Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài lá kim: Pinus dalatensis, Pinus kesiya và Podocarpus neriifolius ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN HOÀNG SA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,
PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

NGUYỄN HOÀNG SA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,
PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
Mã số: 62 44 01 14

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trịnh Thị Thủy
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Thanh Tâm

Hà Nội – 2017


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học
của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm. Các kết quả
thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Toàn bộ trích dẫn trong luận án đều
chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án

Nguyễn Hoàng Sa


LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý
báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy
và TS. Nguyễn Thanh Tâm là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên,
Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm
luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công
nghệ, lãnh đạo Viện Hóa học, bộ phận đào tạo Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện
và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khánh Hòa, trưởng Khoa
cùng cán bộ của Khoa Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong thời gian làm luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TSKH. Trần Văn Sung đã có những định
hướng xây dựng nền móng ban đầu cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa
học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi
hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !
Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2017
Tác giả luận án

Nguyễn Hoàng Sa


MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... iv
DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG....................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................. viii
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ ix
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................................. 3

1.1.

Tổng quan về các loài nghiên cứu .......................................................................... 3

1.1.1.

Thông đà lạt (Pinus dalatensis)........................................................................ 3

1.1.2.

Thông ba lá (Pinus kesiya) ............................................................................... 3

1.1.3.

Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius) .................................................. 4

1.2.

Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus ............................... 5

1.2.1.

Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus ............................................. 5

1.2.2.

Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus ................................................................ 6

1.2.3.

Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus ............................................................. 14

1.2.4.

Các hợp chất lignan từ chi Pinus ................................................................... 17

1.2.5.

Các hợp chất khác từ chi Pinus ...................................................................... 19

1.3.

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Thông ba lá ................................. 20

1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi
Pinus.. .............................................................................................................................. 20
1.4.1.

Hoạt tính kháng viêm và giảm đau ................................................................ 21

1.4.2.

Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư ............................................... 22

1.4.3.

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm ............................................................ 24

1.4.4.

Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................................. 26

1.4.5.

Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác ............................................. 27

1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi
Podocarpus. .................................................................................................................... 28
1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus
neriifolius).... ................................................................................................................... 39
Chương 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................................ 42

i


2.1.

Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học ........................................................... 42

2.2.

Phương pháp xử lý và chiết mẫu........................................................................... 42

2.3.

Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật ........ 42

2.4.

Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................................. 43

2.5.

Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học.......................................................... 43

2.6.

Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 46

2.7.

Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu .................. 47

2.8.

Phân lập chất từ các chiết xuất .............................................................................. 48

2.8.1.

Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt ................. 48

2.8.2.

Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt ...................... 49

2.8.3.

Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt ....................... 49

2.8.4.

Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt .................. 50

2.8.5.

Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá ................... 51

2.8.6.

Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài ............ 52

2.9.

Dữ kiện phổ của các chất tách được ..................................................................... 60

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 70
3.1.

Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis) ................................. 70

3.1.1.

Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol ................................................................... 70

3.1.2.

Hỗn hợp TT2 ................................................................................................. 71

3.1.3.

Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid ........................................................ 73

3.1.4.

Chất TT4: Lambertianic acid ........................................................................ 75

3.1.5.

Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid ................. 77

3.1.6.

Chất TT6: Isopimaric acid ............................................................................. 78

3.1.7.

Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one ................................................ 79

3.1.8.

Chất TF1: Pinocembrin.................................................................................. 81

3.1.9.

Chất TF2: Chrysin ......................................................................................... 82

3.1.10. Chất TF3: Pinostrobin.................................................................................... 83
3.1.11. Chất TF4: (+) Catechin .................................................................................. 84
3.1.12. Chất TF5: Kaempferol ................................................................................... 85

ii


3.1.13. Chất TF7: Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside........ ....................................................................................................................... 86
3.1.14. Chất TP1: Dihydropinosylvin ........................................................................ 89
3.1.15. Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether ............................................... 89
3.1.16. Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene ..................................................... 90
3.1.17. Hỗn hợp TP5 .................................................................................................. 90
3.1.18. Chất TP6: Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside) ....................................... 92
3.1.19. Chất TL1: (+) Lariciresinol ........................................................................... 94
3.1.20. Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside ............................................ 95
3.1.21. Chất TS1: β-Sitosterol.................................................................................... 97
3.1.22. Chất TS2: Daucosterol ................................................................................... 98
3.2.

Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya) ......................................... 99

3.2.1.

Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid ...................................... 99

3.2.2.

Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside ........................ 101

3.2.3.

Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside. ................................................. 102

3.2.4. Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -βD-glucopyranoside ..................................................................................................... 103

3.2.5.
3.3.

Chất TL2: Cedrusin ..................................................................................... 105

Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius)................ 105

3.3.1.

Chất TT7: Totarol ........................................................................................ 105

3.3.2.

Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid ......................................................... 106

3.3.3.

Chất TT9: Inumakiol D ............................................................................... 107

3.3.4.

Chất TT10: Macrophyllic acid..................................................................... 108

3.4.

Hoạt tính sinh học của một số chất sạch ............................................................. 111

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 116
DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...................................................... 119
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 120

iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CC
GFC
TLC
1

H-NMR

13

C-NMR

COSY

Các phương pháp sắc ký
Column Chromatography
Gel filtration chromatography
Thin Layer Chromatography
Các phương pháp phổ
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
Correlation Spectroscopy

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
ESI-MS
Electron Spray Ionization Mass Spectrometry
HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation

IR
NOESY

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
carbon 13
Phổ tương tác hai chiều 1H1
H
Phổ DEPT

Phổ khối ion hóa phun mù
điện tử
Phổ khối phân giải cao ion
hóa phun mù điện tử
Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết
t: triplet
q: quartet
brd: broad doublet

ddd: doublet of doublet of doublets
dt: doublet of triplets

s: singlet
d: doublet
m: multiplet
brs: broad singlet
dd: doublet of doublets
td: triplet of doublets
HSQC

Sắc ký cột thường
Sắc ký lọc Gel
Sắc ký bản mỏng

Heteronuclear Single Quantum
Coherence
Infrared Spectroscopy
Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
Các dòng tế bào

9-KB

Human epidermoid carcinoma

26-L5
A-431
A-549

Murine colon carcinoma

Human epidermoid carcinoma
Human bronchogenic carcinoma

iv

Phổ tương tác dị hạt nhân
qua một liên kết
Phổ hồng ngoại
Phổ NOESY
Ung thư biểu mô họng ở
người
Ung thư ruột kết ở chuột
Ung thư biểu mô ở người
Ung thư phổi ở người


Bel-7402

Human hepatoma

DU-145

Human prostate adenocarcinoma

HeLa
Hep-G2

HeLa cell line
Human hepatocellular carcinoma

HL-60

Human promyelocytic leukemia

HT-1080

Human fibrosarcoma

KB

Human epidermoid carcinoma

L-929

Mouse fibroblast

LNCaP

Human prostate adenocarcinoma

LU
MCF-7

Human bronchogenic carcinoma
Human breast adenocarcinoma

NCI-H292

Human lung mucoepidermoid

OCI-AML

Acute Myeloid Leukemia cells

P-388

Lymphocytic leukemia

PC-3

Human prostate adenocarcinoma

SK-LU-1

Human Caucasian Lung adenocarcinoma

SK-N-SH

Human neuroblastoma cell line

SMMC7721
T-47D
U-397
COX-2
CTPT
EBV
ED50

Human hepatocarcinoma
Human ductal breast epithelial tumor

Human leukemic monocyte lymphoma
Các viết tắt khác
Cyclooxygenase-2
Epstein-Barr Virus
Effective Dose

v

Ung thư gan ở người
Ung thư tuyến tiền liệt ở
người
Tế bào ung thư Hela
Ung thư gan ở người
Ung thư máu cấp tính ở
người
bào ung thư biểu mô liên kết
di căn ở người
Ung thư biểu mô ở người
Ung thư biểu mô liên kết sợi
ở chuột
Ung thư tuyến tiền liệt ở
người
Ung thư phổi ở người
Ung thư vú ở người
Ung thư biểu mô phổi ở
người
Tế bào ung thư bạch cầu
myeloid cấp tính
Ung thư máu lympho
(Ung thư bạch cầu)

