Các dẫn xuất của furocoumarin từ rễ cây angelicae dahuricae (bạch chỉ) và ảnh hưởng của chúng tới sự điều hòa phiên mã gene RXRα

Abstract:
1 dẫn xuất mới của furcoumarin gọi là oxyalloimperatorin (1), cùng với 17 dạng dẫn suất
furcoumarin khác đã được phân lập từ rễ Angelica dahurica. Cấu trúc hóa học của hợp chất
chuyển hóa mới được xác định bằng phân tích dữ liệu quang phổ IR, NMR, HRESI-MS. Trong số
các hợp chất biệt lập, 13, 16, 18 (mỗi chất 20µM) có thể làm tăng đáng kể chức năng phiên mã
gen của nuclear receptor RXRα (một dạng protein thụ thể cảm nhận steroid hormones và
thyroid hormones giúp điều hòa 1 gene xác định). Trong khi đó, 7-9, 13, 14 & cấu trúc mới – 1
( mỗi thứ 20 µM) giảm rõ rệt sự phiên mã của RXRα kích thích bởi 9-cis-retionid acid. Nhiều
nghiên cứu cho thấy dẫn xuất Furocoumarin này có thể giải quyết những căn bệnh khó chữa,
như ung thư, bệnh rối loạn chuyển hóa, bởi khả năng điều hòa phiên mã gene RXRα.


1. Giới thiệu

Rễ Angelica Dahurica (Bạch Chỉ), được sử dụng rộng rãi trong y học truyền thống ở Trung Quốc
cho các bệnh như: đau răng, đau đầu, ho, hen suyễn, sổ mũi … Các nghiên cứu trước đây về
hợp chất từ thực vật phát hiện ra rằng rễ của Angelica Dahurica chứa nhiều hợp chất hóa học
khác nhau bao gồm dầu dễ bay hơi, coumarin & glycoside. Trong đó, coumarin có vai trò quan
trong nhất trong các hoạt động nổi bật, như là kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế lipogenetic.
Trong đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào tác dụng chống ung thư của coumarin từ gốc
Angelicae Dahuricae
X receptor-α(RXRα) Retinoid là 1 thành phần trong nhóm nuclear receptor của nhân tố phiên
mã ligand-ativated và là 1 thành phần heterodimer (có nghĩa là 1 protein gồm 2 chuỗi
polypeptide) bắt buộc cho các nuclear receptor khác như thụ thể peroxisome proliferatoractivated (PPAR), thụ thể của retinoid acid (RAR), thụ thể liver X (LXR) . Nó đóng vai trò mấu
chốt trong nhiều quá trình sinh học khác nhau như ung thư, tiểu đường, béo phì, xơ vữa động
mạch, cả agonist (tạm gọi là yếu tố xúc tác) & antagonist (yếu tố ức chế) của RXRα đều có tác
dụng tốt cho mỗi trường hợp bệnh. Trong những năm gần đây, càng nhiều nghiên cứu tập trung
vào tìm kiếm các phân tử từ thiên nhiên với tác dụng điều hòa phiên mã RXRα. Mục đích chính
của các nghiên cứu hiện nay là tìm ra các hợp chất tự nhiên mới với vai trò trên. Nhiều dạng
Furocoumarin được phân lập từ gốc Angelicae Dahuricae & hoạt động phiên mã của chúng đã
được khảo sát.

