chuyển hóa sinh học và các sản phẩm trao đổi chất acid lipoic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYỂN HÓA SINH HỌC
VÀ CÁC SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT

ACID LIPOIC
GDHD:
TS. Nguyễn Thị Mỹ Lan
TS. Nguyễn Thị Thanh Kiều

1


NỘI DUNG
I. TỔNG QUAN VỀ LIPOATE

1.
2.

Lipoate
Cấu trúc của các phức hợp lipoated.

II. LIPOATE TRONG XÚC TÁC
III. CƠ CHẾ LIPOYL HÓA

3.
4.
5.

Tổng hợp lipoate
Khử lipoate
Tách lipoate

IV. LIPOATE LÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA
V. CHUYỂN HÓA LIPOATE Ở VI KHUẨN

6.
7.

Vi khuẩn Gram âm
Vi khuẩn Gram dương

VI. CHUYỂN HÓA LIPOATE Ở NẤM
VII. CHUYỂN HÓA LIPOATE Ở ĐỘNG VẬT NGUYÊN SINH


TỔNG QUAN VỀ LIPOATE

1. Lipoate

-

Là cofactor organosulfur, cần cho phức hợp enzyme trong quá trình oxy hóa và
chuyển hóa carbon.

-

Dạng đồng phân lập thể R là dạng có hoạt tính sinh học. (A)
Lipoamide - dạng oxy hóa của cofactor lipoyl. (B)

Dihydrolipoamide - dạng khử của cofactor lipoyl. (C)

3


TỔNG QUAN VỀ LIPOATE

-

Yếu tố kích thích sự tăng trưởng của các vi khuẩn axit lactic (ARF – yếu tố thay thế
acetate).

-

Giúp S. faecalis oxy hóa pyruvate (POF – nhân tố oxy hóa pyruvate).
Giúp Butyribacterium rettgeri sử dụng lactate làm cơ chất (nhân tố BR).
Tan trong dầu, tham gia vào quá trình đồng hóa của các axit béo.
Các sinh vật có thể tự tổng hợp lipoate từ chất tiền thân là axit octanoic (axit caprylic)

4


TỔNG QUAN VỀ LIPOATE
Các phức hợp đa enzyme phụ thuộc vào lipoate

5


TỔNG QUAN VỀ LIPOATE
2. Cấu trúc của các phức hợp lipoated.

-

Các phức hợp α-ketoacid dehydrogenase và acetoin dehydrogenase:
+ Lõi là các trimers E2 được sắp xếp sao cho các vùng lipoyl hóa

được lộ ra mặt ngoài của phức hợp để tương tác với các tiểu đơn vị ngoại vi
E1 và E3.
+ Dimeric E1 (hoặc heterotetrameric α2β2 E1) và dimeric E3 được
sắp xếp xung quanh các lõi E2.
+ E1 của PDH ở hầu hết các vi khuẩn Gram âm và tất cả KDH là
homodimeric (α2), E1 của PDH ở vi khuẩn Gram dương và tất cả BCDH và
AoDH là heterotetramers (α2β2).
+ E1 chứa hai cofactor thiamine pyrophosphate (TPP) hoạt động
thuận nghịch trong xúc tác.

6


TỔNG QUAN VỀ LIPOATE

-

Phức hợp glycine cleavage (GCV): các tiểu đơn vị protein của GCV không hình thành một phức hợp ổn định mà lại
hoạt động như những protein độc lập gồm:
+ Protein P (protein chứa pyridoxal phosphat)
+ Protein H (protein vận chuyển hydrogen)
+ Protein T (protein chứa tetrahydrofolate)
+ Protein L (lipoamide dehydrogenase).

7


LIPOATE TRONG XÚC TÁC
1. Cơ chế xúc tác

-

Các phức hợp α-ketoacid dehydrogenase:

•

E1: sự khử carbon của α-ketoacids => acylates + giải phóng CO2.

•

E2: chuyển acyl từ dihydrolipoamide đến coenzyme A => acyl-CoA.

•

E3: oxy hóa dihydrolipoamide => lipoamide

-

Phức hợp AoDH: cơ chế phản ứng tương tự phức α-ketoacid dehydrogenase, cơ chất là acetoin (3-hydroxy-2butanone) và giải phóng acetaldehyde .

-

Phức hợp GCV:

•

Protein P xúc tác phản ứng khử carboxyl của glycine.

•

Methyleneamine được gắn đồng hóa trị với dihydrolipoamide trên protein H.