Ung thư tuyến tiền liệt ở
người
Ung thư phổi ở người
U nguyên bào thần kinh ở
người
Ung thư biểu mô tế bào gan
ở người
Ung thư vú ở người
Ung thư máu ở người
Enzym cyclooxygenase-2
Công thức phân tử
Virus Epstein-Barr
Liều tác dụng tối đa trên 50%
đối tượng thử


FIV

Feline immunodeficiency virus

HSV

Herpes simplex virus

HIV

Human immunodeficiency virus

IC50

Inhibitory Concentration 50%

LD50
MIC

Lethal Dose 50
Minimum Inhibitory Concentration

MMTV

Mouse mammary tumour virus

OD

Optical Density

ROS

Reactive oxygen species

mp

Melting point

Virus gây suy giảm miễn
dịch ở động vật họ mèo
Virus Herpes simplex
Virus gây suy giảm miễn
dịch ở người
Nồng độ ức chế 50% đối

tượng thử
Liều gây chết 50% thú thử
Nồng độ ức chế tối thiểu
Chủng virus gây ung thư vú
ở chuột
Mật độ quang
Những phần tử hoạt động
chứa Oxygen
Điểm nóng chảy

n-BuOH
CDCl3
DCM
DMSO
EtOAc
EtOH
MeOH
CD3OD
TMS

n-Butanol
Chloroform deuteri (d)
Dichloromethane
Dimethylsulfoxide
Ethyl acetate
Ethanol
Methanol
Methanol deuteri (d4)
Tetramethylsilane

Ac
Bz
OMe
Ph
Et
Me
Glc

Acetoxyl
Benzoyl
Methoxy
Phenyl
Ethyl
Methyl
Glucose

Xyl

C

Carbon bậc 4

Rf

Xylose
Retardation factor
(retention factor)

dm

Dung môi

vi


DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG
Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus ......... 8
Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus ....................... 9
Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus... 14
Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus ................ 16
Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus ..................... 18
Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus .................. 19
Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus ............................ 33
Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus
neriifolius) .......................................................................................................................... 40
Bảng 3.1. Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol ................................................... 70
Bảng 3.2. Số liệu gán phổ 1HNMR và 13CNMR của TT2a và TT2b .................................. 72
Bảng 3.3. Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid ......................................... 74
Bảng 3.4. Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid ......................................................... 76
Bảng 3.5. Số liệu phổ của chất TT5 và 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid
............................................................................................................................................ 78
Bảng 3.6. Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430............................................................ 81
Bảng 3.7. Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside
............................................................................................................................................ 87
Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-Dglucopyranoside.................................................................................................................. 93
Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432 ............................................. 97
Bảng 3.10. Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O ................................... 100
Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-Lrhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside ......................................................................... 104
Bảng 3.12. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của TT7, TT8 và TT9 ..................................... 108
Bảng 3.13. Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8) ..................... 111

Bảng 3.14. Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2 của một
số chất sạch ...................................................................................................................... 112

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3).. .... 3
Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá ............................... 4
Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài ............................... 4
Hình 2.1. Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất......................... 47
Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 54
Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 55
Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 56
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 57
Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông
ba lá ......................................................................................................................... 58
Hình 2.7. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông
tre lá dài ................................................................................................................... 59
Hình 3.1. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b ................................ 73
Hình 3.2. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4 ................................................. 76
Hình 3.3. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6 ............................... 79
Hình 3.4. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6 ................................................. 94
Hình 3.5. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1 ............................... 95
Hình 3.6. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11 ............................................. 100
Hình 3.7. TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10. ............ 109

Hình 3.8. Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6,
TT10, TF1, TP2 và TL1 ........................................................................................ 113
Hình 3.9. Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24
giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1. ............................... 114
Hình 3.10. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi
được xử lí. (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác
nhau ....................................................................................................................... 115

viii


Phụ lục 1
Phụ lục 2
Phụ lục 3
Phụ lục 4
Phụ lục 5
Phụ lục 6
Phụ lục 7
Phụ lục 8
Phụ lục 9
Phụ lục 10
Phụ lục 11
Phụ lục 12
Phụ lục 13
Phụ lục 14
Phụ lục 15
Phụ lục 16
Phụ lục 17
Phụ lục 18
Phụ lục 19

