Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HUỲNH VĂN CHƢƠNG

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ
VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HUỲNH VĂN CHƢƠNG

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU
CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ

Chuyên ngành : Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số

: 62 64 01 02

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam

HÀ NỘI, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn,
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017
Tác giả luận án

Huỳnh Văn Chƣơng

i


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự
hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng
nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới thầy cô PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình
hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học
và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017
Nghiên cứu sinh

Huỳnh Văn Chƣơng

ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

vii

Danh mục bảng

viii

Danh mục hình

ix

Danh mục biểu đồ

xi

Danh mục đồ thị

xi

Trích yếu luận án

xii

Thesis abstract

xiv

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Mục tiêu của đề tài

3

1.3

Phạm vi nghiên cứu

3

1.4

Những đóng góp mới của đề tài

3

1.5

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1

Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà

4

2.1.1

Căn bệnh cầu trùng

4

2.1.2

Đặc điểm dịch tễ

13

2.1.3

Sinh bệnh học

14

2.1.4

Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng

15

2.1.5

Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà

16

2.1.6

Điều trị bệnh cầu trùng gà

18

2.1.7

Miễn dịch chống cầu trùng ở gà

18

2.1.8

Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà

20

2.2

Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp

21

2.2.1

Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp

21

2.2.2

Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện
gene trong E. coli

21

iii


2.3

Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phƣơng pháp gây miễn
dịch cho gà mái

24

2.3.1

Trọng lƣợng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin)

24

2.3.2

Cấu trúc của IgY

24

2.3.3

Độ bền của IgY

25

2.3.4

Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY

26

2.3.5

Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà

27

2.3.6

Những ứng dụng của IgY

28

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

31

3.1

Địa điểm nghiên cứu

31

3.2

Thời gian nghiên cứu

31

3.3

Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

31

3.3.1

Vật liệu nghiên cứu

31

3.3.2

Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu

31

3.4

Nội dung nghiên cứu

33

3.4.1

Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà

33

3.4.2

Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang
gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli

3.4.3

33

Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định
lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp

33

3.4.4

Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

33

3.4.5

Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh

33

3.5

Phƣơng pháp nghiên cứu

34

3.5.1

Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể,
vi thể của gà mắc cầu trùng

34

3.5.2

Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng

34

3.5.3

Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà

35

3.5.4

Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

35

3.5.5

Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng
và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10.

3.5.6

Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu
hiện gene kháng nguyên 3-1E

3.5.7

37
39

Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lƣợng

của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp

40

iv


3.5.8

Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh
cầu trùng gà

3.5.9
3.5.10

41

Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế
phẩm

42

Phƣơng pháp xử lý số liệu

43

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1

44

Tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể,
vi thể ở gà mắc cầu trùng

4.1.1

44

Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa
Thiên Huế

44

4.1.2

Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi

44

4.1.3

Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng

46

4.1.4

Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng

47

4.1.5

Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng

50

4.2

Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng

54

4.2.1

Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng

55

4.2.2

Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng
(35-42 ngày tuổi)

4.2.3

56

Kết quả nghiên cứu hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu
trùng (35 - 42 ngày tuổi)

58

4.3

Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E

59

4.3.1

Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà

59

4.3.2

Xác định loài cầu trùng bằng phƣơng pháp PCR

59

4.3.3

Kết quả tách chiết ARN tổng số

60

4.3.4

Kết quả thực hiện PCR

61

4.3.5

Tinh sạch sản phẩm PCR

62

4.4

Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E

63

4.4.1

Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng

63

4.4.2

Phân tích trình tự gene 3-1E

64

4.4.3

Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện

pET200/D-TOPO

4.4.4
4.5

66

Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng
đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+

68

Tối ƣu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp

70

v


4.5.1

Kết quả sinh trƣởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã
hóa kháng nguyên 3-1E

70

4.5.2

Kết quả về khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng

71

4.5.3

Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ƣu

72

4.5.4

Kết quả tốc độ lắc tối ƣu lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli
chủng BL21 (DE3)

73

4.5.5

Kết quả về môi trƣờng biểu hiện tối ƣu

74

4.5.6

Nồng độ tối ƣu của chất cảm ứng IPTG

74

4.5.7

Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ƣu

75

4.5.8

Nhiệt độ cảm ứng tối ƣu

76

4.5.9

Mật độ tế bào tối ƣu

77

4.6

Tách chiết, tinh sạch, định lƣợng và xác định tính đặc hiệu của kháng
nguyên 3-1E tái tổ hợp