•

Protein T xúc tác sự giải phóng NH3 từ methyleneamine và sự chuyển đổi của nhóm methylene từ THF => 5,10CH2-THF

•

Protein L xúc tác quá trình oxy hóa hai electron của dihydrolipoamide => lipoamide.
8


CƠ CHẾ LIPOYL HÓA

2 cơ chế biến đổi sau dịch mã của protein về lipoate là:
1. Tổng hợp lipoate

•

Hình thành lipoate bám protein từ tiền chất octanoyl

E. coli có con đường tổng hợp và khử lipoate xảy ra độc lập v
nhau.

2. Khử lipoate

•

Gắn lipoate tự do vào protein mục tiêu

9


1. Tổng hợp lipoate

LipB
Octanoyl transferase

EC 2.3.1.181

Bước 1: LipB chuyển nhóm octanoyl từ protein mang octanoyl acyl
EC 2.8.1.8

(octanoyl-ACP) sang apoprotein nhưng không sử dụng octanoate làm cơ
chất nên phải nhờ fatty acid synthase loại II tổng hợp octanoyl-ACP.

Bước 2: 2 nguyên tử S được thêm vào bởi LipA, hình thành
dithiolane lipoate

Lipoate synthase
LipA
10

1. Tổng hợp lipoate
- Trong ti thể và plastid thực vật, có các LipB và các paralog LipA .

Mitochondrial
Octanoyl – ACP synthesis

+ Trong plastid cần phải có FAS loại II để tạo sản phẩm là octanoyl – ACP.

+ Trong ti thể, mặc dù có lipoate ligase nhưng nguồn chủ yếu tổng hợp ra octanoyl – ACP do
FAS loại II
- Ở một số sinh vật nhân thực khác, đặc biệt là ở ti thể nấm men, có số lượng khá nhiều FAS
loại II  tổng hợp lipoate càng nhiều
- Ở động vật có vú, lipoate có thể cung cấp từ thức ăn, lipoate theo dòng máu đến các enzyme
mục tiêu vào ti thể của tế bào .

11


2. Khử lipoate
LplA
EC 6.3.1.20

Thực hiện phản ứng qua 2 bước và phụ thuộc ATP

Lipoate ligase

- Bước 1: ATP hoạt hóa lipoate tự do  hình thành phức lipoyl-AMP.

ATP

PPi

Apoprotein

- Bước 2: phản ứng tại gốc carboxyl với lysine trên apoprotein tạo thành liên kết
lipoamide.
12


3. Tách lipoate
Lipoamidase

Lpa

Phân cắt liên kết lipoamide
và giải phóng ra lipoate tự do

- Năm 1950, Reed và các cộng sự phát hiện ra rằng một phần nào đó hoạt tính của enzyme
Enterococcus faecalis

tinh sạch từ E. faecalis không còn hoạt tính trong phức hợp PDH đồng thời giải phóng ra
lipoate tự do.

- Lpa chỉ mới phát hiện gần đây:
+Khối lượng 80 kDa.
+Vùng amidase có đầu N-terminal đặc trưng bởi Ser-Ser-Lys
nhưng vùng C-terminal vẫn chưa rõ chức năng

13

3. Lipoate là chất chống oxi hóa
- Lipoate và dihydrolipoate có vai trò quan trọng trong phản ứng oxi
hóa khử

Cặp oxi hóa – khử

14


3. Lipoate là chất chống oxi hóa
Lipoate có thể tan trong lipid lẫn trong nước, có khả năng tương tác với các chất chống oxi hóa khác tạo màng tế bào có thể chống oxi
hóa

Tocopherol

Glutathione (GSH)

Dihydrolipoate hoạt động cùng chất chống oxy hóa, có khả năng sinh ra các dạng
hoạt động của chất chống oxy hóa khác như vitamin C, glutathione, coenzyme Q10,
vitamin E…

15


Chuyển hóa lipoate ở vi khuẩn-khuẩn gram âm
Alpharoeobacteria

Betaproteobacteria

(Rickettsia- sốt phát ban)

Gammaproteobacteria

Epsilonproteobacteria

Chlamydiae

( P. aeruginosa -bệnh cơ hội )

(bao gồm các loài thuộc chi Helicobacter

(bệnh đau mắt hột )

và Campylobacter)

- Bộ gen: chu kì TCA, phức hợp KDH,
phức hợp lipoate thứ cấp(tiểu phần
E1, E1, E2 - giống PDH).

-loài gây bệnh:
+ chứa protein H,P,T của phức GCV ,
nhưng thiếu protein L tự do.

- Bộ gen; mã hóa PDH, KDH, BCDH, GCV,

- Bộ gen: không mã hóa bất kỳ phức hợp

- C.trachomatis : bộ gen tương tự

và acetoin dehydrogenase.(phức

lipoylated hoặc các enzym tham gia vào

Rickettsia nhưng chứa một phức

lipoylated )

lipoylation.

hợp BCDH bất thường. Phức GCV

+ có khả năng tổng hợp và tinh sạch

chỉ còn protein H.