2. Kết quả và thảo luận

Sắc kí dịch chiết EtOAc-soluble của rễ Angelicae Dahuricae cho ra 1 Furocoumarin mới là 1, cùng
với 17 Furocoumarin khác là 2-18. Các hợp chất được nhận dạng là isoimperatorin (2) [16],
cnidilin (3) [17], phellopterin (4) [18], bergapten (5) [18], imperatorin (6) [19], xanthotoxin (7)
[5], alloimperatorin (8) [16], isooxypeucedanin (9) [20], isodemethylfuropinarine (10) [21],
xanthotoxol (11) [16], 5-methoxy-8-hydroxypsoralen (12) [22], demethylfuropinarine (13) [23],
apaensin (14) [24], pabulenol (15) [25], isobyakangelicin (16) [26], byakangelicol (17) [18] and
oxypeucedanin hydrate (18) [17]Trong đó, 10 & 13 được tìm thấy đầu tiên.
Hợp chất 1 thu dc ở dạng bột trắng vô định hình, [α] 22D+5 (c0.4, MeOH). Công thức phân tử là
C17H6O5, được thành lập bằng HR – ESI – MS với khối lượng là [M+Na] +. Quang phổ IR của 1 biểu
thị đặc tính hấp thu của nhóm α,β-unsaturated lactone, & α,β-unsaturated carbonyl. Quang phổ
1
H-NMR của 1 cho thấy 2 methyl, 1 methoxyl, 5 olefinic & 1 methylene proton. Quang phổ 13CNMR & DEPT của 1 cho thấy 18 carbon, bao gồm 2 methyl, 1 methoxyl, 5 olefinic methane, 2
ketone carbonyl & 5 quarternary carbon (table 1). Dấu hiệu Proton được nhận thấy bởi sự quan
sát tương quan HMQC từ δH 6.69 (1H, d, J = 9.6 Hz) to δC 120.2, δH 7.90 (1H, d, J = 9.6 Hz)
to δC 140.7, δH 8.09 (1H, d, J = 2.0 Hz) to δC 149.6, δH 6.92 (1H, d, J = 2.0 Hz) to δC 110.0, δH
2.84 (2H, br d, J = 7.6 Hz) to δC 39.1, δH 4.78 (1H, tq, J = 7.6, 1.2 Hz) to δC 115.9, δH 1.53 (3H, d,
J = 1.2 Hz) to δC 24.7, δH 1.42 (3H, d, J = 1.2 Hz) to δC 17.1, and δH 3.03 (3H, s) to δC 51.8.
Dữ liệu 1H-NMR & 13C-NMR tương đương nhau ở alloiperatorin (8), 1 furocoumarin tiếp hợp với
1 đơn vị prenyl. Đầu tiên, dấu hiệu proton của olefinic methine ở H 4.78 cho thấy cặp ổn định 2
methyl proton & methylene proton ở H 2.84. quang phổ HMBC cho thấy sự tương quan của bộ
ba olefinic & methy resorance, của methylene proton, của 2 methy proton cộng hưởng. Các số
liệu trên cùng với sự tương quan với 1H-1H COSY giữa H4.78 & methylene proton ở h2.84 đã chỉ
ra sự có mặt của đơn vị prenyl ở 1. Sau đó, phần còn lại của vòng pyrone của coumarin bao gồm
sự cộng hưởng của δC 158.7, 120.2, 140.7, 150.9, 126.6 và δH 6.69, 7.90 Được xác định bằng
phân tích quang phổ 1H-, 13C-NMR & HMBC. Trong đó, 2 cặp tín hiệu proton ở 6.69 & 7.90 được
xem như cặp proton liên kết của pyrone vòng có sự cộng hưởng HMBC với…. do đó, cộng hưởng

HMBC từ 8.09 & 6.92 tới 138.4 & 147.3 cho thấy sự có mặt của vòng furan bao gồm sự cộng
hưởng của δH 8.09 (H-2′), 6.92 (H-3′), δC 149.6 (C-2 ′), 110.0 (C-3 ′), 138.4 (C-6), and 147.3 (C-7).
Methylene proton của prenyl có sự thay đổi có thể so sánh với 8, thay đổi hóa học ở 3.72, chỉ ra
rằng prenyl không còn ảnh hưởng tới carbon không bão hòa của nhóm chức furocoumarin.
Quan sát sự tương quan HMBC từ 2.84 tới carbon signal ở 76.4, 126.6, 138.4 cho thấy prenyl
nằm ở carbon thứ 4 ở 76.4, bên cạnh pyrone & furan ring. Do đó, cộng hưởng 164.7 ở
downfield shift trong quang phổ 13C-NMR cho thấy sự tiếp hợp keton carbon cùng với sự rung
động kéo căng α,β – carbonyl không bão hòa trong quang phổ IR. Tương quan long-rang HMBS
từ H-4 tới 164.7 cho thấy mối liên hệ gần giữa pyrone ring & keton carbon. Vị trí của methoxyl


nhóm thế đã xác định quan sát sự tương quan long-range từ methyl proton signal ở 3.03 tới
cacbon thứ 4 ở 76.4. từ đó, cấu trúc hóa học của 1 cuối cùng cũng được sáng tỏ ở Figure 1, tên
là oxyalloimperatorin. Hóa học lập thể của C-5 cũng được xác định.

Tất cả các
hợp
chất
được phân
lập đều là
dẫn xuất của


furocoumarin. Tác dụng của chúng lên hoạt động phiên mã của RXRα được đánh giá thông qua
hệ thống phân tích Dual – Luciferase reporter. 9-cis-retinoid acid (9-cis-RA) được biết đến rộng
rãi như là một yếu tố tăng cường sự phiên mã [27], Figure 2 nói về các kết quả trước đây, xử lý
tế bào với 9-cis-RA (0.1 µM) thúc đẩy phiên mã liên quan tới hoạt động của luciferase 79%.

