NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO OLIGOCHITOSANNANO BẠC VÀ THỬ NGHIỆM BẢO QUẢN BƯỞI DA XANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM
*****************

LÊ NGHIÊM ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO
OLIGOCHITOSAN/NANO BẠC VÀ THỬ NGHIỆM
BẢO QUẢN BƯỞI DA XANH
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống
Mã số

: 60.54.01.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn Khoa học:
TS. LẠI THỊ KIM DUNG
TS. PHAN THẾ ĐỒNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2012

i


NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO
OLIGOCHITOSAN/NANO BẠC VÀ THỬ NGHIỆM
BẢO QUẢN BƯỞI DA XANH

LÊ NGHIÊM ANH TUẤN

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS. TS. NGUYỄN VĂN KẾ
Đại học Nông Lâm TP.HCM

2. Thư ký:

TS. HỒ THỊ NGUYỆT THU
Đại học Nông Lâm TP.HCM

3. Phản biện 1:

PGS. TS. NGUYỄN QUỐC HIẾN
Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ

4. Phản biện 2:

TS. NGUYỄN VŨ HỒNG HÀ
Đại học Quốc tế – ĐHQG TP.HCM

5. Ủy viên:

TS. BÙI DUY DU
Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

ii

LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Lê Nghiêm Anh Tuấn sinh ngày 01 tháng 09 năm 1986 tại huyện
Tánh Linh, tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh Bình Thuận).
Tốt nghiệp PTTH tại trường Trung học Phổ thông Phước Bình, huyện Phước
Long, tỉnh Bình Phước năm 2004.
Tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm
hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh năm 2009.
Quá trình công tác:
Từ tháng 09/2009 đến nay, nghiên cứu viên tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng
dụng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các công trình đã công bố:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học cây Mai dương (Mimosa Pigra L), Tạp
chí Hóa học T48 (4B), trang 481 – 485, 2010.
2. Tổng hợp Bạc nano/Chitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co – 60
ứng dụng làm thuốc bảo vệ thực vật, Tạp chí Đại học Sài Gòn, T06, trang 155 – 161,
2011.
3. Nghiên cứu công nghệ sản xuất gạch không nung từ đất đồi, Tạp chí Hóa
học T50 (5B), trang 378 – 382, 2012.
Tháng 10 năm 2010 theo học Cao học ngành Công nghệ thực phẩm và đồ
uống tại trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Điạ chỉ liên lạc: P.46B – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Số 01, đường
Mạc Đĩnh Chi, phường Bến Nghé, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh.
Điện thoại: 0933917534
Email:

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Học viên

Lê Nghiêm Anh Tuấn

iv


LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn chính của TS. Lại Thị Kim
Dung và TS. Phan Thế Đồng.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Lại
Thị Kim Dung và TS. Phan Thế Đồng là người thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất,
chỉ bảo, giúp đỡ tôi từng bước trong suốt quá trình thức hiện luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm,
phòng Sau Đại học – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện thuận
lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khoá học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng
dụng và các đồng nghiệp trong Trung tâm Sinh học và Vật liệu mới – Viện Khoa
học Vật liệu Ứng dụng đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ba Mẹ, những người thân
trong gia đình và bạn bè đã luôn bên tôi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập.
TP.Hồ Chí Minh, ngày
tháng
Học viên

Lê Nghiêm Anh Tuấn

v

năm 2012


TÓM TẮT
Đề tài "Nghiên cứu quy trình công nghệ chế tạo oligochitosan/nano bạc và
thử nghiệm bảo quản bưởi da xanh (Citrus maxima Burm. Merr.cv. Da Xanh)" được
tiến hành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 10/2012. Mục tiêu của nghiên cứu là chế
tạo oligochitosan từ chitosan, khảo sát khả năng ổn định của hạt nano bạc trong
oligochitosan, tăng hiệu lực cộng hưởng kháng vi sinh vật của oligochitosan khi
mang nano bạc và ứng dụng hoạt tính sinh học của OCTS/nAg trong bảo quản nông
sản sau thu hoạch. Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng
(response surface) hai yếu tố với sử dụng phần mềm thống kê JMP 4.0 và bố trí theo
kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố có lặp lại.
Đề tài đã nghiên cứu cắt mạch chitosan ở nhiệt độ phòng bằng phương pháp
hóa học sử dụng 2 tác nhân là HCl và H2O2. Kết quả cho thấy khi sử dụng HCl ở
nồng độ 18% và thời gian phản ứng là 7 giờ thì MW của OCTS nằm trong khoảng 50
– 80 kDa. Còn khi sử dụng H2O2 ở nồng độ 6% và thời gian phản ứng là 10 giờ thì
MW của OCTS trong khoảng 50 – 70 kDa. Trên thực tế, phương pháp cắt mạch
chitosan bằng H2O2 có nhiều ưu điểm và lợi thế hơn HCl.
Đề tài cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ OCTS và hàm lượng nano
bạc đến các tính chất đặc trưng của OCTS/nAg, ảnh hưởng của pH đến kích thước
trung bình hạt nano bạc và độ ổn định của hạt nano bạc trong OCTS/nAg theo thời
gian lưu giữ. Kết quả đã tạo ra chế phẩm OCTS/nAg chứa OCTS 5% và nano bạc
50 ppm với khả năng ổn định sau 6 tháng lưu giữ ở pH = 6 – 7.
Tiến hành thí nghiệm khảo sát in vitro hiệu lực của OCTS/nAg với hai loại
nấm Phytophthora (gây bệnh thối quả) và Colletotrichum (gây bệnh thán thư) trên
cây ăn trái sau thu hoạch ở các độ pha loãng 25 lần (OCTS 0,2%/nAg 2 ppm), 16,7

