Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN PHƯƠNG LAN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI- 2017


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Xuân Thành
và các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ để em hoàn thiện được khóa luận
này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em
trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại
học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh
nhất. Nhưng do lần đầu em được làm quen với công tác nghiên cứu khoa học,
cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi
những thiếu sót mà bản thân chưa thấy được. Em rất mong được sự đóng góp
của quý thầy cô và các bạn để khóa luận của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2017

Sinh viên
Trần Phương Lan


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của em trong suốt thời gian
qua, những kết quả và số liệu trong khóa luận được em thực hiện tại “Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2”.
Những số liệu đạt được không hề sao chép hay trùng lặp với bất kỳ tài
liệu nào và cũng chưa từng được công bố trên bất kỳ phương tiện truyền
thông nào.
Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2017

Sinh viên
Trần Phương Lan


BẢNG VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên tiếng anh

Tên tiếng Việt

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

BC

Bacterial cellulose

Cellulose vi khuẩn

OD

Optical Density

Mật độ quang phổ


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
4. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
5. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 4
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................ 5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................ 7
1.2. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu. .......................................... 7
1.2.1. Đặc điểm phân loại của A. xylinum ........................................................ 7

1.2.2 . Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A. xylinum ............................... 9
1.3. Sơ lược về Curcumin ............................................................................... 12
1.4. Tình hình nghiên cứu về Curcumin ......................................................... 17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 21
2.2.1. Phương pháp dựng đường chuẩn .......................................................... 21
2.2.2. Chuẩn bị màng BC ................................................................................ 23
2.2.3. Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline)-PBS 1X ... 26
2.2.4. Chế tạo màng BC .................................................................................. 26
2.2.5. Xác định lượng Curcumin nạp vào màng BC ....................................... 27
2.2.6. Khảo sát lượng thuốc giải phóng của màng BC ở các độ dày màng
0,3cm và 1cm, trong các môi trường pH khác nhau ....................................... 28


2.2.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc Curcumin.
......................................................................................................................... 29
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ................................................ 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 30
3.1. Nghiên cứu về độ dày màng..................................................................... 30
3.2. Tinh chế màng BC ................................................................................... 31
3.3. Thu màng BC nạp Curcumin ................................................................... 33
3.4. Giải phóng thuốc từ màng BC ................................................................. 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 45
1. Kết luận ....................................................................................................... 45
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo ................................... 11
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Curcumin ........... 14
Bảng 2.1. Bảng nồng độ Curcumin 30% ở giá trị đo OD=427 (n=3)............. 22
Bảng 2.2. Môi trường lên men tạo màng BC .................................................. 23
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS ...................................................................... 26
Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tươi .............................................................. 30
Bảng 3.2. Khối lượng Curcumin nạp vào màng BC (n=3) ............................. 34
Bảng 3.3. Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n=3) ............. 37
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc Curcumin (n=3) .......................................... 39
Bảng 3.5. Hệ số tương quan bình phương (R2), tốc độ giải phóng (K) và trị số
số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau của hai độ dày
màng BC .......................................................................................................... 43


DANH MỤC HÌNH
Hình1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của BC: chuỗi polime ß-1,4-glucopyranose
không phân nhánh ............................................................................................. 9
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của Curcumin 20% ............................. 22
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS ...................................................................... 26
Hình 3.1. Màng BC khi lên men ..................................................................... 30
Hình 3.2. Màng BC ngâm trong NAOH 3% ................................................... 32
Hình 3.3. Màng BC ngâm HCL 3% ................................................................ 32
Hình 3.4. Màng BC tinh chế ........................................................................... 33
Hình 3.5. Màng BC sau khi nạp thuốc curcumin sấy loại bớt 30% nước....... 34
Bảng 3.3. Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n=3) ............. 37
Hình 3.9. Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc của màng BC..................................... 40
Hình 3.10. Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng ở pH=2 ................................... 41
Hình 3.11. Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng ở pH=6. .................................. 41
Hình 3.12. Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng ở pH=12 ................................. 42