78

4.6.1

Tách chiết, tinh sạch và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E

78

4.6.2

Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

78

4.7

Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà

79

4.7.1

Xác định liều lƣợng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà

79

4.7.2

Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà

80

4.7.3

Định lƣợng kháng thể IgY

81

4.7.4

Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ

82

4.7.5

Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm

83

4.7.6

Đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm

86

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

89

5.1

Kết luận

89

5.2

Kiến nghị

89

Danh mục các công trình đã công bố

91

Tài liệu tham khảo

92

Phụ lục

106

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Bp

Base pair

Cặp ba zơ

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bò

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic acid

Sợi ADN bổ sung

DNA

Deoxyribonucleic acid

A xít Deoxyribonucleic

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ
gắn enzyme

HI

Hemagglutination inhibition

Ức chế ngƣng kết hồng cầu

IgY

Yolk Immunoglobulin

Kháng thể long đỏ trứng

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

kDa

Kilo dalton

Kilo dalton

NC

Negative control

Đối chứng âm

OD

Optical density

Mật độ quang học

PBS

Phosphate buffer saline

Dung dịch muối đệm phốt phát

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

RIA

Radioimmunoassay

Phƣơng pháp miễn dịch phóng
xạ

RT – PCR

Reverse transcription polymerase chain

Phản ứng chuỗi trùng hợp

reaction

phiên mã ngƣợc

SARS

Severe acute respiratory syndrome

Hội chứng viêm phổi cấp tính

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide

gel electrophoresis
WSF

Phần hòa tan trong nƣớc

Water soluble fraction

vii


DANH MỤC BẢNG
STT
4.1

Tên bảng

Trang

Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú
Vang

44

4.2

Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà

45

4.3

Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng

46

4.4

Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng

48

4.5

Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể
các cơ quan gà bệnh

50

4.6

Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng

55

4.7

Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng

57

4.8

Hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng

58

4.9

Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà

60

4.10

Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên
3-1E ở các môi trƣờng khác nhau

4.11

70

Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên
3-1E ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau

4.12

Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên
3-1E ở các tốc độ lắc khác nhau

4.13

73

Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong long đỏ trứng của gà đƣợc gây miễn
dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất

4.14

84

So sánh tỷ lệ chết ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể
kháng kháng nguyên 3-1E

4.16

80

So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng
kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E

4.15

73

85

So sánh sinh trƣởng của gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể
kháng kháng nguyên 3-1E

85

4.17

Lƣợng Oocyst trong phân gà trƣớc và sau điều trị

86

4.18

Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau điều trị

86

4.19

Ảnh hƣởng của kháng thể kháng sinh lên sinh trƣởng của gà

87

viii

DANH MỤC HÌNH

STT

Tên hình

Trang

2.1

So sánh cấu trúc phân tử của IgY gà và IgG thỏ

25

4.1

Gà mắc bệnh cầu trùng, phân lẫn máu, đứng co cụm, mào yếm nhợt nhạt

47

4.2

Gà chết khi bị mắc bệnh cầu trùng

47

4.3

Manh tràng căng phồng đỏ sẫm bên trong có máu

49

4.4

Manh tràng bên trong xuất huyết màu đỏ sẫm

50

4.5

Oocyst cầu trùng, 20x

52

4.6

Chất chứa lẫn máu trong ruột gà mắc cầu trùng, màu đỏ tƣơi, HE 10x

52

4.8

Giai đoạn tiền Schizont của cầu trùng trong ruột gà, HE.40x

53

4.7

Hồng cầu tràn ngập trong ruột gà mắc cầu trùng, HE. 40x

53

4.9

Megatozit và Schizont 2 (liệt tử) trong ruột gà, HE. 40x

54

4.10

Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở hạ niêm mạc ruột của gà mắc cầu
trùng, HE. 40x.

54

4.11

Oocyst thu đƣợc bằng phƣơng pháp phù nổi

59

4.12

Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho một số loài Eimeria

59

4.13

Ảnh điện di ARN tổng số trên agarose gel 1% có sử dụng
formaldehyde để biến tính.

61

4.14

Ảnh điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1

62

4.15

Ảnh điện di sản phẩm sau tinh sạch trên agarose gel1%

62

4.16

Ảnh nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc

63

4.17

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM T-easy-3-1E trong
chủng E. coli TOP10 trên agarose gel1%

4.18

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên agarose
gel 1%

4.19

64

64

Mức độ tƣơng đồng giữa gene 3-1E đƣợc phân lập với gene 3-1Eđã
đƣợc công bố (AF13613)

65

ix


4.20

Mức độ tƣơng đồng của trình tự amino a xít của kháng nguyên 31E đã phân lập và kháng nguyên 3-1E đã đƣợc công bố
(AAD39362)

65

4.21

Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang gene 3-1E

67

4.22

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid TOPO-3-1E sau khi tách từ
chủng E. coli BL21 (DE3)

4.23

67

Biểu hiện của protein 3-1E trong E. coli BL21 tái tổ hợp trên gel
SDS-PAGE 15%.

68

4.24

Ảnh tinh sạch và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+

69

4.25

Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene
mã hóa kháng nguyên 3-1E

4.26

72

Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên mức độ biểu hiện kháng nguyên tái
tổ hợp 3-1E

4.27

74

Kết quả biểu hiện kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp ở các nồng độ
IPTG khác nhau

4.28

75

Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng của IPTG lên sản xuất kháng nguyên
tái tổ hợp 3-1E

76

4.29

Ảnh hƣởng của nhiệt độ cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên 3-E

76

4.30

Ảnh hƣởng của mật độ tế bào trƣớc khi bổ sung chất cảm ứng

77

4.31

Lƣợng kháng nguyên 3-1E thu đƣợc sau khi tinh sạch bằng gel
ProBondTM Nickel-Chelating Resin

78

4.32

Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E

79

4.33

Ảnh điện di định lƣợng kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE 12%

82

4.34

Bột lòng đỏ trứng sau khi đông khô

83

4.35

Ảnh kết quả ELISA một số mẫu kháng thể IgY3-1E

83

4.36

Oocyst phát triển thành dạng gây nhiễm

84

x


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
STT
4.1.

Tên biểu đồ

Trang

Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong trứng của gà đƣợc gây miễn dịch với
các tá chất khác nhau

81

DANH MỤC ĐỒ THỊ
STT
4.1.