lần (OCTS 0,3%/nAg 3 ppm), 12,5 lần (OCTS 0,4%/nAg 4 ppm), 10 lần (OCTS
0,5%/nAg 5 ppm) và 8,3 lần (OCTS 0,6%/nAg 6 ppm) của OCTS 5%/nAg 50 ppm.
Kết quả thu được: OCTS/nAg ở độ pha loãng 10 lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) và

vi


độ pha loãng 8,3 lần (OCTS 0,6%/nAg 6 ppm) có hiệu lực tốt nhất. Trên cơ sở đó
các dung dịch OCTS/nAg có độ pha loãng 11,1 lần (OCTS 0,45%/nAg 4,5 ppm), 10
lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) và 9,1 lần (OCTS 0,55%/nAg 5,5 ppm) đã được sử
dụng để bảo quản bưởi da xanh. Kết quả phân tích cho thấy ở độ pha loãng 10 lần
(OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) chế phẩm có thể bảo quản bưởi da xanh trong thời gian 3
tháng và thời gian bảo quản dài hơn so với mẫu đối chứng và mẫu so sánh.
Kết luận: OCTS có MW = 50 – 70 kDa được chế tạo bằng cách cắt mạch
chitosan với tác nhân H2O2 và có thể sử dụng chế phẩm OCTS 0,5%/nAg 5 ppm để
bảo quản bưởi da xanh trong thời gian 3 tháng.

vii


SUMMARY
The

subject

untitled

"Research

on

processing

technology

of

oligochitosan/nano silver and its application to preserve post-harvest Da Xanh
pomelo (Citrus maxima Burm. Merr.cv. Da Xanh)" was conducted from january to
october 2012 at the Institute of Applied Materials Science – Vietnam Academy of
Science and Technology. The objectives of this work are firstly to obtain oligochitosan from chitosan by chemical method and examine the stability of silver
nanoparticles in oligochitosan matrix. Secondly, to benefit the synergy antimicrobial effects of oligochitosan and silver nanoparticles in the post-harvest preservation
of agricultural products. The experiment was designed according to response
surface method with two factors using statistical software JMP 4.0.
The cleavage of chitosan chain to oligochitosan with low molecular weight
(MW) was performed at room temperature by two chemical agents HCl and H2O2.
The effects of agent concentration and reaction time were studied. The results
showed that: When the concentration of HCl was 18% and the reaction time was 7
hours, the MW of OCTS is between 50 – 80 kDa. In case of H2O2 the MW of OCTS
varied from 50 to 70 kDa when the concentration was 6% and the reaction time was
10 hours. In fact, the cleavage of chitosan by H2O2 was more practical and has some
convenient compared to HCl.
The effects of OCTS concentration and nano silver content on the
characteristics of OCTS/nAg, and then the effects of pH on the average size of
silver nanoparticles and on the their stability in OCTS matrix were studied. The
OCTS/nAg can be produced by mixing OCTS 5% with the solution of 50 ppm of
silver particles. The product still stable after 6 months of storage at pH = 6 – 7.
The antifungal properties of OCTS/nAg were studied using two species of
fungi Phytophthora (causes rot) and Colletotrichum (causing anthracnose) It has
been observed that the diluted solutions with OCTS 0,5%/nAg 5 ppm and OCTS