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, Acetobacter xylinum (A. xylinum) cũng như bacterial
cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa
học trong nước cũng như nước ngoài. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng
BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy
mô công nghiệp. BC là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng
A. xylinum. BC được tạo thành từ A. xylinum có cấu trúc hóa học rất giống
cellulose của thực vật nhưng có một số tính chất lý hóa đặc biệt như: độ bền
cơ học và khả năng thấm hút nước cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn
định về kích thước và hướng, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao và độ
polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi
enzyme [1],… Vì vậy BC là một loại nguyên liệu mới, được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như thực phẩm, công nghệ giấy, mỹ phẩm,… đặc biệt trong
lĩnh vực y học.
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC để
nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc với một số loại thuốc có
hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường.
Việc sử dụng màng BC cho việc hấp thụ và giải phóng của hàng loạt các loại
thuốc đã được nghiên cứu, cụ thể là lidocaine, ibuprophen, caffeine,
diclofenac và sulfadiazine bạc cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu
này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có độ bền và trương nở
tương tự như da người, hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di chuyển của tế bào
da của con người.
Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC hấp thụ thuốc là khả năng
chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, khả năng hấp thụ dịch tiết với việc giải
phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan. Do đó, một hệ thống hấp thụ có khả

1

năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có
thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí.
Nghệ (tên khoa học Curcuma longa) có tác dụng cho gan và tiêu hóa,
rối loạn kinh nguyệt và chuột rút, vàng da, và là một tác nhân chống viêm tốt.
Thành phần hoạt chất chính giúp Nghệ phát huy tác dụng chăm sóc sức khỏe
toàn diện là Curcumin. Những năm gần đây, Curcumin nổi lên như một hoạt
chất của thời đại với số lượng trên 1000 nghiên cứu và trên 6000 bài báo viết
về tác dụng. Kết quả các nghiên cứu khẳng định, Curcumin là một trong
những tinh chất thiên nhiên tốt nhất cho sức khỏe. Tại Hoa Kỳ, Curcumin đã
được cấp "Chứng nhận An toàn " (GRAS) theo FDA. Thư viện Pubmed có tới
5612 bài báo nghiên cứu về tác dụng của hoạt chất Curcumin. Từ năm 2008,
đã có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng trên người để nghiên cứu về tác dụng của
Curcumin. Curcumin đã được các nhà khoa học khẳng định hiệu quả trong
việc hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính, nan y như: ung thư, viêm loét dạ dày
(Curcumin có tác dụng diệt 65 chủng lâm sàng vi khuẩn Helicobacter pylori,
ức chế chất gây viêm COX2 [28], tăng tái tạo mạch máu chống thiếu máu cục
bộ [20], tăng tiết chất nhày dạ dày). Tuy nhiên, rào cản lớn khiến tinh chất
nghệ Curcumin chưa được ứng dụng rộng rãi là do Curcumin ít tan trong
nước, sinh khả dụng thấp [18]. Curcumin có nhiều tác dụng trong việc điều trị
ung thư, đau dạ dày, có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và
làm tăng hồng cầu,… Ngoài ra Curcumin còn là một trong những chất chống
viêm, chống oxi hóa điển hình. Nó không chỉ điều trị đắc lực cho các bệnh
ung thư, đau dạ dày, tá tràng,… mà còn điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả
cao các bệnh rối loạn hệ miễn dịch như viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm
lõi cầu khớp, bệnh đa sơ cứng, bệnh cứng bì, loãng xương,… Tuy nhiên,
Curcumin cũng giống như các chất oxi hóa khác, là con dao hai lưỡi có nhiều
tác dụng thì cũng có nhiều hạn chế. Cần thiết kế hệ thống hấp thụ và giải

2


phóng thuốc Curcumin để giúp thuốc giải phóng một cách kéo dài, từ đó có
thể tăng khả dụng sinh học của thuốc.
Với mục đích nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc dựa trên
màng BC giúp Curcumin giải phóng một cách kéo dài, từ đó có thể làm tăng
khả dụng sinh học của thuốc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Curcumin của màng cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và thu sản phẩm BC từ A. xylinum từ đó
nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc dựa trên màng BC nhằm
khắc phục được hạn chế của thuốc, giúp thuốc giải phóng kéo dài, có thể giúp
tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể để thuốc phát huy được hiệu quả tốt nhất
trong việc chữa trị bệnh, từ đó có thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc, tăng
hiệu quả điều trị của thuốc.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc Curcumin của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro (nghiên cứu ngoài cơ thể).
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật, Khoa
Sinh-KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng
dụng trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế, tạo màng BC, nạp Curcumin vào màng.
-Thử nghiệm tác dụng của màng BC nạp Curcumin trong quá trình giải phóng
thuốc. Đánh giá sự hấp thụ và giải phóng thuốc của màng BC.

