Nghiên cứu tình trạng nhiễm norovirus ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non ở hà nam năm học 2014 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------***------------

Đ T

V ệt H

n

NGHIÊN CỨU
- 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nộ – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------***------------

Đ T

V ệt H

n

- 2015

: Vi sinh v t học
: 60420107

Chuyên ngành
Mã số

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
N

ờ

ớn dẫn k oa ọc:
PGS.TS. N uyễn Vân Tran
PGS.TS. Bù T

Hà Nộ – 2016

V ệt Hà


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vân Trang,
người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà cùng các
thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo
trong bộ môn Vi sinh vật học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và
dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian
học tập tại trường.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.s. Vũ Thị Bích Hậu,CN.Nguyễn
Phương Anh, CN.Nguyễn Thanh Tâm làm việc tại Phòng Miễn dịch Vắc xin –
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt
quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động
viên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Học viên

Đỗ Thị Việt Hương

i


BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký ệu
HBGA

T ến An
Histoblood group antigen

T ến V ệt
Kháng nguyên nhóm máu tương
dung tổ chức

ADN/ ARN (Deoxi)ribonucleic acid
Primer
forward

V t chất di truyền

LRC

Long Control Region

Vùng kiểm soát dài của gen

FUT

Enzyme fucosyltransferase

PCR

Polymerase Chain Reaction

Mồi xuôi

Phản ứng chuỗi trùng hợp

Probe

-

Đầu dò gắn huỳnh quang

Primer
Reverse

-

Mồi ngược

ORF

Open Reading Frame

Khung đọc mở của gen

ORI

Origin

Vị trí khởi đầu tái bản

OD

Optical density

M t độ quang của mẫu ADN

URR

Upstream Regulatory Region

Vùng điều hòa của gen

DEPC

Diethylpyrocarbonate

dNTPs
H
mRNA

Deoxyribonucleic triphotphate
giờ
ARN thông tin

NoV
RT-PCR

Norovirus
Reverse transcription
polymerase chain reaction
Taq-DNA
Thermus aquaticus DNA
polymerase polymerase
WHO
World Health Organization
RV
Rotavirus

ii

Enzyme phiên mã ngược
Tổ chức y tế thế giới


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1.Giới thiệu chung về Viêm dạ dày ruột cấp ở trẻ em ........................................ 3
1.1.1.Định nghĩa bệnh VDDRC ........................................................................ 3
1.1.2.Phân loại................................................................................................... 3
1.1.3.Tình hình bệnh VDDRC trên thế giới và Việt Nam ................................ 4
1.1.4.Dịch tễ học bệnh VDDRC ....................................................................... 4
1.1.5.Các tác nhân gây VDDRC ....................................................................... 7
1.2.Giới thiệu chung về NoV ................................................................................. 7
1.2.1.Bệnh VDDRC do nhiễm NoV ................................................................. 7
1.2.2.Phân loại, hình thái và tổ chức bộ gen của NoV...................................... 8
1.2.3.Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và sinh lý bệnh ................................. 12
1.2.4.Chẩn đoán .............................................................................................. 13
1.2.5.Phương pháp real time RT-PCR (Real time Reverse transcription
polymerase chain reaction) ............................................................................. 16
1.3.Tình hình nghiên cứu NoV trong và ngoài nước ........................................... 16
1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 16
1.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 17
1.4.Kiểu gen FUT-2 ở người và tính cảm nhiễm NoV ........................................ 19
1.5. Kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) và khả năng cảm
nhiễm của NoV .................................................................................................... 21
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 23
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 23
2.3. V t liệu ......................................................................................................... 24
2.3.1. Máy móc, dụng cụ ................................................................................ 24
2.3.2. Sinh phẩm ............................................................................................. 24
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 25
2.4.1. Thu th p bệnh phẩm ............................................................................. 25
iii

2.4.2. Kỹ thu t real time-RT PCR phát hiện ARN của NoV .......................... 26
2.4.3. Kỹ thu t RT PCR khuếch đại đoạn gen vùng C của NoV ................... 28
2.4.4. Phương pháp xác định kiểu gen FUT-2 ................................................ 31
2.4.5. Xác định kiểu hình HBGA (ABO và Lewis) trong mẫu nước bọt ........... 33
2.5. Xử lý số liệu ................................................................................................. 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 36
3.1. Tỷ lệ lưu hành của NoV ở trẻ không triệu chứng tại trường mầm non ở
Hà Nam .............................................................................................................. 36
3.2. Biến động genotype của NoV lưu hành ở trẻ không triệu chứng tại trường mầm
non ở Hà Nam ...................................................................................................... 39
3.3. Mối liên hệ giữa tính cảm nhiễm NoV với kiểu gen của FUT-2 ................. 47
3.3.1. Tần số SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2.. 47
3.3.2. Mối quan hệ giữa alen đồng hợp lặn A385T và sự kháng nhiễm NoV 52
3.4. Mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả
năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non ở Hà Nam ............ 53
3.4.1. Kiểu hình HBGA ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non Hà Nam ........ 53
3.4.2. Mối liên quan giữa kiểu hình của kháng nguyên HBGA với khả năng
cảm nhiễm NoV .............................................................................................. 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 60

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần kỹ thu t Realtime RT-PCR đơn cặp primer và probe phát hiện
NoV genotype G1 ....................................................................................................... 27
Bảng 2.2. Thành phần kỹ thu t Realtime RT-PCR đơn cặp primer và probe phát hiện
NoV genotype G2 ....................................................................................................... 28

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RT-PCR đơn cặp primer đối với G1 ..................... 29
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng RT-PCR đơn cặp primer đối với G2 ..................... 29
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen FUT-2.................................. 32
Bảng 3.1. Đặc điểm chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam ..................... 37
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh ........................................................... 40
Bảng 3.3. Các genotypes NoV phát hiện ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam
(T3/2014 - T5/2015) .................................................................................................. 41
Bảng 3.4. Đặc điểm genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại một số nhà trẻ ở Hà Nam
vào một số tháng khác nhau ...................................................................................... 45
Bảng 3.5. Tần số các SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2 ở
trẻ tại 01 trường mẫu giáo tại Hà Nam ......................................................................... 50
Bảng 3.6. Các tần số đột biết ở FUT-s ở các quần thể Châu Á láng giềngvà Việt Nam.. 51
Bảng 3.7. Phân bố kiểu gen 385 trong 85 người có mẫu phân được xét nghiệm lây
nhiễm NoV ................................................................................................................ 52
Bảng 3.8. Phân bố kiểu hình kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis a,
b ở trẻ tại trường mầm non ở Hà Nam (n=119) ........................................................ 54
Bảng 3.9. Phân bố kiểu hình kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis x,
y ở trẻ tai trường mầm non ở Hà Nam (n=119) ........................................................ 54
Bảng 3.10. Tổ hợp kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis ab và xy ở
trẻ tại trường mầm non ở Hà Nam (n=119) .............................................................. 54
Bảng 3.11. Tỷ lệ kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức ABO (n=119) ....... 56
Bảng 3.12. Tần suất kháng nguyên Lewis theo tình trong nhiễm NoV (n=119) ...... 57
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa kiểu hình ABO và tình trạng đơn nhiễm NoV (n=119) . 57

