Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ MAI KHUYÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CIMETIDIN CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
ThS. Ngô Thị Hải Yến

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Cimetidin của màng Cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”, tôi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại Viện Nghiên cứu
Khoa học và Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Với lòng kính
trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: ThS.
Ngô Thị Hải Yến - người đã hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Viện Nghiên cứu
Khoa học và Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô và

các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Sinh lý người và động
vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều
kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã
quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Khuyên


LỜI CAM ĐOAN
Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:
Khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Cimetidin của
màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo’’ là công
trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS.
Ngô Thị Hải Yến. Đề tài này chưa từng công bố ở đâu và hoàn toàn không
trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Hà Nội, tháng 04 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Khuyên


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1

A. xylinum

Acetobacter xylinum

2
3

CVK
CM

4
5

CVK - CM
ĐHSP

6

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

7

Nxb

Nhà xuất bản

8

OD

Mật độ quang phổ

9

rpm

Tốc độ quay 100 vòng/phút

10

ThS

Thạc sĩ

Cellulose vi khuẩn
Cimetidin
Màng cellulose vi khuẩn đã hấp thụ thuốc Cimetidin
Đại học Sư phạm


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 2
3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 3
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................ 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Một vài đặc điểm của Cellulose vi khuẩn .............................................. 4
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK ..................................................................4

1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng CVK ...............................4
1.1.3. Màng CVK của vi khuẩn A. xylinum....................................................5
1.2. Tổng quan về thuốc Cimetidin ............................................................... 7
1.2.1. Công thức .............................................................................................7
1.2.2. Tính chất lí hóa ....................................................................................8
1.2.3. Tác dụng của CM .................................................................................8
1.2.4. Đặc điểm dược động học .....................................................................8
1.2.5. Dược lực học của CM ..........................................................................9
1.2.6. Tác dụng phụ của CM ........................................................................10
1.3. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .... 11
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK .................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CM ............................12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................... 14
2.1.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................14
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất .......................................................................14
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................14


2.1.4. Môi trường lên men thu màng CVK ..................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo ..15
2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ...................17
2.2.3. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của CM .................................18
2.2.4. Phương pháp chế tạo màng CVK - CM.............................................19
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline) PBS 1X..........................................................................................................20
2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK - CM
20
2.2.7. Phương pháp phân tích động học giải phóng của CM ......................21
2.2.8. Phương pháp xử lý thống kê ..............................................................22

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường nước vo gạo .......... 23
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường ....................................................... 23
3.3. Tinh chế màng CVK ............................................................................. 24
3.4. Thu màng CVK - CM ........................................................................... 26
3.5. Lượng thuốc CM giải phóng khỏi màng CVK - CM ............................ 27
3.6. Phân tích động dược học giải phóng của CM ....................................... 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 35


DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ........................................ 4
Bảng 1.2. Các ứng dụng của CVK .................................................................... 7
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK ............................................... 15
Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng CVK thô ......................................................... 16
Sơ đồ 2.2: Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK ................................................. 17
Bảng 2.2. Giá trị OD của dung dịch CM ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n
= 3) .................................................................................................................. 18
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS ...................................................................... 20
Bảng 3.1. Khối lượng CM hấp thụ vào màng CVK ở các độ dày khác nhau (n
= 3) .................................................................................................................. 26
Bảng 3.2. Giá trị OD (y) tương ứng với nồng độ CM ở các độ dày màng, môi
trường pH và thời điểm khác nhau khi giải phóng từ màng CVK - CM (n = 3)
......................................................................................................................... 27
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng CVK - CM trong các độ dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3)................................................ 29
Bảng 3.4. Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau ............................................ 31

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của CM......................................... 19
Hình 3.1. Hình ảnh màng CVK nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ...... 23
Hình 3.2. Thu màng CVK thô ở các khoảng thời gian khác nhau .................. 24
Hình 3.3. Quy trình xử lý màng CVK............................................................. 25
Hình 3.4. Mật độ quang phổ của màng CVK - CM trong các độ dày, thời gian
và môi trường pH khác nhau ......................................................................... 28
Hình 3.5. Tỉ lệ giải phóng CM từ màng CVK - CM trong các độ dày, thời
gian và môi trường pH khác nhau ................................................................. 29