3

5. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ môi trường nước vo gạo, thuốc
Curcumin dạng tinh khiết 95%.
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
❖ Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC
Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng BC vào việc khắc phục
hạn chế của thuốc Curcumin sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ
dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên
nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn.
Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng BC
để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng BC, hạn
chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh vực khác
nhau. Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tiềm năng của màng BC để áp dụng loại
màng này vào nhiều các lĩnh vực khác nhau trong thực tiễn đời sống. Từ kết
quả nghiên cứu trên, mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng hấp thụ
và giải phóng thuốc của màng BC trên nhiều các loại thuốc khác nhau
nhằm tăng khả dụng sinh học của các loại thuốc đó.
❖ Ý nghĩa thực tiễn
+ Xây dựng được quy trình tạo màng BC từ chủng A. xylinum
+ Từ màng BC đã được tạo ra được dùng nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải
phóng thuốc nhằm khắc phục tối đa những hạn chế của Curcumin, từ đó có
thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực
công nghệ khác nhau. Tác giả Brown (1989), dùng màng BC làm môi trường
phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin
và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad (1998) dùng màng
như là một chất để chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang,
làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [7].
Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời
thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu
trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người [7].
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
BC trong hấp thụ và giải phóng thuốc đã được báo cáo [21], trong đó có 9
nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng
BC và 7 với các vật liệu Nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp
tục được tiến hành nghiên cứu.
Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ
thống hấp thụ và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho thấy có
hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường
[7]. Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu
được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn,
Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị
diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo
dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S. aureus và B. subtilis. Sợi BC với
các hạt Nano bạc đã sản xuất thành công lên đến 99,99% hoạt tính kháng
khuẩn chống lại E. coli và S. aureus [26]. Nghiên cứu khác cho thấy việc sử
5

dụng Nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [24]. Các
S-enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao huyết áp, có được
giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate, và đã thử nghiệm
in vivo cho kết quả tốt [6, 8]. Một miếng dán có thể giải phóng thuốc
enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một bể chứa gel và
polyme in dấu phân tử (MIP) màng. Nghiên cứu về gel miếng dán gồm của
chitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8 giờ, Cmax của S-propranolol đã
đạt được (8,0 ± 1,0ng/ml) từ một hồ chứa 1,5mg propranolol racemic [23].
Tiềm năng hấp thụ và giải phóng thuốc của màng BC qua da đã được nghiên
cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không
được chiếu xạ. BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so
với ảnh hưởng của BC chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC
không chỉ có khả năng hấp thụ mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng
thuốc qua màng [21]. Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của
nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine [14, 15], ibuprophen [15], caffeine [12],
diclofenac [11] và sulfadiazine bạc [10] cho kết quả tích cực. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động
hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da. Tất cả 5 loại thuốc trên đã được
thử nghiệm in vitro cho thẩm thấu qua da [23] và so sánh với cách thức thông
thường. Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ưu mỡ thấm qua màng BC cao
hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400,
lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprofen, do màng
BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán
của thuốc được kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các
cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc
mà không gây tình trạng quá mẫn [15]. Luan J. et al. (2012) [10], đã nghiên
cứu màng BC cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ
biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Nó đã
được chứng minh rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine,
hoạt động kháng khuẩn đối với P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu

quả tốt hơn dạng kem bôi thông thường.

6


1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật-Vi sinh Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum có
khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ
chủng A. xylinum có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo
ra màng trị bỏng cho người [1].
Tại Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh
cùng nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng
cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”.
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [3] đã tiến hành nuôi cấy, tinh
chế và thu màng BC từ A. xylinum đạt hiệu quả cao. Đồng thời nhóm nghiên
cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều
trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất
kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh
mô tốt hơn hẳn.
Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc Curcumin
trong việc làm đẹp, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi
phí. Màng BC có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ
kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo
hệ thống hấp thụ và giải phóng thuốc Curcumin.
1.2. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.2.1. Đặc điểm phân loại của A. xylinum
1.2.1.1. Vị trí phân loại của A. xylinum
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae [14].
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc [14]:
7


