Nghiên cứu bào chế Nano Doxorubicin đa chức năng

Header Page 1 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

LÊ THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO
DOXORUBICIN ĐA CHỨC NĂNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC

HÀ NỘI – 2017

Footer Page 1 of 116.


Header Page 2 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

LÊ THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO
DOXORUBICIN ĐA CHỨC NĂNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC

KHÓA: QH.2012.Y
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. HÀ PHƯƠNG THƯ

PGS. TS. DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG

HÀ NỘI - 2017
Footer Page 2 of 116.


Header Page 3 of 116.

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Dương Thị Ly
Hương và TS Hà Phương Thư, hai cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ
tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài này. Hai cô đã luôn động viên và
chỉ cho tôi hướng giải quyết vấn đề, để tôi có thể hoàn thành các mục tiêu của đề
tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Lê Thị Thu Hương, chị
đã cho tôi những lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các anh, chị làm việc tại phòng Nano Y sinh, Viện Khoa
học vật liệu, Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam, những người đã nhiệt
tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật
viên Bộ môn Bào chế - Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện
và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Hà Nội ngày 09 tháng 06 năm 2017
Sinh viên

Lê Thị Mỹ Hạnh

Footer Page 3 of 116.

Header Page 4 of 116.

DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

% GP

Phần trăm giải phóng

AD

Alginat - doxorubicin

ADFo

Alginat – doxorubicin – acid folic

ADR

Phản ứng có hại của thuốc

Alg

Alginat

CS%

Phần trăm tế bào sống sót

DLS

Tán xạ laze ánh sáng động

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO

Dimethyl Sulfoside

DOX

Doxorubicin

ECG

Điện tâm đồ

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
hydrochloride

FAD

Fe3O4 – alginat - doxorubicin

FADF

Fe3O4 – alginat – doxorubicin- acid folic

FESEM

Kính hiển vi điện tử quét- phát xạ trường
(Field Emission Scanning Electron Microscope)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IC50

Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử

FTIR

Phổ hồng ngoại

KTTP

Kích thước tiểu phân

MEME

Minimum Essential Medium with Eagle’s salt

MNP

Hạt nano sắt từ
(Magnetic nano particles)

NHS

N-hydroxysuccinimide

PSF

Penicillin- Streptomycin sulfate - Fungizone

SRB

Sulfo Rhodamine B

TCA

Trichloro Acetic acid

Footer Page 4 of 116.


Header Page 5 of 116.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 1
1.1. Giới thiệu chung về hệ nano ......................................................................... 2
1.1.1. Định nghĩa .................................................................................................... 2
1.1.2. Ứng dụng công nghệ nano trong lĩnh vực y dược........................................ 2
1.2.Tổng quan về doxorubicin ............................................................................. 2
1.2.1. Cấu trúc hóa học ............................................................................................ 2

1.2.2. Tính chất lí hóa .............................................................................................. 3
1.2.3.Định tính ........................................................................................................ 3
1.2.4. Định lượng ................................................................................................... 3
1.2.5. Dược lí, cơ chế tác dụng và chỉ định ............................................................ 3
1.2.6. Dược động học ............................................................................................. 4
1.2.7. Tác dụng không mong muốn........................................................................ 4
1.2.8. Các dạng thuốc chứa doxorubicin ................................................................ 6
1.3. Chất mang thuốc polyme alginat ................................................................. 6
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc......................................................................................... 6
1.3.2. Tính chất của natri alginat ............................................................................ 7
1.3.3. Ứng dụng trong ngành dược ........................................................................ 8
1.4. Tác nhân hướng tế bào ung thư acid folic: ................................................. 9
1.4.1. Công thức hóa học........................................................................................ 9
1.4.2. Tính chất lý hóa .......................................................................................... 10
1.4.3. Ứng dụng acid folic trong bào chế các dạng thuốc hướng đích ................. 10
1.5. Hạt nano sắt từ và ứng dụng trong bào chế thuốc sinh học:................... 10
1.5.1. Công thức hóa học của oxid sắt từ ............................................................. 10
1.5.2. Tính chất ..................................................................................................... 10
1.5.3. Ứng dụng hạt nano oxid sắt từ vào liệu pháp tăng thân nhiệt trong điều trị
ung thư.................................................................................................................. 11
1.5.4. Các kĩ thuật chế tạo hạt nano oxid sắt từ ................................................... 11
1.5.5. Ổn định hạt nano oxid sắt từ ...................................................................... 12
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 13

Footer Page 5 of 116.


Header Page 6 of 116.

2.1. Đối tượng ..................................................................................................... 13

2.2. Nguyên liệu, hóa chất .................................................................................. 13
2.3. Thiết bị ......................................................................................................... 14
2.4. Phương pháp nghiên cứu: .......................................................................... 14
2.4.1. Phương pháp chế tạo hệ dẫn thuốc ............................................................. 14
2.4.2. Phương pháp xác định các đặc trưng lí hóa ............................................... 16
2.4.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất mang thuốc và mức giải phóng
doxorubicin in vitro .............................................................................................. 18
2.4.4. Phương pháp đánh giá khả năng gây độc tế bào ........................................ 19
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 21
3.1. Các đặc trưng hóa lý của vật liệu............................................................... 21
3.1.1. Phổ hồng ngoại ........................................................................................... 21
3.1.2. Hình dạng và kích thước ............................................................................ 22
3.1.3. Độ bền và kích thước hạt trong môi trường lỏng ....................................... 24
3.1.4. Khả năng đốt nhiệt cảm ứng ...................................................................... 27
3.2. Hiệu suất mang thuốc, khả năng giải phóng của các hệ trong môi trường
pH 5,5 và 7,4; tác dụng in vitro của các hệ trên tế bào thường Vero và 3 dòng
tế bào ung thư Hep – G2, Hela, LU – 1 ............................................................ 28
3.2.1 Hiệu suất mang doxorubicin của các hệ dẫn ............................................... 28
3.2.2. Khả năng giải phóng của các hệ dẫn ở môi trường pH 5,5 và 7,4 ............. 28
3.2.3. Tác dụng in vitro trên dòng tế bào thường Vero và 3 dòng tế bào ung thư
Hep – G2, Hela, LU – 1. ...................................................................................... 32
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 35

Footer Page 6 of 116.