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Thuốc Cimetidin (viết tắt là CM) là chất đối kháng trên receptor
histamin H2, đây là một trong những thuốc đầu tiên được khám phá bằng cách
tiếp cận phương pháp nghiên cứu thuốc hợp lí. Tác dụng chủ yếu của thuốc là
ức chế tế bào thành dạ dày tiết acid [9].
Cimetidin sau khi trải qua hàng loạt các nghiên cứu thử nghiệm đã được
báo cáo là một chất ức chế sự phát triển của các khối u tuyến nội tiết, ung thư đại
trực tràng, điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính [16],… đã được thành công
trên thị trường với tên Tagamet, nhưng sinh khả dụng của thuốc thấp khoảng
35% đã làm ngăn cản các ứng dụng điều trị trong khoảng thời gian dài [9].
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những tác
dụng phụ không mong muốn như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà, lú
lẫn, trầm cảm, rối loạn chức năng gan, viêm tụy có thể xảy ra,… Các phản
ứng này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc.
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sinh ra màng cellulose,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Khi nuôi cấy những vi khuẩn này
trong môi trường chứa glucose, glycerol hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ

khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose
sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học cellulose vi khuẩn.
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) có cấu trúc và đặc tính rất giống với
cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên
kết β-1,4 glucorit), khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp
chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có
những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc [3]. Trên thế giới, màng
CVK đã được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng
màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất

1


mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải
phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [14]. Theo kết quả nghiên cứu cho
thấy màng CVK được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản
xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn
nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay
phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn,
trọng lượng thấp, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ,... Đồng thời là
một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất
ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng,
màng CVK còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [10, 13],…
Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận chuyển và
phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp thuốc
không bị phá hủy trong môi trường acid.
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ
khiêm tốn. Nhu cầu về các loại màng để đắp vết thương hở, mặt nạ dưỡng da,
vật liệu dẫn truyền thuốc… trong nước và đều phải nhập ngoại với giá thành

cao. Trong khi đó, màng CVK hoàn toàn có thể sản xuất trong nước bằng
phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường
lỏng.
Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc CM của màng CVK,
tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
Cimetidin của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế chế tạo hệ thống màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo
được nạp thuốc CM và nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc từ hệ thống này.
Chế tạo hệ thống CVK đã nạp thuốc CM có khả năng kéo dài thời gian

2


giải phóng thuốc, điều này có thể giúp cải thiện sự hấp thụ thuốc vào cơ thể,
nâng cao được hiệu quả tốt trong chữa trị viêm loét dạ dày ở người.
3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
 Vật liệu nghiên cứu:
- Màng CVK thu được từ môi trường nước vo gạo.
- Thuốc CM dạng tinh khiết 99,6%.
 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc CM của
màng CVK.
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tạo màng và xử lí màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo.
Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp thuốc CM.
Nghiên cứu khả năng giải phóng CM từ hệ thống CVK đã được nạp
thuốc ở môi trường pH khác nhau, định hướng sử dụng cho đường ruột hay
da.

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK. Mở ra những hướng
nghiên cứu mới về khả năng giải phóng của màng CVK trên nhiều loại thuốc
khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian giải phóng của các
loại thuốc đó.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo được màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum trong môi trường nước vo
gạo. Sử dụng màng CVK làm hệ thống vận chuyển thuốc CM nhằm định
hướng tạo ra hệ thống nạp thuốc có hiệu quả cao, từ đó có thể cải thiện những
hạn chế của thuốc trong điều trị bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng.

3


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một vài đặc điểm của Cellulose vi khuẩn
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK

- Màng CVK được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn như: Acetobacter,
Achromobacter, Agrobecterium, Pseudomonas,…
- Acetobacter xylinum là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Giống vi
khuẩn A. xylinum sử dụng được lấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng CVK

Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Trong đó, nước vo gạo được xem là môi trường thích hợp trong nuôi cấy

A. xylinum. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày như
trong bảng 1.1 [6].
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7% - 8%), Zn (12% - 13%)

Acid amin

leucine, valine, lysine

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước
vo gạo chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng trưởng
như nhóm vitamin B1, B3, B5; nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm và các

acid amin.

