camellia Sinensis L ”.
Nội dung chính của đề tài :

8


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

- Nghiên cứu phương pháp chiết chè xanh để thu nhận polyphenol tổng số từ
chè xanh, đồng thời cũng thu được lượng caffeine.
- Xác định hàm lượng “tổng phenol”, sự phân bố các catechin;
- Phân lập và xác định cấu trúc các catechin tinh khiết phân lập được;

9


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về cây chè và catechin
1.1.1 Vài nét về tình hình trồng và chế biến chè ở trong và ngoài nước [1 - 3]

Cây chè, Camellia sinensis (L.) O.Kuntze. thuộc họ Chè - Theaceae, có nguồn
gốc ở Vân Nam, Trung Quốc sau đó được trồng phổ biến tại Việt Nam, Nhật Bản, Ấn
Độ và nhiều nước Châu Á khác [1].
Chè là cây thân gỗ, khoẻ, khi mọc
hoang có thể cao tới 10 m, đường kính thân
một người ôm không xuể. Đôi khi mọc thành
rừng gỗ trên núi đá cao. Nhưng khi trồng, để
phù hợp với việc thu hái người ta thường cắt
xén để cây chỉ cao nhất là 2m, nhiều cành
đâm ngay từ gốc, lá mọc so le. Hoa chè màu
trắng, to, mọc ở kẽ lá, mùi thơm, nhiều nhị.
Quả là một nang, thường có 3 ngăn nhưng chỉ
có một hạt do các hạt khác teo đi [2].
Theo số liệu thống kê năm 2002 FAO/WHO, tổng diện tích trồng chè thế giới
đạt 2.550.000 ha, tập trung chủ yếu ở các

Hình 1.1: Búp chè xanh

nước như Trung Quốc 1.086.000 ha (80,7 %),
Idonexia 129.400 ha (4,7 %), Kenya 97.000
ha (3,5 %), Việt Nam 82.000 ha (3,08 %).
Hàng năm, sản lượng chè trên thế giới đạt 2,5 triệu tấn chè, trong đó 80% có
nguồn gốc từ Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ và Srilanka.

10


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

Ở nước ta, chè được trồng ở 33 tỉnh (chủ yếu ở Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà
Giang, Thái Nguyên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Nghĩa Bình) với
tổng diện tích 125.000 ha, sản lượng 577.000 tấn, với rất nhiều loại chè thương phẩm
khác nhau, trong đó 60 % lượng chè xuất khẩu là chè đen. Năm 2006, Việt Nam là
nước xuất khẩu chè đứng thứ 7 thế giới, xuất khẩu sang 67 thị trường khác nhau, tăng
3 thị trường so với năm 2005, trong đó, Pakixtan là thị trường lớn nhất của Việt Nam
với sản lượng xuất khẩu trong năm 2006 tăng 34 % so với năm 2005. Ấn Độ là thị
trường đạt mức tăng trưởng xuất khẩu chè cao nhất trong năm 2006 với mức tăng 299
% về lượng và 293 % về trị giá so với năm 2005.
1.1.2 Chè xanh và chế phẩm trong thực phẩm và dược phẩm
Đồ uống trong văn hóa châu Á:
Chè là sản phẩm chế biến từ búp (tôm), cuộng và các lá non thu hái từ cây chè.
Với những phương pháp chế biến khác nhau, người ta phân ra hai loại chè:
+ Chè xanh: Nước pha xanh vàng, vị đậm dịu, có hương thơm tự nhiên của chè.
Chè xanh được chế biến bằng cách đem nguyên liệu chè diệt men (men có sẵn trong
nguyên liệu chè) rồi vò, sau đó đem sấy.
+ Chè đen: Trong quá trình chế biến không diệt men ngay mà có thêm quá trình
lên men để tạo ra những biến đổi sinh hóa cần thiết làm cho sản phẩm có màu sắc,
hương vị đặc biệt. Màu nước pha chè đen có màu đỏ nâu sáng, vị dịu, hương thơm
nhẹ.
Ngoài hai loại chè được tiêu thụ chủ yếu hiện nay ở trên, phụ thuộc vào công
nghệ chế biến, còn có các loại chè khác như: chè đỏ và chè vàng. Chè đỏ được chế
biến bằng cách đem nguyên liệu chè làm héo và lên men, sau đó sao và vò kết hợp,
cuối cùng sấy khô, loại chè này nước pha có màu vàng ánh hoặc ánh kim, vị đậm,
hương thơm đặc biệt. Chè vàng được chế biến từ nguyên liệu chè qua các giai đoạn
diệt men rồi vò (hoặc không vò), cuối cùng ủ, sao hoặc sấy ở nhiệt độ không cao.
Ngoài ra, các loại chè nếu đem ướp hương thì người ta gọi là chè hương, hoặc