Phụ lục 20
Phụ lục 21
Phụ lục 22
Phụ lục 23
Phụ lục 24
Phụ lục 25
Phụ lục 26
Phụ lục 27
Phụ lục 28
Phụ lục 29
Phụ lục 30
Phụ lục 31
Phụ lục 32
Phụ lục 33

PHỤ LỤC
Các phổ của hợp chất TT1
Các phổ của hỗn hợp TT2
Các phổ của hợp chất TT3
Các phổ của hợp chất TT4
Các phổ của hợp chất TT5
Các phổ của hợp chất TT6
Các phổ của hợp chất TT12
Các phổ của hợp chất TF1
Các phổ của hợp chất TF2
Các phổ của hợp chất TF3
Các phổ của hợp chất TF4
Các phổ của hợp chất TF5
Các phổ của hợp chất TF7
Các phổ của hợp chất TP1

Các phổ của hợp chất TP2
Các phổ của hợp chất TP3
Các phổ của hỗn hợp TP5
Các phổ của hợp chất TP6
Các phổ của hợp chất TL1
Các phổ của hợp chất TL3
Các phổ của hợp chất TS1
Các phổ của hợp chất TS2
Các phổ của hợp chất TT11
Các phổ của hợp chất TF6
Các phổ của hợp chất TP4
Các phổ của hợp chất TP7
Các phổ của hợp chất TL2
Các phổ của hợp chất TT7
Các phổ của hợp chất TT8
Các phổ của hợp chất TT9
Các phổ của hợp chất TT10
Các biểu đồ biểu thị kết quả thử hoạt tính chống tăng
sinh trên dòng tế bào OCI-AML của TF3
Kết quả phân tích protein bằng Western plot của hỗn
hợp TT2 với các tế bào OCI-AML

ix

PL1
PL5
PL13
PL17
PL24
PL28

PL38
PL41
PL45
PL48
PL51
PL53
PL56
PL60
PL64
PL67
PL69
PL74
PL80
PL89
PL94
PL97
PL101
PL108
PL113
PL117
PL122
PL126
PL130
PL135
PL147
PL155
PL155


MỞ ĐẦU

Ngày nay, đi đôi với sự phát triển nhanh chóng về mọi mặt của xã hội loài người là
nhiều vấn đề nghiêm trọng mà cả thế giới đang phải đối mặt. Trong tám mục tiêu thiên niên
kỷ mà nhân loại cố gắng đạt được trong thế kỷ 21 (gọi tắt là MDGs từ tiếng Anh:
Millennium Development Goals), thì vấn đề có liên quan tới sức khỏe của con người là một
trong số mục tiêu được đặt lên hàng đầu. Rõ ràng, biến đổi khí hậu đang diễn ra trên phạm
vi toàn cầu cùng với sự ô nhiễm ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng và vấn đề thực
phẩm bẩn đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng tiêu cực đến sức khỏe của con người
nói riêng và sự sống của toàn thể sinh vật trên trái đất nói chung. Cụ thể là, gần đây nhân
loại luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại
dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các loại ung
thư, các loại bệnh viêm nhiễm, các loại cúm virus, bệnh do virus Ebola, các biến chứng do
nhiễm virus Zika, tim mạch, đái tháo đường, vv... Việc tìm ra phương pháp hiệu quả để
điều trị các bệnh này là vấn đề vô cùng khó khăn, nó đặt ra nhiều thách thức lớn cho các
nhà khoa học. Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra
các chất có hoạt tính tiềm năng có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật
nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Và như thế, người ta có thể sử dụng các
hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng
làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới.
Việt Nam là nước có khí hậu và địa hình rất đa dạng, gồm có bốn miền khí hậu chủ
yếu: khí hậu phía Bắc, phía Nam, Trung và nam Trung bộ, khí hậu Biển Đông. Việt nam
với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi. Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên
và khí hậu như trên đã tạo ra thảm thực vật có đa dạng sinh học cao. Theo những nghiên
cứu mới đây ở Việt Nam có hơn 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600
loài nấm, hơn 2000 loài tảo, 537 loài vi tảo, 667 loài rong biển và 15 loài cỏ biển, trong đó
nhiều loài được dùng làm thuốc [1].
Trong thảm thực vật phong phú và đa dạng ấy, các loài cây lá kim là những cây rừng
quan trọng cả về sinh thái, kinh tế, thương mại và văn hóa. Ngoài nguồn cung cấp gỗ, tinh
dầu thông còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, công
1