Header Page 7 of 116.

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1: Đặc trưng cấu trúc của alginat: ...................................................................... 7
Hình 2: Sơ đồ phản ứng tạo amid có xúc tác EDC và NHS........................................ 9
Hình 3: Sơ đồ chế tạo các hệ ..................................................................................... 15
Hình 4: Hệ thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ (a) và minh hoạ bố trí thí nghiệm đốt
nóng cảm ứng từ (b). ................................................................................................. 17
Hình 5: Phổ IR của DOX, AD, ADFo, acid folic và alginat ..................................... 21
Hình 6: Đồ thị so sánh phổ IR của FAD, FADFo và Fe3O4 .................................... 22
Hình 7: Ảnh FESEM vật liệu FA .............................................................................. 23
Hình 8: Ảnh FESEM các vật liệu: ............................................................................. 23
Hình 9: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu FA .......................... 24
Hình 10: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu AD ........................ 24
Hình 11: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu ADFo ................... 25
Hình 12: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu FAD ..................... 25
Hình 13: Sự phân bố kích thước tiểu phân trong chất lỏng mẫu FADF ................... 25
Hình 14: Khả năng đốt nhiệt của FAD

Hình 15: Khả năng đốt nhiệt của FADF..27

Hình 16: So sánh khả năng đốt nhiệt của mẫu FAD 2 mg/ml và FADF 2 mg/ml .... 27
Hình 17: Đồ thị % giải phóng DOX 4 hệ tại pH 7,4 ................................................. 30
Hình 18: Đồ thị % giải phóng DOX 4 hệ tại pH 5,5 ................................................. 30
Hình 19: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX của AD, ADFo tại pH 7, 4 và 5,5 ....... 31
Hình 20: Đồ thị so sánh % giải phóng DOX của FAD và FADF tại pH 7,4 và 5,5 .31
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Kích thước trung bình hạt và thế Zeta khi phân bố trong chất lỏng ....... 26
Bảng 2: Hiệu suất mang thuốc của 4 hệ ............................................................... 28
Bảng 3: % giải phóng DOX ở môi trường pH 5,5 ............................................... 28
Bảng 4: % giải phóng DOX ở môi trường pH 7,4: .............................................. 29
Bảng 5: Giá trị IC50 của các hệ ........................................................................... 32

Footer Page 7 of 116.


Header Page 8 of 116.

MỞ ĐẦU
Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới hiện nay. Theo ước tính
của Hiệp hội quốc tế phòng chống bệnh ung thư thì mỗi năm trên thế giới có
khoảng 14,1 triệu người mắc bệnh ung thư mới và hơn một nửa trong số này có 8
triệu người là ở các nước kinh tế đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Đối phó
với căn bệnh nguy hiểm này, đã có khá nhiều thuốc chữa bệnh ung thư ra đời.
Doxorubicin (DOX) là một hoạt chất được sử dụng khá phổ biến hiện nay.
Tuy nhiên, khi bào chế ở dạng qui ước, DOX gây ra khá nhiều tác dụng phụ
nghiêm trọng, do có kích thước hạt nhỏ, phân bố thuốc đến cả tế bào lành và tế
bào ung thư. Do đó, việc nghiên cứu, phát triển doxorubicin thành các hệ phân
phối thuốc hướng đích là xu thế tất yếu trong việc điều trị bệnh ung thư hiện nay.
Thuốc hướng đích được phát triển dựa trên hai cơ chế. Cơ chế thứ nhất là
nhắm đích bị động, tạo ra các hệ dẫn thuốc có kích thước nano, chỉ đi vào mô ung
thư là các mô có đường kính mao mạch lớn, mà không đi vào được các mao mạch
nhỏ có ở mô lành. Nhờ tính tương thích sinh học cao, dễ phân hủy sinh học, và
kích thước phân tử lớn nên các phân tử polyme alginat được ứng dụng rộng rãi để
làm chất mang trong các hệ phân phối thuốc nano [1],[ 16].
Cơ chế thứ hai là nhắm đích chủ động. Các nhà khoa học sẽ gắn lên hệ các
tác nhân hướng đích, có liên kết đặc hiệu với các thụ thể có trên bề mặt tế bào ung
thư. Acid folic là tác nhân được sử dụng hiệu quả trong các hệ phân phối thuốc
hiện nay [5]. Bên cạnh đó, việc gắn lên hệ các hạt nano oxid sắt từ, sau đó dùng
một từ trường ngoài tác động vào có thể định hướng thuốc chỉ tập trung vào vùng
cần điều trị. Ngoài khả năng hướng đích, hạt nano oxid sắt từ còn có thể làm tăng
nhiệt độ khối u [10], nhờ đó mà hỗ trợ tác dụng điều trị bệnh khi kết hợp với
doxorubicin.

Dựa trên bốn yếu tố trên, với mong muốn tạo ra các hệ phân phối thuốc
hướng đích, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu bào chế nano doxorubicin
đa chức năng ”.
Mục tiêu của đề tài:
1. Chế tạo các hệ dẫn thuốc cấu trúc nano đa chức năng từ alginat,
doxorubicin, acid folic và Fe3O4.
2. Đánh giá hiệu suất mang thuốc, khả năng giải phóng doxorubicin của các
hệ trong môi trường pH 5,5 và 7,4; đánh giá tác dụng in vitro của các hệ trên tế
bào thường Vero và các dòng tế bào ung thư : Hep – G2, Hela, LU-1.
1

Footer Page 8 of 116.