4


Nước vo gạo sau khi vo được sử dụng không quá 3 giờ, tránh để cho
nước bị chua làm cho đường, vitamin và các chất dinh dưỡng khác giảm đi
dẫn đến cho hiệu suất kém.
1.1.3. Màng CVK của vi khuẩn A. xylinum
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A.
xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp
bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng CVK [31].
1.1.3.1. Cấu trúc của màng CVK
Cellulose vi khuẩn được cấu tạo bởi những chuỗi polime β-1,4
glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác
nhau về cấu trúc đại thể [14]. Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi
siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau
thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 8nm.
1.1.3.2. Tính chất độc đáo của CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, không độc và không gây dị
ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn.
Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,

trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể.

5


Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể,
lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 - 700
lần trọng nước của nó [14].
Màng CVK được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì
vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bước trung gian.
Màng CVK được định hướng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng hình
thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và White (1989)
[32] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng
một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống không khí bên
trong môi trường lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung
quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn.
Màng CVK được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có
thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi
trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá
trình tổng hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen
liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose.
1.1.3.3. Ứng dụng của CVK
Với những ưu điểm nổi bật, CVK ngày càng được nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi [2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 14, 18, 20, 25] được thể hiện
cụ thể trong bảng 1.2:

6

Bảng 1.2. Các ứng dụng của CVK
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm
Tráng miệng (thạch dừa), ăn kiêng (kem, salad)

Thực phẩm

Thịt nhân tạo, vỏ bao xúc xích
Nước uống siro không có cholesterol
Lớp màng trị bỏng, da nhân tạo

Y dược

Hệ thống phân phối thuốc
Phẫu thuật ghép mô, cơ quan

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo

Môi trường

Hấp thu chất độc

Dầu mỏ

Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn, thu hồi dầu

Trang phục
Thể thao

Sản xuất sợi nhân tạo, quần áo, giày dép tự phân hủy
Y phục quân đội
Lều lắp ráp
Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2. Tổng quan về thuốc Cimetidin
1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C10H16N6S
Phân tử lượng: 252,3
Độ nóng chảy: 142°C
Công thức cấu tạo:

7


Tên khoa học: N" - cyano - N methyl - N' - [2 - [[(5 - methyl - 1H imidazol - 4 - yl) methyl] thio] - ethyl] - guanidin [9].
1.2.2. Tính chất lí hóa

CM là loại thuốc đối kháng thụ thể histamin H2 [9].
Thuốc ở dạng bột hoặc gần như trắng, có dạng thù hình, tan trong
ethanol 96%, khó tan trong nước, tan trong các axit vô cơ loãng [1].
1.2.3. Tác dụng của CM
CM ức chế cạnh tranh với hisitamin tại thụ thể H2 của tế bào thành dạ
dày, làm giảm bài tiết và giảm nồng độ acid dạ dày cả ở điều kiện cơ bản (khi
đói) và được kích thích bởi thức ăn, insulin, cafein hoặc pentagastrin. Tác
dụng chủ yếu của thuốc CM là ức chế tế bào thành dạ dày tiết acid với chỉ
định rộng rãi trong điều trị chứng ợ nóng và loét dạ dày. CM được hấp thu
nhanh chóng sau khi uống và được hấp thụ không hoàn toàn ở đường tiêu
hóa, khả dụng sinh học của CM dùng theo đường uống vào khoảng 35%. Tuy
nhiên, trong quá trình sử dụng CM, các nhà lâm sàng đã phát hiện rất nhiều
tác dụng của nó trong một số bệnh nhờ cơ chế ức chế thụ thể histamin H2 của
tế bào T ức chế. Vì thế, ngoài tác dụng kháng tiết acid trong bệnh viêm loét
dạ dày được FDA Hoa Kỳ công nhận, CM còn được sử dụng trong điều trị
một số bệnh da liễu [9].
1.2.4. Đặc điểm dược động học
* Hấp thu và sinh khả dụng
CM được hấp thu nhanh chóng, không hoàn toàn ở đường tiêu hóa sau
khi uống thuốc. Theo Pedersen P.U, Miller R (1980) [21], sinh khả dụng của
thuốc ở trong khoảng từ 35 - 40% ở bệnh nhân loét dạ dày.
Nồng độ của CM trong huyết tương đảm bảo làm giảm đến 50% lượng