0,6% /nAg 6 ppm had the best effect. Based on these results, the Da Xanh pomelo

viii


was preserved with two diluted solutions of OCTS/nAg (OCTS 0,45%/nAg 4,5
ppm), (OCTS 0,55%/nAg 5,5 ppm). The results showed that the solution of OCTS
0,5%/nAg 5 ppm can prolong the shelf-life of Da Xanh pomelo 3 months compared
to the control.
Conclusion: OCTS MW = 50 – 70 kDa is made by cleavage of chitosan with
H2O2 agent and may used OCTS 0,5%/nAg 5 ppm to preserve Da Xanh pomelo for
3 months.

ix


MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa ................................................................................................................... i
Trang Chuẩn Y ......................................................................................................... ii
Lý Lịch Cá Nhân ..................................................................................................... iii
Lời Cam đoan .......................................................................................................... iv
Lời Cảm ơn ...............................................................................................................v
Tóm tắt .................................................................................................................... vi
Mục lục......................................................................................................................x
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... xiii
Danh sách các bảng .................................................................................................xv
Danh sách các hình................................................................................................ xvi
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1
1. TỔNG QUAN ................................................................................................... 3

1.1. Chitosan .......................................................................................................... 3
1.1.1. Tính chất vật lý và hoá học của chitosan. .................................................... 3
1.1.2. Khả năng tạo màng của chitosan. ................................................................ 5
1.1.3. Đặc tính ức chế vi sinh vật của chitosan ..................................................... 6
1.1.4. Quy trình sản xuất chitosan ......................................................................... 8
1.2. Các phương pháp cắt mạch chitosan tạo thành OCTS ................................... 8
1.3. Kim loại bạc và vai trò của bạc ...................................................................... 9
1.3.1. Cơ chế sát khuẩn của bạc và nano bạc ......................................................10
1.3.2. Ứng dụng bạc và nano bạc ........................................................................11
1.4. Chế tạo keo nano bạc theo phương pháp chiếu xạ gamma Co – 60 .............12
1.5. Cơ chế ổn định hạt nano bạc của chitosan....................................................13
1.6. Một số bệnh gây hư hỏng sau thu hoạch do nấm gây ra ..............................15
1.6.1. Bệnh thán thư (do nấm Colletotrichum gloeosporioides) .........................15

x


1.6.2. Bệnh đốm đen (do nấm Guignaria sp) ......................................................15
1.6.3. Bệnh thối quả (do nấm Phytophthora, Diplodia natalensis).....................15
1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ..................................................15
1.7.1. Nghiên cứu trong nước ..............................................................................15
1.7.2. Nghiên cứu ngoài nước..............................................................................17
2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................20
2.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................20
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................20
2.4. Vật liệu, hoá chất và trang thiết bị ................................................................25
2.4.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................25
2.4.2. Hóa chất thí nghiệm...................................................................................25
2.4.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu..................................................................26

2.5. Thực nghiệm .................................................................................................26
2.5.1. Thí nghiệm cắt mạch chitosan thành OCTS bằng phương pháp hóa học ở
nhiệt độ phòng ..............................................................................................26
2.5.1.1.Thí nghiệm cắt mạch chitosan bằng acid HCl .........................................26
2.5.1.2. Thí nghiệm cắt mạch chitosan bằng H2O2 ..............................................27
2.5.2. Thí nghiệm điều chế OCTS/nAg ...............................................................28
2.5.2.1. Thí nghiệm khảo sát nồng độ OCTS và hàm lượng nano bạc................28
2.5.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến kích thước trung bình hạt nAg trong
OCTS/nAg....................................................................................................30
2.5.2.3. Khảo sát độ ổn định kích thước trung bình hạt nAg trong OCTS/nAg
theo thời gian ................................................................................................30
2.5.3. Thử invitro hiệu lực kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của
OCTS/nAg....................................................................................................30
2.5.3.1. Thử hoạt tính kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch bằng phương
pháp khuếch tán thạch ..................................................................................30

xi


2.5.3.2. Thử hoạt tính kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của
OCTS/nAg dạng màng .................................................................................31
2.5. Phân tích và xử lý số liệu..............................................................................33
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................34
3.1. Nghiên cứu cắt mạch chitosan thành OCTS bằng phương pháp hóa học ở
nhiệt độ phòng ..............................................................................................34
3.1.1. Nghiên cứu cắt mạch chitosan thành OCTS sử dụng tác nhân HCl ..........34
3.1.2. Nghiên cứu cắt mạch chitosan thành OCTS sử dụng tác nhân H2O2 ........39
3.2. Quy trình điều chế nano bạc .........................................................................44
3.3. Nghiên cứu điều chế OCTS/nAg ..................................................................46
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ OCTS và hàm lượng nano bạc đến kích thước