Header Page 9 of 116.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về hệ nano
1.1.1. Định nghĩa
Công nghệ nano là công nghệ nghiên cứu, phát triển và sử dụng các vật liệu
siêu nhỏ ở kích thước nanomet, đồng thời khai thác các đặc tính và hiện tượng mới
xuất hiện khi vật chất ở kích thước nano [19].
1.1.2. Ứng dụng công nghệ nano trong lĩnh vực y dược
Trong những thập niên gần đây, công nghệ nano được sử dụng như là một
công cụ để nghiên cứu và phát triển các dạng thuốc mới, cách dùng mới cho các dược
chất có sẵn, qua đó khắc phục được những hạn chế của dược chất và dạng thuốc
truyền thống như ít tan, không bền, sinh khả dụng thấp, thời gian lưu trong hệ tuần
hoàn ngắn…
Trong điều trị ung thư, có thể ứng dụng công nghệ nano để chế tạo thuốc tác
dụng tại đích.

1.2.Tổng quan về doxorubicin
1.2.1.Cấu trúc hóa học
Công thức phân tử: C27H29NO11.HCl.
Khối lượng phân tử: 579,99.
Tên

khoa

học:

(8S,10S)-10-{[(2R,4S,5S,6S)-4-amino-5-hydroxy-6-

methyloxan-2-yl]oxy}-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-methoxy5,7,8,9,10,12-hexahydrotetracene-5,12-dione [17].
Công thức cấu tạo: [17]

2

Footer Page 9 of 116.


Header Page 10 of 116.

1.2.2.Tính chất lí hóa
Ở nhiệt độ phòng, doxorubicin là các tinh thể hay bột vô định hình, màu vàng
cam, không mùi, dễ tan trong nước, methanol, acetonitrin, tetrahydrofuran. Khi phân
tán trong nước có kích thước < 10 nm. Doxorubicin không tan trong chloroform,
aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu và các dung môi hữu cơ khác [17].
Dung dịch 5mg/ml trong nước có pH 4,5 – 6, màu đỏ. Ở pH > 9, DOX chuyển
thành dạng base không bền, tạo dung dịch có màu tím. Do đó, DOX có vai trò như
một chất chỉ thị màu [17].

Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp. Tuy nhiên ở nồng
độ điều trị thì doxorubicin được coi là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng và
không cần có biện pháp riêng để bảo vệ DOX khỏi ánh sáng [4]. DOX hấp thụ ánh
sáng ở vùng UV-VIS.
1.2.3.Định tính
Doxorubicn được định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng dùng hệ dung
môi 1-butanol/ acid acetic/ nước. Ngoài ra còn có thể dùng phương pháp HPLC và
phương pháp đo quang UV- VIS để phát hiện sự có mặt của DOX [15].
1.2.4. Định lượng
DOX được định lượng bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 233 nm và
480 nm, hoặc bằng phương pháp HPLC [15].
1.2.5. Dược lí, cơ chế tác dụng và chỉ định
Cơ chế tác dụng của doxorubicin chưa được rõ ràng, nhưng nhiều nhà khoa
học đã đồng ý với giả thiết rằng: DOX xen vào giữa cấu trúc xoắn kép ADN tại vị trí
giữa cặp base Guanin – Cytosin tạo ra phức hợp bền vững gây ức chế ADN phụ thuộc
vào enzyme ARN- polymerase, làm rối loạn chức năng cũng như quá trình tổng hợp
ADN khiến tế bào ung thư không nhân lên được. DOX gây gián đoạn mạnh chu kỳ
phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân tuy nhiên cũng tác
dụng tới các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào [4],[ 8].
Được chỉ định chủ yếu trong các trường hợp: ung thư bàng quang, ung thư
phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng, ung thư tinh hoàn, u lympho
dạng Hodgkin và không Hodkgin, sarcoma xương và mô mềm… DOX có thể dùng

3

Footer Page 10 of 116.


Header Page 11 of 116.

đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc khác như vincristine, methotrexate,
cyclophosphamide [4],[ 8].
1.2.6. Dược động học
Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin phân bố nhanh chóng đến các mô phổi,
gan, tim, lách, thận. Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol.
Khoảng 40 - 50% lượng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5-7 ngày ở dạng chưa
chuyển hóa, 5% bị đào thải qua nước tiểu trong vòng 5 ngày. Doxorubicin không qua
được hàng rào máu não, nhưng qua được nhau thai và bài tiết qua tuyến sữa.
Doxorubicin không dùng đường uống vì sinh khả dụng rất thấp (dưới 5%) [8].
1.2.7. Tác dụng không mong muốn [8]
Ðiều trị bằng doxorubicin thường có nhiều tác dụng không mong muốn, một
số phản ứng nghiêm trọng cần được theo dõi chặt chẽ và giúp đỡ của thầy thuốc. Tác
dụng không mong muốn thường phụ thuộc vào đường dùng và liều dùng, tốc độ
dùng, tần số dùng. Suy giảm chức năng tủy xương là phản ứng có hại rất nhạy với
giới hạn liều dùng, nhưng có thể hồi phục. Buồn nôn, nôn và rụng tóc thường thấy ở
tất cả các người bệnh. Một vấn đề cần chú ý là sự tích lũy thuốc gây độc cho tim, tổng
liều tối đa không nên vượt giới hạn 550 mg/m2 da.
Thường gặp, ADR > 1/100
Toàn thân: Chán ăn, sốt, chóng mặt.
Hệ tạo máu: Suy giảm chức năng tủy xương, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu.
Tuần hoàn: Bệnh cơ tim (2%), thay đổi điện tâm đồ (ECG) trong thời gian ngắn.
Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, viêm niêm mạc, ỉa chảy, chán ăn.
Da: Rụng tóc, ban đỏ dọc theo tĩnh mạch tiêm thuốc, sẫm màu móng tay, bong
móng.
Các loại khác: Phản ứng tại chỗ gây kích ứng bàng quang, đặc biệt ngay sau
khi bơm thuốc vào bàng quang.
Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100
Trên da: Phát ban, ban đỏ, mày đay lan rộng.
Tiết niệu - sinh dục: Tăng acid uric máu.

4

Footer Page 11 of 116.


Header Page 12 of 116.