Tế bào chuyển gene 293T được xử lý với những hợp chất ( 20 µM) hoặc là 9 – cis – retinoid acid (RA) (0.1
µM). trong 12h. Hoạt động của Firefly luciferase và Rellina luciferase được đo đạc. Mức độ ảnh hưởng

từ các hoạt động của luciferase được tính toán thông qua tỉ lệ hoạt động của Firefly luciferase và Rellina
luciferase. RA được sử dụng như một yếu tố kiểm soát dương. Dữ liệu thể hiện có nghĩa với ± SD (n = 3).
*p < 0.05; **p < 0.01 với các thiết bị xử lý, # p < 0.01 với RA.

Trong các hợp chất ly trích được, 18 (20 µM) tăng đáng kể (P < 0.01) sự kích hoạt phiên mã ở
RXRα, trong khi 13 và 16 (20 µM) cho thấy ảnh hưởng yếu (P < 0.05) trên sự tăng cường phiên
mã. Ngoài ra, 18 với ảnh hưởng phụ thuộc nồng độ trong khoảng 10 – 40 µM được trình bày ở
figure 3.
Tất cả các hợp chất ly trích cũng được kiểm tra khả năng ức chế hoạt động phiên mã của RXRα
sử dụng phương pháp phân tích giống với các báo cáo trước đây, khi đồng thời sử dụng 9 – cis –
RA để kích hoạt quá trình phiên mã của gene RXRα. Trong số các hợp chất thử nghiệm, 7 – 9 ,
13, 14 và hợp chất mới là 1 (mỗi loại 20 µM) cho thấy sự giảm đáng kể ảnh hưởng của các hoạt
động của luciferase kích thích bởi 9 – cis – RA. Thêm vào đó, 1, 9 và 14 được thử nghiệm them ở
3 nồng độ khác nhau là 10, 20 và 40 µM. Như trình bày ở figure 5, cả 3 hợp chất chuyển hóa cho
thấy tác dụng ức chế phụ thuộc nồng độ tốt.


Những phát hiện kể
trên cho thấy các dẫn
xuất của furocoumarin
có thể hữu dụng trong
nhiều bệnh nan y như
ung thư hoặc rối loạn
chuyển hóa, do khả
năng kiểm soát quá
trình kích hoạt phiên
mã của RXRα. Rất thú vị rằng, hợp chất 13 không chỉ cho thấy rằng nó có ảnh hưởng yếu lên quá
trình kích hoạt phiên mã của RXRα mà còn làm giảm hoạt động phiên mã của RXRα kích thích
bởi 9 – cis – RA. Một trong những lý do có thể đúng là hợp chất 13 và 9 – cis – RA cùng cạnh
tranh dính với RXRα khi chúng đồng thời cùng được sử dụng. Vì tác dụng của hợp chất 13 yếu

hơn 9 – cis – RA nhiều, nên hoạt động phiên mã kích thích do 9 – cis – RA giảm. Tuy nhiên giả
thiết này và thực sự có việc tất cả các hợp chất tương ứng cũng có thể dính với RXRα và kiểm
soát hoạt động biểu hiện của gene này hay không còn cần phải nghiên cứu sâu hơn.
Tế bào chuyển gene 293T
được xử lý với 9 – cis – RA (0.1
µM) với có hoặc không các
hợp chất ( 20 µM) trong 12
giờ. Hoạt động của Firefly
luciferase và Rellina luciferase
được đo đạc và mức ảnh
hưởng của hoạt động
Luciferase được tính toán. Dữ
liệu thể hiện có nghĩa ở ± SD (n = 3). *p < 0.05; **p < 0.01



3. Thực nghiệm
3.1. Tổng quan
Dung môi sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được mua từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức). Thuốc
thử phân tích nhận được từ Sinopharm Chemical Reagent co., Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc).
Silica gel (200-300 mesh) được sử dụng trong sắc ký cột và tấm TLC được mua từ Qingdao
Haiyang Chemical Co., Ltd (Qingdao, China). YMC gel ODS-A đã được mua từ YMC co., Ltd
(Allentown, Hoa Kỳ). Quang phổ NMR được thu lại trên một quang phổ kế Bruker Avance 400
tetramethylsilane là tài liệu tham khảo nội bộ. HR-ESI-MS đã được ghi nhận trên Bruker FT-MS.
Phổ hồng ngoại đã được thực hiện trên IR200 Nicolet (Thermo Electron Corporation, USA).Dữ
liệu luân chuyển được thu thập từ một phân cực kế 341 (PerkinElmer Co, LtD, Hoa Kỳ). Các giá
trị của luciferases được đo trên 1420 VICTOR3 TM V (PerkinElmer, Boston, MA, USA).
3.2. Vật liệu
Rễ khô của cây Angelicae Dahuricae (Bạch chỉ) , mua từ một cửa hàng của Tongrentang
Pharmacy (thành phố Hàng Châu, tỉnh Chiết Giang, Trung Quốc) và được xác định bởi bà