trung bình hạt nano bạc và độ nhớt của dung dịch ......................................46
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến đến kích thước trung bình hạt nano bạc trong
OCTS/nAg....................................................................................................53
3.3.3. Khảo sát sự ổn định của dung dịch OCTS/nAg theo thời gian .................54
3.4. Quy trình công nghệ điều chế OCTS/nAg ...................................................56
3.5. Thử invitro hiệu lực kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của
OCTS/nAg....................................................................................................58
3.5.1. Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch ...............................58
3.5.1.1. Hiệu lực kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng dung dịch .....58
3.5.1.2. Hiệu lực kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng dung dịch ...59
3.5.2. Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng màng ......................................61
3.5.2.1. Hiệu lực kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng màng ............61
3.5.2.2. Hiệu lực kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng màng ..........62
3.6. Thử nghiệm bảo quản bưởi da xanh bằng OCTS/nAg .................................64
3.7. Tính toán giá thành sản phẩm và hiệu quả kinh tế .......................................70
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................................72
PHỤ LỤC ...........................................................................................................78

xii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTS

Chitosan

CHCl

Nồng độ HCl

CnAg

Hàm lượng nano bạc

COCTS

Nồng độ OCTS

DDA

Degree Deacetyl (độ deacetyl)

dK

Đường kính kháng nấm

dT

Đường kính tơ nấm

dtb

Kích thước trung bình của hạt nano bạc

GPC

Gel Permeable Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel)

HHKL

Hao hụt khối lượng

IC

Inhibition Concentration (Nồng độ ức chế)

ICP – AES

Inductively Coupled Plasma – Atomic Emission Spectroscopy
(Quang phổ phát xạ nguyên tử cảm ứng plasma)

IR

Infrared (Phổ hồng ngoại)

STH

Sau thu hoạch

MAP

Modified Atmosphere Packaging (Đóng gói điều chỉnh khí)

MBC

Minimum Bactericidal Concentration
(Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu)

MEA

Malt Extract Agar (Thạch chiết malt)

MIC

Minimum Inhibition Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MW

Mocular Weight (Khối lượng phân tử)

nAg

Nano bạc

OCTS

Oligochitosan

PDA

Potato Dextrose Agar (Thạch khoai tây)

PE

Polyethylene

tPƯ

Thời gian phản ứng

t

Thời gian

xiii


TEM

Transmission Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua)

Vit C

Vitamin C

XRD

X – ray Diffractomete (Nhiễu xạ tia X)

xiv


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Giá trị MIC và MBC ức chế E. coli, S. choleraesuis và S. aureus (µg/ml)
.................................................................................................................... 7
Bảng 3.1. MW và DDA của OCTS phụ thuộc nồng độ HCl (CHCl) và tPƯ ................34

Bảng 3.2. MW và DDA của chitosan theo nồng độ H2O2 và tPƯ ...............................39
Bảng 3.3. dtb (nm) và độ nhớt [] phụ thuộc vào COCTS và CnAg ..............................47
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến đến kích thước trung bình hạt nano bạc .............53
Bảng 3.5. Độ ổn định của dung dịch OCTS/nAg theo thời gian lưu giữ .................55
Bảng 3.6. Đường kính tản nấm (dT) Phytophthora và IC50 của OCTS/nAg dạng
dung dịch ..................................................................................................58
Bảng 3.7. Đường kính tản nấm (dT) Colletotrichum và IC50 của OCTS/nAg dạng
dung dịch ..................................................................................................59
Bảng 3.8. Đường kính kháng nấm (dK) Phytophthora và IC50 của OCTS/nAg dạng
màng .........................................................................................................61
Bảng 3.9. Đường kính kháng nấm (dK) Colletotrichum và IC50 của OCTS/nAg dạng
màng .........................................................................................................63
Bảng 3.10. Quan sát cảm quan và khuẩn ty nấm bưởi da xanh trong quá trình bảo
quản ...........................................................................................................64
Bảng 3.11. HHKL, độ Brix và hàm lượng vitamin C (Vit C) của bưởi da xanh theo
thời gian (t) bảo quản bằng OCTS/nAg ....................................................65
Bảng 3.12. Chi phí sản xuất 10 lít chế phẩm OCTS 5%/nAg 50 ppm .....................70
Bảng 3.13. So sánh hiệu quả kinh tế.........................................................................70

xv


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan ................................................... 3
Hình 1.2. Liên kết của chitin và chitosan với Ni ........................................................ 5
Hình 1.3. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan............................................................... 8