Tiêu hóa: Dùng cùng với cytarabin đôi khi gây loét và hoại tử đại tràng, đặc
biệt biểu mô manh tràng. Cần chú ý theo dõi.
Hiếm gặp, ADR < 1/1000
Toàn thân: Phản ứng phản vệ, rét run, hoa mắt.
Mắt: Viêm kết mạc.
Máu: Suy tủy xương, mạnh nhất xảy ra sau 8 - 15 ngày điều trị, nhưng máu sẽ trở
lại bình thường sau 21 ngày. Nên giảm liều hoặc kéo dài thời gian ngắt quãng dùng thuốc
khi số lượng hồng cầu không bình thường trở lại trong thời gian mong muốn.
Tuần hoàn: Ðộc tính đối với tim là một tác dụng không mong muốn cần phải
được hết sức chú ý trong khi điều trị lâu dài. Mức độ độc tính đối với tim liên quan
tới tổng liều gây tích lũy. Hai loại độc tính đối với tim được mô tả như sau: Biến đổi
ECG cấp nhưng có hồi phục, xảy ra ngay hoặc trong vòng vài giờ sau khi dùng thuốc.
Những thay đổi này hồi phục được, nhưng ít có biểu hiện lâm sàng rõ ràng, đặc biệt
cần phải chú ý nguy cơ loạn nhịp tim và sẵn sàng điều trị. Bệnh cơ tim phụ thuộc vào
tổng liều tích lũy, có thể phát triển sau một thời gian dài điều trị, cho một hậu quả rất
nghiêm trọng. Phản ứng này thường có đặc điểm là giảm sóng QRS và tiến triển
nhanh giãn cơ tim, thường không điều trị được bằng bất kỳ thuốc co sợi cơ tim nào.
Ðể tránh bệnh cơ tim gây suy tim, phải chú ý không sử dụng tổng liều gây tích lũy là
trên 550 mg/m2 da.
Các yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh cơ tim là chiếu tia xạ vào vùng trung thất ở
người có mắc bệnh tim từ trước và người cao tuổi. Nguy cơ sẽ giảm nếu dùng thuốc
theo chế độ hàng tuần. Theo dõi chức năng tim, đặc biệt là phân số tống máu thất trái
bằng siêu âm tim là rất cần thiết. Tuy vậy có nhiều trường hợp bệnh cơ tim phát triển,

thậm chí hàng năm sau khi ngừng điều trị. Ðo cung lượng tim trong quá
trình điều trị là cần thiết nhưng không nên đánh giá quá mức vì như vậy có sự đánh giá
sai về an toàn. Nguy cơ luôn luôn cao nếu tổng liều vượt quá 550 mg/m2 diện tích da.
Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn thường xảy ra 24 giờ đầu sau khi dùng thuốc. Viêm
niêm mạc (viêm miệng, thực quản) sau 5 - 10 ngày, thường nặng và hay gặp hơn khi
điều trị 3 ngày liên tục. Loét và hoại tử biểu mô đại tràng, đặc biệt ở manh tràng có
thể gây chảy máu và nhiễm khuẩn nghiêm trọng, đôi khi gây tử vong. Vấn đề này đã
gặp ở những người bệnh điều trị bệnh bạch cầu tủy bào cấp khi kết hợp doxorubicin
và cytarabin trong 3 ngày.

5

Footer Page 12 of 116.


Header Page 13 of 116.

Da: Rụng tóc, phụ thuộc vào liều sử dụng và có thể bình phục sau khi ngừng
điều trị.
1.2.8. Các dạng thuốc chứa doxorubicin
Chế phẩm dạng qui ước gồm: dung dịch thuốc tiêm 2 mg/ml (tên biệt dược:
Doxorubicin Ebewe, Adorucin, Adrimycin PFS…) và dung dịch tiêm truyền 2 mg/ml
(tên biệt dược: Adrim, Caelyx…). Hai dạng bào chế trên khá phổ biến trên thị trường
thuốc hiện nay, có ưu điểm là giá rẻ và dễ bảo quản. Tuy nhiên, khi sử dụng, lại gây
ra khá nhiều tác dụng phụ, đặc biệt trên tim và tủy xương, gây nguy hiểm đến tính
mạng người bệnh.
Ngoài ra còn có hỗn dịch liposome 2 mg/ml ( chế phẩm: Doxil, Myocet, LipoDox,…) là các dạng thuốc hướng đích mang lại hiệu quả điều trị cao hơn và có ít tác
dụng phụ hơn. Tuy nhiên, đây đều là các thuốc nhập từ nước ngoài, nên có giá khá
đắt, nhiều bệnh nhân đã phải từ chối sử dụng thuốc vì không đủ chi phí chữa bệnh.
Với mong muốn tạo ra các hệ phân phối thuốc hướng đích, có giá cả phải chăng hơn,

chúng tôi tiến hành chế tạo ra hệ phân phối thuốc mới, khắc phục được cả hai nhược
điểm của cả hai dạng thuốc đang có trên thị trường.
1.3. Chất mang thuốc polyme alginat
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc [6]
Alginat là tên gọi chung các muối của acid alginic.
Trong thuật ngữ phân tử, alginat là một họ của copolyme nhị phân không phân
nhánh gồm các gốc β-Dmannuronic (M) và α-L-guluronic (G) liên kết với nhau bằng
liên kết 1-4 glucozid. Cấu trúc khác nhau phụ thuộc vào vị trí của các monome trong
chuỗi mạch, tạo nên các đoạn homopolyme (MM hoặc GG) lẫn các heteropolyme
(MG hoặc GM).

6

Footer Page 13 of 116.


Header Page 14 of 116.