nghiệp chất béo, vv...), một số loài Thông còn được dùng là vị thuốc dân tộc. Thông còn là
môi trường của nhiều loài nấm nội kí sinh, Taxol® (paclitaxel) là thuốc chống ung thư được
cho là tốt nhất hiện nay được phát hiện từ loài thông đỏ ở châu Âu.
Cũng như các chi khác trong bộ Thông (Pinales), nhiều loài trong chi Pinus L.
(Pinaceae) và chi Podocarpus L'Hér. ex Pers. (Podocarpaceae) từ lâu đã gắn bó với đời
sống hằng ngày của người dân và cũng được sử dụng trong y học cổ truyền để trị nhiều loại
bệnh khác nhau. Trong khi đó, tính tới thời điểm này (2017) tuy đã có nhiều công trình
nghiên cứu nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của trên một trăm loài
Pinus và khoảng tám mươi loài Podocarpus nhưng vẫn còn có nhiều loài trong hai chi này
hầu như chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu. Trong đó, loài
Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) là một loài gần như đặc hữu của Việt Nam và chưa
được nghiên cứu về mặt hóa học; Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) và loài
Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên
cứu nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài này là rất
cần thiết, nhằm góp phần tạo cơ sở để hướng đến nghiên cứu khai thác và sử dụng sau này.
Chính vì lý do trên, mục tiêu của các nghiên cứu trong luận án này là:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài lá kim: Thông đà lạt (P. dalatensis),
Thông ba lá (P. kesiya) và Thông tre lá dài (P. neriifolius)
2. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch tách ra từ các loài trên để
tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng vào cuộc sống.

2


Chương 1.
1.1.

TỔNG QUAN

Tổng quan về các loài nghiên cứu

1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré)
Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré), tên đồng nghĩa: Pinus wallichiana A.B. Jacks.
[2] thuộc họ Thông (Pinaceae). Đây là một loài thông năm lá gần đặc hữu của Việt Nam,
cây phân bố chủ yếu ở Đà Lạt và một số vùng lân cận, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở
Quảng Nam, Quảng Bình và biên giới Việt-Lào. Cây mọc trong rừng rậm, trên núi trung
bình, ở độ cao 1500-2000 m. Cây gỗ to, cao đến hơn 30 m và đường kính thân 0.6-0.8 m
[2]. Gỗ không bị mối mọt, được sử dụng trong xây dựng, làm đồ gỗ gia dụng và mỹ nghệ.
Đến nay, chưa có công bố nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thành phầ n hóa ho ̣c
và hoa ̣t tính sinh học của loài này.

Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3)
(Tiêu bản số VNMN.B000005006 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)
1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon)
Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon; tên đồng nghĩa: Pinus langbianensis A.
Chev., Pinus insularis var. khasyana (Griff.) Silba, Pinus yunnanensis Franch.) là một loài
lá kim thuộc họ Thông (Pinaceae). Trên thế giới, cây phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Thái
Lan, Lào, Việt Nam và Philippines. Ở Việt Nam, thông ba lá lần đầu được phát hiện ở cao
nguyên Langbiang, đó là loài có diện tích lớn nhất trong số các loài thông ở Việt Nam, phân
bố ở Hà Giang, Sơn La, Gia Lai, Kon Tum,... nhưng nhiều nhất (90% diện tích) là trên cao
3


nguyên Langbiang. Lá cây hình kim, thường đính ba lá kim trên một đầu cành ngắn, thường
có màu xanh ngọc, mỗi lá kim thường dài 20-25 cm. Đầu cành ngắn đính lá thường có độ
dài 1.5 cm, đính cách vòng xoắn ốc trên cành lớn [3]. Cây thường được trồng để lấy gỗ
phục vụ cho công nghiệp giấy, ngành xây dựng và mỹ nghệ. Đến nay, chỉ mới có vài công
bố về thành phần hóa học và hoạt tính của tinh dầu từ loài này. Gần đây (năm 2013 và
2014), có một vài công bố nghiên cứu bước đầu về thành phầ n hóa ho ̣c của loài này ở Trung

Quốc [4, 5].

Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá
(Tiêu bản số VNMN.B000005007 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)
1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius D. Don)

Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài
(Tiêu bản số VNMN.B0000050013 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)
Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) là một loài thực vật họ Thông tre
4


(Podocarpaceae). Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng nguyên sinh các tỉnh Kon Tum,
Gia Lai, ĐakLak, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang,
Nghệ An, Hà Tĩnh, Yên Bái, Tuyên Quang... và mọc ở độ cao 2300 m ở Vườn quốc gia Bì
Đúp - Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng. Cây gỗ cao 20–25 m, đường kính có thể tới 50 cm,
thân thẳng, tròn. Vỏ xám nâu, mỏng, nhẵn. Cành lá mọc vòng, màu xanh non hoặc xanh
vàng. Lá mọc cách, hình mác dài, đầu nhọn dần, dài 7–15 cm, rộng 0.9–1.9 cm, đầu và đuôi
nhọn, đầu mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh vàng. Gân chính nổi ở giữa rõ cả 2 mặt, mép
lá cong xuống phía dưới. Cuống lá dài 0.3–0.5 cm, phía dưới có rãnh. Nón đực dạng bông
không cuống, thường 3 bông mọc chụm ở nách lá gần đầu cành, khi non hình trứng, khi già
hình trụ dài 2–5 cm. Nón cái mọc lẻ ở nách lá, chỉ có một lá noãn phát triển mang một noãn,
các lá noãn khác hợp thành đế. Nón hình trứng dài 1.2–1.6 cm, đường kính 0.8–12 cm, đế
mập to gần bằng nón, có cuống dài 0.5-1 cm. Có 2 lá bắc sớm rụng, dài 1,5 cm, rộng 1 cm.
Hạt hình trứng, dài 1,2–1.6 cm, rộng 1.1 cm, dưới có đế mập, đường kính gần bằng đường
kính hạt, quả màu tím [6].
1.2.

Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus
Về thành phần hóa học thì hầu hết các loài lá kim đều có chứa tinh dầu. Bên cạnh

đó, theo thống kê trên thế giới đến nay đã có trên 450 hợp chất được phân lập từ trên một
trăm loài thuộc chi Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpenoid,
phổ biến nhất là diterpene có khung carbon rất đa dạng như: cembrane pimarane, labdane
và abietane; triterpene khung seratane và lanostane, lignan, steroid, các phenol, flavonoid
và flavonoid glycoside [7].
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus
Hầu hết các loài trong chi Pinus đều có tinh dầu, có rất nhiều nghiên cứu trong vòng
40 năm trở lại đây chỉ ra rằng thành phần chính của có trong dầu thông của nhiều loài thuộc
chi Pinus có chứa chủ yếu là các hợp chất terpenoid như: sesquiterpenoid và monoterpenoid; trong đó thường hay gặp với hàm lượng cao là các chất α-pinene (1) và β-pinene (2),
camphene (3), α-myrcene (4), β-myrcene (5) α-terpineol (6), limonene (7) và α-terpinene
(8) [8, 9, 10, 11, 12]; các sesquiterpenoid thường thấy nhất là longifolene (9), caryophyllene (10) và germacrene D (11) [10, 11]. Ngoài ra, theo một nghiên cứu gần đây vào
5


2014 về thành phần tinh dầu của loài P. nigra, người ta đã nhận thấy sự có mặt lượng lớn
các nhóm chất oxygen–diterpene và sesquiterpene [13]. Trong một công bố vào năm 2015
của Zhouqi Li và các cộng sự, ngoài α-pinene (1) còn tìm thấy thêm hàm lượng βcaryophellen (12) tương đối cao trong tinh dầu ở sáu loài thuộc chi Pinus bản địa ở Trung
Quốc [14].
1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus
Các triterpenoid được tìm thấy trong chi Pinus chủ yếu có khung seratane và
lanostane. Trong một công bố vào năm 1991, từ vỏ loài thông trắng Trung Quốc P.
armandii các nhà khoa học đã tách ra được các chất (13-22) có khung seratane [15]. Từ các
loài thông trắng miền Tây ở Bắc Mỹ là P. monticola, và loài thông Luchu P. luchuensis đã
tách được tám triterpenoid khung seratane (23-30) trong các công bố vào năm 1984, 1975
và 2001 [16, 17, 18]. Ngoài ra, các seratane triterpenoid kể trên cũng được tìm thấy từ các
loài P. massoniana, P. taiwanensis, P. monticola và P. strobus [12]. Các lanostane
triterpenoid được tìm thấy chủ yếu từ loài P. monticola và P. luchuensis. Cụ thể là, năm
1981, mười chất (31-40) đã được phân lập từ loài P. monticola [19]; năm 2000, có bốn
chất mới (41-44) được xác định từ loài P. luchuensis [20]; năm 2010, hợp chất mới