11

Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

nếu sản phẩm chè ở dạng cánh rời thì gọi là chè rời, dạng bánh gọi là chè bánh, dạng
bột (nước pha chè đem cô đặc rồi sấy khô) gọi là chè bột hay chè hòa tan [4]. Đã hàng
trăm năm nay, người châu Âu và các cư dân nước Mỹ hài lòng với những chén chè đen
buổi sáng tinh sương hay trong các bữa tiệc gia đình ấm cúng. Còn ở châu Á và một số
các quốc gia Trung Đông, chè xanh là nước uống truyền thống từ hàng ngàn năm nay.
Ứng dụng trong dược - thực phẩm:
Các hiểu biết về cơ chế tác dụng sinh lý của chè mới được bắt đầu nghiên cứu
mạnh mẽ trong thế kỷ 20. Trước đây các tác dụng của chè thường được quy cho thành
phần caffein và vitamin C, bắt đầu từ khoảng thập niên 1970, các nghiên cứu sâu về
hóa sinh và hợp chất thiên nhiên đã chứng minh những tác dụng về mặt dược lý và
sinh lý của nhóm các hợp chất catechin trong chè. Đã có nhiều công bố về tác dụng
của các polyphenol chè xanh đối với các bệnh ung thư, tim mạch, tiết niệu, tiêu hóa,
Alzheimer, bệnh Parkison, .v.v...; ngoài ra polyphenol chè xanh còn có tác dụng làm
giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng xạ…[5, 6].
Theo nghiên cứu mới nhất của các nhà khoa học ở trung tâm dinh dưỡng
Unilever (Vlaardingen, Hà Lan), một số các bệnh viện đã bắt đầu đưa chè vào danh
sách những thực phẩm có tính năng bảo vệ sức khoẻ. Các nhà khoa học nhận thấy sau
khi uống đều đặn mỗi ngày 3 chén nước chè, có hoặc không có sữa tùy thuộc khẩu vị
của từng người, “khối lượng” và phạm vi hoạt động của gốc tự do ôxy hóa trong huyết
thanh của cơ thể đã giảm đi rõ rệt. Bên cạnh đó, nghiên cứu này còn lưu ý tác dụng của
chè xanh cao hơn so với chè đen. Một kết quả nghiên cứu mới được các chuyên gia
Đài Loan công bố cũng cho thấy rằng uống chè thường xuyên trong vài năm sẽ giúp
tăng cường mật độ khoáng chất bảo vệ xương ở cả nam và nữ giới.
Chè xanh có tác dụng giải khát, tăng cường chất dinh dưỡng và ngăn ngừa bệnh

nhờ vào các chất có hoạt tính sinh học cao có trong lá chè. Nó đã trở thành nguyên liệu
quan trọng để chế biến nhiều loại thức ăn, đồ uống khác nhau ở rất nhiều nước trên thế
giới. Phần lớn chè xanh được sử dụng ở dạng đồ uống. Tuy nhiên ngày nay, khuynh
hướng sử dụng chè xanh trong chế biến thức ăn rất được phát triển. Các loại bánh kem

12


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

chè xanh, bánh gatô chè xanh, kem chè xanh, thạch chè xanh, mì ăn liền chè xanh,
sandwich chè xanh đang được tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ, Úc.
Trong đó, Nhật Bản là nước có nhiều loại đồ uống và thức ăn được chế biến với chè
xanh nhất [7, 8], bảng 1.1 nêu một số ứng dụng trong thực phẩm của chế phẩm Theaflan (chế phẩm giàu catechin từ chè xanh) và polyphenol chè xanh.
Bảng 1.1: Ứng dụng của chế phẩm polyphenol chè xanh trong chế biến thực phẩm
Lĩnh vực
sử dụng

Hàm lượng sử dụng
Công dụng đối với các sản phẩm

Thea-flan

Polypheno
l

- Dầu ăn thông thường (dầu thực vật, dầu đậu
tương, dầu cọ, mỡ lợn...);

- Thực phẩm chứa dầu (snack food, thực phẩm rán,
margarin...);
- Dầu có chứa các axít béo bão hòa phân tử lượng 0,1 - 1,0 % 0,2 - 0,3 %
lớn;
Chất bảo quản
chống ôxi hóa - Kéo dài thời gian sử dụng của các thực phẩm chế
biến từ hải sản;
- Thịt, cá, thịt nghiền, xúc xích ...