Khối lượng phân tử của alginat thường trong khoảng 50 - 1000kDa.
Hình 1: Đặc trưng cấu trúc của alginat:
a) Các monome của alginat; b) Cấu trúc chuỗi, cấu dạng ghế;
c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch alginat.
1.3.2. Tính chất của natri alginat [6]
-

Độ tan

Natri alginat dễ tan trong nước, tạo dung dịch keo nhớt, không tan trong ethanol
(95%), ether, chloroform và các dung môi hữu cơ khác, dung dịch có pH < 3.
-

Độ nhớt
Khi nằm trong vách tế bào, alginat có độ nhớt cao nhưng khi tách chiết bằng

phương pháp khác nhau, alginat bị giảm độ nhớt. Alginat có khối lượng phân tử
trung bình lớn thì độ nhớt càng lớn. Tỷ lệ mannuronic/guluronic (M/G) cũng ảnh
hưởng đến độ nhớt của sản phẩm. Tuy nhiên, tỷ lệ M/G và trọng lượng phân tử lại
phụ thuộc nhiều vào nhiều yếu tố: Loài rong, độ trưởng thành, khu vực sinh trưởng,
kỹ thuật chiết xuất, thời gian bảo quản... Các alginat mà có tỷ lệ G cao hay M/G thấp
sẽ cho gel rắn hơn.
-

Độ ổn định

7

Footer Page 14 of 116.


Header Page 15 of 116.

Giống như các polysaccarit tự nhiên khác, alginat không bền với nhiệt và ion
kim loại… Độ ổn định của alginat sắp xếp theo thứ tự: natri alginate > amoni alginat
> acid alginic. Alginat có độ nhớt cao kém ổn định hơn alginat có độ nhớt trung bình
hoặc thấp. Bột alginat rất dễ bị giảm độ nhớt nếu không được bảo quản ở nhiệt độ
thấp. Khi lưu trữ alginat có độ nhớt khoảng 50 mPa.s ở 10 - 20ºC, trong thời gian 3
năm, độ nhớt thay đổi rất ít so với ban đầu. Còn với alginat có độ nhớt cao (khoảng
4000 mPa.s), khi bảo quản ở 25ºC sau một năm độ nhớt bị giảm 10% và ở 33ºC thì
bị giảm 45%. Dung dịch alginat ổn định ở pH từ 5,5 - 10 tại nhiệt độ phòng một thời
gian dài, nhưng sẽ chuyển sang dạng gel ở pH nhỏ hơn 5,5.

-

Tính chất tạo gel

Dung dịch hòa tan alginat sau khi đun sôi, để nguội, sẽ tự chuyển sang dạng
gel. Dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel với sự tham gia của những ion hóa
trị II, III. Khi nhỏ một giọt dung dịch natri alginat vào dung dịch CaCl2 sự tạo gel xảy
ra gần như tức thời trên bề mặt của giọt và cho ta hạt gel có dạng hình cầu. Các gel
được tạo thành ở bất kỳ nhiệt độ nào (dưới 100ºC) và không bị chảy ra khi đun nóng.
1.3.3. Ứng dụng trong ngành dược
Alginat được nghiên cứu khá rộng rãi trong ngành dược bởi tính tương thích
sinh học, độc tính thấp và giá thành rẻ [1],[ 16].
Hiện nay, alginat được ứng dụng để cố định tế bào, làm thuốc bao niêm mạc
dạ dày và làm chất ổn định trong các quá trình sinh học… Trong khóa luận này, chúng
tôi đề cập đến khả năng ổn định các hạt nano oxid sắt từ bằng các phân tử polyme
alginat. Bên cạnh đó, khi phân tán trong nước, các tiểu phân alginat có kích thước
khá lớn, nên rất phù hợp làm chất mang thuốc doxorubicin, tạo hệ dẫn thuốc nano
phân tán thuốc đến các mô đích ung thư.
Dựa trên hai cơ sở ứng dụng này của alginat, chúng tôi tiến hành tổng hợp tạo
nên hệ dẫn thuốc gắn doxorubicin với alginat và các hạt nano oxid sắt từ Fe3O4.
Alginat có nhóm chức COO- , doxorubicin có nhóm chức NH2. Do đó, có thể
gắn 2 phân tử trên với nhau thông qua liên kết amid NHCO. Tuy nhiên, nếu chỉ dùng
2 chất này thì phản ứng diễn ra chậm và có hiệu suất thấp. Do vậy, cần dùng EDC và
NHS để hoạt hóa alginat trước phản ứng gắn, để thu được phản ứng có hiệu suất cao
hơn [12].

8

Footer Page 15 of 116.

Header Page 16 of 116.

Hình 2: Sơ đồ phản ứng tạo amid có xúc tác EDC và NHS
1.4. Tác nhân hướng tế bào ung thư acid folic:
1.4.1. Công thức hóa học [11]

Khối lượng phân tử : 441,4

C19H19N7O6

Tên khoa học: acid2-[[4-[[(2-amino-4-oxo-1,4-1,4dihydropteridin-6 yl)
methyl]amino]benzoyl]amino]pentanedioic.

9

Footer Page 16 of 116.


Header Page 17 of 116.

1.4.2. Tính chất lý hóa [11]
Bột màu vàng da cam hoặc màu vàng, ít tan trong nước (1 mg tan trong 100
ml nước), không tan trong các dung môi hữu cơ nói chung, dễ tan trong các dung dịch
hydroxyd và carbonat kim loại kiềm, trong acid hydrochloric hoặc acid sulfuric loãng
làm cho dung dịch có màu vàng.
Dễ tan trong các dung dịch kiềm, các dung dịch acid loãng (HCl, H2SO4…)
làm dung dịch có màu vàng.
Acid folic dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng, tia tử ngoại, chất oxy
hóa, chất khử, acid, kiềm và khi đun nóng. Vì vậy phải bảo quản acid folic trong thủy