Xiuhong Zhou (Senior Engineer, Cục Lâm nghiệp Yongchun, thành phố Tuyền Châu,Trung Quốc).
Một mẫu đã được gửi tại Trường Khoa học dược phẩm ở Hạ Môn, Đại học Hạ Môn, Trung
Quốc. Plasmid (pBind RXRα LBD và pG5 luc) được cung cấp bởi tiến sĩ Xiao-kun Zhang từ Viện
Burnham, Medical Research, Trung tâm Ung thư, La Jolla, CA, USA. Bộ kit thử nghiệm DualLuciferase Reporter đã được mua từ Tổng công ty Promega. Thuốc thử lipofectamine 2000 đã
được mua từ Invitrogen Co., Ltd.
3.3. Ly trích và cô lập
Rễ khô của A. dahurica (3 kg) đã được đun sôi hồi lưu trong 2 giờ với dung dịch ethanol 60% (5
L × 3 lần). Sau khi lọc, dịch chiết xuất được cô đặc trong bình chân không sau đó được huyền
phù trong H2O (5 L) và phân vùng với EtOAc (5 L × 3 lần). Các chất chiết xuất thu được trong
EtOAc được cô lập và làm bay hơi dưới chân không để thu đủ được một lượng chiết xuất hòa
tan trong EtOAc (48,3 g).
Dịch chiết hòa tan trong EtOAc (45,0 g) được sắc ký trên cột silica gel bằng cách sử dụng rửa giải
theo gradient với CHCl3-MeOH (100:0 ~ 0:100) để có được 11 phần (Fr. 1-11).
Fr.2 (12,1 g) sắc ký cột silica gel tẩy rửa với n-hexan-EtOAc (98:2 ~ 1:1) để có được 10 phần nhỏ
(Fr.2-1 ~ Fr.2-10).
Fr.2-5 (1,9 g) được áp dụng cho YMC sắc ký cột ODS và tách rửa bằng dung dịch acetonitrile (55
~ 100%) để cấp cho hợp chất 2 (257,0 mg).


Fr.2-6 (1,3 g) được sắc ký cột YMC gel ODS và rửa với methanol dung dịch nước (40 ~ 100%) để
có 3 (14,0 mg).
Fr.2-7 (2,0 g) được sắc ký trên YMC gel ODS và tách rửa với dung dịch methanol (50 ~ 100%) để
cung cấp cho 4 (300 mg) (Fr.2 7-2) được tiếp tục tịnh hoá thông qua chuẩn bị HPLC (Restek
Prinnacle DB C18, 5 mm, 250 x 10 mm) tẩy rửa với 60% dung dịch nước methanol để đủ 5
phần (40,0 mg, Rt 14,0 phút) và 6 phần (61,0 mg, Rt 17,5 phút).
Fr.2-8 (782,0 mg) đã được sắc ký cột gel YMC với methanol (30 ~ 100%) để thu được 7 (13,0
mg). Fr.2-9 (738,0 mg) được áp dụng cho sắc ký cột gel YMC và tách rửa với methanol (40 ~
100%) để được 8 phần (58,0 mg)
(Fr.2 9-2) đã được tiếp tục tinh chế qua chuẩn bị HPLC tẩy rửa với MeOH-H2O (60:40) đủ 9