- PDH xúc tác phản ứng khử

lipoate.

- tính độc do một hệ thống bài tiết loại III

pyruvate => acetyl coenzyme A

-B. pseudomallei ( gây bệnh melioidosis).

(T3SS) quyết định. acetyl-CoA thúc đẩy

(acetyl-CoA) mà chu kỳ TCA cần

+bộ gen: bốn genes BCDH giả định mã

acetyl-CoA.
- Lấy lipoate tinh sạch từ tế bào
chủ.

-Chu trình TCA:
+enzyme kỵ khí -ketoglutarate

biểu hiện của T3SS.

oxidoreductase (KOR) tạo succinylCoA

hóa các tiểu phần E1,E1,E2,E3. Gene LipB

- P. aeruginosa đột biến PDH không gây

thay KDH.

-B. pertussis ( gây bệnh ho gà).

độc ở chuột .

+bộ gen: gene mã hóa cho E1, E1 BCDH.

+flavodoxin oxidoreductase (POR) tạo
acetyl-CoA thay PDH .

-LipB bị gián đoạn làm yếu đi tính độc hại.

16


2.Vi khuẩn gram dương

• Gồm 2 ngành chính: Actinobacteria và Firmicutes.
Actinobacteria

•
•

Chứa nhiều GC và chủ yếu sống hiếu khí.
Có thể tổng hợp các lypoate, không tổng hợp được
lipoate ligase

•

Gồm có nhiều chi trong đó có Corynebacterium
diphtheria, Mycobacterium tuberculosis và
Mycobacterium leprae là vi khuẩn hiếu khí, sống
nội bào.

Fimicutes

•
•

Bộ Bacillales

Bộ gene có ít GC, chủ yếu sống kị khí

B. anthracis, L.monocytogenes ,
Staphylococus aureus

mã hóa lipoate ligase, không tổng hợp
lipoate hoàn chỉnh

•

Chia thành 2 lớp Bacilli và Clostridia, lớp
Bacilli chia làm 2 bộ Lactobacillales
và Bacillales

Streptococcus pneumoniae,
Bộ Lactobacillales

Streptococcus pyogenes,
Enterococcus faecalis

Lớp Clostridia

C.Dificile và C.botulium

17


Actinobacteria
PDH

Corynebacterium

E1, CAE50216; E2,

diphtheria

CAE50166b;
E3, CAE48873

KDH

GCV

a: Các gen nằm trong cụm được in đậm và được liệt kê theo thứ tự
được tìm thấy trong các cụm gen.

E1, CAE49520c;

b: LipB và Lipa được mã hóa gần cụm gen này.

E2, CAE49520

c: Một protein nhị chức mà thiếu một miền lipoylation và đã được
chứng minh là có α-ketoglutarate decarboxylase
d: M. tuberculosis PDH E2 (DlaT) và E3 (LpdC) đã được chứng

Mycobacterium

E1α, CAB08930; E1β,

tuberculosis

CAB08929;
E2
, CAB08928; E1,

E1, CAA15904c;
E2
, CAA15904c

T, CAA94254; H,
CAB01475;
P

minh có chức năng như các thành phần PDH .Hai protein E3 tiềm
năng khác (LPDA và LpdB) có vai trò khác.

, CAB01470

CAA94662;
E2, CAA94256d;
E3, CAA17417d

Mycobacterium leprae

E1, CAC30602; E2,

E1

T,CAC31246; H, CAC31032;

CAC31242b;

, CAC31476c;

P

E3, CAC31903

E2

, CAC31027

, CAC31476c

18


M. tuberculosis

•

M. tuberculosis tồn tại ở các phế nang phổi của vật chủ và phải chịu một lượng oxi và
ni tơ cao ở vật chủ.

•

DlaT và LpdC ( E2 và E3 của PDH) là các thành phần của một phức
hợp chống oxy hóa

NADH

Oxi hóa

LpdC

dihydrolipoamide

Tạo
AhpD

Khử
AhpC

Peroxide và peroxinitrit

Phản ứng tạo ra tại vùng rìa
DlaT
19


M. tuberculosis

Sự xáo trộn dlaT (DlaT) làm cho phức NPPR và PDH không hoạt động và do đó ảnh hưởng đến stress oxy hóa và chuyển hóa trung gian.
In vitro, đột biến DlaT của M. tuberculosis cho thấy tăng sự nhạy cảm với “stress nitrosative” và vi khuẩn dễ bị tiêu hóa bởi đại thực bào, không thể
phát triển trên glucose và glycerol
In vivo, DlaT vi khuẩn tồn tại nhưng không gây ra bệnh lý nghiêm trọng.