Hình 1.4. Cơ chế ổn định keo nano bạc bằng chitosan ............................................14
Hình 2.1. Sơ đồ phổ kế ICP-AES. ............................................................................24
Hình 2.2. Sơ đồ cắt mạch chitosan tạo OCTS bằng HCl .........................................27
Hình 2.3. Sơ đồ cắt mạch chitosan tạo OCTS bằng H2O2........................................28
Hình 2.4. Sơ đồ điều chế OCTS/nAg .......................................................................29
Hình 2.5. Thước panme với độ chính xác 0,01 m ..................................................31
Hình 3.1. Phổ GPC của OCTS có Mw = 85 kDa (CHCl = 16%; tPƯ = 6 giờ) ...........35
Hình 3.2. Phổ GPC của OCTS có Mw = 45 kDa (CHCl = 16%; tPƯ = 8 giờ) ...........36
Hình 3.3. Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc MW, DDA của OCTS vào
CHCl và tPƯ.................................................................................................36
Hình 3.4. Phổ IR của chitosan ban đầu ....................................................................37
Hình 3.5. Phổ IR của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng HCl ...............................37
Hình 3.6. Phổ XRD của chitosan ban đầu ................................................................38
Hình 3.7. Phổ XRD của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng HCl ..........................38
Hình 3.8. Phổ GPC của OCTS có Mw = 66 kDa (Nồng độ H2O2 = 6%; tPƯ = 10
giờ)............................................................................................................40
Hình 3.9. Phổ GPC của OCTS có Mw = 57 kDa (Nồng độ H2O2 = 8%; tPƯ = 12
giờ)............................................................................................................41
Hình 3.10. Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và tPƯ
đến MW, DDA của OCTS .........................................................................41
Hình 3.11. Phổ IR của chitosan ban đầu ..................................................................42
Hình 3.12. Phổ IR của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng H2O2 ...........................42
Hình 3.13. Phổ XRD của chitosan ban đầu ..............................................................43

xvi


Hình 3.14. Phổ XRD của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng H2O2 .......................43
Hình 3.15. Phản ứng cắt mạch chitosan tạo thành OCTS ........................................44
Hình 3.16. Sơ đồ điều chế nano bạc bằng phương pháp chiếu xạ............................44

Hình 3.17. Keo nano bạc ..........................................................................................45
Hình 3.18. Phổ XRD của keo nano bạc ....................................................................45
Hình 3.19. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nAg trong keo nano bạc
..................................................................................................................46
Hình 3.20. Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện sự ảnh hưởng của COCTS và CnAg đến dtb
và [] của OCTS/nAg ..............................................................................48
Hình 3.21. Phổ UV - vis của CTS, CTS/Ag+, OCTS/nAg .......................................49
Hình 3.22. Phổ UV - vis của OCTS/nAg theo nồng độ khác nhau của OCTS ........49
Hình 3.23. Sự biến đổi dtb của OCTS/nAg theo nồng độ OCTS khác nhau ............50
Hình 3.24. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung
dịch OCTS/nAg (4 %/50 ppm) ...............................................................51
Hình 3.25. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung
dịch OCTS/nAg (4,5%/50 ppm) .............................................................51
Hình 3.26. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung
dịch OCTS/nAg (5%/50 ppm) ................................................................51
Hình 3.27. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung
dịch OCTS/nAg (5,5%/50 ppm) .............................................................52
Hình 3.28. Phổ XRD của OCTS và OCTS/nAg (OCTS 5% và nAg 50 ppm) ........52
Hình 3.29. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc ở pH = 6 .....53
Hình 3.30. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc ở pH = 7 .....54
Hình 3.31. dtb của nano bạc trong OCTS/nAg lưu giữ theo thời gian ......................55
Hình 3.32. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc sau 6 tháng
lưu giữ ....................................................................................................56
Hình 3.33. Sơ đồ quy trình điều chế OCTS/nAg .....................................................57
Hình 3.34. Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch theo độ pha loãng
...................................................................................................................................60

xvii

Hình 3.35. Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng màng theo độ pha loãng .....63
Hình 3.36. Đồ thị biểu diễn HHKL của bưởi theo thời gian bảo quản ....................68
Hình 3.37. Đồ thị biểu diễn độ Brix của bưởi theo thời gian bảo quản ...................68
Hình 3.38. Đồ thị biểu diễn hàm lượng Vit C của bưởi theo thời gian bảo quản ....68
Hình 3.39. Bưởi sau thời gian 2 tháng bảo quản ......................................................69
Hình 3.40. Quy trình bảo quản bưởi bằng OCTS/nAg.............................................69