Tên đồ thị

Trang

Kết quả ELISA khảo sát lƣợng kháng thể kháng 3-1E

xi

80


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chƣơng
Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu
chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi;

Mã số: 62 64 01 02

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa
Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng
nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cầu
trùng gà.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phƣơng pháp: Các biểu hiện lâm sàng đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp thƣờng quy, thu Oocyst cầu trùng bằng phƣơng pháp phù nổi và kiểm tra trên
kính hiển vi. Tất cả những gà chết do cầu trùng đƣợc mổ khám thu mẫu bệnh phẩm để xác
định bệnh lý đại thể và vi thể, mẫu bệnh phẩm đƣợc cố định trong dung dịch formon 10 ,
tiêu bản vi thể đƣợc làm theo quy trình tẩm đúc parafin và nhuộm bằng HaematoxylinEosin. Một số chỉ tiêu huyết học đƣợc xác định bằng máy tự động Cell Dyn 3700.
ARN tổng số của cầu trùng gà đƣợc phân lập bằng Kit “SV Total RNA Isolation

System (Promega)” tổng hợp sợi ADN bổ sung từ khuôn ARN đƣợc thực hiện bằng Kit
“First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) ” và đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại
bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA
GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’). Sản phẩm PCR
đƣợc gắn vào vector pGEM-T Easy (Promega), gene 3-1E đƣợc cắt từ vector pGEM-T
Easy/3-1E và tinh sạch bằng Kit “Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System (Promega)”,
sau đó gắn vào vector biểu hiện pET200 D-TOPO, phản ứng gắn đƣợc thực hiện ở 4°C
qua đêm.
Mức độ biểu hiện của protein 3-1E đƣợc xác định bằng SDS-PAGE (15% w/v), sau
đó gel đƣợc nhuộm với Coomassie Blue R-250. Protein 3-1E đƣợc tinh sạch bằng Kit
“ProBondTM Puriication System (Invitrogen, USA)”, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Kết quả chính và kết luận
Gà mắc bệnh cầu trùng biểu hiện các triệu chứng chủ yếu nhƣ: ủ rũ, ít vận động,

xii


tiêu chảy, phân có màng nhầy, có bọt và lẫn máu.
Biến đổi bệnh lý chủ yếu tập trung ở ruột non và manh tràng xuất huyết, manh tràng
căng phồng lên và lớp niêm mạc bị bào mòn. Các tổn thƣơng vi thể nhƣ sung huyết,
xuất huyết nặng, thoái hóa, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm tại manh tràng,
ngoài ra cũng có các tổn thƣơng bệnh lý tại hồi tràng và trực tràng. Trên tiêu bản vi thể
quan sát đƣợc các giai đoạn phát triển khác nhau của cầu trùng ở tế bào biểu mô ruột.
Gà mắc bệnh cầu trùng dẫn đến các chỉ tiêu hệ hồng cầu giảm, số lƣợng bạch cầu
tăng, công thức bạch cầu cũng thay đổi, số lƣợng bạch cầu trung tính và ái toan tăng, trong
khi số lƣợng tế bào lympho giảm. Protein tổng số, lƣợng Albumin và tỷ lệ A G đều giảm.
Phân lập đoạn mã hóa gene 3-1E từ Oocyst cầu trùng thu đƣợc đoạn gene có chiều
dài là 513 bp, mã hóa chuỗi polypeptide chứa 170 amino a xít, tƣơng đồng 99

so với

gene3-1E đƣợc công bố trên GeneBank (mã số: AF113613). Phân tích điện di SDS cho
thấy protein dung hợp 3-1E có khối lƣợng phân tử khoảng 26 kDa.
Môi trƣờng nuôi cấy LB cho khả năng sinh trƣởng tốt nhất với tỷ lệ tiếp giống 2
(OD600 = 0,8), lắc 200 vòng phút ở 37ºC sau 11 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, mức độ biểu
hiện của protein dung hợp 6xHis-3-1E lại cho kết quả tốt nhất trên môi trƣờng YJ trong
cùng một điều kiện tối ƣu (nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8 mM, nuôi lắc ở 200
vòng phút, nhiệt độ cảm ứng 20ºC trong thời gian 10 giờ). Sắc ký lọc gel 6xHis cho
thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lƣợng phân tử khoảng 26 kDa.
Bằng phƣơng pháp đông khô đã thu đƣợc 6-7g bột lòng đỏ từ mỗi quả trứng, sau khi
hoàn nguyên với PBS theo tỷ lệ 1:9 (w w), chế phẩm có hiệu giá kháng thể đặc hiệu đạt
1 280.000. Sử dụng bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng 3-1E tái tổ hợp cho kết quả tốt
trong phòng và điều trị bệnh cầu trùng do Eimeria acervulina, Eimeria tenella,
Eimeria maxima ở gà, nhƣ làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst,
tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trƣởng ở gà.