tinh màu vàng, tránh ánh sáng, dung dịch phải trung tính, đựng trong thủy tinh trung
tính.
Acid folic có nhóm NH2 và COOH, có thể tạo liên kết amid với cả DOX và
alginat. Do vậy, chúng tôi tiến hành gắn acid folic lên doxorubicin và alginat bằng
cặp phản ứng EDC/NHS tương tự như trong mục 1.3.3 đã trình bày ở trên.
1.4.3. Ứng dụng acid folic trong bào chế các dạng thuốc hướng đích
Trên các tế bào ung thư có một lượng lớn các folate - receptor hơn so với tế
bào thường, nên khi gắn thuốc với các phân tử acid folic sẽ làm tăng hiệu quả hướng
đích, nhắm đến các tế bào ung thư của thuốc [5].
1.5. Hạt nano sắt từ và ứng dụng trong bào chế thuốc sinh học:
1.5.1. Công thức hóa học của oxid sắt từ
Công thức phân tử : Fe3O4 hay FeO.Fe2O3.
Khối lượng phân tử: 231,533.
1.5.2. Tính chất
Oxid sắt từ ở dưới dạng chất rắn màu đen, không tan trong nước và thể hiện từ
tính. Khi làm nhỏ nguyên liệu đến kích thước nhất định, oxid sắt từ thể hiện tính siêu
thuận từ: các hạt từ tính không tương tác với nhau. Khi tác động một từ trường bên
ngoài đủ lớn về cường độ, tần số sẽ làm cho các hạt nano này hưởng ứng, tạo ra nhiệt,
nung nóng các vùng xung quanh [10]. Do đó, có thể lợi dụng tính chất này để làm
tăng nhiệt độ khối u, tiêu diệt các tế bào ung thư. Bên cạnh đó, khi tác động một từ
trường ngoài vào, các hạt nano sẽ tương tác với nhau, tập trung ở vùng cần

10

Footer Page 17 of 116.


Header Page 18 of 116.

điều trị. Với các tính chất trên, hạt nano oxid sắt từ phù hợp để bào chế thành hệ dẫn

thuốc chữa ung thư tác dụng tại đích.
1.5.3. Ứng dụng hạt nano oxid sắt từ vào liệu pháp tăng thân nhiệt trong điều
trị ung thư.
Tăng thân nhiệt là liệu pháp làm tăng nhiệt độ ở các mô, cơ quan trong cơ thể
đến một giá trị thích hợp, để tiêu diệt, gây suy yếu tế bào ung thư, mà ít ảnh hưởng
hoặc không gây tổn thương tế bào lành [18].
Liệu pháp tăng thân nhiệt được chia thành 2 dạng. Dạng thứ nhất là làm nóng
tế bào đến nhiệt độ khoảng 41 - 46ºC, để gây tổn thương trực tiếp hoặc làm cho các
tế bào nhạy cảm với thuốc và tia xạ hơn. Phương pháp này được dùng kết hợp với
hóa trị và/hoặc xạ trị. Dạng thứ hai là làm nóng tế bào đến nhiệt độ 50ºC, để tiêu diệt
trực tiếp khối u [18].
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi muốn ứng dụng các hạt nano oxid
sắt từ để làm tăng nhiệt độ khối u lên 41- 46 ºC, sau đó kết hợp với khả năng gây độc
tế bào của doxorubicin để tiêu diệt hoàn toàn khối u.
1.5.4. Các kĩ thuật chế tạo hạt nano oxid sắt từ
Hiện nay có khá nhiều phương pháp để tạo hạt nano sắt từ: vi nhũ tương, điện
phân, đồng kết tủa, khắc bằng chùm tia điện tử…[14]
Trong khóa luận này, chúng tôi xin đề cập chi tiết về phương pháp đồng kết
tủa, là phương pháp mà chúng tôi tiến hành trong suốt quá trình làm đề tài.
-

Việc chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 dựa vào phương trình hóa học:
2FeCl3 + FeCl2 + 8NH3 + 4H2O

Fe3O4 + 8NH4Cl

- Sau phản ứng, đem rửa bằng nước cất, dùng miếng nam châm đặt dưới đáy
cốc, các hạt Fe3O4 bị từ tính hút, sẽ lắng xuống dưới. Sau một thời gian thì loại bỏ
phần dung dịch phía trên để loại bỏ các tạp chất, đồng thời giữ lại Fe3O4. Làm như
vậy 3 lần, kết quả thu được các hạt oxid sắt từ có kích thước nano phân tán trong

nước. Tuy nhiên sau một thời gian thì các hạt này sẽ kết tụ và lắng đọng làm cho hệ
không còn ở trạng thái như trước nữa.
Phương pháp đồng kết tủa được sử dụng nhiều nhất để chế tạo hạt nano từ tính
vì đây là phương pháp đơn giản, dễ chế tạo, cho kết quả nhanh và chi phí thấp. Tuy
nhiên, phương pháp này có nhược điểm là: trong quá trình điều chế và bảo quản có
sự kết tụ giữa các tiểu phân, tạo thành các tiểu phân lớn hơn, làm mất tính
11

Footer Page 18 of 116.


Header Page 19 of 116.

chất của hạt nano sắt từ. Do đó, cần phải thêm các chất ổn định để bảo vệ các hạt
nano này.
1.5.5. Ổn định hạt nano oxid sắt từ [3]
Việc chia nhỏ các hạt tiểu phân oxid sắt từ đến kích thước nano làm chúng
phản ứng rất nhanh với các tác nhân oxy hóa, nhất là khi có mặt của nước và không
khí ẩm. Do đó, để đảm bảo tính ổn định về vật lý, hóa học của hệ, ta cần phải tạo một
lớp vỏ bảo vệ các tiểu phân nano. Hơn nữa, việc phủ lên bề mặt các hạt MNP một lớp
vỏ bảo vệ còn làm tăng khả năng phân tán của chúng trong nước, dễ dàng tương tác
với các phân tử sinh học và các đích gắn trong cơ thể người, tránh làm kết tụ các hạt
lại với nhau. Có hai phương pháp để bao các hạt nano này. Phương pháp thứ nhất là
tạo ra lớp vỏ polyme bao quanh nhân sắt từ. Phương pháp này khá dễ làm và cho kết
quả khá tốt ở nhiều nghiên cứu. Phương pháp thứ hai: đóng gói các hạt sắt từ vào
trong các liposome, có bản chất là phospholipid kép.
Ở khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp thứ nhất, dùng các phân tử
polyme alginat để bảo vệ các hạt nano.

12

Footer Page 19 of 116.


Header Page 20 of 116.