Kiểm soát
mầm bệnh
Khử mùi

- Thực phẩm khô như bột cá;
- Bơ, phomat, sữa chua, bánh sữa...;
- Chống nhạt màu của các chất màu tự nhiên.

0,01 - 0,1
%

- Tất cả các thực phẩm thông thường

0,1 - 0,5 %

0,05 - 0,3
%

- Thực phẩm chống hôi miệng (bánh kẹo, kẹo cao
su)

0,1 - 0,5 %

≤ 0,2 %

- Đồ uống tăng lực
Thực phẩm
chức năng

0,1 - 0,3 %

- Chống sâu răng, viêm lợi (kẹo, bánh);
- Ngăn ngừa cảm cúm;
- Ức chế tăng cholesterol (sử dụng trong hămbơgơ,
thịt băm, xúc xích, thực phẩm rán... cho người ăn
kiêng).

0,1 - 2 %

1.2 Thành phần hóa học và sinh học của chè xanh
Thành phần hóa học của nguyên liệu chè bao gồm tannin, cafein, protein, tinh
dầu, men, sắc tố, pectin, vitamin, chất khoáng, axit hữu cơ... trong đó tannin, cafein,

13


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

sắc tố, dầu thơm, pectin là những thành phần quan trọng quyết định màu sắc, hương vị

của sản phẩm [3].
1.2.1 Tannin và catechin
Một số khái niệm:
Tannin là tên chung để chỉ hỗn hợp các chất polyphenol, trong đó bao gồm cả
các catechin chè xanh (Xem thêm Hình 1.2), hàm lượng tannin tăng dần từ đầu vụ
(tháng 3 - 4), đạt cực đại vào giữa tháng 7 rồi giảm dần vào mùa thu. Các hợp chất này
dễ bị ôxy hóa dưới tác dụng của xúc tác, enzym hoặc ôxy. Trong quá trình chế biến
chè đen, 1/2 lượng tannin trong nguyên liệu chè bị mất đi, các sản phẩm ôxy hóa gây
ảnh hưởng lớn đến màu sắc và hương vị của chè đen. Do đó, để sản xuất chè đen
người ta thường chọn nguyên liệu chè có nhiều tanin. Ngược lại, trong quá trình sản
xuất chè xanh, tannin tổn thất không nhiều, do đó có thể dùng nguyên liệu chè có ít
tannin để sản xuất chè xanh.

Theo hình 1.2 nêu trên, khi sắp xếp theo cấu hình tuyệt đối và các nhóm thế có
thể xuất hiện tới 24 catechin, tuy nhiên đến nay chỉ có 8 catechin [10, 11] được phân
lập và xác định cấu trúc từ chè xanh (Xem thêm Hình 1.3). Tỷ lệ % mol và hàm lượng
các catechin này trong lá và các bộ phận khác của chè xanh được nêu trong bảng 1.2a
và 1.2b dưới đây:
Bảng 1.2a: Các catechin chính đã tìm thấy trong chè xanh
Stt

Tên

Viết tắt

Tỉ lệ (mol)

1

(+)-catechin

C

0,40

14


Luận văn thạc sĩ khoa học

2
3
4
5
6
7
8

Đỗ Văn Đạt

(-)-epicatechin
(+)-gallocatechin
(-)-epigallocatechin
(-)-epicatechin-3-(3-O-methylgallate)
(-)-epigallocatechin-3-(3-O-methylgallate)
(-)-epicatechin gallate
(-)-epigallocatechin gallate

EC
GC

EGC

1,30
2,00
12,00

ECG
EGCG

18,01
58,10

Epigallocatechin gallat (EGCG) là thành phần polyphenol chính trong lá chè,
chiếm 10 - 50 % tổng lượng catechin, epigallocatechin (EGC), epicatechin gallat
(ECG), epicatechin (EC), gallocatechin gallat (GCG) là những catechin khác có hàm
lượng thấp hơn. Ngoài ra còn có catechin (C), gallocatechin (GC), epicatechin-3-(3-Omethylgallate) và epigallocatechin-3-(3-O-methylgallate) với hàm lượng rất thấp [13].
Hoạt tính chống ôxy hóa của các hợp chất này tăng dần như sau: EC < ECG < EGC <
EGCG [15].