xiii


THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Huynh Van Chuong
Thesis title: Research on pathological characteristics of chicken infected with coccidia
and development of bioproduct for prevention and treatment of coccidiosis in chicken
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 62 64 01 02
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Survey on some mainly pathological characteristics of chicken infected with
coccidiosis in Thua Thien Hue provine and produce a bioproduct containing specific
IgY antibodies against 3-1E antigen of chicken coccidia used in for prevention,

treatment efficacy of coccidiosis in chicken.
Materials and Methods
The clinical parameters were determined by conventional method, Oocyst
isolation by flotation method. All died chickens caused by coccidiosis were slaughtered
to collect the samples for determination of both macroscopic and microscopic
pathological changes. Tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin and
stained with Haematoxylin- Eosin stain. The change of several hematological
parameters were determined by automated Cell Dyn 3700 sytem.
Total RNA of coccidia was isolated by SV Total RNA Isolation System Protocol
(Promega). First strand cDNA from RNA templates was made First Strand cDNA Synthesis
Kit (Fermentas) and was then used as template in PCR amplification with the specific primers
(topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA
GCGCCCTGGTACA-3’). PCR products (3-1E gene) were ligated into pGEM-T Easy vector
(Promega), The 3-1E gene was cut from pGEM-T Easy/3-1E vector, and purified by
Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System Kit (Promega),they were then ligated into
pET200/D-TOPO expression vector, The ligation mix was incubated at 4°C overnight.
Expression levels of 3-1E protein were determined by sodium dodecyl sulfate-15%
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 15% w/v). The gel slice was then stained
with Coomassie Blue R-250. The 3-1E protein was purified by ProBondTM Purification
System kit (Invitrogen, USA), according to the manufacturer’s instructions.
Main findings and conclusions
Chickens infected with coccidia consist of mainly clinical signs such as: droop,

xiv


inactiveness, watery diarrhea with mucus, bloody or creamy exudate feces.
The main macroscopic lesions of infected chickens showed hemorrhagic and huge
necrosis in intestine and caecum, distended caecum and eroded mucosal layer. The
microscopic lesions consisted of severe hemorrhage, necrosis, degeneration of epithelial

cells, inflammatory infiltrations in caecum, on the other side, pathogenic characteristics
could also be observed in ileum and rectum. The different stages of coccidia were also
observed in the epithelial cells.
Erythro-system parameters decreased, leukocytes number increased and its formula
was changed, number of neutrophils and eosinophils increased, in case of lymphocytes
decreased. The protein total of serum, its formula and A/G ratio were decreased.
We cloned and expressed a gene coding 3-1E antigen from Eimeria isolated from
Thua Thien Hue province, Vietnam. The open reading frame of 3-1E gene has 513 bp in
length, encoding a polypeptide chain with 170 amino acid residuces. Homology search
showed that our 3-1E gene is 99% similarity with 3-1E gene of Genebank (accession
number: AF113613). SDS electrophoresis showed that expression of the 3-1E gene in
E. coli BL21 (DE3) produced a fusion protein with molecule of ~26 kDa.
Improvement of the recombinant antigen expression level in E. coli strain BL 21
Star TM (DE3) encoding gene 3-1E of Eimeria was conducted. The result showed that
LB medium has given the best growth of E. coli BL 21 (DE3) in comparison with other
media in the same 2% initial seed inoculum size (OD600 = 0.8), shaking 200 rpm at
37oC for 11hrs. However, the highest level of fusion protein (6xHis-3-1E) was obtained
from YJ medium in the same optimum culture condition (0.8 mM IPGT-Isopropyl β-D1-thiogalactopyranoside for 10hrs at 20oC). Molecular weight of purified 6xHis-3-1E
protein from 6xHis affinity chromatography was about 26 kDa.
By using lyophilized method, 6-7g of powder from 1 egg, after reverting with PBS
(1: 9, w/w) the solution presented specific antibody titer reaching 1/128.000. Using egg
yolk powder containing antibodies against recombinant 3-1E antigen showed good
results in prevention and treatment of coccidiosis that caused by E. acervulina, E.
tenella, E. maxima in chicken, such as: reducing morbidity, mortality, Oocyst shedding
as well as increasing recovery rate and growth performance.

xv


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bệnh cầu trùng gà là nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho ngành chăn
nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002). Trên toàn thế giới hàng năm ƣớc tính
thiệt hại trên 2 tỷ USD (Williams, 1998). Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh, tỷ
lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao ở gà con (30 - 100 ), làm tăng số gà còi cọc, giảm
tốc độ tăng trƣởng cho toàn đàn, giảm sản lƣợng trứng ở gà đẻ từ 20 - 40%, giảm
chất lƣợng thịt và tăng tiêu tốn thức ăn (Edgar, 1955; Tyzzer, 1932). Bệnh gây ra
bởi ký sinh trùng đơn bào (Protozoa), thuộc phân lớp Coccidia, họ Eimeriidae và
chi Eimeria (Finlay et al., 1993; Lillehoj and Lillehoj, 2000). Gà ở tất cả các lứa
tuổi đều có thể nhiễm cầu trùng, trong đó thƣờng gặp nhất là gà ở giai đoạn 2- 3
tuần tuổi (Lillehoj and Lillehoj, 2000; Lillehoj et al., 2004).
Hiện nay có nhiều loài Eimeria gây bệnh trên gà, trong đó có 7 loài gây bệnh
chủ yếu: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. brunetti,
E. praecox và E. mitis (Shirley, 1986). Mỗi một loài Eimeria khác nhau có vị trí gây
bệnh khác nhau trong đƣờng tiêu hóa (Nguyễn Hữu Hƣng, 2010; Fanatico, 2006).
Cho đến nay, để phòng trị bệnh cầu trùng ngƣời chăn nuôi chủ yếu dùng
kháng sinh bổ sung vào trong thức ăn và nƣớc uống. Tuy nhiên, phƣơng pháp
này còn nhiều hạn chế nhƣ: Xuất hiện một số chủng Eimeria có khả năng kháng
kháng sinh (Chapman, 1997), tạo ra một loại thuốc mới đòi hỏi chi phí cao
(Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dƣ trong
sản phẩm gia cầm làm ảnh hƣởng đến ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, tạo ra các chế
phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh cầu trùng, thay thế kháng sinh là nhu cầu cấp
bách của thực tiễn.
Protein 3-1E là một kháng nguyên bề mặt có khung đọc mở dài 513 bp, mã
hóa đoạn polypeptide dài 170 amino a xít với khối lƣợng phân tử là 18.523 kDa,
tồn tại ở giai đoạn Sporozoite và Merozoite của một số loài nhƣ E. acervulina,
E.tenella, E. maxima. Đã có những nghiên cứu sử dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ
hợp làm vắc xin chống lại E. acervulina, E. tenella và E. maxima (Lillehoj et al.,
2000). Tiêm chủng bằng vắc xin ADN dựa trên gene 3-1E cũng gây đƣợc đáp