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
Các hệ cấu trúc nano doxorubicin đa chức năng.
2.2. Nguyên liệu, hóa chất
- Bột sắt FeCl3, FeCl2.6H2O, bột doxorubicin, dung dịch HCl, NH3 đậm đặc,
NHS, EDC, alginat khối lượng phân tử 10 kDa, acid folic tất cả đều được mua từ
hãng Sigma Aldrich, Mỹ.
-

Nước cất được dùng trong toàn bộ các thí nghiệm.

- Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME
(Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L- glutamine, Sodium
piruvat, NaHCO3, PSF (Penicillin- Streptomycin sulfate - Fungizone); NAA (NonEssential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)
- Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic
acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B);
acidAcetic.
-

Chất chuẩn chứng dương tính dùng trong thí nghiệm đánh giá tác dụng in

vitro là dung dịch tiêm truyền Taxol 30mg/5ml, có thông tin chi tiết như sau:
+ Hoạt chất: Paclitaxel.
+ Nhà sản xuất: Bristol Myers Squibb

+ Số đăng ký: VN–8573–04.
+ Số lô: 1537678.
+ Ngày sản xuất: 23/05/ 2015.
+ Ngày hết hạn: 23/05/ 2018.
-

Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan).

-

Dòng HeLa (HeLa cancer cell line – Dòng tế bào ung thư HeLa).

-

Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi).

-

Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ).

13

Footer Page 20 of 116.


Header Page 21 of 116.

2.3. Thiết bị
-

Máy phản ứng vi sóng Microwave Sino 1000, Trung Quốc.

-

Máy đo Zetasizer ZS90.

-

Kính hiển vi điện tử quét Hitachi S - 4800

-

Máy IMPACT – 410 – NICOLET.

-

Máy phát thương mại RDO – HFI.

-

Túi thẩm tích kích thước lỗ lọc 12000 – 14000 Da.

-

Máy đo UV – 2600, Shimadzu, Nhật Bản.

-

Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet
pasteur, các đầu týp cho micropipet…

2.4. Phương pháp nghiên cứu:
2.4.1. Phương pháp chế tạo hệ dẫn thuốc
2.4.1.1. Phương pháp tạo hạt nano oxid sắt từ
Chuẩn bị 0,325 g FeCl3 và 0,2 g FeCl2.4H2O hòa vào 20 ml HCl 2M trong
bình cầu.
Lắp bình phản ứng vào máy phản ứng vi sóng Microware Sino 1000.
Sục khí N2 vào bình 10 phút trước khi tiến hành làm phản ứng nhỏ giọt NH3.
Chọn điều kiện phản ứng là 70ºC trong 30 phút, tốc độ khuấy từ là 600
vòng/phút.
Nhỏ giọt từ từ 25 ml NH3 2M xuống bình phản ứng.
Sau khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ. Dùng nam
châm để lắng từ và rửa hỗn hợp bằng nước cất đến khi thử pH = 7 thì ngừng lại.
Phân tán phần chất rắn màu đen vào 20 ml nước cất, chạy rung siêu âm trong
15 phút để thu được các hạt sắt từ phân bố đều trong nước.
2.4.1.2. Ổn định Fe3O4 bằng alginat
Hòa 200 mg alginat vào 20 ml H2O, thu được dung dịch alginat có nồng độ
10 mg/ml.

14

Footer Page 21 of 116.


Header Page 22 of 116.

Rung siêu âm và nhỏ giọt dung dịch alginat vào hỗn dịch Fe3O4 thu được hệ
hỗn dịch Fe3O4 bọc alginat, ký hiệu là mẫu FA, có nồng độ 5 mg Fe 3O4/ml và 5 mg
alginat/ml.
2.4.1.3. Hoạt hóa alginat

Hòa 0,2 g EDC và 0,1 g NHS vào 10 ml H2O, lắc đều cho tan hết.
Hòa 0,3 g Alg vào 50 ml H2O, khuấy từ đến khi tan hết. Sau đó, hòa tiếp dung
dịch EDC, NHS ở trên vào, bọc kín miệng cốc, và cho khuấy từ trong 2 giờ, thu được
60 ml dung dịch alginat đã hoạt hóa nồng độ 5 mg/ml. Dung dịch này, sau khi chế tạo
xong, nếu chưa dùng đến, cần bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh từ 10 - 20ºC, để bảo
đảm sự ổn định của các tiểu phân trong dung dịch.
2.4.1.4.Gắn DOX và acid folic lên hệ chất mang alginat/Fe3O4

iDOX + alginat

+ FA

AD

FAD
+ acid folic

+ acid folic

FADF

ADFo

Hình 3: Sơ đồ chế tạo các hệ
Cho lần lượt 2 ml DOX 5mg/ml, 6 ml H2O và 2 ml dung dịch alginat đã hoạt
hóa vào cốc có mỏ. Sau đó, khuấy từ trong 1 giờ, thu được 10 ml hệ AD1 ( nồng độ
doxorubicin 1mg/ml).
Pha loãng 2 ml AD1 với 2 ml H2O, khuấy từ trong 30 phút, tạo thành 4ml hệ
AD ( có nồng độ doxorubicin 500 µg/ml).

15

Footer Page 22 of 116.


Header Page 23 of 116.

Pha tiếp 2 ml AD với 0,2 mg acid folic, tiến hành khuấy từ trong 1 giờ, thu
được 2 ml hệ ADFo ( tương đương với nồng độ doxorubicin 500 µg/ml, acid folic
100 µg/ml).
Tiếp đó, pha 5 ml AD1 (nồng độ doxorubicin 1 mg/ml) với 2 ml FA ( nồng độ
Fe3O4 5 mg/ml) và 3 ml H2O, tiến hành rung siêu âm trong 30 phút để thu được 10
ml hệ FAD (tương đương nồng độ Fe3O4 1000 µg/ml, doxorubicin 500 µg/ml).
Phân tán 0,5 mg acid folic vào 5 ml FAD, khuấy từ trong 1 giờ thu được 5 ml
hệ FADF (tương đương nồng độ Fe3O4 1000 µg/ml, doxorubicin 500 µg/ml, acid folic
100 µg/ml).
Sau toàn bộ quá trình, đã chế tạo được 4 hệ dẫn thuốc: AD, ADFo, FAD và
FADF có nồng độ như sau:
-

Doxorubicin:

500 µg/ml.