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. NoV dưới kính hiển vi điện tử ................................................................... 8
Hình 1.2. Biến đổi chủng NoV ở miền Bắc nước ta từ 2010-2013 ......................... 10

Hình 1.3. Phân bố genotype khác nhau của NoV ở miền Bắc và miền Nam nước ta
trong năm 2010 ........................................................................................................ 10
Hình 1.4. Cấu trúc của NoV ..................................................................................... 11
Hình 1.5. Cấu trúc bộ gen của NoV ......................................................................... 11
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt các loại mẫu thu th p sử dụng cho nghiên cứu ................. 25
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu .......................................................... 35
Hình 3.2. Tỷ lệ lưu hành genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam ...... 42
Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loài dựa trên đoạn gen vùng capsid của các chủng NoV
phát hiện trong nghiên cứu này .................................................................................. 44

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm dạ dày ruột cấp (VDDRC) hay còn gọi là tiêu chảy ở trẻ em là
một vấn đề sức khỏe đang được quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt thu hút được
rất nhiều chú ý của các nhà khoa học, y học bởi đó là một trong những nguyên nhân
hàng đầu gây bệnh t t và tử vong cho trẻ em dưới 5 tuổi ở các nước đang phát triển.
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) và nhiều công trình nghiên cứu điều tra ở châu Á,
châu Phi và châu Mỹ La Tinh cho thấy, ở các nước đang phát triển hàng năm có
trên 750 triệu trường hợp VDDRC, trong đó 500 triệu là trẻ em dưới 5 tuổi. Tử
vong do VDDRC hàng năm lên tới 3-6 triệu trẻ em, có 80% trong số này là trẻ em
dưới 2 tuổi. Ở những nước đang phát triển như nước ta, đây là bệnh có tần suất mắc
nhiều thứ 2 (sau các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp). Tử vong do VDDRC thường
không dược đánh giá đúng và kịp thời, tuy nhiên ước tính hàng năm có 6000-8000
trường hợp tử vong ở nước ta do VDDRC. Tác nhân gây VDDRC khá đa dạng, các
báo cáo cho thấy có ít nhất 26 loại tác nhân khác nhau có thể gây ra bệnh VDDRC ở
trẻ em, trong đó có 60-70% của các trường hợp nguyên nhân là do các virus. 7
nhóm virus thường gây VDDRC là rotavirus, NoV, sapovirus, adenovirus,
astrovirus, parechovirus và aichivirus được coi là các tác nhân thường gặp của bệnh

viêm dạ dày ruột cấp ở người. NoV là tác nhân quan trọng nhất gây ra các vụ dịch
VDDRC không do vi khuẩn ở người lớn và trẻ em. Theo các báo cáo hàng năm trên
toàn thế giới, có đến hơn 267 triệu trường hợp nhiễm do NoV. NoV còn có khả
năng gây nhiễm nhưng không có triệu chứng.
NoV thuộc họ Caliciviridae là virus ARN sợi đơn, dương có khả năng lây
nhiễm cho người và động v t. NoV khá đa dạng về kiểu gen và tính kháng nguyên,
bao gồm 5 nhóm gen (từ GI đến GV) và 35 typ gen đã được phát hiện dựa vào trình
tự đoạn gen mã hóa protein VP1. NoV ở người thuộc GI, GII và GIV nhưng hầu hết
các chủng gây bệnh ở người đều thuộc nhóm gen GI và GII. Các virus thuộc họ
Caliviridae có khả năng lây nhiễm người ở mọi lứa tuổi và thường liên quan đến
các trường hợp tiêu chảy cấp lẻ tẻ và vụ dich tiêu chảy cấp trên toàn thế giới. Các
vụ dịch này thường xảy ra ở điều kiện bán trú (semi-enclosed) như trường học, bệnh
1


viện, nhà dưỡng lão, nhà trẻ. Ở nước ta, nhiều nghiên cứu giám sát bệnh tiêu chảy ở
trẻ em dưới 3 tuổi tại bệnh viện cho thấy RV và NoV là hai tác nhân quan trọng
nhất. NoV không những gây tiêu chảy cấp cho trẻ, mà còn có khả năng nhiễm
không triệu chứng, là tác nhân tiềm ẩn gây ra các vụ dịch và là nguồn lây lan mạnh
trong cộng đồng đặc biệt ở nhà trẻ, lớp học.
Mức độ cảm ứng của cơ thể đối với NoV có liên quan đến các trạng thái của
gen FUT-2, mã hóa cho enzym fucosyltransferase α(1,2) để điều hòa sự biểu hiện
của kháng nguyên H. Đã có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa gen FUT- 2 và
sự nhiễm virus. Nghiên cứu mới nhất trên gen tiết (secretor gene) ở các nhóm quần
thể người khác nhau đã xác định được một vài đột biến của các gen này có thể làm
mất hoặc giảm sự hoạt động của enzyme fucosyltransferase. Trong khi đó, kháng
nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) là thụ thể trong quá trình nhiễm
NoV. Những kháng nguyên này được tổng hợp do kết quả hoạt động của một số
enzyme glycosyltransferase được mã hóa chủ yếu bởi các họ gen ABO (FUT-1),
Lewis (FUT-3) và secretor (FUT-2).