ứng miễn dịch chống lại cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011).

1


Áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp
3-1E và dùng kháng nguyên này để gây tối miễn dịch cho gà sẽ tạo đƣợc kháng
thể có khả năng chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng. Đây là lợi thế của
phƣơng pháp tiếp cận mới có áp dụng công nghệ cao so với các phƣơng pháp
tách chiết kháng nguyên truyền thống.
Công nghệ chế tạo kháng thể truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở ngƣời
và động vật thƣờng sử dụng các gia súc lớn nhƣ ngựa, cừu. Tuy nhiên, công nghệ
này có nhƣợc điểm là kích thƣớc động vật lớn, đòi hỏi lƣợng kháng nguyên để
gây miễn dịch phải nhiều, để có kháng thể phải lấy máu động vật tách huyết
thanh hoặc huyết tƣơng rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp, việc
lấy máu động vật không đƣợc thƣờng xuyên dẫn đến sản lƣợng kháng thể thu
đƣợc từ mỗi cá thể động vật không nhiều (Hoàng Ngọc Hiển và Nguyễn Văn
Việt, 1998; Lê Thu Hồng, 2004).
Loài gà có khả năng sinh kháng thể tƣơng tự nhƣ động vật có vú. Trong số
các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể đƣợc chuyển qua và tích tụ
trong lòng đỏ trứng, đƣợc gọi là IgY (yolk immunoglobulin). Muốn sản xuất
kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng. Gà mái ở độ
tuổi đẻ ổn định, việc thu hoạch trứng đƣợc thực hiện hàng ngày với lƣợng kháng
thể thu đƣợc từ mỗi quả trứng rất lớn so với kích thƣớc của gà mẹ. Kỹ thuật tách
chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tƣơng đối đơn giản, từ đó công nghệ
chế tạo IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng
đỏ trứng do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lƣợng lớn
kháng thể sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng nhƣ cho ngƣời
(Dias da Silva and Tambourgi, 2010; Schade et al., 2005).
Kháng thể lòng đỏ trứng gà đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và

hiệu quả của nó trong phòng và trị bệnh nhiều bệnh truyền nhiễm đã đƣợc chứng
minh. Mặt khác, kháng thể lòng đỏ có giá thành thấp, dễ bảo quản, có độ an toàn
và tính đặc hiệu cao, đặc biệt là chỉ tác động lên mầm bệnh, không ảnh hƣởng
đến vi sinh vật có lợi trong cơ thể, không gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và
không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng của thực phẩm. Bên cạnh đó việc dùng
kháng thể trong phòng và điều trị bệnh là một giải pháp đƣợc lựa chọn hàng đầu
trong định hƣớng phát triển của ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng
sinh trong phòng trị bệnh ở vật nuôi.

2


1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định đƣợc các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà trên đàn gà
đƣợc nuôi tại Phú Vang- Thừa Thiên Huế.
Sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể
kháng cầu trùng gà.
Xác định đƣợc hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà của chế phẩm sinh học
chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Về thời gian: Các nghiên cứu đƣợc thực hiện từ 2012-2015, tại Viện công
nghệ sinh học- Đại học Huế và Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y- Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.
Về không gian: Đề tài tiến hành khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh
cầu trùng ở gà Tre nuôi thịt tại địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế và nghiên cứu chế
tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả luận án cho thấy triệu chứng lâm sàng, tổn thƣơng đại thể, vi thể và
thay đổi các chỉ tiêu huyết học của gà Tre mắc bệnh cầu trùng tại thừa Thiên
Huế. Đồng thời, xuất phát từ lợi thế của công nghệ sản xuất globulin miễn dịch

từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu có các chế phẩm kháng thể đặc hiệu
thay thế cho thuốc kháng sinh chống lại bệnh cầu trùng gà. Đề tài đƣợc tiến hành
để tạo ra một chế phẩm sinh học có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên
3-1E của cầu trùng gà. Điểm mới trong nghiên cứu này là ứng dụng công nghệ
sinh học để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và gây miễn dịch cho gà mái đẻ.
Sau đó thu trứng có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. Thành
công trong nghiên cứu này là đã chế tạo đƣợc bột lòng đỏ trứng có chứa kháng
thể kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà và sử dụng trong phòng và điều
trị bệnh cho kết quả tốt nhƣ: Làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải
Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trƣởng của gà.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Đây là một công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử để tạo ra
kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để
phòng và điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế và nâng
cao hiệu quả cho ngành chăn nuôi gia cầm.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ
2.1.1. Căn bệnh cầu trùng
Bệnh cầu trùng đã đƣợc phát hiện bởi Rivolta (1983), căn bệnh là một loại ký
sinh trùng có trong phân gà, đến năm 1864 mới xác định đƣợc Eimeria là nguyên
sinh động vật sinh sản theo bào tử thuộc lớp Sporozoa, bộ Cocoidie, họ Eimeriaidae.
Ngày nay bệnh cầu trùng ở gà thế giới đã xác định có khoảng 12 loài
Eimeria. Trong đó có 9 loài đã đƣợc xác định rõ tên, kích thƣớc, màu sắc gồm
E. tenella, E. acervulina, E. mitis, E. brunetti, E. necatrix, E. maxima, E. praecox,
E. hagani, E. mivatti. Có 7 loài cầu trùng gà trong số 9 loài trên gây bệnh phổ
biến (trừ Eimeria hagani, Eimeria mivatti) (Conway and Mckenzie, 2007).

2.1.1.1. Phân loại cầu trùng ở gà
Cầu trùng thuộc giống Eimeria với hình thái và kích thƣớc khác nhau đƣợc
xác định là có khả năng gây bệnh cầu trùng trên gà. Trong đó có một số loài gây
bệnh chủ yếu sau.
a. Eimeria tenella
Các Oocyst của E. tenella có hình ovan, vỏ bọc màu trắng xám hoặc xanh
nhạt, không có lỗ sinh dục (Micropil), cực của Oocyst có nhân phân cực. Kích
thƣớc Oocyst từ 14,2 - 31,2 x 9,5 - 24,8 μm. Quá trình tạo thành bào tử nang ở
môi trƣờng bên ngoài kéo dài 24 - 48 giờ, chúng ký sinh không những trên bề
mặt niêm mạc mà còn thâm nhập sâu vào trong các lớp của màng dịch thuộc
manh tràng và trực tràng (Lê Văn Năm, 2004).
b. Eimeria acervulina
Các Oocyst của E. acervulina có hình quả trứng gà hoặc hình ovan. Đầu
nhỏ của Oocyst có một lỗ sinh dục, đầu to có nhân phân cực. Oocyst có vỏ bọc
nhẵn, có kích thƣớc là 17,7 - 20,2 x 13,7 - 16,3 μm. Oocyst có hai lớp vỏ, không
có thể cặn. Sporocyst có hình trứng, không có thể cặn. Thời gian hình thành bào
tử nang ở môi trƣờng bên ngoài là 24 giờ. E. acervulina ký sinh ở vùng đầu của
ruột non. Oocyst nằm trong ruột tạo nên những điểm màu trắng hay xám hoặc lan
rộng ở mặt ruột non (Lê Văn Năm, 2004).
c. Eimeria maxima
Oocyst của E. maxima có hình quả trứng hoặc hình ovan. Vỏ bọc của

4


Oocyst xù xì, màu nâu nhạt. Tại đầu nhỏ của Oocyst có một lỗ sinh dục và phía
dƣới là nhân phân hạt. Kích thƣớc của Oocyst là 24,4 - 42,5 x 16,5 - 29,8 μm tức
là loại Oocyst lớn. Thời gian hình thành bào tử nang ở môi trƣờng bên ngoài cơ
thể là 48 giờ, ký sinh không những trong các lớp tế bào biểu bì, bề mặt niêm mạc
mà còn trong các lớp sâu của màng dịch thuộc đoạn tá tràng và đoạn dƣới

tá tràng (Lê Văn Năm, 2004).
d. Eimeria mitis
Oocyst của E. mitis có dạng hình tròn, vỏ bọc không màu, không nhân phân
hạt. Kích thƣớc nhỏ 11,0 - 19,0 x 10 - 17,1 μm. Thời gian hình thành bào tử nang
trong môi trƣờng bên ngoài là 48 giờ, loài này ký sinh trong tá tràng và ruột non
dƣới tá tràng (Lê Văn Năm, 2004).
e. Eimeria necatrix
Phân bố rộng trên thế giới, giai đoạn sinh sản vô tính thứ nhất và thứ hai
xảy ra ở ruột non, giai đoạn sinh sản vô tính thứ 3, tiền giao tử và giai đoạn sinh
sản giao tử xảy ra ở ruột già.
Oocyst của E. necatrix có hình ovan hoặc hình tròn và nhân phân hạt, kích
thƣớc nhỏ 13 - 22,7 x 11,3 - 18,3 μm. Vỏ Oocyst cứng và bào tử nang hình thành
trong 48 giờ. E. Necatrix ký sinh chủ yếu ở ruột non ngay dƣới tá tràng. Sporocyst
hình trứng, có thể Stieda, không có thể cặn (Lê Văn Năm, 2004).
f. Eimeria praecox
Loài này phân bố rộng, định vị trên 1/3 phía trên ruột non của gà. Oocyst
của E. praecox có hình trái xoan, vỏ cứng không màu. Nhân phân cực nằm một
bên hoặc xen kẽ giữa các nguyên bào tử. Kích thƣớc nhỏ 16,6 - 27,7 x 14,8 - 19,4
μm. Thời gian tạo thành bào tử nang là 24 - 36 giờ, loài này ký sinh ở đầu ruột
non. Giai đoạn sinh sản xảy ra ở tế bào biểu mô nhung mao ruột thƣờng dọc theo
một phía của nhung mao và ở phía dƣới của nhân tế bào, có 3 hoặc 4 quá trình
sinh sản vô tính (Lê Văn Năm, 2004).
g. Eimeria hagani
Oocyst hình bầu dục, kích thƣớc 15,8 - 29,9 x 14,3 - 29,5 μm, không có lỗ
noãn, không màu. Thời gian sản sinh bào tử là 48 giờ. Loài này ký sinh ở phần
đầu ruột non (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
h. Eimeria brunetti
E. brunetti là loài cầu trùng có độc lực cao gần nhƣ E. tenella. Nang trứng
5