8


acid tối đa là 0,5 - 1,0mcg/ml [15], [16].
* Phân phối
Thể tích phân phối của CM ở mức xấp xỉ 0,8 - 1,391/kg. Tuổi bệnh nhân
càng tăng thì thể tích phân phối càng giảm. CM phân bố rộng khắp phần lớn

trong dịch cơ thể, các cơ quan và mô người, không có trong mô mỡ [9].
Tỷ lệ phân phối trung bình của CM giữa dịch não tủy và huyết thanh
thay đổi từ 0,03 - 0,18mcg/ml. Tỷ lệ này là 0,2 - 0,5 ở người bệnh gan hay
thận. Tỷ lệ gắn protein huyết tương của CM là 18 - 26% ở mức nồng độ giữa
0,05 - 50mcg/ml. Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỷ lệ này đạt
khoảng 13 - 25% (trung bình 19%) [9].
* Chuyển hóa và thải trừ
CM và chất chuyển hóa của nó được đào thải qua thận. Khoảng 50 - 80%
tổng lượng CM dùng đường tiêm tĩnh mạch tồn tại dưới dạng không đổi trong
nước tiểu. Tỷ lệ này là 40% nếu dùng thuốc đường uống. Sự chuyển hóa CM chỉ
chiếm khoảng 25 - 40% tổng lượng thải trừ của CM và quá trình này phụ thuộc
vào độ tuổi [9]. Nửa đời thải trừ của CM khoảng 2 giờ, tăng lên khi suy thận.
Sulphoxide Cimetidin được chứng minh là chất chuyển hóa chính của CM [25].
Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dược động học của CM. Tuổi
càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh thải này giảm một
nửa từ độ tuổi 30 - 65 [9]. Một lượng nhỏ liều thuốc tiêm tĩnh mạch được đào
thải qua mật (Stephen J et al., 1979) [29]. CM có thể qua hàng rào nhau thai,
được bài tiết qua sữa mẹ và ở những người mẹ cho con bú, thuốc vào được cơ
thể trẻ nhiều mg/ngày [28].
1.2.5. Dược lực học của CM
Các thử nghiệm cho thấy CM là một chất đối kháng cạnh tranh chọn lọc
với thụ thể histamin H2 mà không có tương tác có ý nghĩa nào với catecholamin,
thụ thể β, thụ thể histamin H1, thụ thể muscarinic và không có tác dụng kháng

9


cholinergic. CM làm giảm bài tiết và giảm nồng độ acid dạ dày cả ở điều kiện
cơ bản (khi đói) và khi được kích thích bởi thức ăn, histamin, pentagastrin,
insulin và cafein [27]. Vì quá trình tiết acid cơ bản dài nhất xảy ra vào ban

đêm nên việc dùng thuốc sau ăn tối hoặc trước khi ngủ sẽ đạt hiệu quả tối ưu.
CM cũng ức chế enzym cytochrome P - 450, cytochrome P - 448 trong gan
đồng thời với các hệ thống chức năng oxidase, đối kháng dihydrotestosterone
(hoạt động kháng androgen) [25].
Ngoài ra, CM tăng cường sự bảo vệ niêm mạc dạ dày và có khả năng chữa
khỏi các rối loạn liên quan đến acid, đặc biệt là loét và chảy máu dạ dày do
stress, bằng cách tăng sản xuất chất nhầy dạ dày, tăng tiết chất nhầy do
bicacbonat, tăng lưu lượng máu ở niêm mạc dạ dày, tăng tổng hợp prostaglandin
nội sinh và tăng tốc độ tái tạo tế bào biểu mô [12], [29].
1.2.6. Tác dụng phụ của CM
- Đường tiêu hóa: Tiêu chảy (nhẹ), tần suất 1/100 bệnh nhân [9].
- Hệ thần kinh trung ương: Đau đầu (nhẹ đến nặng), chóng mặt và buồn
ngủ (nhẹ). Các rối loạn tâm thần như kích động, trầm cảm, lo âu, ảo giác, mất
phương hướng, mất đi sau 3 - 4 ngày ngừng thuốc [9].
- Nội tiết: Chứng vú to đã được báo cáo. Theo S. M. Sabesin [23], nếu
uống CM kéo dài với liều lớn hơn 5g/ngày mới có thể gây bất lực và chứng
vú to ở nam giới.
- Quá mẫn: Sốc phản vệ và viêm mạch máu quá mẫn.
- Thận: Tăng creatinin huyết thanh (tăng nhẹ). Có thể gặp viêm thận kẽ
và bí tiểu phải ngừng điều trị.
- Tim mạch: Nhịp tim chậm, nhanh và block nhĩ thất đã được báo cáo
với thuốc đối kháng thụ thể H2. S. Saltissi (1981) [24] cho thấy không có sự
thay đổi đáng kể nào lên hệ tim mạch của 24 bệnh nhân dùng 400mg CM/ngày
trong 4 tuần.