xviii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vùng Nam bộ có các loại cây ăn quả mang tính đặc trưng của vùng nhiệt đới
và có giá trị kinh tế cao và gắn liền với những chỉ dẫn địa lý như bưởi Da xanh, xoài
cát Hòa Lộc, măng cụt Lái Thiêu, vú sữa Lò Rèn, thanh long Bình Thuận… đã được
canh tác theo quy trình sản xuất hàng hóa, tuy nhiên do công nghệ bảo quản sau thu
hoạch (STH) còn chưa được chú trọng nên tổn thất STH là khá lớn, cả về số lượng
và chất lượng dẫn đến hiệu quả kinh tế không cao.
Hiện nay, ở Việt Nam chỉ có một số doanh nghiệp lớn và các siêu thị có
phương tiện tồn trữ trái cây ở nhiệt độ thấp, còn đa số các vựa thu mua trái cây cũng
như nông dân đều thu hoạch, vận chuyển và tồn trữ trái cây theo tập quán, chưa có
quy trình bảo quản. Việc thiếu đầu tư các công nghệ bảo quản nông sản STH cũng
dẫn đến tính chất thời vụ, hơn nữa dẫn đến tình trạng ứ đọng và hư hỏng sản phẩm.
Trong bối cảnh hòa nhập kinh tế với nhiều cơ hội và thách thức, xuất phát từ
những yêu cầu ngày càng cao của thị trường trong nước, vấn đề vận chuyển và bảo
quản trái cây STH đã được các nhà kinh doanh cũng như các nhà vườn đặc biệt
quan tâm, điều này đòi hỏi các nhà khoa học đặt ra hướng nghiên cứu bảo quản trái
cây STH. Nhiều công trình nghiên cứu đã có kết quả bước đầu khả quan. Khi hướng
đến xuất khẩu thì việc áp dụng các công nghệ bảo quản STH để ổn định chất lượng
và kéo dài thời gian tồn trữ trong quá trình vận chuyển là một yêu cầu tất yếu. Do
đó những công trình nghiên cứu bảo quản trái cây STH bằng các chế phẩm sinh học

đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là rất cần thiết, có thể mang lại những đóng góp
đáng kể trong việc nâng cao giá trị thương phẩm cho trái cây trên thị trường trong
và ngoài nước đem lại hiệu quả kinh tế cao.
Trong thời gian gần đây, các loại trái cây với đầy đủ chủng loại từ nho, táo lê
của Mỹ, Úc, Trung Quốc, chuối của Philippin, đến Sầu riêng, xoài Thái Lan… đang

1


được tiêu thụ trên thị trường Việt Nam. Việc xây dựng thương hiệu trái cây để cạnh
tranh là vấn đề hết sức cần thiết và cấp bách, nếu không trái cây Việt Nam sẽ mất
chỗ đứng trên chính thị trường trong nước và càng không thể cạnh tranh tại thị
trường ngoài nước.
Chitosan là một loại hợp chất sinh học cao phân tử được chiết xuất từ vỏ tôm
và có đặc tính ưu việt hơn các loại hoá chất khác dùng trong bảo quản trái cây.
Màng chitosan chống thoát hơi nước, kháng vi sinh vật, thân thiện với môi trường
và con người. Bạc đã được biết đến có tính năng kháng khuẩn mạnh, hạn chế và tiêu
diệt sự phát triển của nấm mốc, khi bạc nguyên tử ở kích thước nano, hoạt tính sát
khuẩn tăng lên khoảng 20 – 50 lần so với bạc ion (Bùi Duy Du, 2009). Điều này đã
thu hút nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ứng dụng nano bạc vào thực tiễn.
Qua những thông tin liên quan, luận văn chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu
quy trình công nghệ chế tạo oligochitosan/nano bạc (OCTS/nAg) và thử nghiệm
bảo quản bưởi da xanh” với các mục tiêu:
1. Điều chế oligochitosan từ chitosan
2. Điều chế oligochitosan/nano bạc
3. Khảo sát khả năng cộng hưởng hiệu lực kháng nấm của oligochitosan khi mang
hạt nano bạc
4. Ứng dụng hoạt tính sinh học của OCTS/nAg trong bảo quản bưởi da xanh.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
- Sử dụng OCTS/nAg được sản xuất từ vỏ tôm phế liệu (rẻ tiền, có sẵn), dễ phân

huỷ sinh học.
- OCTS/nAg có hiệu quả cao trong bảo quản nông sản và an toàn vệ sinh thực
phẩm. Thành công này còn góp phần rất lớn trong việc giải quyết tình trạng ô
nhiễm môi trường do chất thải từ ngành chế biến thủy hải sản.