Hình 1.3: Một số cấu trúc catechin chè xanh

15


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

Bảng 1.2b: Thành phần catechin trong các bộ phận chè xanh [14]
Catechin

Lá thứ 1

Lá thứ 2

Lá thứ 3

Lá già

Cuộng

EGC
GC
EC
EGCG
ECG

122,10
0
45,53
580,54
138,52

152,27
0
47,84
577,93
132,27

206,27

0
45,16
431,14
103,09

232,36
0
45,16
431,14
103,09

222,08
68,79
65,65
292,93
87,98

Tổng lượng
catechin

886,69

910,31

786,11

701,82

737,40

Đơn vị: mg/g chế phẩm chiết bằng etyl axetat
Trong các catechin chè xanh, EGCG là chất có khả năng chống ôxy hóa, chống
ung thư và có tính đề kháng cao nhất. Hoạt tính chống ôxy hóa của EGCG cao gấp 100
lần so với vitamin C và cao hơn 25 lần so với vitamin E. EGCG hỗ trợ hiệu quả trong
các thử nghiệm lâm sàng ức chế các tác nhân gây ung thư, điều trị các bệnh tim mạch,
phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch do tác dụng làm giảm tích tụ gốc tự do - ngăn cản
sự ôxy hóa của lipid trong máu, giảm LDL-cholesterol, tăng HDL-cholesterol. Do
những lợi ích của EGCG nên người ta cho rằng trà xanh có thể giúp chống lão hóa mô,
kéo dài tuổi thọ của con người [13, 14].
Tính chất của các Catechin [9]:
Catechin là chất không màu, khi kết tinh có dạng hình kim hoặc hình lăng trụ.
Chúng có vị chát ở mức độ khác nhau, có hậu ngọt, riêng hai chất EGC và EGCG có
vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát dịu khi ngưng thành các
dicatechin.
Các catechin dễ tan trong nước nóng, ancol, axeton, etyl axetat, không tan trong
benzen và chlorofoc. Tính tan tốt trong nước và trong etyl axetat đã được áp dụng rộng
rãi trong công nghiệp sản xuất các catechin từ hỗn hợp tannin chè xanh.
Các chất catechin tạo phản ứng màu với FeCl3 và tùy thuộc vào các nhóm
hydroxyl trong phân tử mà cho màu xanh lá cây hoặc màu xanh da trời.

16


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

Các chất catechin có tính khử mạnh nên dễ dàng bị ôxy hóa bởi dung dịch
KMnO4 trong môi trường axit và bởi dung dịch I2 trong môi trường kiềm, chúng có thể
tự ôxy hóa trong không khí ẩm.

Dưới tác dụng của các men peroxydaza, hoặc ở nhiệt độ cao, các catechin bị
ôxy hóa và tiếp đến các sản phẩm ôxy hóa thứ cấp lại gây ra hàng loạt các chuyển hóa
hóa học của các hoạt chất có trong lá chè, góp phần tạo ra mùi thơm đặc trưng cho các
loại chè. Cuối cùng, các sản phẩm ôxy hóa bị ngưng tụ thành các hợp chất có màu
vàng chuyển dần sang màu đỏ đặc trưng cho màu nước chè đen.
1.2.2 Giới thiệu riêng về EGCG ((-)-epigallocatechin gallat)
Tên gọi:
Theo IUPAC: 3,4,5-Trihydroxybenzoic acid,
(2R,3R)-3,4-dihydro-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxy-phenyl)-2H-1-benzopyran-3-yl ester;
Tên thương mai: (-)-Epigallocatechin gallate;
Dạng thù hình: Chất kết tinh trắng;
Điểm nóng chảy: 218°C; [α]D -185 ± 2° (etanol);
Liều dùng (theo đường uống): 0,8 - 1,6 g/ngày.