10


- Cơ xương khớp: Đau khớp và đau cơ tự hồi phục.
- Da và phần phụ: Phát ban nhẹ, hội chứng Stevens - Johnson, hoại tử

thượng bì nhiễm độc, hồng ban đa dạng, đỏ da bong vảy toàn thân, rụng tóc.
1.3. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK
* Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989),
dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm
ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm
[14].
Czaja và cộng sự (2006) sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở,
vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng
kí bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả
Jonas và Farad (1998), Czaja và cộng sự (2006) đã dùng màng CVK làm da
nhân tạo, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [4].
Gần đây hơn, Lin Huang và cộng sự [19] nghiên cứu việc sử dụng màng
CVK cho việc kiểm soát in vitro của Berberin. Ngoài thẩm thấu qua da, thí
nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc qua màng CVK còn được thử nghiệm
mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu được cho thấy thuốc đã được
giải phóng với một tốc độ chậm.
* Tại Việt Nam
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK mới được quan
tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu.
Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành

11


phố Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng CVK từ A. xylinum

phối hợp với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực
nghiệm cho kết quả tốt [4]. Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [4] đã tiến
hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng
thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng
dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt chất
tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng CVK có cho
thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu
điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [7] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nước tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.
Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc
tính và cấu trúc màng. Về thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo
màng sinh học dùng trong trị bỏng, và được ứng dụng trong sản xuất thạch
dừa. Hiện nay việc nghiên cứu CVK làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là
một hướng đi mới.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CM
*Trên thế giới
Jayswal B. D., Yadav V. T., Pater K. N., Patel B. A (2012) [17] đã sử
dụng Sodium alginate - một polymer tự nhiên, được sử dụng làm hệ thống
phân phối thuốc CM qua đường uống. Nghiên cứu đã xây dựng và đánh giá
các Sodium alginate và pectin dựa trên In situ gel của CM. Kết quả nghiên
cứu cho thấy các thí nghiệm có chứa 1,2% natri alginate và 1,5% pectin có

12

khả năng hấp thụ thuốc tốt hơn và thời gian giải phóng thuốc dài hơn.
Nghiên cứu của Srivastava A. K. et al. (2005) [28] liên quan đến việc
đánh giá các vi cầu khuẩn nổi với CM như mô hình kéo dài thời gian cư trú
thuốc tại dạ dày. Các vi cầu được chuẩn bị bằng phương pháp bay hơi dung
môi sử dụng polymer hydroxyporyl methyl celllulose và ethyl cellulose. Hình
dạng và bề mặt hình thái của vi cầu được quan sát bằng kính hiển vi quang
học và kính hiển vi điện tử quét.
Kết quả cho thấy nồng độ polymer, kích thước vi cầu khuẩn, thành phần
dung môi ảnh hưởng tới thời gian giải phóng thuốc. Kích thước hạt vi cầu
khuẩn tăng lên, nồng độ polymer cao hơn thì thời gian cư trú CM tại dạ dày
tăng lên [28].
Fukuda M và cộng sự đã chứng minh hiệu quả của CM là một chất đối
kháng thụ thể histamin H2 điều trị tổn thương dạ dày cấp tính, ung thư đại trực
tràng [16].
Arisawa T và cộng sự có công trình nghiên cứu sự kết hợp CM và
Rabeprazole đơn trị liệu điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính thông qua
đường miệng tái tạo mô liên kết [13].
Nghiên cứu của Franco I. (2000) dùng CM với liều 30 - 40mg/ngày,
dùng trong 3 tháng liền để chữa mụn cóc trên bốn trẻ em. Kết quả là bốn trẻ
đều khỏi mụn cóc [15].
* Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, phần lớn CM được sử dụng là một loại thuốc để chữa trị bệnh
viêm loét và trào ngược dạ dày, ngăn ngừa tái phát sau khi bị viêm loét dạ dày.
Ngoài ra, CM còn được ứng dụng trong chữa các bệnh về da liễu, Hà
Nguyễn Phương Anh của trường Đại học Y dược đã thành công với luận án:
Nhiễm Human papillomavirus trên bệnh nhân bị nhiễm trùng lây truyền qua
đường tình dục và tác dụng của CM trong phòng tái phát bệnh sùi mào gà [1].