-

Acid folic:

100 µg/ml.

-

Fe3O4:

1000 µg/ml.

2.4.2. Phương pháp xác định các đặc trưng lí hóa
2.4.2.1. Phương pháp xác định phổ hồng ngoại (FTIR)
Phổ hồng ngoại (FTIR) là một trong những kĩ thuật được sử dụng nhiều nhất
để khẳng định hạt nano từ đã được chức năng hoá do tính đơn giản và sẵn có của phép
đo này. Các phép đo phổ hồng ngoại trong khóa luận được thực hiện trên máy
IMPACT – 410 – NICOLET trong vùng 4000 – 400 cm-1 tại Viện Hóa học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.2.2. Hiển vi điện tử quét (FESEM)
Kết quả đo cho thông tin về hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của các hạt.
Các phép đo và phân tích FESEM trong khóa luận được thực hiện trên thiết bị kính
hiển vi điện tử quét Hitachi S - 4800 đặt tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm vật liệu
và linh kiện điện tử thuộc Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.4.2.3. Phương pháp đo phổ tán xạ laze động (DLS)
Phân bố kích thước hạt và phân bố thế zeta của các mẫu trong khóa luận được
xác định bằng phương pháp tán xạ laze động trên thiết bị Zetasizer - Nano ZS của
hãng Malvern – UK được đặt tại Viện khoa học vật liệu. Đại lượng đặc trưng cho độ
ổn định của hệ phân tán keo là thế Zeta (ζ). Đối với các phân tử và các hạt
16

Footer Page 23 of 116.


Header Page 24 of 116.

đủ nhỏ, thế Zeta cao (âm hoặc dương) sẽ cho độ ổn định cao, hệ phân tán sẽ chống
lại sự keo tụ [20].
2.4.2.4. Phân tích khả năng tạo nhiệt cảm ứng của hệ dẫn thuốc
Khi đặt trong từ trường, Fe3O4 có khả năng tạo nhiệt cảm ứng, có thể nung
nóng và tiêu diệt các tế bào ung thư. Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng
tạo nhiệt cảm ứng của hai hệ có Fe3O4 là FAD và FADF.
Hòa lần lượt FAD, FADF vào bịnh đựng nước cất, pha thành các dung dịch có
nồng độ tương đương nhau về Fe3O4. Khảo sát hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ trên
máy phát thương mại RDO – HFI, thiết bị được đặt tại Phòng Vật liệu nano y sinh Viện Khoa học vật liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. Thực
nghiệm đốt nóng cảm ứng từ được thực hiện trong từ trường xoay chiều có tần số 236
kHz và cường độ 40 ÷ 100 Oe. Từ trường được tạo bởi cuộn dây cảm ứng (7 vòng,
đường kính 3 cm và dài 11,5 cm) có công suất lối ra 5 kW. Các mẫu đo được phân
tán trong môi trường nước và được đặt cách nhiệt với môi trường ngoài bằng một vỏ
bình thuỷ tinh được hút chân không 10-3 ÷ 10-4 Torr (hình 4 b). Nhiệt độ được đo bằng
nhiệt kế quang (GaAs sensor, Opsens) với độ chính xác 0,3 ºC trong
dải 0 - 250 ºC.

(a)

(b)

Hình 4: Hệ thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ (a) và minh hoạ bố trí thí nghiệm đốt
nóng cảm ứng từ (b).

17

Footer Page 24 of 116.

Header Page 25 of 116.

2.4.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất mang thuốc và mức giải phóng
doxorubicin in vitro:
2.4.3.1.Hiệu suất mang thuốc của hệ
Hiệu suất mang thuốc của hệ được đánh giá bằng phương pháp thẩm tích. Lấy
2 ml mỗi mẫu thuốc đem đặt trong túi thẩm tích có kích thước lỗ lọc trong khoảng
12000 – 14000 Da thẩm tích trong 50 ml môi trường. Sau 24 giờ lấy dịch thẩm tích
đem đo quang ở bước sóng 497 nm trên máy UV – 2600 tại phòng 504 tòa nhà Y1,
Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội để định lượng doxorubicin tự do. Từ đó, tính
được khả năng mang DOX của từng hệ theo công thức:
% Load =

20–c1
20

. 100

Trong đó:
-

% Load: Hiệu suất mang doxorubicin của hệ dẫn.

-

c1: Nồng độ doxorubicin tự do dung dịch bên ngoài thẩm tách sau 24 giờ.
Nếu hệ không mang thuốc, có 100% doxorubicin tồn tại ở dạng tự do thì dịch

thẩm tích có nồng độ doxorubicin là

500 . 2
50

= 20 µg/ml.

2.4.3.2. Mức độ giải phóng in vitro của doxorubicin
Mức độ giải phóng in vitro của doxorubicin khỏi các hệ dẫn thuốc được đánh
giá bằng phương pháp thẩm tích trên 2 môi trường pH khác nhau:
-

pH 7,4: Môi trường sinh lý trong các tế bào thường.

-

pH 5,5: Môi trường trong tế bào ung thư.

Lấy 2 ml mỗi mẫu thuốc đem đặt trong túi thẩm tích có kích thước lỗ lọc trong
khoảng 12000 – 14000 Da thẩm tích trong 50 ml môi trường, ủ ở 37ºC trong 48 giờ.
Tại các thời điểm khác nhau, lấy ra 5ml dịch thử, và bổ sung lại bằng 5ml môi trường.
Sau đó, định lượng doxorubicin trong dịch thử bằng phương pháp đo quang ở bước
sóng 497 nm trên máy UV – 2600 và tính được lượng dược chất giải phóng theo công
thức:
𝑖−1

∑

𝐶𝑗. 5 + 𝐶𝑖. 50 = 𝑚𝑖

𝑗−1

%GP=

mi

.100

mo

18

Footer Page 25 of 116.