Hoạt tính sinh học của EGCG: Hoạt tính chống ôxy hóa được quy bởi các
nhóm hydroxy phenyl trên vòng C - trong cấu trúc các catechin không galloyl (ví dụ
EC và EGC) và trên các vòng C - và vòng D - trong các este galloyl catechin (ECG và
EGCG) [15 - 17]. Yếu tố cấu trúc 3,4,5-trihydroxyphenyl trên vòng C - đóng vai trò
quan trọng nhất trong hoạt tính chống ôxy hóa và dọn gốc tự do của các hợp chất này
[15], có thể sắp xếp hoạt độ chống ôxy hóa của các hợp chất này theo dãy EGCG >
ECG > EGC > EC (Rice-Evans và các cộng sự, 1995) [13]. Rice-Evans cũng đã chứng
minh hoạt tính dọn gốc tự do của EGCG mạnh hơn hẳn các vitamin C và E, thêm vào
đó, khả năng tạo phức chelat với Fe và các kim loại chuyển tiếp của EGCG cũng đã
cho chất này có khả năng ứng dụng điều trị các bệnh lý thần kinh như Alhzeimer và

17


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

Parkinson [13].
Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1,
một chất dẫn truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da; thể hiện khả
năng ngăn chặn protein kinase, enzym kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của
tế bào ung thư da, thể hiện khả năng ngăn chặn protein kinase, enzym kích hoạt trong
giai đoạn phát triển của tế bào ung thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm
thời gian sống của tế bào ung thư.
Khi quá trình ung thư diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế hoạt động của
urokinase, enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và biến đổi của tế
bào ung thư, phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do adevirus hay ngăn
chặn quá trình tổng hợp AND trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia và ung thư
phổi…
Từ năm 1997 - 2001, Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ đã hoàn tất các
nghiên cứu Phase I dược tính và dược lý của EGCG và hiện đã bước vào giai đoạn
cuối thử nghiệm lâm sàng Phase II cho loại dược phẩm này trên các bệnh ung thư, đặc
biệt đối với các thể khối u rắn [18 - 20].
Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy để đạt được hiệu quả điều trị ngang với
liều lượng 20 mg Amilorid/ngày, người bệnh chỉ cần một tách nhỏ chè chứa 150 mg
epigallocatechin gallat và uống thêm một vài loại chè mình yêu thích khoảng 10
tách/ngày.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Chang và các cộng sự (1994) đã chứng tỏ rằng
các catechin epigallocatehin, epicatechin gallat và epigallocatechin gallat được chiết từ
chè xanh Trung quốc - Camellia sinensis L. - có tác dụng ức chế, gây miễn nhiễm với
vi rút HIV, IC50 của epigallocatechin là 7,8; của epicatechin gallat là 0,32 và của
epigallocatechin gallat là 0,63 mmol [21].
1.2.3 Các thành phần khác
Caffein: Đây có thể coi là một hoạt chất chính của chè xanh [9]. Caffein có tác

18


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

dụng tạo cảm giác hưng phấn, được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm và nước giải
khát có gas..
Caffeine tan trong nước chè nóng tạo nên hương thơm, giảm vị đắng do có
khả năng tạo muối tannat với các thành phần
tannin bị ôxy hóa. Hàm lượng caffein biến đổi
theo mùa, cao nhất vào tháng 7 (4 % chè khô).
Caffein thăng hoa ở nhiệt độ 100oC, do đó
khoảng 10 % caffein sẽ bị hao hụt khi sao sấy,
chế biến chè xanh [9].
Nước: Chiếm 75 - 80 % lá chè tươi, hàm lượng nước giảm dần từ lá đến thân.
Ngoài ra, hàm lượng nước còn thay đổi theo thời điểm thu hoạch và thời tiết lúc thu
hoạch. Khi chế biến, nước là môi trường và tham gia trực tiếp vào nhiều phản ứng
thủy phân và ôxy hóa khử xảy ra trong quá trình chế biến. Khi hàm lượng nước trong
nguyên liệu chè < 10 % thì các loại men trong nguyên liệu chè bị ức chế hoạt động. Để
chuẩn hóa nguyên liệu cho quá trình chế biến từng loại thành phẩm chè, người ta
thường cố gắng tránh làm mất nước và áp dụng rất nhiều biện pháp hạn chế sự mất
nước trong quá trình thu hái, bảo quản và vận chuyển [9].
Các enzyme: Các enzym trong chè xanh chủ yếu thuộc về hai nhóm: 1 - Thủy
phân: Amilaza, proteaza; và 2 - Ôxy hóa: peroxydaza, polyphenoloxydaza.
Trong sản xuất chè đen, enzym đóng một vai trò rất quan trọng cho những biến
đổi sinh hóa trong các giai đoạn vò nát, làm héo, lên men từ đó tạo ra hương vị, màu
sắc đặc biệt của chè đen. Các men này hoạt động mạnh ở 40°C, nhiệt độ cao hơn sẽ
yếu dần và đến hơn 70°C thì mất hoạt tính. Trong quá trình lên men chế biến chè đen,