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài ―Nghiên cứu tình
trạng nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non ở Hà
Nam năm học 2014 - 2015" với các mục tiêu như sau:
1. Xác định tỷ lệ nhiễm NoV và kiểu gen của các chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh.
2. Đánh giá mối liên quan giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen FUT-2.
3. Đánh giá mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ
chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh
Đề tài được chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin, Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ương.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. G ớ t ệu c un về V êm dạ dày ruột cấp ở trẻ em
1.1.1. Định nghĩa bệnh VDDRC
Viêm dạ dày ruột cấp hay còn gọi là tiêu chảy là một bệnh nhiễm trùng đường
tiêu hóa, phổ biến và thường gặp ở mọi lứa tuổi, đặc biệt là trẻ em. Theo tổ chức Y tế
Thế giới VDDRC được định nghĩa là ―đi ngoài phân lỏng hoặc tóe nước trên 3 lần
trong 24 giờ, phân lỏng là phân không thành khuôn‖ [96]. Độ rắn mềm của phân do
thành phần nước trong phân quyết định: Phân có 85% nước gọi là nhão; phân có 88%
nước gọi là lỏng: phân có 90% nước gọi là lỏng như nước [1]. Số lượng phân được bài
tiết ra ngoài bình thường mỗi ngày thay đổi tùy theo chế độ ăn, tuổi của từng cá thể.
Khi có tiêu chảy, phân chứa nhiều nước hơn bình thường gọi là phân nước hay phân
lỏng. Trong những trường hợp lỵ, trực khuẩn phân có thể chứa máu [2].
Mối nguy hiểm chính của VDDRC là tử vong và suy dinh dưỡng. Tử vong
do VDDRC hầu hết thường gây ra bởi vì mất một lượng lớn muối và nước từ cơ thể
[8]. Những biến chứng do VDDRC thường gặp là kém ăn, đôi khi kèm nôn mửa
[1]. Trẻ ăn ít đi và khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng bị giảm so với nhu cầu
dinh dưỡng của trẻ, chính những yếu tố đó góp phần làm cho trẻ bị suy dinh dưỡng

và bệnh cảnh lâm sàng càng trở nên phức tạp hơn.
1.1.2. Phân loại
VDDRC được phân loại tùy thuộc vào thời gian kéo dài các triệu chứng,
trong đó một đợt VDDRC kéo dài ít hơn 2 tuần là VDDRC cấp tính. Theo Chu Văn
Tường, VDDRC cấp tính ở trẻ em thường xảy ra dưới 5 ngày, VDDRC kéo dài 2
tuần còn gọi là VDDRC kéo dài [7].
Ngày nay, người ta xác định 3 hội chứng lâm sàng khác nhau của VDDRC gồm:
- Tiêu chảy phân lỏng cấp tính: gồm các trường hợp khởi bệnh cấp tính, kéo
dài dưới 14 ngày.
- Hội chứng lỵ: gồm các trường hợp tiêu chảy phân có đàm máu.
- Tiêu chảy kéo dài: gồm các trường hợp khởi đầu với tiêu chảy cấp tính rồi
kéo dài trên 14 ngày.
3


Theo một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, tiêu chảy phân lỏng cấp tính
chiếm 47,29%, hội chứng lỵ chiếm 51,25%, tiêu chảy kéo dài chiếm 1,48%.
1.1.3. Tình hình bệnh VDDRC trên thế giới và Việt Nam
Các bệnh về VDDRC là nguyên nhân chính của dịch bệnh và tử vong ở trẻ
em tại các nước đã và đang phát triển [73]. Bệnh thường lây qua đường tiêu hóa và
thường gặp ở các khu dân cư có điều kiện sống không đảm bảo, trình độ dân trí
thấp, kiến thức về phòng chống VDDRC bị hạn chế. Trên thế giới, ước tính có
712.000 trường hợp tử vong do VDDRC, chiếm 9,9% trong tổng số 6,9 triệu trường
hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi (thống kê năm 2011) [56]. Ở Châu Phi, Châu Á và Mỹ
Latinh đã có 744 triệu đến 1 tỷ trường hợp viêm dạ dày cấp và 2,4 đến 3,3 triệu
trường hợp tử vong hàng năm ở trẻ em dưới 5 tuổi [73]. Tử vong do VDDRC hàng
năm từ 3-6 triệu trẻ em, có 80% trong số này là trẻ em dưới 2 tuổi [6].
Tại Việt Nam, theo thống kê của Bệnh viên nhi Trung ương cho biết, trung bình
mỗi trẻ bị VDDRC 3 lần/ năm, nhóm trẻ tại vùng nông thôn có tỷ lệ mắc cao hơn do ý
thức vệ sinh kém, trẻ không được chăm sóc cẩn th n. Do đó, bệnh VDDRC được đưa

vào số 26 bệnh báo cáo thường xuyên. Số ca bệnh VDDRC trong năm 2012 ở 28 tỉnh
miền Bắc là 433.000, chỉ đứng sau số ca có triệu chứng cúm (870.000) [92], [91], [93],
[94]. Số ca tử vong ước tính (năm 2005) là 9600-12.400 ca tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi do
VDDRC. Trong năm 2005, ước tính chi phí điều trị trực tiếp cho những trường hợp
VDDRC lên đến 3,1 triệu đô la Mỹ, 685.000 đô la cho chi phí trực tiếp khác và 1,5
triệu đô dành cho chi phí gián tiếp [33]. Trong số trẻ dưới 5 tuổi 15% sẽ phải nh p viện
do VDDRC và 50% cần tới phòng khám [16]. Những con số trên cho thấy gánh nặng
của bệnh VDDRC cho bản thân trẻ, gia đình và nền y tế nước ta.
1.1.4. Dịch tễ học bệnh VDDRC
a. Các đường lây truyền
Hầu hết các nghiên cứu về bệnh sinh - dịch tễ cho rằng, các tác nhân gây tiêu
chảy đều chủ yếu truyền qua đường phân, miệng thông qua thức ăn hoặc nước uống
bị ô nhiễm hay lây do tiếp xúc trực tiếp với phân người bị bệnh VDDRC, hoặc
trung gian truyền bệnh như ruồi, dán…
4