• Lớp: Schizomycetes
• Bộ: Pseudomonadales
• Bộ phụ: Pseudomonadieae
• Họ: Pseudomonadaceae
1.2.1.2. Đặc điểm vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6-0,8µm, dài khoảng 2-3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già
hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài
hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [25].
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3-7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2-5mm, tròn, nhày, rìa mép
trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu
cafe sữa rồi khô dần [25].
1.2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát
triển từ 25-30°C. Ở nhiệt độ 37°C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ
thích hợp nhất là 25°C [9].
Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3-8, pH tối ưu để sản xuất
cellulose là 5,5.
Nghiên cứu gần đây của Maccormick và cộng sự cho rằng A. xylinum

có khả năng chịu được hàm lượng EtOH lên đến 10%. A. xylinum sử dụng
cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà lượng đường
có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho hiệu suất cao là:
glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp hơn là
glycerol, galactose, sucrose, maltose [9].
A. xylinum có thể tích tụ acid acetic trong môi trường nuôi cấy. Các tế
bào vi khuẩn kháng lại được sự thay đổi pH của môi trường. Trong lúc nuôi
cấy môi trường có thể giảm đi từ 1-2 đơn vị do sự tạo ra acid acetic, acid
gluconic, do đó khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta
thường bổ sung acid acetic vào môi trường [9].
8


Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển
hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36-48
giờ lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7-10 ngày [9].
1.2.2 . Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A.xylinum
1.2.2.1. Cấu trúc
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer ß-1,4glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose-PC), tuy
nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [13].

Hình1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của BC: chuỗi polime ß-1,4glucopyranose không phân nhánh
Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3-8nm [13].
Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy.
(Watanabe et al.,1998a; Yamanaka et al.,2000).
Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh, A. xylinum tạo ra cellulose nhiều
hơn và tạo thành màng dày trên bề mặt môi trường. Màng BC thu được dẻo

dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng. BC được tạo ra từ phương
pháp nuôi cấy tĩnh gọi là S-BC (S-BC: Static-Bacterial cellulose) trong đó
chuỗi ß-1,4-glucogan xếp song song quanh trục. Các sợi cellulose sơ cấp
được đẩy ra từ các lỗ nằm trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, các sợi sơ cấp này

9


kết tinh lại thành các vi sợi được đẩy ra bên ngoài môi trường nuôi cấy và các
dãy cellulose tạo nên các mặt phẳng song song có vai trò chống đỡ cho tế bào
A. xylinum [13].
1.2.2.2. Đặc tính của màng BC
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01-0,5nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt
là khả năng cản khuẩn. Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học [1].
1.2.2.3. Chức năng sinh lý của BC
A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào, những tế
bào vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề
mặt môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi
khuẩn không nằm trong mạng lưới polymer [1].
Cellulose có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và hút cao,
trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như
việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng
nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [1].
1.2.2.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum

Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [9].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,

10


fructose, manitol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, glactose, lactose, sucrose cho
hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate.
Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong môi
trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [9].
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử
dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường,
nước dừa già, nước mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum.
Trong đó nước gạo được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A.
xylinum.
Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước gạo có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các vitamin như cacbonhydrat,
sắt, vitamin C, vitamin B,... Vì vậy A. xylinum rất thích hợp phát triển trong
môi trường nước gạo, thành phần dinh dưỡng của nước gạo được thể hiện ở
bảng 1.1:
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo

Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2,B5,B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7% - 8%) , Zn (12% -13%)

Axitamin

leucine , valine , lysine

11


1.3. Sơ lược về Curcumin
1.3.1. Tìm hiểu về Curcumin
Tên IUPAC: (1E, 6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5dion.
Công thức phân tử: C21H20O6
Phân tử khối: 368,38g/mol.
Curcumin là tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan trong nước, tan trong
rượu, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh. Hiện tại người ta

tìm thấy Curcumin tồn tại ở 4 dạng hợp chất:

+ Curcumin là hợp chất chính chiếm 60%:

Curcumin
+ Demetoxy-curcumin chiếm 24% có công thức cấu tạo sau:

Demetoxy-curcumin
+ Bis-demetoxy-curcumin chiếm 14%:

Bis-demetoxy-curcumin

12


+ Và một số hợp chất mới phát hiện là xiclocurcumin chiếm khoảng
1%:

Xiclocurcumin
1.3.2.Tính chất vật lý
- Tinh thể nâu đỏ, ánh tím.
- Nhiệt độ nóng chảy: 183°C (361 K).
- Curcumin là một polyphenol và là sắc tố tạo nên màu vàng đặc trưng
của củ nghệ.
- Curcumin là chất màu tan trong dầu, ethanol, methanol,
dichloromethane, acetone, hầu như không tan trong nước ở môi trường acid
và trung tính, tan trong môi trường kiềm.
- Dung dịch Curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thụ cực đại ở
bước sóng khoảng từ 420-430nm.
- Curcumin có thể phản ứng được với acid boric tạo nên hợp chất có

màu đỏ cam nên được ứng dụng dùng để nhận biết muối của nguyên tố Bo.
Chính vì Curcumin là sắc tố tạo nên màu vàng sáng nên Curcumin được dùng
làm chất phụ gia thực phẩm. Trong chất phụ gia thực phẩm Curcumin được kí
hiệu dưới ám số E100 [27].
1.3.3. Tính chất hóa học của Curcumin
a. Sự điện ly
Trong môi trường pH < 1, Curcumin có màu đỏ thể hiện trạng proton
hóa H4A+. Ở pH từ 1-7; hầu hết các diferulolylmethane đều ở dạng trung hòa
H3A; có khả năng hòa tan rất thấp và dung dịch có màu vàng. Ở pH >7,5; màu
13


dung dịch chuyển sang đỏ. Giá trị hằng số phân ly pKa của 3 proton dạng acid
của Curcumin (dạng H2A-, HA-2, A3-) được xác định tương ứng là 7,8; 8,5 và
9,0.
Curcumin không tan ở môi trường nước ở pH acid và trung tính, nhưng
tan tốt trong pH kiềm. Nghiên cứu ở kĩ thuật HPLC cho kết quả điện li theo
pH của Curcumin [12] được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Curcumin

pH
<1
1-7
>7,5

Màu của dung
dịch
Đỏ
Huyền phù màu
vàng

Đỏ

Dạng ion tồn tại
H4A+
H3A
H2A-, HA- 2, A3-

b. Phản ứng với H2
Do có nối đôi ở mạch cacbon nên Curcumin có khả năng phản ứng cộng với
H2 với xúc tác PtO2.
Trong đó tetrahydrocurcumin (THC) cũng là một chất có hoạt tính chống
oxy hóa có khả năng loại bỏ gốc tự do như gốc tert-butoxyl và peroxyl [16].
c. Phản ứng phân hủy trong môi trường kiềm
Curcumin tương đối bền ở pH acid, nhưng lại nhanh chóng bị phân hủy
ở pH kiềm. Đầu tiên ferulic acid và ferulolymethane được tạo thành. Sau đó,
eruolylmethane nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đến
vàng nâu. Tiếp theo, eruolylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và
acetone và lượng các chất này tăng theo thời gian ủ [16].
d. Phân hủy dưới tác dụng ánh sang
Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch. Curcumin bị
phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn.
14


Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid
[29]. Khi bị chiếu xạ, Curcumin bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillin
acid, vanillin và ferulic acid (Sasaki et al, 1998) [16]. Khi có mặt của oxy và
ánh sáng, Curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinyl guaialcol và vanillin.
e. Phản ứng tạo phức với kim loại
Curcumin là hợp chất β - diketone nên cũng có tính chất hóa học của một

β - diketone. Protone của nhóm methyl ở dạng keto và proton của nhóm
hydroxyl ở dạng enol của hợp chất β - diketone có tính acid. Khi các hydro
này bứt ra, diketone sẽ tạo thành anion 1,3 - diketoneate. Diketone anion này
có thể tạo phức vòng càng với các kim loại chuyển tiếp và những nguyên tố
phân nhóm chính. Muối kim loại thường được sử dụng cho phản ứng tạo phức
là muối acetate, clorua, nitrate, sunfate, carbonate của các kim loại chuyển
tiếp như: Cu, Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg [17]. Các phức này cũng
có hoạt tính loại bỏ gốc tự do được ứng dụng trong ngành dược.
f. Phản ứng của nhóm phenolic OH
Một trong những hoạt tính đáng chú ý của Curcumin là khả năng loại bỏ
gốc oxygen hoạt động và các gốc nitrogen tự do. Đó là do Curcumin có 2
nhóm o - methoxy phenolic OH đính vào mạch hetadience - dione. Các
electron chưa liên kết của nhóm OH liên hợp với vòng benzen làm cho H của
nhóm này linh động hơn. Điều đó giải thích cho tính acid và khả năng phản
ứng với các gốc tự do của Curcumin [17].
1.3.4. Dược tính của Curcumin
Curcumin có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa dọn
sạch gốc tự do điển hình gấp 300 lần vitamin E. Curcumin tốt cho tiêu hóa,
não bộ, thần kinh, viêm khớp, hỗ trợ ngăn ngừa ung thư, giảm lipit máu, tiểu
đường,… Hiện nay, trong y học Curcumin được sử dụng nhiều nhất trong