các enzym oxydaza và peroxydaza tham gia vào quá trình oxy hóa tannin tạo ra các
sản phẩm có màu đỏ sẫm, màu sữa hoặc lốm đốm hồng.
Trong sản xuất chè xanh, cần thiết giữ hàm lượng tannin cao, tránh bị ôxy hóa.
Vì thế, ngay từ giai đoạn đầu tiên của quá trình chế biến chè xanh, người ta dùng nhiệt

19


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

độ cao để diệt men trong nguyên liệu chè [9].
Các sắc tố: Như phần lớn lá thực vật bậc cao, chè xanh rất giàu các sắc tố; ví
dụ
- Chlorofin: sắc tố chủ yếu quyết định màu nước pha chè xanh thành phẩm. Tuy
nhiên lại làm giảm đi màu sắc đặc trưng của nước chè đen. Do đó, trong quá trình chế
biến chè đen ở Trung Quốc, người ta tách triệt để chlorofin khỏi nguyên liệu và tận thu
làm nguyên liệu dược phẩm;
- Caroten và xantofin: Các sắc tố màu vàng, không tan trong nước cho bã chè
có màu vàng xỉn;
- Antocyanidin khi bị ôxy hóa thì tan được trong nước và nó là sắc tố chủ yếu
của màu sắc nước pha chè đen (màu đồng đỏ), hàm lượng anthocyanidin thường được
điều chỉnh trong công nghệ lên men sản xuất chè đen. Tuy vậy, nồng độ cao sắc tố này
làm chè có vị rất đắng và làm xấu màu nước pha chè xanh [9].
Các tinh dầu: Trong nguyên liệu chè có khoảng 0,03 % tinh dầu, thành phần
chính là các aldehyd, có mùi chè hăng thơm ngọt. Nguyên liệu chè chứa nhiều dầu
thơm có nhiệt độ sôi cao sẽ làm tăng chất lượng chè thành phẩm [9].
Pectin: Hàm lượng pectin trong nguyên liệu chè ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình
chế biến và chất lượng chè thành phẩm. Với một lượng pectin thích hợp thì tạo điều

kiện tốt cho lá chè dễ dàng xoăn chặt lại; tuy nhiên nếu chứa quá nhiều pectin sẽ làm
cho khối nguyên liệu chè vón cục lại khi vò và sẽ gây khó khăn khi sấy chè; pectin có
tính hút ẩm mạnh nên sẽ làm tăng độ ẩm trong quá trình bảo quản, làm giảm chất
lượng chè. Mặc dầu vậy, để sản xuất chè bánh, pectin được thêm vào để tạo độ nhờn
và kết dính định hình bánh chè dưới tác dụng nhiệt độ cao [9].
1.3 Các phương pháp công nghệ sản xuất catechin chè xanh
Hình 1.4 dưới đây tóm tắt phương pháp chiết xuất các hợp chất catechin từ chè
xanh - hay còn gọi là polyphenol chè xanh - hiện được áp dụng rộng rãi ở Trung Quốc
và trên thế giới [5, 22 - 25].