b. Một số hành vi làm gia tăng sự lan truyền tác nhân gây bệnh VDDRC
- Không nuôi con hoàn toàn bằng sữa mẹ trong 4-6 tháng đầu tiên sau khi
sinh: theo tổ chức Y tế Thế giới, những trẻ không được nuôi bằng sữa mẹ trong 4-6
tháng đầu tiên của cuộc đời có nguy cơ mắc VDDRC gấp nhiều lần so với những trẻ
được nuôi bằng sữa mẹ hoàn toàn, nguy cơ tử vong do tiêu chảy của những trẻ này
cũng lớn hơn một cách đáng kể. Bởi sữa mẹ có chứa globulin miễn dịch chủ yếu là
IgA (95%) IgM, IgG có tác dụng bảo vệ cơ thể chống các bệnh đường ruột và một
số bệnh khác do virus gây ra [14].
- Tập quán cai sữa sớm (trước 1 tuổi): Cho trẻ bú sữa mẹ kéo dài sẽ làm
giảm chỉ số mắc và sự trầm trọng của một số bệnh VDDRC như lỵ trực tràng và tả.
- Cho trẻ bú sữa bình: Khi cho sữa vào một bình không sạch thì sẽ bị ô
nhiễm, nếu trẻ không bú hết sữa trong bình thì sự phát triển của vi khuẩn sẽ xảy ra.
- Tập quán cho ăn dặm sớm (trước 4 tháng tuổi): Cho ăn dặm không đúng,

quá sớm hay quá muộn hoặc ăn dặm không đúng cách đều dễ dẫn đến VDDRC dẫn
đến suy dinh dưỡng.
- Dùng nước uống đã bị nhiễm tác nhân đường ruột: Nước có thể bị nhiễm
bẩn ngay tại nguồn của nó hoặc trong suốt quá trình dự trữ tại nhà. Sự ô nhiễm tại
nhà là do bảo quản hoặc sử dụng không hợp vệ sinh.
- Không rửa tay sau khi đi ngoài, sau khi xử lý phân, trước khi chuẩn bị thức
ăn: Thói quen rửa tay là một hành vi tốt bảo vệ sức khỏe chung, đặc biệt có hiệu lực
đối với việc phòng VDDRC.
- Không xử lý phân (đặc biệt là phân trẻ nhỏ) một cách hợp vệ sinh: Nhiều
b c cha mẹ thường cho rằng phân trẻ em là không nguy hiểm, nhưng thực ra, chúng
chứa rất nhiều virus và vi khuẩn gây bệnh. Phân súc v t cũng chứa nhiều vi sinh v t
có thể truyền bệnh cho người.
c. Các yếu tố vật chủ liên quan đến sự gia tăng chỉ số mắc, mức độ trầm trọng,
thời gian bị bệnh VDDRC
- Suy dinh dưỡng: VDDRC và suy dinh dưỡng liên quan chặt chẽ với nhau
nhất là đối với những trẻ suy dinh dưỡng nặng, những trẻ đó sự hồi phục niêm mạc
5


ruột bị ch m trễ do thiếu vitamin A, giảm sức đề kháng của cơ thể. Sự nghiêm
trọng, kéo dài và nguy cơ dễ tử vong doVDDRC sẽ gia tăng đối với những trẻ bị
suy dinh dưỡng. Ngược lại điều này sẽ làm cho tình trạng suy dinh dưỡng trở nên
trầm trọng hơn [8].
- Sởi: Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, tiêu chảy và lỵ thường gặp ở trẻ đang
bị sởi hoặc mới khỏi bệnh sởi trong vòng 4 tuần lễ, do trong thời gian này hệ thống
miễn dịch bị suy giảm [1].
- Bệnh suy giảm miễn dịch hoặc ức chế miễn dịch: Tình trạng này có thể tạm
thời do một số bệnh nhiễm vi rus (như sởi), hoặc có thể kéo dài như ở những người
có hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS). Nếu tình trạng ức chế
miễn dịch nặng thì VDDRC có thể xảy ra do các tác nhân bất thường và bệnh cũng

có thể kéo dài.
- Tuổi: Hầu hết tiêu chảy xảy ra trong hai năm đầu cuộc đời. Chỉ số mắc bệnh
cao nhất là ở nhóm trẻ 6-11 tháng, khi mới t p ăn dặm [6]. Theo tổ chức Y tế Thế giới
cho biết, nhóm tuổi này dễ mắc bệnh VDDRC bởi vì thời kỳ này trẻ phải ăn thức ăn bổ
sung, trong khi đó các yếu tố bảo vệ chống tiêu chảy trong sữa mẹ lại giảm.
d. Tính chất mùa
Người ta nh n thấy tình trạng VDDRC trẻ em có sự khác biệt theo mùa ở
nhiều địa dư khác nhau. Ở những vùng ôn đới, VDDRC do vi khuẩn thường xảy ra
vào mùa nóng, ngược lại VDDRC do virus, đặc biệt là RV lại xảy ra cao điểm vào
mùa đông. Ở những vùng nhiệt đới,VDDRC do RV xảy ra quanh năm nhưng tăng
vào các tháng khô và lạnh, ngược lại VDDRC do vi khuẩn lại xuất hiện cao điểm
vào giao điểm giữa mùa mưa và nóng. Tỷ lệ mắc VDDRC kéo dài cũng dao động
theo mùa.
e. Các vụ dịch
Hai tác nhân gây bệnh có thể gây thành dịch lớn và tử vong cao là Vibro
cholerae 01 và Shigella dysenteriae týp 1. Những vụ dịch xảy ra gần đây là năm
1961, dịch xảy ra do Vibrio cholerae 01 ở Indonesia lan đến Châu Á, Trung C n
Đông và Châu Phi, một số nước châu Âu và Bắc Mỹ. Shigella dysenteria Týp 1 gây
6


dịch lỵ lớn ở Trung Mỹ và gần đây ở Châu Phi và vùng Nam Á. Ngoài ra, còn có
một số vụ dịch lỵ trực khuẩn ở Trung Mỹ, Trung Phi và Nam Phi.
1.1.5. Các tác nhân gây VDDRC
Tác nhân gây VDDRC khá đa dạng, nhiều nghiên cứu miêu tả 26 các loại tác
nhân khác nhau từ virus như: RV, NoV, adenovirus (Adv), astrovirus, đến vi khuẩn
như các chủng E.coli gây tiêu chảy (DEC) như: vi khuẩn thuộc họ Vibrio trong đó
có phảy khuẩn tả (V.cholera), Samonella, Shigella, ký sinh trùng như họ
Crytosporidium, Giardialamblia, Entamoeba histolytica… [55, 60]. Tuy nhiên, dù
là 26 tác nhân trong một số ít nghiên cứu, hay 2-6 tác nhân trong đa số các nghiên

cứu, tỷ lệ phát hiện ít nhất một tác nhân không vượt quá mức 80%. Trong số đó, 6070% do vi rút gây ra, thường gặp là RV, NoV.
Một số tác nhân gây tiêu chảy:
- Nhóm vi rút: RV, NoV, adenovirus...
- Nhóm vi khuẩn: Vibrio cholera, Salmonella, Shigella, E. coli...
- Ký sinh trùng: Crytosporidium
1.2.