hình bầu dục không màu, kích thƣớc 20,7 - 30,3 x 18,1 - 24,2 μm. E. brunetti
sinh sản bào tử kết thúc trong vòng 24 giờ, trong nang trứng có một cực hay một
số hạt cực, trong thời kỳ nội sinh phát triển trong ruột già, phần cuối ruột non cũng
nhƣ trực tràng, lỗ huyệt cũng có thể bị nhiễm (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
k. Eimeria mivati
Nang trứng của E. mivati có hình trứng, hình bầu dục không màu, có lỗ
noãn và hạt cực, kích thƣớc 10,7 - 20 x 10,1 - 15,3 μm. E. mivati sinh sản bào tử
tiến hành trong 18 - 24 giờ. Thời kỳ phát triển nội sinh của cầu trùng gây tổn
thƣơng tế bào biểu bì, nhung mao hay những khe hốc suốt chiều dài ruột non
(Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
2.1.1.2. Vòng đời phát triển của cầu trùng
Chu kỳ sinh học của cầu trùng giống Eimeria gồm 3 giai đoạn: giai đoạn
sinh sản vô tính, giai đoạn sinh sản hữu tính và giai đoạn sinh sản bào tử. Hai giai
đoạn đầu thực hiện trong tế bào biểu mô ruột còn giai đoạn thứ ba diễn ra ở ngoài
cơ thể vật chủ (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
a. Giai đoạn sinh sản vô tính
Khi các Oocyst xâm nhập vào cơ thể qua đƣờng tiêu hóa, dƣới tác dụng của
dạ dày cơ và các enzyme trong dịch tiêu hóa làm cho vỏ Oocyst bị phá hủy, giải
phóng các Sporocyst và sau đó nhanh chóng xâm nhập vào tế bào biểu bì ruột,
thận, mật,…đôi khi vào mô bào dƣới niêm mạc. Tại đây cùng với sự phân chia
của hạt nhân các Oocyst lớn lên nhanh chóng có hình tròn, hình ovan hoặc hình
elip với nhiều nhân gọi là thể phân lập thuộc thế hệ 1 (Schizont 1).
Ở Schizont 1, xung quanh mỗi nhân nguyên sinh chất xuất hiện và bao quanh
để hình thành dạng ký sinh nhỏ, hình bầu dục. Lúc này chúng đƣợc gọi thể phân
lập trung gian (Merozoite). Các Merozoite thế hệ 1 (kích thƣớc 5 x 15 µm) sinh
trƣởng rất nhanh làm tan vỡ tế bào biểu bì của vật chủ (số lƣợng Merozoite trong
một Schizont thay đổi rất lớn tùy loài dao động từ 8 đến 16, có khi tới 120.000
Merozoite). Khi các tế bào biểu bì nơi cƣ trú bị phá hủy thì các Merozoite lập tức
tấn công sang các tế bào biểu bì mới và quá trình phát triển này đƣợc lặp lại nhƣ

cũ. Đến đây các ký sinh này thuộc thế hệ thứ hai và đƣợc gọi là Schizont 2.
Tùy theo các loài cầu trùng và vật chủ có thể hình thành tiếp các thế hệ
Schizont 3, Schizont 4,…một cách ồ ạt theo cấp số nhân kiểu phản ứng dây
chuyền nguyên tử làm cho hàng loạt tế bào biểu bì của vật chủ bị phá vỡ gây tổn