20


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

Dựa trên tính chất hóa học đặc trưng của catechin là các hợp chất phân cực yếu,
hay gặp trong chè xanh dưới dạng các glycosid dễ tan trong nước nóng và các dung
môi hữu cơ có độ phân cực cao như etanol, metanol, hoặc hỗn hợp của chúng với nước
nên người ta thường chọn các dung môi này để chiết các catechin ở giai đoạn đầu tiên.
Kết quả sàng lọc hoạt tính chống ôxy hóa của các dịch chiết cũng cho thấy khi chiết
chè xanh bằng các dung môi phân cực cho các sản phẩm có hoạt tính mạnh hơn so với
khi chiết bằng các dung môi có độ phân cực yếu như n-hexan, ete dầu hỏa, ete etylic,
hay hỗn hợp của ete etylic với clorofoc, axeton, etylaxetat [26 - 29]. Mặc dầu vậy,
trong dịch chiết tồn tại một lượng lớn các hợp chất không mong muốn bị chiết cùng
với catechin, thêm vào đó các glycosid cũng bị thủy phân khi sử dụng dung môi chiết
là dung dịch nước axít

Hình 1.4: Tóm tắt công nghệ chiết Polyphenol chè xanh trên thế giới

Các dung môi phân cực yếu, lại có đặc tính ưu việt hơn khi tiến hành tinh chế

21


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

các dịch chiết của dung môi phân cực. Phần lớn các catechin có phân tử lượng thấp và
các aglycon đều bị hòa tan trong các dung môi này và hầu hết các hợp chất này đều có
tính chống ôxy hóa cao. Có thể tham khảo một số ví dụ về các công nghệ chiết
catechin từ chè xanh bằng dung môi hữu cơ dưới đây [14, 30 - 32]:
Phương pháp của Delaunay J.C. và các cộng sự: 100 g lá chè được ngâm chiết ở
nhiệt độ phòng bằng 1 lít Nước/Axeton (3 : 2, v/v) trong 12 giờ. Dịch chiết được cô
kiệt trong chân không ở 40°C. Chiết bằng n-hexan để loại tạp chất, cuối cùng catechin
được chiết bằng etylaxetat, chế phẩm được làm đông khô thành bột mịn. Sản phẩm
được phân tích xác định các catechin và cafein bằng các phương pháp sắc ký như sắc
ký lỏng cao áp kết nối khối phổ hoặc sắc ký điện di [30].
Các tác giả Xuejun Pan, Guoguang Niu [14, 30, 31] đã so sánh các phương
pháp chiết catechin bằng Soxhlet với các kỹ thuật chiết kết hợp viba và kết hợp siêu
âm (Xem bảng 1.4) [31].
Bảng 1.4: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theo
các kỹ thuật sử dụng viba, siêu âm và Soxhlet [31].
Kỹ thuật

A

B

C

D

MAE

30

4

77

10

UE

28

3,6

75

10

Soxhlet

28

3,6

72

9

Trong đó:
A - % Catechin so với nguyên liệu ban đầu;
B - % Caffeine so với nguyên liệu ban đầu;
C - Hàm lượng % Catechin trong dịch chiết;
D - Hàm lượng % Caffein trong dịch chiết.
MAE: Phương pháp chiết có hỗ trợ viba. Dung môi Etanol/nước (1:1, v/v), tỷ
lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1. Thời gian tác dụng của viba trong 4 phút và ngâm
tĩnh 90 phút ở 20°C.

22


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

UE: Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm. Dung môi Etanol/nước (1:1, v/v) tỷ
lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1. Thời gian chiết 90 phút, nhiệt độ chiết 20 - 40°C.
Soxhlet: Chiết hồi lưu trên phễu Soxhlet trong 45 phút, nhiệt độ chiết 85°C.
Nhìn chung, các phương pháp nêu trên đều có ưu điểm cho hiệu suất thu nhận
catechin cao, phù hợp với các nước phát triển có trình độ kỹ thuật và công nghệ cao, tự
chủ được các dung môi và hóa chất cơ bản. Đây cũng là các yếu tố kỹ thuật quan trọng
để có giá thành sản phẩm thấp, đặc biệt có ý nghĩa đối với các quốc gia và vùng lãnh
thổ không có nguyên liệu chè phế loại.
Các kỹ thuật tách EGCG và các catechin từ chè xanh:
Các hợp chất catechin và các proanthocyanin trong chè xanh có tính axít, đặc