G ớ t ệu c un về NoV

1.2.1. Bệnh VDDRC do nhiễm NoV
NoV được coi là nguyên nhân chính gây viêm dạ dày ruột cấp tính ở trẻ em
và người lớn. Bệnh do NoV thường xảy ra và tìm thấy ở các nơi khác nhau: nhà
hàng, trường học, các trung tâm chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, nhà điều dưỡng và
tàu du lịch. Hằng năm có đến hơn 267 triệu trường hợp nhiễm do NoV trên toàn thế
giới [68]. Con đường truyền chính của virus này thường lan truyền qua đường thực
phẩm, đường nước, không khí và lan truyền từ người sang người [35], [62].
NoV được phát hiện lần đầu tiên bởi Kapikian và cộng sự vào năm 1972
dưới kính hiển vi điện tử (EM). Trước đây, các virus được kí hiệu là ―Norwalk-like
viruses‖. Chủng nguyên thủy của NoV là virus Norwalk, chúng được phát hiện từ
một đợt bùng phát viêm dạ dày ruột cấp tính tại một trường tiểu học ở Norwalk,
Ohio năm 1968 [46]. NoV là thành viên của chi NoV, cùng với chi Sapovirus trong
họ Caliciviridae [38]. Các virus này thường nhỏ và không có màng bao quanh,
sRNA (+) với đường kính khoảng 27-35 nm (hình 1.1).
7


Hìn 1.1. NoV d ớ kín

ển v đ ện tử [65]

1.2.2. Phân loại, hình thái và tổ chức bộ gen của NoV
Trước đây, việc phát hiện lây nhiễm NoV ở người bị hạn chế bởi vì NoV gây
bệnh ở người nhưng khó nuôi cấy được trên tế bào và cũng không có động v t thí
nghiệm nào thích hợp cho sự gây nhiễm NoV. Tạo dòng của bộ gen virus Norwalk
được thực hiện năm 1990 đã dẫn đến sự tiến bộ lớn trong sự hiểu biết về virus học
phân tử và dịch tễ học của NoV [42]. Gần đây, các phương pháp chẩn đoán phân tử
có độ nhạy dựa trên phản ứng RT-PCR và các kỹ thu t giải trình tự bộ gen để phát
hiện, mô tả đặc điểm NoV đã góp phần nâng cao thêm sự hiểu biết của chúng ta về
dịch tễ học của sự lây nhiễm NoV [98]. Những kỹ thu t này đã chứng minh rằng
các NoV có tính di truyền và đa dạng về kháng nguyên [99]. Dựa vào trình tự giống
nhau và phân tích cây phát sinh chủng loài, NoV có thể được phân loại theo nhóm
gen (genogroup), kiểu gen (genotype) và cụm gen (genocluster). Hiện nay, NoV
được phân loại thành năm nhóm gen khác nhau: từ GI đến GV [38],[80]. NoV ở
người thuộc GI, GII và GIV, nhưng hầu hết các chủng gây bệnh ở người đều thuộc
nhóm gen GI và GII. NoV GIII và GV cho đến nay đã được tìm thấy ở loài bò và
các loài chuột. Trong các nhóm gen (genogroups), NoV được chia tiếp thành các
kiểu gen (genotypes), trong số đó có ít nhất 29 kiểu gen đã được báo cáo. Hiện nay
nhóm gen GI được chia thành tám kiểu gen (GI.1 đến GI.8), GII bao gồm ít nhất 17
kiểu gen (GII.1 đến GII.17), GIII có hai kiểu gen (GIII.1-GIII.2) và mỗi GIV và GV
bao gồm một kiểu gen [99].
8


Các phân tích về trình tự toàn bộ chiều dài bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng
các chủng virus trong một nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng về
nucleotide, trong khi các chủng trong các nhóm gen khác chỉ chiếm 51-56% sự
tương đồng. Ngoài ra, sự phân loại dựa trên trình tự nucleotide của gen cho protein
vỏ capsid cho thấy rằng các trình tự chênh lệch nhau bởi 60% giữa các genogroups
và 20- 30% giữa các genotypes. Trong cùng genocluster, trình tự vỏ capsid của
virus thường rất giống nhau [29].

Thông qua việc giám sát dịch tễ của NoV trên thế giới đã cho thấy vai trò chủ
yếu của những chủng có nhóm gen GII, đặc biệt là những chủng có kiểu gen GII/4
chiếm ưu thế là nguyên nhân của các vụ dịch (hiện tại ước tính khoảng gần 80% của
tất cả các trường hợp lây nhiễm, nó cũng là nguyên nhân của cả 5 vụ dịch trong hơn
th p kỷ qua) và có các biến thể GII.4 mới xuất hiện từ 1-2 năm gần đây. Dường như
sự tăng lên thường xuyên của biến thể GII.4 mới đã tiếp diễn trong những năm gần
đây và đã trở thành một hiện tượng toàn cầu [76], [77]. Các nghiên cứu về dịch tiêu
chảy cấp ở quân đội Israel chủng phân l p là GII.6 nhưng nhanh chóng chuyển thành
chủng GII.4 [30]. Điều tra ở Mỹ do CDC tiến hành vào năm 2006 tỷ lệ các ca do GII.4
tăng lên rõ rệt trong toàn nước Mỹ [43]. Một nghiên cứu của Nh t vào năm 2004-2005
cho thấy GII chiếm 98,6% trong đó GII.4 chiếm tới 77,4% [37]. Tại Brazil trẻ tiêu
chảy cấp nhiễm NoV genogroup GI chiếm 6,1%, genogroup GII chiếm 78,7%, còn lại
là bộ nhiễm của 2 genogroup này [19]. Mặc dù dịch bệnh NoV được báo cáo quanh
năm, nhưng đỉnh điểm của việc bùng phát dịch là trong mùa đông [21].
Ở Việt Nam, từ năm 2007-2013, kiểu gen NoV GII.4 luôn luôn là kiểu gen
lưu hành chiếm ưu thế. Sự xuất hiện của các dòng GII.4 ở Việt Nam cùng thời điểm
trên thế giới xuất hiện dòng GII.4 mới tương ứng: sự chiếm ưu thế của dòng
US95/96 ở nước ta trong những năm 1998-1999, sự tồn tại của chủng 2006b ở nước
ta từ 2007-2013, sự xuất hiện của chủng New Orleans-2010 trong giai đoạn 20092011 và sự nổi trội của chủng Sydney 2012 trong năm 2013. Song song tồn tại với
các đa dạng chủng GII.4 là genotype GII.3, chiếm tỷ lệ không dưới 20% (hình 1.2).
Như v y, sự xuất hiện của các đa dạng chủng GII.4 ở nước ta đồng thời với sự lưu
9


hành toàn cầu của các chủng này trên thế giới [22]. Các chủng NoV phổ biến ở
miền Bắc bao gồm GI.8, GII.3, GII.4, GII.13, trong khi đó các genotype NoV lưu
hành ở miền Nam đa dạng hơn với việc thêm nhiều type thuộc nhóm gen GI và GII
như GI.3 GI.4, GI.5, GII.6, GII.9 và GII.12 (Hình 1.3).