6


thƣơng nặng nề cho niêm mạc nơi bị nhiễm (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
Mỗi chủng cầu trùng khác nhau có giai đoạn sinh sản vô tính khác nhau, để
hình thành nên các thể phân lập và số thế hệ thể phân lập tùy theo loài. Sau khi kết
thúc giai đoạn sinh sản vô tính chúng chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính.
b. Sinh sản hữu tính
Giai đoạn sinh sản hữu tính bắt đầu phát triển từ thể phân lập thế hệ cuối
cùng của cầu trùng. Sau một số đợt sinh sản vô tính (tùy loài cầu trùng), các
Schizont thế hệ 1, 2, 3,.. chuyển sang sinh sản hữu tính và bắt đầu tạo ra các thể
Gamet có hình dạng giống Schizont nhƣng phát triển hoàn toàn khác. Từ thể phân
lập thế hệ cuối cùng chúng phân chia thành các thể phân đoạn và xâm nhập vào
các tế bào biểu bì ký chủ, biến thành các thể sinh dƣỡng. Các thể sinh dƣỡng này
lại tiếp tục phát triển tạo nên các giao tử đực và giao tử cái. Sau đó các tế bào
giao tử cái biến thành những tế bào sinh dục cái lớn, ít hoạt động và có lỗ noãn.
Nhờ 2 lông roi, giao tử đực di chuyển đến gặp giao tử cái, chui vào giao tử
cái qua lỗ noãn. Trong giao tử cái diễn ra quá trình đồng hoá nhân và nguyên
sinh chất để tạo thành hợp tử. Hợp tử phân tiết một màng bao bọc bên ngoài, lúc
này nó đƣợc gọi là noãn nang (Oocyst) có hình bầu dục, hình tròn hoặc hình
trứng hay hình quả lê. Đến đây các Oocyst rơi vào trong lòng ruột và kết thúc quá
trình sinh sản hữu tính.
Thời gian nội sinh kết thúc, Oocyst theo phân gà ra bên ngoài môi
trƣờng. Thời gian sinh sản hữu tính kéo dài từ 3-22 ngày tùy vào từng loài cầu
trùng. Thời gian từ khi gà chứa Oocyst có sức gây bệnh đến khi gà thải Oocyst

trong phân là 4,5-5 ngày (đối với loài E. acervulina, E. mitis) và 6,5 ngày với
loài E. tenella (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
c. Sinh sản bào tử
Khi Oocyst theo phân ra ngoài, trong lớp vỏ bọc bên ngoài đã chứa đầy
nguyên sinh chất. Ở ngoại cảnh, gặp điều kiện thuận lợi nhƣ nhiệt độ, độ ẩm sau
vài giờ trong nguyên sinh chất đã xuất hiện khoảng sáng và nguyên sinh chất bắt
đầu phân chia. Sau 13 - 48 giờ tùy vào từng loài cầu trùng nguyên sinh chất sẽ
hình thành 4 túi bào tử (Sporocyst). Trong mỗi túi bào tử, nguyên sinh chất lại
phân chia, kéo dài ra tạo thành 2 bào tử con (Sporozoite). Lúc này, trong Oocyst
đã hình thành 8 bào tử con và trở thành Oocyst có sức gây bệnh. Giai đoạn sinh
sản bào tử kết thúc. Những Oocyst có sức gây bệnh lẫn vào thức ăn, nƣớc uống

7


và đƣợc gà nuốt vào trong đƣờng tiêu hóa (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
2.1.1.3. Tính chuyên biệt của cầu trùng
Bệnh cầu trùng khác với các bệnh do vi khuẩn và vi rút về bản chất tự giới
hạn trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của nó. Điều đó có đƣợc là do tính
chuyên biệt của cầu trùng.
Tính chuyên biệt của cầu trùng là sự thích nghi phức tạp và lâu dài của cầu
trùng với cơ thể ký chủ hoặc cụ thể hơn đối với các cơ quan, các mô bào hay tế
bào nhất định phù hợp cho sự tồn tại và phát triển của chúng.
Gần đây đã có nhiều tài liệu chứng tỏ rằng giống cầu trùng Eimeria có tính
chuyên biệt nghiêm ngặt và chỉ có thể nhiễm vào loại ký chủ mà chúng đã thích
nghi trong quá trình tiến hóa. Ví dụ: cầu trùng cừu không thể nhiễm sang trâu, bò
và các loài gia súc khác đƣợc, cầu trùng thỏ chỉ nhiễm vào kí chủ của nó mà
không thể nhiễm vào bất kỳ loài nào khác, cầu trùng gà không gây bệnh cho gà
tây và ngƣợc lại.
Tính chuyên biệt nghiêm ngặt của cầu trùng giống Eimeria biểu hiện không

chỉ đối với ký chủ của chúng mà còn đối với nơi chúng ký sinh trong cơ thể gia
súc và gia cầm. Ví dụ: E. tenella chỉ sống trong niêm mạc manh tràng, E.
acervulina trong tá tràng của gà, E. Bukidnon Ensis ký sinh ở niêm mạc ruột non
bò trong khi đó E. cylindrica cũng ký sinh trong đƣờng tiêu hóa của bò nhƣng lại
ký sinh ở niêm mạc ruột già (Lê Văn Năm, 2004).
Nhƣ vậy, có thể nói rằng tùy theo loài cầu trùng mà chúng có thể sống ở
trên vật chủ này hay vật chủ khác, hoặc các vị trí ký sinh khác nhau trên cùng
một cơ thể gia súc gia cầm. Điều này có ý nghĩa quan trọng giúp một phần trong
việc phân loại cầu trùng đƣợc chính xác.
2.1.1.4. Một số kháng nguyên của cầu trùng gà
a. Kháng nguyên 3-1E
Protein 3-1E là một kháng nguyên bề mặt có ở giai đoạn Sporozoite và
Merozoite của E. acervulina (Lillehoj et al., 2000; Zhao et al., 2011). Theo
Laurent et al. (1994), kháng nguyên này còn có mặt ở một số loài Eimeria nhƣ:
E. tenella, E. maxima, E. acervulina, E. falciform. Việc tiêm vắc xin ADN có thể
gây đƣợc đáp ứng miễn dịch chống lại bệnh cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000;
Ma et al., 2011).
Theo Xu et al. (2006a) thì gene kháng nguyên (3-1E) của E. tenella và gene
8