15


điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng, phòng chống ung thư, làm đẹp cho phụ nữ
sau sinh [3, 4, 5].
Curcumin là chất hủy diệt ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế hủy
diệt từng bước các tế bào ác tính. Chúng làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và
ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới. Trong khi đó các tế
bào lành tính không bị ảnh hưởng. Curcumin được coi là chất tiêu biểu nhất

cho thế hệ mới các chất chống ung thư vừa rất hiệu lực vừa an toàn [3, 4, 5].
Curcumin có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ làm
tăng hồng cầu, loại bỏ cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn
chặn béo phì, xóa bỏ tàn nhang, đồi mồi, trứng cá chống rụng tóc giúp mau
chóng mọc tóc, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp,...
Curcumin là một trong những chất chống viêm, chống ôxi hóa điển
hình. Nó không chỉ góp phần vào điều trị ung thư, loét dạ dày, hành tá tràng,
đại tràng, yếu gan mật,... mà còn điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả các
bệnh rối loạn hệ miễn dịch như viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm lõi đầu
khớp, đau hệ tiêu hóa, rối loạn tuyến giáp,... hỗ trợ điều trị bệnh Parkison,
nhũn não [3, 4, 5].
Curcumin có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virus HP, viêm
gan B,... rất cao [3, 4, 5].
- Curcumin ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là
thực phẩm điều trị gần 20 loại ung thư khác nhau. Riêng đối với ung thư máu
các nhà khoa học cho biết Curcumin có tác dụng tăng hồng cầu, chống suy
kiệt sức lực [12],…
1.3.5. Hạn chế của Curcumin
Theo Kawanishi et al. (2005), Curcumin cũng giống như các chất
chống oxy hóa khác, là con dao hai lưỡi. Các nghiên cứu lâm sàng trên người
với 2-12g Curcumin cho thấy các tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, rối

16


loạn chuyển hóa sắt và chặn protein hepcidin, có khả năng gây ra thiếu sắt ở
các bệnh nhân mẫn cảm.
1.3.6. Sinh khả dụng của Curcumin
Một phần rất nhỏ Curcumin được hấp thụ sau khi ăn. Curcumin không
bền vững trong ruột và một lượng rất nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh

chóng bị thoái hóa hoặc liên hợp thành glucuronidation. Nghiên cứu của
Shoba G., Joy D., Joseph T. và các cộng sự tại khoa Dược, đại học Y St. John,
Bangalore, Ấn Độ đã cho thấy, hoạt chất Piperine chiết xuất từ hạt tiêu đen có
tác dụng tăng hấp thụ và giảm đào thải của Curcumin trong máu lên rõ rệt.
Một nghiên cứu của nhóm này được đăng tải trên tạp chí Pubmed của Thư
viện y khoa quốc gia và Viện Sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ tháng 5 năm 1998
đã chứng minh được sinh khả dụng của Curcumin trên cơ thể người khi được
kết hợp với Piperine từ hạt tiêu theo tỷ lệ 1% đã tăng lên tới 2000% so với
không dùng Piperine [18, 19].
1.4. Tình hình nghiên cứu về Curcumin
1.4.1. Trên thế giới
Nghiên cứu năm 2007, tại Đại học Y khoa MaryLand khẳng định
Curcumin giúp trị các rối loạn về da, mụn trứng cá, phát ban, mụn cóc nhờ cơ
chế chống viêm, dọn sạch các tế bào gốc tự do. Tiếp đó, năm 2010 theo tạp
chí những tiến bộ trong y học thực nghiệm và nghiên cứu Đại học Y tế
Bethesda, Mỹ chứng minh Curcurmin tác động lên lớp bề mặt da và sâu hơn
giúp giảm tích tụ sắc tố, tăng đào thải hắc sắc tố melanin sinh ra nám và ngăn
cản tác hại của tia tử ngoại, đồng thời kích thích quá trình trao đổi chất ở các
mạch máu dưới da, nuôi dưỡng và đẩy nhanh quá trình tái tạo tế bào da tăng
lắng đọng collagen giúp da căng mịn, hồng hào, tươi trẻ, trắng sáng hơn và
xóa mờ vết nám một cách tự nhiên.

17