pinusyunnanol (45) được phân lập từ loài P. yunnanensis phân bố ở vùng Vân Nam, Trung
Quốc [21]. Ngoài ra trước đó, trong một công bố khác, các chất (24S)-3β-methoxy-5αlanost-9(11)-ene-24,25-diol (31), (32) và (5α,24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46),
(3α,5α,24S)-lanost-9(11)-ene-3,24,25-triol (47) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [18].
Có thể nói diterpenoid là nhóm chất chính có trong chi Pinus. Cho đến nay, các
diterpenoid chủ yếu được tách ra từ các loài thuộc chi này có thể chia thành ba nhóm với
đặc trưng cấu trúc chứa các bộ khung pimarane, abietane và labdane. Các chất 48-58 thuộc
nhóm có khung pimarane thường hay gặp ở loài P. massoniana và P. armandii. Cụ thể là
sandaracopimaric acid (49), 2β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-oic acid (53), pimaric
acid (54), pimara-8(14),15-dien-18-al (55), 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56) và
ent-8,13-epoxylabd-14-en-19-oic acid (57) được tách ra từ loài P. massoniana [12, 22, 23];
từ loài P. armandii đã tách được isopimaric acid (48), isodextropimaric acid (51) cùng với
49 và 54 [12, 24]. Các chất isopimarol (50) và pimarol (52) có trong loài P. kesiya còn
6


manoyl oxide acid (58) đã được tìm thấy trong các loài P. sylvestris, P. nigra và P. pumila
[12].
Cho đến nay, trong các loài Pinus thì các chất thuộc nhóm abietane (59-118) được
tìm thấy với số lượng nhiều nhất so với các diterpenoid còn lại. Từ loài P. massoniana đã
tách được hai mươi ba chất abietane diterpenoid đó là levopimaric acid (60), palustric acid
(61), neoabietic acid (62), abietic acid (63), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic
acid (67), 7α- hydroxydehydroabietan-18-oic acid (68), 7β- hydroxydehydroabietan-18oic acid (69), abieta-6,8,11,13-tetraene-15,19-diol (70), 2β-hydroxydehydroabietic acid
(72), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 7β-hydroxydehydroabiet-15-enoic acid (76),
13β-ethoxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (90), podocarp-8(14)-ene-7,13-dion-18-oic
acid (92), 12α-hydroxydehyroabietic acid (98), abieta-7,13,15-trien-18-oic acid (99), 15hydroxy-12-oxoabietic acid (100), 12β-methoxyabietic acid (103), 13-hydroxypodocarpa8,11,13-trien-18-oic acid (113), 12-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (114), 7βhydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (115), 7α-hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)en-15-oic acid (116) và 13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (117) trong các công bố vào
năm 1993 và 2010 [12, 22, 23]. Trong các năm 2010 và 2011, từ loài P. yunnanensis các
nhà khoa học đã phân lập được dehydroabietane (64), 66, abieta-6,8,11,13-tetraene-15,18diol (71), 73, abiesadine N (75), 15-hydroxy-7-oxodehydroabietic acid (79), 15,18dihydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (80), 4,15-dihydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7one (81), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), 4-hydroxy-19-norabieta-8,11,13trien-7-one