phần (39,0 mg,Rt 6,5 min) và 10 (23,0 mg, Rt 10,5 min).
Fr.2-10 (883,0 mg) được sắc ký cột YMC gel và tách rửa bằng dung dịch methanol (40 ~ 100%)
11 (44,0 mg), 12 (21,0 mg), 1 (12,0 mg).
Fr.2 10-4 (100 mg) được sắc ký gel YMC để có được 13 (14,0 mg).
Fr.2-10-4-1được tiếp tục tinh chế qua chuẩn bị HPLC tẩy rửa với MeOH-H2O (70:30) đủ khả
năng 14
(29,0 mg, Rt 6,5 phút) và 15 (38,0 mg, Rt 7,5 phút).
Fr.4 (2,5 g) được áp dụng cho sắc ký cột gel YMC với methanol (40 ~ 100%) như rửa giải để đủ
16 phần (256,0 mg).
Fr.5 (2,0 g) xử lý tách rửa cột silica gel với EtOAc-MeOH (96:4 ~ 0:100)
Fr.5-7 (155 mg) được kết tinh trong chloroform để có được 17 phần (50,0 mg).
Fr.7 (5,18 g) đã bị sắc ký cột silica gel và tách rửa bằng CHCl3-MeOH (99:1 ~ 0:100) để đủ Fr.7-3.
Các subfraction (0,8 g) được áp dụng cho cột silica gel và tách rửa bằng CHCl3-Acetone (95:5 ~
0:100)
đủ 18 phần (131,0 mg).
Oxyalloimperatorin (1): trắng, bột vô định hình, [α]22D +5 (c 0,4, MeOH). UV (MeOH) λmax 361
(Log ε 3,50) nm; IR (MeOH) νmax 2923, 1738, 1687, 1625, 1438, 1082 cm-1 ;H-NMR (400 MHz,
acetone-d4) và 13C-NMR (100 MHz, acetone-d4), xem Bảng 1; HR-ESI-MS m / z 323,0894 [M +
Na]+


(Calcd cho C17H16O5, 323,0890), m / z 339,0643 [M + K] + (Calcd 339,0629)
3.4. Cấu trúc tế bào và phương pháp phân tích Dual – Luciferase reporter Gene
Tế bào phôi thận người 293T đã được nuôi trong DMEM trung bình chứa 10% huyết thanh bào
thai bò (FBS). Phương pháp phân tích Dual-luciferase reporter gene trước đây với một số sửa
đổi đã được sử dụng trong nghiên cứu hiện nay [14,27]. Tóm lại, khoảng 4 X 104 tế bào / giếng
trong tấm 24 giếng. Tế bào đã được chuyển nạp với hai plasmid, 30 ng pBind RXRα LBD và 60 ng
pG5 luc sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sau 24 giờ, các tế bào đã được tiếp xúc với
các hợp chất thử nghiệm trong 12 h. Sau đó, các tế bào rửa bằng PBS và phân giải với bộ đệm
passive lysis buffer (1 × PLB) trong máy rocking platform trong 15 phút. Các hoạt động của

Firefly luciferase và Rellina luciferase đã được kiểm tra bằng kit phân tích hệ thống DualLuciferase Reporter . Các hoạt động tương đối của luciferase đã đạt được tính bằng tỷ lệ giữa
các hoạt động của Firefly luciferase và luciferase Rellina.
3,5. Phân tích thống kê
Các kết quả thể hiện có nghĩa ở ± phân chia tiêu chuẩn (SD) từ ít nhất ba thí nghiệm độc lập.
Thống kê có nghĩa được so sánh giữa hai nhóm. Phân tích thống kê thực hiện với Student t test. Giá trị của P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.


4. Kết luận
Một dẫn suất furocoumarin mới (1) , cùng với 17 dẫn suất furocoumarins khác ( 2-18) được
phân lập từ Rễ Angelica dahurica. Cấu trúc hóa học của các chất chuyển hóa mới được đặc
trưng bởi phân tích IR, NMR, và các dữ liệu quang phổ HR-ESI-MS. Trong số những dẫn suất
furocoumarin, hợp chất mới 1, và các hợp đã biết là 7-9, 13, 14, 16 và 18 cho thấy tiềm năng
hoạt động trong việc điều chỉnh chức năng kích hoạt phiên mã của RXRα. Những chất chuyển
hóa này có thể hiển thị mang lại lợi ích hiệu quả chống lại các bệnh nan y có liên quan đến
RXRα, ví dụ như chống ung thư và chống bệnh tiểu đường. Các hoạt động sinh học của các chất
chuyển hóa và cơ chế phân tử hoạt động của chúng liên quan đến RXRα nuclear receptor có thể
được xem xét trong các nghiên cứu trong tương lai.


Lời cảm ơn
Công trình này được hỗ trợ tài chính Khoa học Hạ Môn và chương trình Technology Key (Số
3502Z20100006), Hoạt động chính của Phúc Kiến (số 2009Y3004), Fundamental Research Funds cho các
trường đại học Trung ương (số 20101211000) và Quỹ khoa học quốc gia tự nhiên Trung Quốc (NSFC) (số
30.873.146)