sự gián đoạn của dlaT gây hiệu ứng ít nghiêm trọng in vivo hơn in vitro

20

Ngành Fimictes
Lớp Bacilli
Bộ Bacillales

Bacillus anthracis Ames

Listeria monocytogenes

PDH

KDH

BCDH

GCV

AoDH

E1α, AAP27907; E1β,

E1

E3, AAP28101; E1α,

T, AAP28163; P1,

E1α, AAP26611;

AAP27906;

, AAP25228;

AAP28100;

AAP28162;

E1β, AAP26610;

E2,AAP27905; E3,

E2, AP25227

E1β,AAP28099;

P2, AAP28161; H,

E2, AAP26609;

AAP27904

E2, AAP28098

AAP28894

E3, AAP26608

E1α, CAC99130; E1β,

E3, CAC99449; E1α,

T, CAC99426; P1,

CAC99131;

CAC99450;

CAC99427;

E1β,CAC99451;

P2, CAC99428;

E2, CAC99452

H, CAD00503

E2, CAC99132; E3,
CAC99133

Staphylococcus aureus

E1α,CAG42802;

E1,CAG43131;E2

E3, CAG43242;

T, CAG43270; P1,

E1β, AG42803;

, CAG43130

E1α,CAG43241;

CAG43269;

E1β,CAG43239;

P2, CAG43268;

E2, CAG43237

H, CAG42548;

E2, CAG42804; E3,
CAG42805

H, CAG42072

21


Ngành Fimicutes
Lớp Bacilli
Bộ Lactobacillales
PDH

Enterococcus faecalis

KDH

BCDH

GCV

E1α,AAO81144;E1β,AAO81145;E2

E3, AAO81439;

H, AAO82216

,AAO81146;E3,AAO81147

E1α,AAO81438;E1β,AAO81437;E2

AoDH

,AAO81436,

Streptococcus pneumoniae

E1α,AAK99855;
E1β, AK99854;
E2, AAK99853f;
E3,AAK99852e,g

Streptococcus pyogenes

H, CAM30195e

E1α, CAM30335;
E1β, CAM30334;
E2, CAM30333;
E3,CAM30332e,g

e: LplA được mã hóa gần cụm gen này.
f :E2 protein không chứa một miền lipoylation.
g: Một miền lipoylation được tìm thấy ở một đầu amin của protein E3.
22

h: Một protein nhị chức.


Lớp Clostridia

Clostridium botulinum

GCV

AoDH

T,ABS36011; H, ABS38194;

E1α,ABS38403;

P1, ABS35894;

E1β,ABS39150;

P2, ABS38702;

E2, ABS36854;

L, ABS36030e

E3, ABS39191e

e: LplA được mã hóa gần cụm gen này.
f :E2 protein không chứa một miền lipoylation.
g: Một miền lipoylation được tìm thấy ở một đầu amin của protein
E3.

Clostridium difficile

T, CAJ68522e,h; P1,

E1, CAJ66850;

CAJ68522h;

E1, CAJ66851;

P2, CAJ68523; L,

E2, CAJ66852f;

CAJ67557;

E3,CAJ66853e,g

h: Một protein nhị chức.

H, CAJ67563e

23


S. pneumoniae

•
•

Các E2 của AodH thiếu vùng lipoyl.
Vùng lipoyl này được tìm thấy ở đầu N của dehydrogenase dihydrolipoamide (DLDH),
nó điều chỉnh hoạt động của các enzyme này .

•

Hoạt động DLDH điều khiển quá trình nhiễm trùng và sinh bệnh in vivo. DLDH trong S. pneumoniae là
cần thiết cho sự phát triển ở các động vật có vú .

Gây bệnh

S. Pneumoniae bị bất hoat gen DLDH
24

B. subtilis

•

Trong các loài Bacillus, phức hợp lipoylation có thể
điều tiết, hình thành bào tử.

•
o
o

B. subtilis hình thành bào tử, được kiểm soát thông qua PDH
Phức hợp PDH phân ly khi chất xúc tác của nó được sử dụng hết

o

E2 của PDH ở Bacillus thuringiensis bám lên DNA điều chỉnh biểu hiện gen

pdhC và pdhD được điều chỉnh thông qua protein Spo0A bám
prototoxin trong hình thành bào tử

vào 2 vùng binding site nằm trong vùng promoter của pdhC.

o

E1α

pdhA

E2 của PDH B. subtilis bám vào vùng Ori, ức chế sao chép DNA

,E1β

pdhB

E2

pdhC

E3

pdhD
25