tính này gây cản trở lớn trong việc sử dụng các pha tĩnh sắc ký có tính axít - bazơ (ví
dụ như silica gel, silica gel pha liên kết amin...) [33]. Chính vì lý do này, các tác giả
Nonaka và cộng sự (1989) đã khởi đầu các nghiên cứu tách các hợp chất này bằng các
loại pha tĩnh sắc ký trung tính và trao đổi ion và đã phân lập tinh khiết được các
flavano - ellagitannin từ chè xanh. Từ đó mở ra khả năng phân lập tinh khiết các
catechin từ chè xanh bằng phương pháp sắc ký với giá thành hạ áp dụng trong dược
phẩm [22, 33 - 36].
Thông thường polyphenol tổng số chè xanh được nạp lên cột tách trao đổi ion
(Anionid hoặc polystyren với các nhóm trao đổi lưỡng tính) theo tỷ lệ từ 1 - 1,5 % (thể
tích hoặc khối lượng); triển khai rửa giải sắc ký bằng hỗn hợp dung môi metanol nước hoặc isopropanol - nước với tỉ lệ ancol được gradient từ 90 - 100 % theo thể tích.
Phân đoạn EGCG được tinh chế lại bằng các phương pháp sắc ký lỏng trên cột
tách đảo pha RP-C18 và kết tinh phân đoạn. Một số tác giả còn xây dựng công nghệ sử
dụng sắc ký rây phân tử với kích thước lỗ trống 20 - 25 Å (Sephadex LH 20) để làm
sạch các hợp chất tannin và các chất màu phân tử lượng lớn ra khỏi catechin chè xanh
(thông thường các catechin được quan tâm có M từ 300 - 600 Dalton). Phương pháp
này có ưu điểm tăng được hiệu suất tách EGCG và ECG nhưng làm tăng giá thành sản

23


Luận văn thạc sĩ khoa học

Đỗ Văn Đạt

phẩm do tăng số lượt tách và chi phí tổn hao Sephadex lớn [22, 33, 37, 38]. Tóm lại,
sản phẩm của các phương pháp phân lập catechin và EGCG từ các nguồn nguyên liệu
thực vật đều đạt hàm lượng phenol tổng số > 90 %; giá thành của từng sản phẩm riêng
biệt phụ thuộc vào hàm lượng của sản phẩm cụ thể và phương pháp công nghệ của
quốc gia và vùng lãnh thổ có nguyên liệu (Xem thêm Bảng 1.5: Tiêu chuẩn một số sản
phẩm polyphenol Trung Quốc).

Theo thống kê của Tổ chức Nông lương thế giới và Tổ chức Y tế thế giới
(FAO/WHO 2006), sản lượng tiêu thụ của các catechin và EGCG từ cuối những năm
1990 đến nay đạt khoảng 10.000 tấn/năm. Các sản phẩm này được sản xuất từ nhiều
nguồn nhưng chủ yếu vẫn là từ Công nghiệp rượu nho và Công nghiệp chè [5].

Bảng 1.5: Tiêu chuẩn các sản phẩm polyphenol của công ty FuZhou Corona
Science & Technology Development Co., Ltd. (Trung Quốc)
Tên sản phẩm

Chỉ tiêu kỹ thuật

Màu sắc sản phẩm

Polyphenol 98 %

Tổng Polyphenol > 98 %
Tổng Catechin > 90 %
EGCG > 60 % - 70 %
Caffeine < 0,5 %

Bột màu vàng nhạt

Polyphenol 98 %

Tổng Polyphenol > 98 %
Tổng Catechin > 80 % - 85 %
EGCG > 50 % - 60 %
Caffeine < 0,5 % - 1 %

Bột màu vàng nhạt

Polyphenol 95 %

Tổng Polyphenol > 95 %
Tổng Polyphenol > 70 % - 80 %
EGCG > 45 % - 50 %
Caffeine < 0,5 % - 9 %

Bột màu vàng nhạt

Polyphenol 90 %

Tổng Polyphenol > 90 %
Tổng Catechin > 60 % - 70 %
EGCG > 45 % - 40 %
Caffeine < 1 % - 10 %

Bột màu vàng nhạt

Polyphenol 80 %

Tổng Polyphenol > 80 %
Tổng Catechin > 55 %
EGCG > 35 %
Caffeine < 1 % - 10 %

Bột màu vàng nhạt tới
màu vàng nâu

24