(83),

abieta-8,11,13-triene-7a

,15,18-triol

(84),

methyl

7α

,15-

dihydroxydehydroabietate (85), 7α,15-dihydroxypodocarp-8(14)-en-13-one (86), 12α,13βdihydroxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (87), daturabietatriene (93), 18-norabieta8,11,13-triene-4,15-diol (94), abiesadine I (95), dehydroabietinol (96), 18-norabieta8,11,13-trien-4-ol (97), 12α -methoxyabietic acid (102), pinyunin A (104), pinyunin B
(105), 113 và 117 [25, 26]. Ngoài ra, các hợp chất abietane diterpenoid cũng đã được tìm
thấy từ các loài P. koraiensis, P. pumila, P. densiflora, P. strobus, P. taeda, P. kesiya, P.
armandii, P. sylvestris, P. luchuensis, P. sibirica và P. banksiana trong các công bố khoa
học từ năm 1970-2010 [12].
7


Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus
Khung

Cấu trúc cơ bản

Khung

seratane

pimarane

lanostane

abietane

Cấu trúc cơ bản

labdane

Các hợp chất labdane diterpenoid (119-159) cũng thường có mặt trong thành phần
hóa học của nhiều loài Pinus. Năm 1985, từ loài Thông đen P. nigra, Duane và cộng sự đã
tách được: chất 120, labda-13(16),14-dien-8-ol (132), pinifolic acid (133), 4epiimbricataloic acid (134), dimethyl pinifolate (147), methyl 15-methyl-15-oxolabd8(17)-en-18-oate (148), 4-Epiimbricataloate (149) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)en-13-one (150) [27]. Năm 2002, các chất (E)-communic acid (119), (E)-15-norlabda8(17),12-diene-13,19-dioic acid (125), (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid
(126) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-en-13-one (150) đã được tách ra từ loài P.
luchuensis [28]. Trong các năm 1991 và 2005, từ loài P. armandii các nhà khoa học Trung
Quốc đã phân lập được tám labdane, đó là (+)-isocupressic acid (140), demethyl pinusolide
(145), 16-hydroxy-14-oxo-15-norlabd-8-en-19-oic acid (152), pinusolide (153), 16hydroxylabda-8(17),13-diene-15,19-dioic acid butenolide (154), lambertianic acid (155),
labda-8(17),13-dien-16,14-olid-18-oic acid (156) và 15-hydroxylabda-8(17),13-dien16,14-olid-18-oic acid (157) [24, 29]. Năm 2008, từ loài P. densiflora các nhà khoa học
8


Hàn Quốc đã tách ra được hai labdane là 4-epicommunic acid (120)và (E)-15-nor-14oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) [30]. Năm 2010, từ loài P. massoniana đã tách
được elliotinol (121), (E)-19-acetoxylabda-8(14),12,15-triene (122), 13-epimanool (128)
và 8,14-dioxo-8,14-secoabiet-13(15)-en-18-oic acid (138) [23]. Trong các năm 2006, 2008
và 2010, từ loài P. sylvestris các nhà khoa học đã tách được chất 133, 134, 15-acetoxylabd8(17)-en-18-oic acid (135), 15-ethyl 18-methyl pinifolate (136), 18-acetoxylabd-8(17)-en15-oic acid (137), 15-norpinifolic acid (139), (13E)-18-hydroxylabda-8(17),13-dien-15-yl
acetate

(142),

(13E)-18-acetoxylabda-8(17),13-dien-15-oic

acid

(143),

(13E)-3β-

hydroxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (144) và monomethyl pinifolate (146) [12, 31, 32].
Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid khung labdane cũng đã được tìm thấy ở các loài
P. pumila, P. sibirica, P. koraiensis, P. radiata, P. strobus và P. banksiana [12]. Hợp chất
(14S)-14,17-cyclolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (160) là một là một chất tương đối khác
lạ với cấu trúc vòng C có bảy cạnh, đã được phân lập từ vỏ của loài P. strobus [33]. Chất
isocembrol (161) và 18-norcembra-2,7,11-trien-4-one (162) là các macrocyclic diterpene
có trong dầu-nhựa của loài P. koraiensis [12, 34].
Năm 2009, từ phần ethyl acetate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã tách
được một diterpenoid glucoside mới là 9α,13α-epoxy-8β,14β-dihydroxy-abietic acid-18-Oβ-D-glucopyranoside (163). Đặc biệt đây là lần đầu tiên hợp chất monoterpenoid glucoside
được tìm thấy trong chi này đó là bornyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-Dglucopyranoside (164) và bornyl 6-O-β-D-apiofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside
(165) [35].
Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus

9


10


11


12