13

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh khoa sinh - KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất
Nguyên liệu: Nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng
Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thường
có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam.
- Thuốc CM dạng tinh khiết 99,6%, nguồn gốc Trung Quốc;
- Các hóa chất thông thường: đường glucose, pepton, acid acetic,
(NH4)2SO4, NaOH, HCl, nước cất;
- Hóa chất dùng pha môi trường pH: HClđđ, NaCl, KCl, Na2HPO4,
KH2PO4, thuốc thử fehling.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
2.1.3.1. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ);
- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S;
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh);
- Bể ổn nhiệt (Đức);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.

14

2.1.3.2. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh,
đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp
gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định mức loại 100ml, 500ml,
1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, thước kẹp panme,... và nhiều dụng
cụ hóa sinh khác.
2.1.4. Môi trường lên men thu màng CVK
Tạo màng CVK có cải tiến từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [30]
bằng cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo để tạo màng CVK do chi phí
rẻ và trong nước vo gạo có rất nhiều vi chất dinh dưỡng, vitamin thuộc nhóm
B như vitamin B1, B5,… vitamin E và một số thành phần có lợi khác. Vì vậy
A.xylinum rất thích hợp phát triển trong môi trường này.
Cùng với nước vo gạo, chúng tôi bổ sung thêm chất dinh dưỡng
(glucose, kalihydrophotphat, điamoni sunfat, pepton) với lượng thích hợp tạo
môi trường tối ưu để lên men tạo màng CVK [4] được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Nước vo gạo

Glucose

20g

1000ml

KH2PO4

2g

Acid acetic

(NH4)2SO4

3g

10% dịch giống A. xylinum

Pepton

4g

5ml

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo
Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: Môi
trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các bình lên men có
bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các bình được đậy bằng vải xô
có độ xốp giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên

15


ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho
quá trình lên men 28 - 30°C. Sợi cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi
trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng
cellulose bên trên. Sau 7 - 10 ngày có thể thu CVK [4].
Cụ thể quy trình tạo màng CVK lên men từ nước vo gạo được thực hiện
theo quy trình ở sơ đồ 2.1 [4].

Nước vo gạo (đã lọc bã, rác)

Bổ sung dinh dưỡng (bảng 2.1)

Hấp khử trùng (113°C, 15 phút)

Để nguội

Bổ sung 10% dịch giống
và 2% acid acetic

Nuôi cấy tĩnh
(26°C, 6 - 14 ngày)

Thu CVK thô
Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng CVK thô

16


2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và
các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid acetic. Vì vậy, trước khi
hấp thu thuốc cần phải xử lý màng, quy trình xử lý màng CVK được thể hiện
qua sơ đồ 2.2 [4].

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép

Ngâm trong HCL 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
CVK tinh chế
Sơ đồ 2.2: Quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
- Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
- Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng
trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc
tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép
màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
- Ngâm nước: màng sau khi ngâm với HCl rửa nước rồi ép màng. Ngâm
nước đến trung hòa hết acid, thời gian khoảng 48 giờ ta thu được CVK tinh
khiết.

17