Hìn 1.2. B ến đổ c ủn NoV ở m ền Bắc n ớc ta từ 2010-2013

Hìn 1.3. P ân bố enotype k ác n au của NoV ở m ền Bắc và m ền Nam
n ớc ta tron năm 2010 [69]
NoV là thành viên của chi Norovirus, trong họ Caliciviridae. Hạt NoV được tạo
thành bởi 3 cấu trúc đơn của vỏ capsid, với khối 20 mặt đối xứng, kích thước 27-40
nm. Bề mặt điển hình của hạt virus có hình dáng lõm của cái tách. Vỏ capsid gồm có
90 dimer của một protein vỏ đơn, có trọng lượng phân tử là 58 Kd (hình 1.4).
10


Hìn 1.4. Cấu trúc của NoV [65]
Bộ gen của NoV bao gồm mạch dương (positive-sense), 7.400-7.700
nucleotide của sRNA. Bộ gen được polyadenyl hóa và chia thành 3 khung đọc mở
(ORF1, ORF2 và ORF3). ORF1 mã hóa cho một polyprotein được tách ra từ enzym
thủy phân protein, tạo thành NTPase, protease, và RNA polymerase phụ thuộc RNA
(RdRp). ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1 tạo thành lớp capsid và mang
tính kháng nguyên của virus. Gen VP1 là gen biến đổi lớn nhất trong hệ gen của
NoV và được chia thành ba miền, miền vỏ (S) được liên kết với miền nhô ra ngoài
(miền P2) nhờ khớp nối lỏng lẻo (miền P1). Miền S có tính bảo thủ rất cao, hình
thành bộ xương của cấu trúc capsid, miền P2 có chứa vùng liên kết với tế bào v t
chủ, do v y miền này mang tính kháng nguyên của virus. Còn ORF3 mã hóa cho
protein VP2 có chức năng trong quá trình lắp ráp và ổn định hạt virus (hình 1.5)
[38]. NoV được phân nhóm dựa vào trình tự axit amin của protein VP1- các virus
có sự khác biệt nhỏ hơn 14,3% thuộc cùng một chủng, khác biệt từ 14,3-43,8%
thuộc cùng một kiểu gen, khác biệt từ 45-61% thuộc cùng một nhóm gen.

Hìn 1.5. Cấu trúc bộ en của NoV

11

1.2.3. Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và sinh lý bệnh
 Đường lây truyền của Novovirus
Sự lan truyền phổ biến của NoV là thông qua thức ăn, nước và môi trường bị
ô nhiễm, sự tiếp xúc giữa người với người, trong không khí.... Ví dụ, NoV lan
truyền qua việc thay tã, chia sẻ đồ dùng ăn uống, ăn thực phẩm hoặc uống chất lỏng
bị nhiễm virus, hoặc đụng chạm vào các bề mặt hoặc đồ v t nhiễm virus và sau đó
cho tay vào hoặc đặt gần miệng.
Các NoV được tìm thấy trong mẫu phân và mẫu nôn của một người bị
nhiễm bệnh. Có ít nhất 2 nhân tố góp phần vào khả năng bùng phát dịch bệnh của
virus. Thứ nhất, virus lây nhiễm rất cao và chỉ một lượng nhỏ, khoảng 10-100 hạt
virion đủ để gây bệnh. Thứ hai, virus tương đối bền trong môi trường, ví dụ khả
năng lạnh khi đóng băng, nhiệt độ đến 60oC, khử khuẩn với chlo, điều kiện axít,
giấm, rượu, các dung dịch khử trùng tay và nồng độ đường cao [89]. Giai đoạn ủ
bệnh trung bình của vius ngắn (12-48h) nhưng sự phát tán của virus được phát hiện
ba tuần sau khi xuất hiện các triệu chứng, tạo cơ hội để mở rộng phạm vi phát tán
của virus sang các v t chủ khác [83]. Hiện nay việc phòng ngừa và khống chế các
vụ dịch của NoV đều dựa vào việc xác định các phương thức truyền nhiễm. Sự lan
truyền bệnh được cắt đứt bằng việc kiểm soát sự ô nhiễm của thực phẩm và nguồn
nước, duy trì vệ sinh cá nhân và làm giảm sự truyền bệnh từ người sang người.
 Đặc điểm lâm sàng
Triệu chứng nhiễm NoV thông thường nhất là nôn mửa hoặc tiêu chảy, đau
quặn bụng và đôi khi có sốt. Phân tiêu chảy thường không có máu, ít chất nhờn, thể
lỏng và có nước. Các triệu chứng thường kéo dài khoảng 24-60h [47]. Các nghiên
cứu trên người tình nguyện cho thấy rằng có đến 30% các trường hợp nhiễm trùng
mà không có triệu chứng nào. Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu
VDDRC do NoV, cũng như không có vacxin để phòng ngừa bệnh [38]. Điều trị chỉ
t p trung vào chăm sóc hỗ trợ, bổ sung dinh dưỡng, đặc biệt là hồi phục nước và
điện giải. Các biến chứng từ nhiễm NoV có thể thường thấy ở trẻ sơ sinh và người
cao tuổi. Người già và trẻ em mất nước gây rối loạn điện giải có thể dẫn đến tử