2


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Chitosan
Chitin là polysaccharide mạch thẳng, được cấu tạo từ các đơn vị acetylglucosamine, trong đó nhóm (– OH) ở C2 của các đơn vị glucose được thay thế
bằng nhóm acetyl amino (– NHCOCH3) (Hình 1.1a), vậy chitin có thể gọi poly – (N
– acetyl – 2 – amino – 2 – deoxi – β – D – glucopyranose) liên kết với nhau bởi các
liên kết β – (1 – 4) glycoside. Chitin là một polymer sinh học tự nhiên nhiều thứ hai
sau cellulose (Marguerite Rinaudo, 2006).
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin. Chitosan được cấu tạo từ các
đơn vị D-glucosamin liên kết với nhau bởi các liên kết -(1→4)-glicosid, do vậy
chitosan có thể gọi là poly  – (1 – 4) – 2 – amino – 2 – deoxi – D – glucopyranose
hoặc là poly – (1 – 4) – D – glucosamin (Hình 1.1b).

a) Chitin

b) Chitosan

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan.
Trong lớp vỏ của một số loài giáp xác (tôm, cua, mực) thành phần chitin
chiếm khoảng 20 – 30%, chitin còn hiện diện trong một số loài nấm mốc.
1.1.1. Tính chất vật lý và hoá học của chitosan.
Độ deacetyl của chitosan nằm trong khoảng 56% đến 99%, trung bình là

80%, tùy thuộc vào từng loại giáp sát và phương pháp sản xuất (No và Meyers,

3


1995; No và ctv, 2002). Để đánh giá độ deacetyl (DDA) người ta thường dùng
phương pháp quang phổ IR và tính theo một trong các công thức sau:
Domszy and Roberts (1985), DDA = 100 – [(A1655 / A3450) x 100 / 1,33] (1)
Sabnis and Block (1997), DDA = 97,67 – [26,486 x (A1655 / A3450)]

(2)

Baxter và ctv (1992), DDA= 100 – [(A1655 / A3450) x 115]

(3)

Rout (2001), DDA = 118,883 – [40,1647 x (A1655 / A3450)]

(4)

Trong các công thức trên: A1655 là cường độ hấp phụ tại đỉnh 1655
A3450 là cường độ hấp phụ tại đỉnh 3450
- Chitosan không độc, có tính vi sinh vật cao, có khả năng phân huỷ sinh học nên
không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trường.
- Là hợp chất cao phân tử có cấu trúc ổn định, có khả năng hấp phụ cao đối với
các kim loại, ở pH < 6,3 chitosan có tính điện dương cao.
- Khối lượng của phân tử chitosan tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu và phương
pháp sản xuất, nằm trong khoảng 100 – 1.200 kDa (Li và ctv, 1992).
- Chitosan hòa tan trong các dung dịch acid loãng có pH < 6,0 như acid acetic,
acid lactic và hòa tan trong các acid vô cơ: Chitosan có thể hòa tan trong dung

dịch HCl 1% nhưng không hòa tan trong H2SO4 và H3PO4. Khi pH > 7,0 tính
hòa tan của chitosan rất kém. (Rout, 2001).
- Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm – OH, nhóm – NH2 trên các đơn vị D
– glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcohol vừa là amin, vừa là amide. Phản
ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O –, N –, hoặc
O –, N.
- Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau bởi
các liên kết β – (1 – 4) – glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các tác
nhân hoá học như: acid, base, tác nhân oxy – hóa và các enzyme.
a) Các phản ứng của nhóm – OH
+ Dẫn xuất sulfate.
+ Dẫn xuất O – acyl của chitin/chitosan.
+ Dẫn xuất O – tosyl hoá chitin/chitosan.
b) Phản ứng ở vị trí N

4


+ Phản ứng N – acetyl hoá chitosan.
+ Dẫn xuất N – sulfate chitosan.
+ Dẫn xuất N – glycochitosan (N – hydroxyl – ethylchitosan).
+ Dẫn xuất acroleylen chitossan.
c) Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N
+ Dẫn xuất O, N – cacboxymethylchitosan.
+ Phản ứng cắt đứt liên kết β – (1 – 4) glycoside.
d) Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại của chitosan
Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên
tử oxy và nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả
năng tạo phức với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+,
Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+.... Ví dụ: phức Ni(II) với chitosan có cấu trúc tứ diện

với số phối trí bằng 4 (Qi L. và ctv, 2004).

Ni(II)chitin

Ni(II)chitosan

Hình 1.2. Liên kết của chitin và chitosan với Ni.
1.1.2. Khả năng tạo màng của chitosan
Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm như thịt,
cá tươi và rau quả nhằm hạn chế các tác nhân gây hư hỏng bằng phương pháp MAP.
 Màng chitosan có thể điều chỉnh độ ẩm, thành phần khí quyển trong bao bì, giúp
bảo quản rau quả tươi được lâu hơn và giữ chất lượng được tốt hơn. Trong khi
đó đối với bao bì làm từ PE khả năng trao đổi hơi nước và không khí qua màng
tương đối kém do vậy mức cung cấp oxy bị hạn chế đồng thời hơi nước bị
ngưng đọng tạo môi trường thuận lợi cho nấm mốc phát triển (Romanazzi, 2009).
 Tính chất cơ học của màng chitosan tương đối tốt, màng dai, khó xé rách, độ bền
tương đương với một số chất dẻo được dùng làm các loại bao bì truyền thống.

5


 Bao gói rau quả bằng màng chitosan làm chậm quá trình lên men tạo ra các sản
phẩm polymer hóa của oquinon, ức chế được hoạt tính oxy hóa của các
polyphenol, anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến
đổi, giữ cho rau quả tươi hơn và ít bị thâm (Qi L. và ctv, 2004).
1.1.3. Đặc tính ức chế vi sinh vật của chitosan
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được nghiên cứu trong nhiều tài liệu (El
Ghaouth A. và ctv, 1992; Vishnu prasanna K.N, 2000; Qi L. và ctv, 2004). Theo
những nghiên cứu trước, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trường acid
là do sự proton hóa nhóm – NH2 tại vị trí C2 của D – glucosamine. Chitosan mang

điện dương sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ màng bằng
cách làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc bằng cách ức chế sự truyền
dưỡng chất vào trong tế bào, nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0,03 – 0,25%. Trong
một nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan khi bổ sung chitosan vào môi
trường nuôi cấy, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương.
Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp hoạt động
ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết tụ lại của các tế bào và sự tích điện dương ở
màng tế bào của vi khuẩn. Chitosan N – carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có
thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer có tính acid trên bề mặt vi
khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau.
Nhiều kết quả nghiên cứu gần đây chứng minh chitosan có khả năng ức chế
sự phát triển của vi sinh vật. Đặc tính này của chitosan phụ thuộc vào MW và loại vi
sinh vật, chitosan có Mw = 470 kDa ức chế vi khuẩn gram dương rất tốt, như
Lactbacillus sp, L. monocytogenes, B. megaterium, B. cereus, S. aureus, L. brevis, L.
bulgaris… Trong khi đó chitosan có Mw = 1.106 kDa mới có ảnh hưởng đối với vi
khuẩn gram âm như E.coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus… với nồng độ chitosan 0,1% pH = 5,6 có khả năng kháng các loại nấm:
Fusarium, Alternaria, Rhizopus…(No và ctv., 2002). Chitosan có Mw = 5 đến 50
kDa đều kháng tốt vi khuẩn S.aureus và nấm candida. Điều này thể hiện cơ chế
kháng khuẩn khác nhau ở chitosan có MW thấp và cao, kết quả cho thấy khả năng

6


này giảm khi khối lượng phân tử tăng. Khả năng kháng VSV tăng cao ở pH thấp, và
giảm khi có mặt ion Ca2+, Mg2+.
Wen – Li Du và ctv (2009) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của
những hạt nano chitosan tripolyphosphate mang nhiều kim loại khác nhau như Ag+,
Cu2+, Zn2+, Mn2+ và Fe2+. Những vi khuẩn được chọn để thử nghiệm là Escherichia
coli 25922, Salmonella choleraesuis ATCC 50020 và Staphylococcus aureus 25923.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được tiến

hành trong phòng thí nghiệm. Kết quả được nêu trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Giá trị MIC và MBC ức chế E. coli, S. choleraesuis và S. aureus (µg/ml)
(Wen – Li Du và ctv, 2009)
Mẫu

E. coli

S. choleraesuis

S. aureus

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC MBC

Nano chitosan

117

187

117

187

234

281

Nano chitosan mang Ag+

3

6

3

6

6

12

Nano chitosan mang Cu2+

9

12

9

12

21

24

Nano chitosan mang Zn2+

18

24

18

24

36

48

Nano chitosan mang Mn2+

73

97

73

97

85

97

Nano chitosan mang Fe2+

121

195

121

195

146

195

Ag+

4

8

4

8

8

16

Cu2+

256

512

256

512

448

512

Zn2+

768

1024

768

1024

768

1024

Mn2+

1472

1536

1472

1536

1600

1664

Fe2+

1728

1856

1728

1856

1792

1856

Chlortetracycline

1

2

1

2

2

4

Oligochitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan nên
có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan, các nghiên cứu chế tạo
nano oligochitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn (Qi L. và ctv, 2004).

7