12


vong nhanh chóng nếu không được cấp cứu kịp thời. Tuy nhiên, dữ liệu mới cho
thấy rằng các dấu hiệu và các biến chứng lâm sàng bất thường từ sự lây nhiễm NoV
có thể xảy ra ở những người suy giảm miễn dịch và căng thẳng tinh thần [48].
 Sinh lý bệnh
Các nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh bị nhiễm virus cho
thấy sự nhiễm trùng chính thường xảy ra ở phần dưới của ruột non. Khi niêm mạc ruột
bị tổn thương thì khả năng hấp thu nước và điện giải của ruột bị suy giảm, h u quả là
các chất dinh dưỡng không được đem vào máu mà tồn đọng trong lòng ruột khiến tăng
áp lực thẩm thấu trong lòng ruột, sẽ kéo theo nước và điện giải theo phân ra ngoài
thành tiêu chảy. Nhiễm NoV kích thích cơ thể sinh ra kháng thể IgG, IgA đặc hiệu và
kháng thể IgM trong huyết thanh, ngay cả khi đã có sự phơi nhiễm trước đó. Hầu hết
các bệnh nhân đều có sự đề kháng với sự tái lây nhiễm với cùng một chủng gây nhiễm
ban đầu trong khoảng 4 - 6 tháng. Tuy nhiên, không có sự miễn dịch lâu dài [97].
Nghiên cứu ban đầu trong các nhóm tình nguyện đã chứng minh rằng khoảng
30% trường hợp nhiễm bệnh mà không có triệu chứng đi kèm [75]. Gần đây, nghiên
cứu cho thấy rằng những người nhiễm bệnh NoV phụ thuộc vào sự hiện diện của
các thụ thể kháng nguyên nhóm máu histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong đường
tiêu hóa [59]. HBGAs ở người là phức hợp các carbohydrate bao gồm một
oligosaccharide liên kết với protein hoặc lipid trên niêm mạc biểu mô của hệ hô
hấp, sinh dục và ống tiêu hóa, hoặc như các oligosaccharide tự do trong các dịch
sinh học như nước bọt [66]. Cả 3 họ HBGA chính (họ ABO, Lewis và họ secretor)
đã cho thấy có sự liên quan đến việc nh n diện NoV. Sự phối hợp của liên kết đặc
hiệu chủng và biểu hiện biến đổi trên thụ thể HBGA có thể giải thích sự mẫn cảm
của người nhiễm khác nhau được theo dõi trong các vụ dịch NoV và trong các
nghiên cứu ở người tình nguyện [88].
1.2.4. Chẩn đoán
Có nhiều phương pháp thích hợp để chẩn đoán nhiễm NoV. Những phương

pháp này bao gồm: quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử (EM), quan sát bằng
kính hiển vi điện tử miễn dịch (IEM), thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch
13


(IAHA), thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm miễn dịch enzym
(EIA), thử nghiệm sắc ký miễn dịch (IC), RT-PCR, real-time PCRvà giải trình tự
nucleic acid. Trong số những phương pháp này thì RT-PCR, real-time PCR và giải
trình tự nucleic acid được sử dụng rộng rãi để phát hiện và xác định kiểu gen của
NoV [50], [71], [81], [98] . Các kỹ thu t sinh học phân tử này đã thay thế các thử
nghiệm miễn dịch truyền thống và trở thành tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán nhiễm
trùng NoV trong th p kỷ qua.
 Các kỹ thuật chẩn đoán thông thường
- Quan sát trực t ếp bằn sử dụn EM: kỹ thu t này cho phép phát hiện
một lượng virus > 106/ml trong dịch huyền phù phân, nó chỉ có thể thành công khi
áp dụng trong giai đoạn sớm của bệnh [89].
- Kỹ t uật IEM: trong kỹ thu t này, huyết thanh miễn dịch được sử dụng để
nâng cao sự phát hiện virus bởi sự ngưng kết của các hạt virus trong dịch huyền phù
phân. Sự kết cụm virus xảy ra trong sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu có thể phát
hiện và cải thiện khả năng chẩn đoán đặc hiệu. Tuy nhiên, kỹ thu t này chỉ được sử
dụng cho các mẫu phân thu nh n trong giai đoạn đầu của bệnh [58].
-T ửn

ệm n

n kết ồn cầu m ễn d c (IAHA) và m ễn d c p ón

xạ (RIA): IAHA là thử nghiệm để đánh giá nồng độ kháng thể NoV trong một lượng
lớn huyết thanh vì thế các nghiên cứu dịch tễ học về huyết thanh có thể được thực hiện
bằng thử nghiệm này [45]. Những hạt virus được làm sạch từ mẫu phân có thể được

dùng như một kháng nguyên và tương tác của phức hợp giữa kháng nguyên/kháng thể
được phát hiện bởi sự ngưng kết hồng cầu nhóm máu O ở người. Mặc dù thử nghiệm
có lợi thế là đòi hỏi kháng nguyên ít hơn, nó nhanh chóng được thay thế bằng RIA.
RIA đã được phát triển như là một phương pháp thay thế cho IEM để phát hiện kháng
nguyên NoV trong các mẫu phân [39]. Hiện nay, 2 phương pháp này đang được nghiên
cứu để phát triển thêm.
 Các kỹ thuật phân tử
Sau thành công về tạo dòng và giải trình tự bộ gen virus Norwalk (NoV), thử
nghiệm RT-PCR được phát triển để phát hiện NoV trong cả mẫu bệnh phẩm và mẫu môi
14


trường trong hai th p kỷ qua. Ứng dụng RT-PCR và các kỹ thu t giải trình tự cDNA để
phát hiện và mô tả đặc điểm di truyền NoV đã tăng cường đáng kể sự hiểu biết của
chúng ta về dịch tễ học của bệnh nhiễm NoV [88], [98]. Gần đây, RT-PCR được sử dụng
rộng rãi như một công cụ để chẩn đoán bệnh nhiễm NoV. Một bước ngoặt đáng tin c y
nhất cho chẩn đoán nhiễm NoV là sự hiện diện RNA của NoV trong các mẫu phân. Để
tạo điều kiện cho việc phân tích phân tử RNA của NoV, khuếch đại bộ gen RNA của
chúng và trình tự của sản phẩm khuếch đại phải được thực hiện. Thêm vào đó, các kỹ
thu t phân tử khác như: PCR miễn dịch, RT-LAMP và realtime PCR, những kỹ thu t đó
nhanh và nhạy hơn phương pháp RT-PCR chuẩn, gần đây các phương pháp realtime RT
PCR đã được phát triển để phát hiện nhanh NoV trong một số lượng lớn các mẫu phân
và mẫu hải sản trong suốt mùa dịch bệnh và các vụ dịch của NoV [44], [90].
Trong những năm gần đây, protein vỏ NoV biểu hiện bởi baculovirus trên dòng
tế bào côn trùng để tạo hạt giống virus-like particles (VLPs). Những VLPs này có hình
thái và kháng nguyên giống với các hạt virus nguyên thể. Các VLPs rất hữu ích cho
việc tạo miễn dịch của nhiều loài động v t khác nhau (chuột, chuột lang và thỏ) để sản
xuất sản phẩm huyết thanh miễn dịch đa và đơn dòng và sau đó có thể được sử dụng để
thiết l p các thử nghiệm chẩn đoán cơ bản EIA như thử nghiệm ELISA và thử nghiệm
IC [84]. Một số bộ kít ELISA dùng để phát hiện NoV trong các mẫu phân đã được phát

triển và thương mại hóa. Mặc dù các mẫu phân có thể được thử nghiệm trực tiếp bằng
những bộ kít ELISA mà không cần bước tinh chế và cô đặc quá phức tạp, độ nhạy của
phương pháp ELISA thì thấp hơn nhiều so với phương pháp RT-PCR [28], [51]. Độ
nhạy thấp là hạn chế của phương pháp ELISA, điều đó làm cho nó không phù hợp cho
việc phát hiện trực tiếp NoV trong các mẫu phân, mẫu hải sản mà không có sự cải thiện
độ nhạy. Gần đây, thử nghiệm phát hiện nhanh bằng bộ kít IC cũng đã trở thành
thương mại hóa, có sẵn để phát hiện NoV. Bộ kít IC này đã chứng minh có độ nhạy
cao hơn so với các thử nghiệm bằng ELISA. Tuy nhiên, hạn chế của các thử nghiệm
chẩn đoán EIA cơ bản để phát hiện NoV là chỉ có một số kiểu gen NoV mà các kháng
thể đơn dòng đặc hiệu có thể được phát hiện.
15


1.2.5. Phương pháp realtime RT-PCR (Realtime Reverse transcription polymerase
chain reaction)
Kỹ thu t Realtime RT-PCR cũng qua 2 bước cơ bản giống như RT-PCR tạo
cDNA và sau đó sử dụng cDNA này để thực hiện phản ứng real-time PCR.
- Giai đoạn phiên mã ngược: Để có thể thực hiện được phản ứng này thì
trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT-reverse transcription) thành
cDNA. Enzym được sử dụng trong giai đoạn này là Reverse transcriptase. Mồi sử
dụng trong giai đoạn này là mồi ―ngược‖ của PCR giai đoạn sau, có thể là
oligonucleotic oligodT (để bắt cặp với đuôi poly A của các mRNA) hoặc cũng có
thể là một mồi ngẫu nhiên (random primer) có bản chất là một hexan nucleotide bắt
cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên mRNA.
- Phản ứng Realtime PCR: là kỹ thu t PCR sử dụng các đặc điểm của quá
trình sao chép DNA. Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy
DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ
bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát
huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh
quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe. Khi DNA tương hợp với primer thì

quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự
gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy BIO-RAD, máy có bộ camera có thể chụp
được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh
quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá
trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định,
sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu
kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để
đánh giá kết quả phản ứng.
1.3. Tìn

ìn n

ên cứu NoV tron và n oà n ớc

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
NoV thuộc họ Caliciviridae là nguyên nhân đứng thứ hai (sau RV) gây nên
các vụ dịch tiêu chảy ở các nhóm tuổi, trong đó gặp chủ yếu là ở trẻ em dưới 5 tuổi
16


[15]. Theo nghiên cứu trên toàn thế giới, tỷ lệ ca tiêu chảy do nhiễm NoV thường
khá cáo (Brazil 33%, Nh t 29%, Ý 48,4%, Đài Loan 29,5%, Ấn Độ và Thái Lan:
12-44%). Từ năm 1995 đến nay, trên thế giới đã xảy ra 5 đại dịch tiêu chảy cấp do
NoV. Những vụ dịch này lan rộng ra toàn thế giới trong vòng vài tháng. Khoảng
thời gian giữa các lần xuất hiện đại dịch ngày càng ngắn hơn. NoV là một trong
những virus có mức độ đa dạng di truyền cao taọ điều kiện để chúng lưu hành phổ
biến và khả năng thích ứng rộng trong cộng đồng.
Trong nghiên cứu của Castilho và cộng sự (2006) đã tiến hành kiểm tra 234
mẫu phân từ trẻ em có hoặc không có viêm dạ dày ruột trong một khoảng thời gian
5 năm (1995-1999) ở bang São Paulo, Brazil. NoV được phát hiện bằng kỹ thu t

RT-PCR với việc sử dụng hai cặp mồi oligonucleotide khác nhau nhắm vào 3’ của
gen RNA polymerase (vùng B), cũng như một khu vực capsid một phần ở đầu 3'
của gen VP1 (vùng D). Tổng cộng có 78 (33%) các mẫu xét nghiệm dương tính cho
NoV, trong đó chủng GI chiếm 6,1% và GII chiếm 78,7%, còn lại là bội nhiễm của
2 genogroup này [24]. Năm 2009, Carlsson B và cộng sự, đã phát hiện ra có 54,2%
trong tổng số 116 người ở một nhà dưỡng lão già ở El Grao de Castellón, Tây Ban
Nha đã nhiễm NoV (GII.4) [23]. Đến năm 2013, Najafi A. và cộng sự đã tiến hành
nghiên cứu trên 375 mẫu phân của trẻ em dưới 7 tuổi bị bệnh viêm dạ dày ruột cấp
tính ở bệnh viện Nhi khoa Shahrivar, thành phố Borazjan, Iran. Trong tổng số mẫu
thu được, NoV được phát hiện ở 47 trong tổng số 375 (12,53%). Tỷ lệ nhiễm cao
nhất là ở trẻ em dưới hai tuổi (76,6%). Đặc biệt, virus này đạt tỷ lệ cao nhất trong
mùa thu (63,83%) và thấp nhất ở mùa hè (6,38%) [70].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tiêu chảy là một trong những bệnh có tỉ lệ mắc cao, đứng thứ hai chỉ sau các
bệnh về đường hô hấp ở trẻ dưới 5 tuổi, đặc biệt ở các nước đang phát triển.
Nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy bao gồm virus, vi khuẩn và ký sinh trùng. Nhờ có
những nỗ lực đưa giám sát tiêu chảy kèm chẩn đoán tác nhân vi rút, do Tổ chức Y
tế thế giới tài trợ từ những năm 1998 đến nay, nghiên cứu về các bệnh tiêu chảy do
virus ở Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu, tiêu điểm nhất là việc sản xuất và
17